專(zhuān)利名稱(chēng)：從豬血中提取具有刺激細(xì)胞呼吸活性作用物質(zhì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從血液中提取刺激細(xì)胞呼吸活性作用物質(zhì)的方法，尤其涉及一種采用超濾等生物技術(shù)手段從豬血中提取促進(jìn)細(xì)胞對(duì)氧和葡萄糖的攝取和利用物質(zhì)的方法。
背景技術(shù)：
豬血去蛋白提取物是以豬血液為原料制備的小分子(分子量＜6000D)肽、核苷酸和寡糖類(lèi)物質(zhì)。其主要藥理作用是促進(jìn)細(xì)胞對(duì)氧和葡萄糖的攝取和利用，使細(xì)胞中葡萄糖的無(wú)氧代謝轉(zhuǎn)向有氧代謝，促使能量物質(zhì)生成增多，延長(zhǎng)細(xì)胞生存時(shí)間，促進(jìn)組織細(xì)胞代謝及功能恢復(fù)和組織修復(fù)。
目前，國(guó)內(nèi)外尚未有關(guān)于從豬血中提取具有刺激細(xì)胞呼吸活性作用物質(zhì)的方法及相關(guān)產(chǎn)品的報(bào)道。
中國(guó)專(zhuān)利(專(zhuān)利號(hào)為96120777.9)公開(kāi)了一種提取小牛血去蛋白提取物的方法，此方法采用乙醇為溶媒去蛋白，然后去除溶媒，這種方法使提取的物質(zhì)的活性損失，并且還存在處理量低、生產(chǎn)周期長(zhǎng)、產(chǎn)量和收率低等問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種有效方法——可以從豬血中提取具有刺激細(xì)胞呼吸活性作用物質(zhì)的方法，該方法解決了目前相關(guān)技術(shù)上存在的處理量低、生產(chǎn)周期長(zhǎng)、產(chǎn)量收率低以及活性損失較高等問(wèn)題，而且應(yīng)用該方法從豬血中提取的產(chǎn)品相對(duì)于傳統(tǒng)工藝的小牛血提取物具有更高的生物活性。
為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的
一種從豬血中提取具有刺激細(xì)胞呼吸活性作用物質(zhì)的方法，包括下述步驟①取非傳染區(qū)經(jīng)檢驗(yàn)合格的健康豬，采用無(wú)菌動(dòng)脈采血方法采血，在采集過(guò)程中或采集后2小時(shí)內(nèi)，用已消毒滅菌的棒狀器具進(jìn)行攪拌，使纖維蛋白吸附在無(wú)菌的棒狀器具上，并將纖維蛋白除去，以避免出現(xiàn)凝血，得到去纖維蛋白豬血；②將去纖維蛋白豬血在-20℃～30℃下反復(fù)凍融，于低溫(0～8℃)條件下的膠體磨中反復(fù)勻漿，顯微鏡下檢查細(xì)胞基本破碎，得勻漿液；③將勻漿液過(guò)濾，用不同截留分子量超濾膜分級(jí)超濾，超濾最終截留分子量＜6000D，得豬血去纖維蛋白提取物超濾液，此超濾液經(jīng)低溫減壓濃縮和病毒滅活后得豬血去蛋白提取物。
所述的步驟②為將去纖維蛋白豬血在-20℃～40℃下反復(fù)凍融2～4次，于0～8℃條件下的膠體磨中勻漿2分鐘，重復(fù)3次，在顯微鏡下檢查細(xì)胞基本破碎，得勻漿液。
所述的步驟③為取勻漿液于4000轉(zhuǎn)/分鐘離心20分鐘后，棄去沉淀，取上清液，用截留分子量100000D的超濾膜超濾，得濾液A；取濾液A，用截留分子量30000D的超濾膜超濾，得濾液B；將濾液B用截留分子量10000D的超濾膜超濾得超濾液C；取超濾液C，用截留分子量6000D的超濾膜超濾，得超濾液D；將超濾液D經(jīng)低溫(25℃)減壓濃縮5～8倍(至總固體含量40mg/ml以上)，得濃縮液；并將濃縮液除菌過(guò)濾，在55～65℃下進(jìn)行病毒滅活10～15小時(shí)；將檢驗(yàn)合格的濃縮液分裝于一次性使用塑料輸液袋中，低溫(-18℃±2℃)貯存，即得豬血去蛋白提取物。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和效果如下1.采用生物技術(shù)及分級(jí)超濾手段在本產(chǎn)品的制造工藝中，首次采用分級(jí)超濾手段。超濾膜分離技術(shù)作為二十一世紀(jì)六大高新技術(shù)之一，以其常溫低壓下操作、無(wú)相變、能耗低等顯著特點(diǎn)已成為一種分離過(guò)程的標(biāo)準(zhǔn)方法，在歐美等發(fā)達(dá)國(guó)家和地區(qū)得到了廣泛的使用，超濾膜分離過(guò)程具有以下幾個(gè)顯著特點(diǎn)①在常溫和低壓下進(jìn)行分離，因而能耗低，因此設(shè)備的運(yùn)行費(fèi)用低。
②設(shè)備體積小、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，故投資費(fèi)用低。
③超濾分離過(guò)程只需簡(jiǎn)單的加壓輸送液體，工藝流程簡(jiǎn)單，易于操作管理。
④超濾分離過(guò)程中的超濾膜是由高分子材料制成的均勻連續(xù)體，該過(guò)程屬于純物理方法過(guò)濾，物質(zhì)在分離過(guò)程中不發(fā)生質(zhì)的變化，并且超濾膜在使用過(guò)程中不會(huì)有任何雜質(zhì)脫落，保證超濾液的純凈。
采用分級(jí)超濾技術(shù)手段，使本品中活性物質(zhì)的活性狀態(tài)保持良好；不經(jīng)過(guò)除溶媒過(guò)程，提高產(chǎn)品質(zhì)量和收率；可進(jìn)行工業(yè)規(guī)模化生產(chǎn)，生產(chǎn)周期短、成本低。
2.以豬血為原料提取其中具有刺激細(xì)胞呼吸活性作用的物質(zhì)目前國(guó)內(nèi)外同類(lèi)產(chǎn)品(包括奧地利的“愛(ài)維治”、瑞士的“素高捷療”；國(guó)內(nèi)已批準(zhǔn)上市的“愛(ài)維治”仿制品“奧德金”等)均以小牛血為原料。但現(xiàn)今由于瘋牛病的肆虐，世界衛(wèi)生組織嚴(yán)格限制使用牛血原料產(chǎn)品，并且廣大民眾對(duì)牛血生物制品也產(chǎn)生一種恐慌心理。目前，中國(guó)也嚴(yán)格限制牛資源制品，尤其是西方國(guó)家的食品和藥品的進(jìn)口。因此，不遠(yuǎn)的將來(lái)，此類(lèi)品種在臨床應(yīng)用上將受到廣泛的限制。所以，有必要尋求新的原料來(lái)源以替代小牛血生產(chǎn)具有相同功能的生化藥物。
由于上述原因，考慮到該類(lèi)產(chǎn)品的原料問(wèn)題，為了控制瘋牛病可能對(duì)人類(lèi)健康造成的不良影響，本發(fā)明研制出一種“豬血去蛋白提取物”。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明豬血去蛋白提取物的有效成份類(lèi)似于小牛血去蛋白提取物，其比活性略高于小牛血去蛋白提取物，并且，該品種易提取，收率高，成本低，更易于規(guī)?；a(chǎn)。由于豬血去蛋白提取物原料來(lái)源安全，有效成分清楚，作用機(jī)理明確，必將替代或大部分替代牛血來(lái)源的同類(lèi)產(chǎn)品，應(yīng)用本發(fā)明工藝提取豬血活性物質(zhì)與應(yīng)用傳統(tǒng)工藝提取小牛血活性物質(zhì)的對(duì)比，結(jié)果見(jiàn)下表

具體實(shí)施方式
實(shí)施例一①取非傳染區(qū)經(jīng)檢驗(yàn)合格出生5個(gè)月的健康豬，采用無(wú)菌動(dòng)脈采血方法采血。在采集過(guò)程中或采集后2小時(shí)內(nèi)，不斷用已消毒滅菌的棒狀器具(木棒或玻璃棒等)進(jìn)行攪拌，使纖維蛋白吸附在無(wú)菌的棒狀器具上，除去纖維蛋白，以避免出現(xiàn)凝血，得到去纖維蛋白豬血。
②將去纖維蛋白豬血在-20℃冷凍，30℃下融化，反復(fù)3次，于低溫0℃或4℃或8℃條件下的膠體磨中反復(fù)勻漿，顯微鏡下檢查細(xì)胞基本破碎，得勻漿液。
③將勻漿液過(guò)濾，用不同截留分子量的超濾膜分級(jí)超濾，超濾最終截留分子量＜6000D，得豬血去纖維蛋白提取物超濾液，此超濾液經(jīng)低溫減壓濃縮及病毒滅活后得豬血去蛋白提取物。
實(shí)施例二①取非傳染區(qū)經(jīng)檢驗(yàn)合格出生6個(gè)月的健康豬，采用無(wú)菌動(dòng)脈采血方法采血。在采集過(guò)程中或采集后2小時(shí)內(nèi)，不斷用已消毒滅菌的棒狀器具(木棒或玻璃棒等)進(jìn)行攪拌，使纖維蛋白吸附在無(wú)菌的棒狀器具上，除去纖維蛋白，以避免出現(xiàn)凝血，得到去纖維蛋白豬血。
②將去纖維蛋白豬血在-20℃冷凍，20℃下融化，反復(fù)3次，于低溫4℃或8℃條件下的膠體磨中反復(fù)勻漿，顯微鏡檢查細(xì)胞基本破碎，得勻漿液。
③將勻漿液過(guò)濾，用不同截留分子量的超濾膜分級(jí)超濾，超濾最終截留分子量＜6000D，得豬血去纖維蛋白提取物超濾液，此超濾液經(jīng)低溫減壓濃縮及病毒滅活后得豬血去蛋白提取物。
實(shí)施例三①取非傳染區(qū)經(jīng)檢驗(yàn)合格出生3個(gè)月的健康豬，采用無(wú)菌動(dòng)脈采血方法采血。在采集過(guò)程中或采集后2小時(shí)內(nèi)，不斷用表面已消毒滅菌的棒狀器具(木棒或玻璃棒等)進(jìn)行攪拌，使纖維蛋白吸附在無(wú)菌的棒狀器具上，除去纖維蛋白，以避免出現(xiàn)凝血，得到去纖維蛋白豬血。
②將去纖維蛋白豬血在-15℃冷凍，40℃下融化，反復(fù)3次，于低溫1℃或3℃條件下的膠體磨中反復(fù)勻漿，顯微鏡檢查細(xì)胞基本破碎，得勻漿液。
③將勻漿液過(guò)濾，用不同截留分子量的超濾膜分級(jí)超濾，最終截留分子量＜6000D，得豬血去纖維蛋白提取物超濾液，此超濾液經(jīng)低溫減壓濃縮及病毒滅活后得豬血去蛋白提取物。
實(shí)施例四①取非傳染區(qū)經(jīng)檢驗(yàn)合格出生4個(gè)月的健康豬，采用無(wú)菌動(dòng)脈采血方法采血，收集在180℃干烤滅菌的不銹鋼桶內(nèi)。在采集過(guò)程中或采集后2小時(shí)內(nèi)，不斷用已消毒滅菌的棒狀器具(木棒或玻璃棒等)進(jìn)行攪拌，使纖維蛋白吸附在器具上，除去纖維蛋白以避免出現(xiàn)凝血，得到去纖維蛋白豬血。
②將去纖維蛋白豬血在-20℃冷凍，40℃下融化，反復(fù)4次，于3～5℃條件下的膠體磨中勻漿2分鐘，重復(fù)3次，顯微鏡檢查細(xì)胞基本破碎，得勻漿液。
③取勻漿液于4000轉(zhuǎn)/分鐘離心20分鐘，棄沉淀；取上清液，用截留分子量100000D的超濾膜超濾，得濾液A；將濾液A用截留分子量30000D的超濾膜超濾，得濾液B；將濾液B用截留分子量10000D的超濾膜超濾，得超濾液C；取超濾液C，用截留分子量6000D的超濾膜超濾，得超濾液D；將超濾液D經(jīng)低溫(25℃)減壓濃縮8倍(至總固體含量40mg/ml以上)，得濃縮液；將濃縮液除菌過(guò)濾，并在60℃條件下進(jìn)行病毒滅活12小時(shí)左右；將檢驗(yàn)合格的濃縮液分裝于一次性使用塑料輸液袋中，低溫-20℃貯存，即得豬血去蛋白提取物。
實(shí)施例五①取非傳染區(qū)經(jīng)檢驗(yàn)合格出生2個(gè)月的健康豬，采用無(wú)菌動(dòng)脈采血方法采血，收集在180℃干烤滅菌的不銹鋼桶內(nèi)。在采集過(guò)程中或采集后2小時(shí)內(nèi)，不斷用已消毒滅菌的棒狀器具(木棒或玻璃棒等)進(jìn)行攪拌，使纖維蛋白吸附在器具上，除去纖維蛋白以避免出現(xiàn)凝血，得到去纖維蛋白豬血。
②將去纖維蛋白豬血在-5℃下冷凍，20℃下融化，反復(fù)凍融2次，于0～5℃條件下的膠體磨中勻漿2分鐘，重復(fù)3次，在顯微鏡下檢查細(xì)胞基本破碎，得勻漿液。
③取勻漿液經(jīng)4000轉(zhuǎn)/分鐘離心20分鐘后，棄沉淀；取上清液，用截留分子量100000D的超濾膜超濾，得濾液A；將濾液A用截留分子量30000D的超濾膜超濾，得濾液B；將濾液B用截留分子量10000D的超濾膜超濾，得超濾液C；取超濾液C，用截留分子量6000D的超濾膜超濾，得超濾液D；將超濾液D，經(jīng)低溫20℃減壓濃縮6倍(至總固體含量40mg/ml以上)，得濃縮液；將濃縮液除菌過(guò)濾，并在65℃下進(jìn)行病毒滅活15小時(shí)左右；將檢驗(yàn)合格的濃縮液分裝于一次性使用塑料輸液袋中，-18℃±2℃貯存，即得豬血去蛋白提取物。
實(shí)施例六①取非傳染區(qū)經(jīng)檢驗(yàn)合格出生6個(gè)月以內(nèi)的健康豬，采用無(wú)菌動(dòng)脈采血方法采血，收集在180℃干烤滅菌的不銹鋼桶內(nèi)。在采集過(guò)程中或采集后2小時(shí)內(nèi)，不斷用已消毒滅菌的棒狀器具(木棒或玻璃棒等)進(jìn)行攪拌，使纖維蛋白吸附在器具上，除去纖維蛋白以避免出現(xiàn)凝血，得到去纖維蛋白豬血。
②將去纖維蛋白豬血在-20℃下冷凍，10℃下融化，反復(fù)凍融4次，于0～8℃條件下的膠體磨中勻漿2分鐘，重復(fù)3次，在顯微鏡下檢查細(xì)胞基本破碎，得勻漿液。
③取勻漿液經(jīng)4000轉(zhuǎn)/分鐘離心20分鐘后，棄沉淀；取上清液，用截留分子量100000D的超濾膜超濾，得濾液A；將濾液A用截留分子量30000D的超濾膜超濾，得濾液B；將濾液B用截留分子量10000D的超濾膜超濾得超濾液C；取超濾液C，用截留分子量6000D的超濾膜超濾，得超濾液D；將超濾液D經(jīng)25℃減壓濃縮5倍，至總固體含量40mg/ml以上，得濃縮液；將濃縮液除菌過(guò)濾，并在55℃條件下進(jìn)行病毒滅活10小時(shí)；將檢驗(yàn)合格的濃縮液分裝于一次性使用塑料輸液袋中，-18℃±2℃貯存，即得豬血去蛋白提取物。
使用本發(fā)明提供的上述方法取得的豬血去蛋白提取物性狀為淡黃色澄明液體，其檢測(cè)情況如下[檢查]pH值應(yīng)為6.5～7.5(中國(guó)藥典2000年版二部附錄VIH)吸收度420nm波長(zhǎng)處的吸收度小于0.25(中國(guó)藥典2000年版二部附錄IVA)蛋白質(zhì)陰性細(xì)菌內(nèi)毒素每1ml中含細(xì)菌內(nèi)毒素量應(yīng)小于1EU(中國(guó)藥典2000年版二部附錄XIE)照高效液相色譜法(中國(guó)藥典2000年版二部附錄VD)測(cè)定大分子量物質(zhì)。用凝膠色譜柱(如Pharmarcia Superdex Peptide或TSKG2000SW柱)，乙腈-三氟醋酸-水(40∶0.1∶60)為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為214nm，按面積歸一化法計(jì)算，含高分子量物質(zhì)(分子量＞5800D)的量不得超過(guò)2.0％。
采用瓦氏呼吸檢壓儀測(cè)定豚鼠肝勻漿的呼吸活力，從測(cè)得的耗氧量計(jì)算出呼吸活力QO2為4.0～6.0μlO2/mg·h；刺激指數(shù)(SI)為2.5～4.0。
(1)總固體量，精密量取2ml，置稱(chēng)量瓶中，在55℃下真空干燥至恒重，每1ml中應(yīng)含固型物為38～60mg。
(2)采用中國(guó)生物制品規(guī)程附錄蛋白質(zhì)含量測(cè)定法，測(cè)定本發(fā)明中產(chǎn)品的多肽含量，每1ml應(yīng)為0.90～1.5mg。
(3)游離氨基酸含量，用高效液相進(jìn)行氨基酸分析，游離氨基酸含量每1ml應(yīng)不少于1.0～1.5mg。
權(quán)利要求
1.一種從豬血中提取具有刺激細(xì)胞呼吸活性作用物質(zhì)的方法，包括以下步驟①取非傳染區(qū)經(jīng)檢驗(yàn)合格的健康豬，采用無(wú)菌動(dòng)脈采血方法采血，在采集過(guò)程中或采集后2小時(shí)內(nèi)，不斷用已消毒滅菌的棒狀器具進(jìn)行攪拌，使纖維蛋白吸附在無(wú)菌的器具上，除去纖維蛋白以避免出現(xiàn)凝血，得到去纖維蛋白豬血；②將去纖維蛋白豬血在-20℃～40℃下反復(fù)凍融，于0～8℃條件下的膠體磨中反復(fù)勻漿，顯微鏡下檢查細(xì)胞基本破碎，得勻漿液；③將勻漿液過(guò)濾，用不同截留分子量的超濾膜分級(jí)超濾，超濾后最終截留分子量＜6000D，得豬血去纖維蛋白提取物超濾液，此超濾液經(jīng)低溫減壓濃縮及病毒滅活后得豬血去蛋白提取物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從豬血中提取具有刺激細(xì)胞呼吸活性作用物質(zhì)的方法，其特征在于所述的步驟②為將去纖維蛋白豬血在-20℃～40℃下反復(fù)凍融2～4次，于0～8℃條件下的膠體磨中勻漿2分鐘，重復(fù)3次，在顯微鏡下檢查細(xì)胞基本破碎，得勻漿液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從豬血中提取具有刺激細(xì)胞呼吸活性作用物質(zhì)的方法，其特征在于所述的步驟③為取勻漿液經(jīng)4000轉(zhuǎn)/分鐘離心20分鐘后，棄沉淀；取上清液，用截留分子量100000D的超濾膜超濾，得濾液A；取濾液A，用截留分子量30000D的超濾膜超濾，得濾液B；將濾液B用截留分子量10000D的超濾膜超濾得超濾液C；取超濾液C，用截留分子量6000D的超濾膜超濾，得超濾液D；將超濾液D經(jīng)低溫(25℃)減壓濃縮5～8倍，至總固體含量40mg/ml以上；將濃縮液在55～65℃下進(jìn)行病毒滅活10～15小時(shí)；將檢驗(yàn)合格的濃縮液分裝于一次性使用塑料輸液袋中，-18℃±2℃貯存，即得豬血去蛋白提取物。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種從豬血中提取具有刺激細(xì)胞呼吸活性作用物質(zhì)的方法，它包括下述步驟取健康豬，采用無(wú)菌動(dòng)脈采集方法采血，不斷用已消毒滅菌的棒狀器具進(jìn)行攪拌，使纖維蛋白吸附在無(wú)菌的器具上，除去纖維蛋白得到去纖維蛋白豬血；－20℃～40℃下反復(fù)凍融，于0～8℃條件下的膠體磨中反復(fù)勻漿，得勻漿液；將勻漿液過(guò)濾，用不同截留分子量的超濾膜分級(jí)超濾，得豬血去纖維蛋白提取物超濾液，此超濾液經(jīng)低溫減壓濃縮及病毒滅活后得豬血去蛋白提取物。該方法所用設(shè)備體積小、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，投資費(fèi)用低；制備的活性物質(zhì)活性狀態(tài)保持良好且活性較高，不經(jīng)過(guò)除溶媒過(guò)程，提高產(chǎn)品質(zhì)量和收率；可進(jìn)行工業(yè)規(guī)模化生產(chǎn)，生產(chǎn)周期短、成本低。
文檔編號(hào)A61K35/14GK1698652SQ200510046289
公開(kāi)日2005年11月23日 申請(qǐng)日期2005年4月20日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月20日
發(fā)明者王光, 李莉, 史曉丹, 馬骉 申請(qǐng)人:沈陽(yáng)斯佳科技發(fā)展有限公司