專利名稱：含毛囊人工皮膚的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物醫(yī)學(xué)，涉及人工皮膚的制備方法，尤其涉及含毛囊人工皮膚的制備方法。
背景技術(shù)：
最近國內(nèi)外已成功地研制出含有真皮和表皮的人工皮膚，但這些人工皮膚尚沒有其他細(xì)胞成份，如無皮脂腺腺體細(xì)胞，皮脂腺分泌的產(chǎn)物稱皮脂，有潤滑皮膚的作用，在皮膚表面形成脂膜，形成皮膚屏障(skin barrier)的一部分。脂膜中的游離脂肪酸對(duì)某些病原微生物的生長起抑制作用；毛囊周圍真皮組織中的成纖維細(xì)胞能產(chǎn)生天然抗生素，有抗菌防御能力。毛囊中的外毛根鞘相當(dāng)于表皮的棘層和基底層細(xì)胞，具有表皮修復(fù)能力，這些細(xì)胞還存在有多種細(xì)胞因子受體，又能分泌重要的細(xì)胞因子，成為皮膚細(xì)胞信息交換的重要場(chǎng)所。
因此，如果在人工皮膚中具有上述細(xì)胞成分，人工皮膚就會(huì)在功能上較為完善。由于毛囊在皮膚中的重要作用，研制出一種具有一定生理功能的含毛囊的人工皮膚對(duì)研究創(chuàng)面的正常化愈合具有重要的理論意義和應(yīng)用前景。
目前臨床上適用于大面積創(chuàng)面覆蓋的人工皮膚主要是以膠原等天然材料為支架的人工皮膚，該類人工皮膚具有培養(yǎng)面積小、產(chǎn)量低、易收縮和移植成功率低等缺點(diǎn)；或是以合成材料為支架的，雖易生產(chǎn)，但易于感染，移植成功率低，沒有表皮層，不利于細(xì)胞生長；人工皮膚的研究重點(diǎn)集中在基質(zhì)的改善和抗感染能力方面，對(duì)人工皮膚中的細(xì)胞成份研究較少，雖然近年來國內(nèi)外已成功地研制出含真皮和表皮的人工皮膚，并具有一定的抗感染能力，但是迄今為止尚未見到含毛囊人工皮膚的報(bào)道。
毛囊是細(xì)胞生物學(xué)和皮膚病學(xué)等學(xué)科的研究熱點(diǎn)，它涉及毛囊真表皮間相互作用、信號(hào)傳導(dǎo)、生長因子和細(xì)胞因子的作用、毛囊生長周期的調(diào)控、毛發(fā)的色素、毛發(fā)的定型、毛囊干細(xì)胞的定位及其生物學(xué)功能等多個(gè)方面，現(xiàn)在已初步闡明毛囊干細(xì)胞定位于毛囊外根鞘的立毛肌附著處。如何利用皮膚毛囊干細(xì)胞在人工皮膚中發(fā)揮重要的生理功能已成為發(fā)展趨勢(shì)。
毛囊的功能毛囊是皮膚的主要輔助器官，它具有重要的生理功能如皮膚的屏障作用，抗菌作用，抑制疤痕形成作用；同時(shí)毛囊是表皮-毛囊-皮脂腺單位干細(xì)胞的所在部位，在適當(dāng)?shù)沫h(huán)境因素刺激下毛囊干細(xì)胞可定向分化為表皮、毛囊和皮脂腺組織，這些組織細(xì)胞及其細(xì)胞因子對(duì)創(chuàng)面的正常化愈合具有不可替代的作用。
由于上述毛囊組織在皮膚中的重要作用，研制出一種具有一定生理功能的含毛囊的人工皮膚對(duì)研究創(chuàng)面的正?；暇哂兄匾睦碚撘饬x和應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供含毛囊人工皮膚的制備方法，通過以下步驟實(shí)現(xiàn)(1)毛囊上皮細(xì)胞制備分離鼠觸須毛囊(C57小鼠)，加入0.5％的分離酶(dispase，Sigma公司)，4℃，消化16～18小時(shí)，將毛囊移入D-Hanks液中，離心去除分離酶，從毛囊中擠出毛干，用0.125％胰蛋白酶加0.02％EDTA(乙二胺四乙酸)消化即成毛囊上皮細(xì)胞，5％新生牛血清D-Hanks液中止消化，吹散細(xì)胞，過篩，計(jì)數(shù)，離心。
(2)毛囊毛乳頭細(xì)胞培養(yǎng)將去除毛干的鼠觸須毛囊用0.3％的膠原酶D，37℃，消化4～6小時(shí)，待包繞毛囊的真皮鞘消化成單細(xì)胞而其內(nèi)的毛乳頭尚未開始消化時(shí)，中止消化，D-Hanks液洗，離心去除膠原酶D三次，300rpm低速離心5分鐘，收上清用DMEM培養(yǎng)基(Dulbecco`s低限量基礎(chǔ)培養(yǎng)基)，37℃，5％CO2中進(jìn)行真皮鞘細(xì)胞培養(yǎng)，吸沉淀過200目的篩網(wǎng)，倒沖篩網(wǎng)，用DMEM培養(yǎng)基，37℃，5％CO2中進(jìn)行毛乳頭細(xì)胞培養(yǎng)。
(3)含毛囊人工皮膚的制備將傳代培養(yǎng)的毛乳頭細(xì)胞(＜6代)與毛囊上皮細(xì)胞按5∶1，3∶1，2∶1，1∶1，1∶2，1∶3，1∶5比例的進(jìn)行細(xì)胞混合，分別注射到膠原/殼聚糖多孔支架上(見專利號(hào)ZL02112498.1記載)，傳代培養(yǎng)細(xì)胞的濃度分別為2.5×104、5×104、1×105、2.5×105、5×105、1×106/ml。每一含毛囊細(xì)胞的膠原/殼聚糖多孔支架置入24孔培養(yǎng)板中，每孔加入1mL DMEM培養(yǎng)基[由含表皮生長因子(EGF)10ng/mL、氫化考的松0.4μg/mL、胰島素5μg/mL]，每2天換液1次。浸沒培養(yǎng)2周后再行氣液界面培養(yǎng)，培養(yǎng)8周后做蘇木素伊紅(H.E.)染色。
本發(fā)明具有以下特點(diǎn)(1)首次在膠原/殼聚糖多孔支架上(見專利號(hào)ZL02112498.1)制備含毛囊人工皮膚；(2)該人工皮膚含有毛囊，使其具有一定的皮膚生理功能；(3)該人工皮膚具有一定的抗菌活性；(4)該人工皮膚具有不易收縮、可吸收特點(diǎn)；(5)該人工皮膚可作為臨床上大面積燒創(chuàng)傷患者的創(chuàng)面覆蓋的醫(yī)用材料，促進(jìn)創(chuàng)面的正?；?；(6)本發(fā)明方法解決了大面積燒創(chuàng)傷中皮膚來源困難的難題；(7)制備方法設(shè)計(jì)合理、操作方便，容易規(guī)?；a(chǎn)。


圖1為制備人工皮膚用的支架。
圖2為共聚焦顯微鏡觀察可見成團(tuán)細(xì)胞，從中有毛干長出。
圖3為真皮鞘細(xì)胞培養(yǎng)8周后未見毛囊樣結(jié)構(gòu)，可見巨大角囊腫。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1(1)在解剖顯微鏡下用顯微外科剪和顯微外科攝分離鼠觸須毛囊若干(＞100個(gè))，加入0.5％的分離酶，4℃，消化16～18小時(shí)，將毛囊移入D-Hanks液中，離心去除分離酶。從毛囊中擠出毛干，用0.125％胰蛋白酶加0.02％EDTA消化即成毛囊上皮細(xì)胞，5％新生牛血清D-Hanks液中止消化，吹散細(xì)胞，過篩，計(jì)數(shù)，離心。
(2)去除毛干的鼠觸須毛囊用0.3％的膠原酶D，37℃，消化4～6小時(shí)，待包繞毛囊的真皮鞘消化成單細(xì)胞而其內(nèi)的毛乳頭尚未開始消化時(shí)，中止消化，D-Hanks液洗，離心去除膠原酶D三次，低速(300rpm)離心5分鐘，收上清用DMEM培養(yǎng)基，37℃，5％CO2中進(jìn)行真皮鞘細(xì)胞培養(yǎng)。吸沉淀過200目的篩網(wǎng)，倒沖篩網(wǎng)，用DMEM培養(yǎng)基，37℃，5％CO2中進(jìn)行毛乳頭細(xì)胞培養(yǎng)。
(3)將傳代培養(yǎng)的毛乳頭細(xì)胞(＜6代)與毛囊上皮細(xì)胞分別按5∶1，3∶1，2∶1，1∶1，1∶2，1∶3，1∶5的比例進(jìn)行細(xì)胞混合，注射(移植)到膠原/殼聚糖多孔支架上(見圖1)，移植用的傳代培養(yǎng)細(xì)胞的濃度為2.5×104/ml，每一含毛囊細(xì)胞的膠原/殼聚糖多孔支架置入24孔培養(yǎng)板中，每孔加入DMEM培養(yǎng)基(含EGF10ng/mL、氫化考的松0.4μg/mL、胰島素5μg/mL)1mL培養(yǎng)，每2天換液1次，浸沒培養(yǎng)2周后再行氣液界面培養(yǎng)，培養(yǎng)8周后做H.E.染色，偶見毛囊樣結(jié)構(gòu)形成，參見圖2。
實(shí)施例2制備方法參照實(shí)施例1，將傳代培養(yǎng)的毛乳頭細(xì)胞(＜6代)與毛囊上皮細(xì)胞分別按5∶1，3∶1，2∶1，1∶1，1∶2，1∶3，1∶5比例進(jìn)行細(xì)胞混合，注射到膠原/殼聚糖多孔支架上，移植細(xì)胞的濃度為5×104/ml。培養(yǎng)8周后可見少量毛囊樣結(jié)構(gòu)形成。
實(shí)施例3制備方法參照實(shí)施例1，將傳代培養(yǎng)的毛乳頭細(xì)胞(＜6代)與毛囊上皮細(xì)胞分別按5∶1，3∶1，2∶1，1∶1，1∶2，1∶3，1∶5比例進(jìn)行細(xì)胞混合，注射到膠原/殼聚糖多孔支架上，移植細(xì)胞的濃度為1×105/ml。培養(yǎng)8周后可見少量毛囊樣結(jié)構(gòu)形成。
實(shí)施例4制備方法參照實(shí)施例1，將傳代培養(yǎng)的毛乳頭細(xì)胞(＜6代)與毛囊上皮細(xì)胞分別按5∶1，3∶1，2∶1，1∶1，1∶2，1∶3，1∶5比例進(jìn)行細(xì)胞混合，注射到膠原/殼聚糖多孔支架上，移植細(xì)胞的濃度為2.5×105/ml。培養(yǎng)8周后可見少量毛囊樣結(jié)構(gòu)形成。
實(shí)施例5制備方法參照實(shí)施例1，將傳代培養(yǎng)的毛乳頭細(xì)胞(＜6代)與毛囊上皮細(xì)胞分別按5∶1，3∶1，2∶1，1∶1，1∶2，1∶3，1∶5比例進(jìn)行細(xì)胞混合，注射到膠原/殼聚糖多孔支架上，移植細(xì)胞的濃度為5×105/ml。培養(yǎng)8周后可見少量毛囊樣結(jié)構(gòu)形成。
實(shí)施例6制備方法參照實(shí)施例1，將傳代培養(yǎng)的毛乳頭細(xì)胞(＜6代)與毛囊上皮細(xì)胞分別按5∶1，3∶1，2∶1，1∶1，1∶2，1∶3，1∶5比例進(jìn)行細(xì)胞混合，注射到膠原/殼聚糖多孔支架上，移植細(xì)胞的濃度為1×106/ml。培養(yǎng)8周后可見毛囊樣結(jié)構(gòu)形成。
實(shí)施例7制備方法參照實(shí)施例1，將傳代培養(yǎng)的真皮鞘細(xì)胞(＜6代)與毛囊上皮細(xì)胞分別按5∶1，3∶1，2∶1，1∶1，1∶2，1∶3，1∶5比例進(jìn)行細(xì)胞混合，注射到膠原/殼聚糖多孔支架上，各種移植細(xì)胞濃度，培養(yǎng)8周后未見毛囊樣結(jié)構(gòu)，部分偶見角囊腫形成，參見圖3。
權(quán)利要求
1.含毛囊人工皮膚的制備方法，其特征是通過以下步驟實(shí)現(xiàn)(1)毛囊上皮細(xì)胞制備分離鼠觸須毛囊，加入0.5％的分離酶，4℃，消化16～18小時(shí)，將毛囊移入D-Hanks液中，離心，從毛囊中擠出毛干，用0.125％胰蛋白酶加0.02％EDTA消化即成毛囊上皮細(xì)胞，5％新生牛血清D-Hanks液中止消化，吹散細(xì)胞，過篩，計(jì)數(shù)，離心；(2)毛乳頭細(xì)胞培養(yǎng)將去除毛干的鼠觸須毛囊用0.3％的膠原酶D，37℃，消化4-6小時(shí)，D-Hanks液洗，離心，300rpm低速離心5分鐘，吸沉淀過篩網(wǎng)，用DMEM培養(yǎng)基，37℃，5％CO2中進(jìn)行毛乳頭細(xì)胞培養(yǎng)；(3)含毛囊人工皮膚將傳代培養(yǎng)的毛乳頭細(xì)胞與毛囊上皮細(xì)胞按5-1∶1-5比例的進(jìn)行細(xì)胞混合，注射到膠原/殼聚糖多孔支架上，每一含毛囊細(xì)胞的膠原/殼聚糖多孔支架置入24孔培養(yǎng)板中，每孔加入DMEM培養(yǎng)基1mL培養(yǎng)，浸沒培養(yǎng)2周后再行氣液界面培養(yǎng)，培養(yǎng)8周后做蘇木素伊紅染色。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的含毛囊人工皮膚的制備方法，其特征是步驟(2)毛乳頭細(xì)胞培養(yǎng)，吸取沉淀過200目的篩網(wǎng)，倒沖篩網(wǎng)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的含毛囊人工皮膚的制備方法，其特征是步驟(3)中選用＜6代的毛乳頭細(xì)胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的含毛囊人工皮膚的制備方法，其特征是步驟(3)中傳代培養(yǎng)的毛乳頭細(xì)胞與毛囊上皮細(xì)胞混合比例選用5∶1，3∶1，2∶1，1∶1，1∶2，1∶3，1∶5中任一種。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的含毛囊人工皮膚的制備方法，其特征是步驟(3)中傳代培養(yǎng)細(xì)胞的濃度選用2.5×104、5×104、1×105、2.5×105、5×105、1×106/ml中任一種。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的含毛囊人工皮膚的制備方法，其特征是步驟(3)中DMEM培養(yǎng)基由10ng/mL表皮生長因子、0.4μg/mL氫化考的松、5μg/mL胰島素組成。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一所述的含毛囊人工皮膚的制備方法制備的人工皮膚，其特征是在臨床上大面積燒創(chuàng)傷患者的創(chuàng)面覆蓋的醫(yī)用材料中應(yīng)用。
全文摘要
一種含毛囊人工皮膚的制備方法，通過以下步驟實(shí)現(xiàn)分離鼠觸須毛囊，加入分離酶消化，離心，得毛囊上皮細(xì)胞；取去除毛干的鼠觸須毛囊用膠原酶D消化，離心，用DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行真皮鞘細(xì)胞培養(yǎng)和進(jìn)行毛乳頭細(xì)胞培養(yǎng)；將傳代培養(yǎng)的細(xì)胞分別與毛囊上皮細(xì)胞按5－1∶1－5比例進(jìn)行混合，移植到膠原/殼聚糖多孔支架上，加入DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)即得。本發(fā)明方法解決了大面積燒創(chuàng)傷中皮膚來源困難的難題。用發(fā)明制備的人工皮膚含有毛囊，具有一定的皮膚生理功能，具有一定的抗菌活性、不易收縮、可吸收的特點(diǎn)；為臨床上大面積燒創(chuàng)傷患者提供創(chuàng)面覆蓋的醫(yī)用材料，促進(jìn)創(chuàng)面的正常化愈合；本發(fā)明方法設(shè)計(jì)合理、操作方便，容易規(guī)?；a(chǎn)。
文檔編號(hào)A61L27/38GK1709523SQ200510050538
公開日2005年12月21日 申請(qǐng)日期2005年7月1日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月1日
發(fā)明者呂中法, 鄭敏, 蔡綏勍, 馬列, 吳賢杰, 高長友 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)