專利名稱：重組人VEGF與bFGF真核表達載體、融合蛋白及其用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物工程領域，涉及重組人血管內皮細胞生長因子(VEGF)與堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)融合基因真核表達載體、融合蛋白及其用途。
背景技術：
周圍動脈狹窄或閉塞造成的肢體動脈缺血性疾病是血管外科領域最常見的疾病之一，目前常用的治療方法包括手術，藥物及近年來興起的介入療法，都各有其適應癥和局限性。自從血管內皮細胞生長因子(VEGF)的基因序列及生物學活性研究報道以來，國內外學者進行了大量的研究，在90年代初提出了有別于傳統(tǒng)的治療心血管和肢體動脈缺血性疾病的新概念，即利用血管生長因子的促血管生長作用，刺激機體產(chǎn)生大量新生血管，建立豐富的側枝循環(huán)，從而改善血供，達到治療缺血性疾病的目的?，F(xiàn)在VEGF基因治療的臨床研究已取得了明顯的效果[1-4]，證明了VEGF治療血管缺血性疾病的臨床應用前景。
VEGF和bFGF同屬于血管生成因子家族的成員，VEGF是有高度特異性的血管內皮細胞有絲分裂原，具有雙重功能既增加微血管通透性，促進血漿纖維素蛋白外滲，為血管形成過程中多種細胞遷移提供一個纖維網(wǎng)絡；又通過內皮細胞上的受體直接刺激內皮細胞的增殖[5]。bFGF也是血管內皮細胞有絲分裂原，具有增加內皮細胞的化學趨向性，誘導蛋白溶解生成，有利于內皮細胞芽穿透基質等功能[6]，從而促進內皮細胞的遷移和血管的生成。在促進血管生成的過程中，VEGF與bFGF之間的作用既相互獨立又相互調節(jié)。本發(fā)明利用基因工程技術將人VEGF和bFGF基因克隆到pcDNA3.1(+)真核表達載體上，將它們重組成融合基因，并在真核細胞中表達了兩種細胞因子的融合蛋白，目的是利用兩種細胞因子在促進血管生成過程中的協(xié)同作用，發(fā)揮更大的生物學作用，目前國內外還未見有相關的報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明提供一種重組真核表達載體，其中含有重組人血管內皮細胞生長因子基因與堿性成纖維細胞生長因子基因。優(yōu)選，所述基因串聯(lián)插入載體中。
本發(fā)明中使用的載體可以是本領域技術人員熟知的任何載體，只要其可以攜帶外源基因在體內表達。在優(yōu)選的實施方案中，使用的載體是pcDNA3.1(+)。最優(yōu)選的重組載體是本發(fā)明中構建的pcDNA/V+b。
本發(fā)明還提供了一種重組融合蛋白，由人血管內皮生長因子基因與堿性成纖維細胞生長因子組成。優(yōu)選所述重組融合蛋白具有SEQ ID NO6的氨基酸序列。
本發(fā)明還涉及本發(fā)明的重組載體和重組融合蛋白的新用途，它們可以被用作治病藥物，從而預防或治療缺血性疾病。


圖1為PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結果。
Mr 100bP DNA Ladder IV1-2 VEGF PCR產(chǎn)物3-4 bFGF PCR產(chǎn)物圖2為重組質粒pGEM-T-V和pGEM-T-b酶切鑒定。
Mr1 Lamda DNA/HindIIIMr2 100bP DNA Ladder IV1、pGEM-T-V 4、pGEM-T-b2、pGEM-T-V cut by HindIII 5、pGEM-T-b cut by EcoRI3、pGEM-T-V cut by HindIII/XbaI 6、pGEM-T-b cut by XbaI/EcoRI圖3為融合基因表達質粒pcDNA/V+b的構建。
圖4為融合基因表達質粒pcDNA/V+b的酶切鑒定。
Mr1 Lamda DNA/HindIIIMr2 100bP DNA Ladder IV1、pcDNA/V+b2、pcDNA/V+b cut by HindIII3、pcDNA/V+b cut by HindIII/EcoRI4、pcDNA/V+b cut by HindIII/XbaI圖5為目的基因VEGF/bFGF用T7引物測序的結果。
圖6為目的基因VEGF/bFGF用BGH引物測序的結果。
圖7為商品抗體VEGF與目的蛋白的Westren-blot分析。
1、293細胞培養(yǎng)上清樣品2、293細胞裂解液樣品3、293-pcDNA3.1(+)細胞培養(yǎng)上清樣品4、293-pcDNA3.1(+)細胞裂解液樣品5、293-hVEGF/bFGF細胞培養(yǎng)上清樣品1#6、293-hVEGF/bFGF細胞裂解液樣品1#7、293-hVEGF/bFGF細胞培養(yǎng)上清樣品2#8、293-hVEGF/bFGF細胞裂解液樣品2#圖8為商品抗體bFGF與目的蛋白的Westren-blot分析。
1、293細胞培養(yǎng)上清樣品2、293細胞裂解液樣品3、293-pcDNA3.1(+)細胞培養(yǎng)上清樣品4、293-pcDNA3.1(+)細胞裂解液樣品5、293-hVEGF/bFGF細胞培養(yǎng)上清樣品1#6、293-hVEGF/bFGF細胞裂解液樣品1#7、293-hVEGF/bFGF細胞培養(yǎng)上清樣品2#8、293-hVEGF/bFGF細胞裂解液樣品2#圖9為rhVEGF/bFGF誘導雞胚絨毛尿囊膜血管新生示圖。
A、生理鹽水對照B、293-pcDNA3.1(+)細胞培養(yǎng)上清C、293-pcDNA3.1(+)細胞裂解液D、293-hVEGF/bFGF細胞培養(yǎng)上清E、293-hVEGF/bFGF細胞裂解液具體實施方式
在本發(fā)明的具體實施方案中，應用基因工程技術將人血管內皮細胞生長因子與堿性成纖維細胞生長因子基因克隆到真核表達載體pcDNA3.1(+)上，重組成融合基因。融合基因中含有6個氨基酸的中間接頭序列，同時對其5’端AUG側翼序列進行翻譯優(yōu)化設計。重組質粒經(jīng)酶切鑒定，證實有1.0kb的片段插入載體，其DNA序列經(jīng)測序分析，結果與genebank的VEGF、bFGF基因序列和實驗設計完全一致，成功構建了一種雙因子融合基因的真核表達載體。
將融合基因表達載體轉染人胚胎腎細胞(293細胞)，經(jīng)G418篩選獲得穩(wěn)定表達的重組質粒細胞克隆。Western印跡結果表明表達產(chǎn)物為約40,000的蛋白，與預計的重組融合蛋白分子量相同，并同時具有對人VEGF和人bFGF兩種抗體的免疫學活性。MTT檢測證實重組融合蛋白能明顯促進體外培養(yǎng)的人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)的分裂增殖。重組融合蛋白經(jīng)雞胚絨毛尿囊膜試驗表明有促血管生成活性。
本發(fā)明所述構建攜帶人類VEGF165cDNA(hVEGF165)和人類bFGF(hbFGF)融合基因的真核表達質粒pcDNA/V+b的技術方法包括引物設計與合成、PCR反應、克隆載體的構建、融合基因表達載體的構建、感受態(tài)細胞的制備與重組質粒的轉化、重組克隆的篩選及酶切鑒定、VEGF/bFGF融合基因序列的測定、進行質粒大量擴增、融合基因表達載體轉染293細胞、重組質粒細胞克隆的篩選及表達等10個步驟。
以下通過實施例來進一步闡明本申請的內容。應當理解，實施例僅用于示例性說明申請的技術方案的具體實施方式
，而不是以任何方式限定本申請的范圍。
實施例1步驟一、引物設計與合成(共設計2對4條引物)引物1含有人VEGF信號肽序列及起始密碼子ATG，ATG側翼含有一段翻譯優(yōu)化序列5’CCACCATG 3’，優(yōu)化序列上游引入HindIII酶切位點；引物2去掉了VEGF的終止密碼子TGA，加上中間6個氨基酸的接頭序列及XbaI酶切位點5’GGAGGCGGTGGTTCTAGA3’；引物3去掉了bFGF的起始密碼子ATG，并加上XbaI酶切位點；引物4中引入了EcoRI酶切位點。
引物由上海生物工程公司合成引物15’CGAAGCTTCCACCATG*AAC TTT CTG CTG TCT TGG3’(SEQ ID NO1)HindIII引物25’GCTCTAGAACC ACC GCC TCCCCG CCT CGG CTT GTC3’(SEQ ID NO2)XbaI引物35’CGTCTAGACCC GCC TTG CCC GAG GAT GGC3’(SEQ ID NO3)XbaI
引物45’GCGAATTCTCA*GCT CTT AGC AGA CAT TGG3’(SEQ ID NO4)EcoRI步驟二、PCR反應1、含人VEGFcDNA序列的質粒pcDNA/V和含人bFGFcDNA序列的質粒pcDNA/b均為本室構建保存，兩個基因的克隆和質粒構建已發(fā)表論文[7][8]。表達載體pcDNA3.1(+)5428bp，購自Invitrogen公司，它含有CMV啟動子，BGH多聚腺苷酸序列，多克隆位點位于CMV和BGH之間。
2、分別以pcDNA/V和pcDNA/b為模板，擴增VEGF、bFGF基因。
PCR反應體系 VEGF bFGF模板DNA(4μg/μl)1μl 1μldNTP(10mM) 1μl 1μl引物1(10uM) 1μl引物2(10uM) 1μl引物3(10uM) 1μl引物4(10uM) 1μlTaqDNA聚合酶(1U/μl) 1μl 1μl10×反應緩沖液 5μl 5μl加40μl無菌水補足反應體系至50μl，加入等體積50μl石蠟油，進行反應。
PCR擴增條件為94℃預變性2分鐘；94℃45秒，68℃3分鐘，30個循環(huán)；末次反應于72℃延伸8分鐘。
3、取5μlPCR產(chǎn)物進行1.2％瓊脂糖凝膠電泳，電泳結果(見圖1)分別在0.6kb和0.4kb處可見到特異性擴增條帶，與預計的VEGF基因(原始序列576bp減去終止密碼子再加連接肽和酶切位點共606bp)、bFGF基因(原始序列463bp減去信號肽序列加上酶切位點共459bp)的片段大小一致。
4、用Promega公司的WizardTM PCR Preps DNA Purification System回收目的條帶。
1)從低熔點瓊脂糖凝膠上切下PCR產(chǎn)物(體積不超過100μl)，放入1.5mlEppendorf管中。70℃水浴至膠完全融化。
2)配置2ml，80％異丙醇備用。
3)在融化的膠溶液中加入1ml樹脂液體，均勻混合20秒。
4)取1只一次性注射器，與微型柱接口連接。
5)將樹脂/DNA混合物加入注射器，用注射器推進器緩慢將混合物推入柱中。
6)取下注射器，拔出推進器，把注射器重新安到柱上，加入2ml 80％異丙醇。用注射器推進器緩慢將異丙醇推入柱中。
7)微型柱10,000g離心2分鐘。
8)微型柱放入新1.5mlEppendorf管，加入50μl無菌水，室溫放置10分鐘，10,000g離心20秒。
9)-20℃保存純化產(chǎn)物。
10)紫外分光廣度法檢測PCR純化產(chǎn)物濃度，結果VEGF濃度為0.08μg/μl，bFGF濃度為0.05μg/μl。
步驟三、克隆載體的構建1、pGEM-T載體試劑盒(包含T4DNA連接酶及2×反應緩沖液)購自Promega公司，將VEGF、bFGF的PCR純化產(chǎn)物分別與pGEM-T載體連接，pGEM-T是一個高拷貝數(shù)的非表達載體，可以直接與PCR產(chǎn)物連接，重組克隆可直接通過藍/白篩選檢出。連接反應按Promega公司pGEM-T載體使用說明進行。VEGF、bFGF的PCR純化產(chǎn)物與pGEM-T載體以3∶1的質量比進行DNA連接反應。
連接反應體系 VEGFbFGF載體DNA(50ng/μl)1μl1μlT4DNA連接酶 1μl1μlPCR純化產(chǎn)物 2μl3.5μl2×反應緩沖液5μl 5μl無菌水 1μl反應體系共10μl，混勻，離心，4℃水浴過夜連接。
2、取5μl連接產(chǎn)物轉化高效感受態(tài)DH5α細菌細胞(購自博大泰克公司)。冰浴20分鐘，室溫放置10分鐘，加入400μlLB培養(yǎng)基，37℃、200轉/分培養(yǎng)1小時。LB培養(yǎng)基平板含氨芐青霉素70μg/ml，鋪菌之前用200μl IPTG(100mg/ml)，20μl X-gal(90mg/ml)先涂板，室溫放置30分鐘，隨后取100-200μl菌液鋪平皿，37℃溫箱培養(yǎng)12-16小時。
3、經(jīng)氨芐青霉素及藍白篩選，挑白色單菌落，液體培養(yǎng)后小量提取擴增。酶切鑒定分析。篩選出pGEM-T-V和pGEM-T-b重組質粒，進行酶切鑒定。
酶切反應體系pT/VEGF pT/bFGF質粒DNA 5μl 5μlHindIII 1μlXbaI 1μl 1μlEcoRI 1μl10×反應緩沖液1μl 1μl無菌水2μl 2μl總體系10μl，混勻，37℃水浴2小時。
4、酶切反應產(chǎn)物經(jīng)1.2％低熔點瓊脂糖凝膠電泳后，電泳結果(見圖2)表明PCR擴增的606bp的VEGF和459bp的bFGF片段已分別插入pGEM-T載體中。
步驟四、融合基因表達載體的構建(構建過程如圖3所示)1、用HindIII、XbaI酶切pGEM-T-V重組質粒，用XbaI、EcoRI酶切pGEM-T-b重組質粒，同時用HindIII、EcoRI酶切pcDNA3.1(+)載體。
酶切反應體系pT/VEGF pT/bFGF pcDNA3.1(+)質粒DNA 50μl 50μl50μlHindIII 2μl 2μlXbaI2μl 2μlEcoRI 2μl2μl10×反應緩沖液 6μl 6μl6μl總體系60μl，混勻，37℃水浴2小時。
2、酶切反應產(chǎn)物經(jīng)1％低熔點瓊脂糖凝膠電泳后，用Promega公司的WizardTM PCRPreps DNA Purification System回收目的條帶，方法與前面相同。
3、紫外分光廣度法檢測酶切反應純化產(chǎn)物濃度，結果VEGF濃度為0.155μg/μl，bFGF濃度為0.17μg/μl，pcDNA3.1(+)濃度為0.28μg/μl。
4、取回收的VEGF、bFGF片段與pcDNA3.1(+)片段以3∶1的質量比進行DNA連接反應。
連接反應體系載體DNA 1μlVEGF DNA5.4μlbFGF DNA4.9μl45℃水浴5分鐘，0℃冰浴10分鐘，再加入T4DNA連接酶 2μl10×反應緩沖液 2μl無菌水 4.7μl反應體系共20μl，混勻，離心，16℃水浴過夜連接。
步驟五、感受態(tài)細胞的制備及連接產(chǎn)物的轉化1、取出-80℃保存的DH5α菌株(購自博大泰克公司)，用無菌接種環(huán)蘸取少量菌液，在LB瓊脂培養(yǎng)平板(無氨芐青霉素)上劃線，37℃培養(yǎng)過夜。
2、挑取單個菌落接種于5mlLB培養(yǎng)基中，細菌培養(yǎng)于搖床中37℃、200轉/分培養(yǎng)16小時。
3、取1ml該菌液接種于100ml LB培養(yǎng)基中，300轉/分培養(yǎng)至OD600達到0.4。
4、將培養(yǎng)物置于冰上放置10分鐘，在4℃離心機中4,000轉/分離心10分鐘。棄上清，加入10ml預冷的0.1mol/L的氯化鈣(無菌)重懸沉淀。
5、冰浴30分鐘后再次離心，沉淀以2ml冰預冷的氯化鈣重懸，冰上放置1小時。分裝備用，剩余的菌液加10％甘油儲存于-80℃。
6、取8μl DNA連接產(chǎn)物加入200μl感受態(tài)細胞中，溫和混勻，冰浴30分鐘。
7、42℃水浴中熱休克2分鐘，再次冰浴2分鐘后加入800μl LB培養(yǎng)基，于37℃、200轉/分震蕩培養(yǎng)1小時。
8、以200μl菌液鋪LB瓊脂培養(yǎng)平板(含氨芐青霉素70μg/ml)，37℃培養(yǎng)過夜。
步驟六、重組克隆的篩選及酶切鑒定1、從轉化后的LB培養(yǎng)基平板上挑取5個單菌落接種于5ml含氨芐青霉素70μg/ml LB培養(yǎng)基中，300轉/分培養(yǎng)16小時。
2、以miniprep方法小量提取重組質粒，分別用HindIII、EcoRI兩個酶和HindIII、XbaI兩個酶對重組質粒進行雙酶切鑒定。
酶切反應體系 12重組質粒DNA5μl 5μlHindIII1μl 1μlXbaI1μlEcoRI 1μl10×反應緩沖液 1μl 1μl無菌水 2μl 2μl總體系10μl，混勻，37℃水浴2小時。
3、酶切產(chǎn)物經(jīng)1.2％低熔點瓊脂糖凝膠電泳后，電泳結果(見圖4)HindIII、EcoRI雙酶切得到兩條帶，一條是載體片段大約5.4kb，另一條1.0kb左右的條帶，與VEGF+bFGF片段(含酶切位點)的大小1043bp一致。由于pcDNA3.1(+)載體的多克隆位點上，在EcoRI酶切位點后還有一個XbaI的酶切位點，用HindIII、XbaI雙酶切重組質粒時得到三條帶，一條是載體的片段大約5.4kb，VEGF+bFGF片段經(jīng)XbaI酶切得到兩條帶VEGF約596bp和bFGF約447bp(均含酶切位點)，且大小與插入片段一致，電泳結果(見圖4)表明得到了融合基因表達載體pcDNA/V+b。
步驟七、VEGF/bFGF融合基因序列的測定酶切鑒定正確的重組融合基因質粒pcDNA/V+b經(jīng)上海生物工程公司ABIPRISMTM 377DNA Sequencer以T7 Promoter Primer和BGH Promoter Primer測序鑒定，進一步證實插入序列與genebanker和實驗設計完全一致(見圖5、6)。
基因序列(SEQ ID NO5)
ATGAACTTTCTGCTGTCTTGGGTGCATTGGAGCCTTGCCTTGCTGCTCTACCTCCACCATGCCAAGTGGTCCCAGGCTGCACCCATGGCAGAAGGAGGAGGGCAGAATCATCACGAAGTGGTGAAGTTCATGGATGTCTATCAGCGCAGCTACTGCCATCCAATCGAGACCCTGGTGGACATCTTCCAGGAGTACCCTGATGAGATCGAGTACATCTTCAAGCCATCCTGTGTGCCCCTGATGCGATGCGGGGGCTGCTGCAATGACGAGGGCCTGGAGTGTGTGCCCACTGAGGAGTCCAACATCACCATGCAGATTATGCGGATCAAACCTCACCAAGGCCAGCACATAGGAGAGATGAGCTTCCTACAGCACAACAAATGTGAATGCAGACCAAAGAAAGATAGAGCAAGACAAGAAAATCCCTGTGGGCCTTGCTCAGAGCGGAGAAAGCATTTGTTTGTACAAGATCCGCAGACGTGTAAATGTTCCTGCAAAAACACAGACTCGCGTTGCAAGGCGAGGCAGCTTGAGTTAAACGAACGTACTTGCAGATGTGACAAGCCGAGGCGGGGAGGCGGTGGTTCTAGACCCGCCTTGCCCGAGGATGGCGGCAGCGGCGCCTTCCCGCCCGGCCACTTCAAGGACCCCAAGCGGCTGTACTGCAAAAACGGGGGCTTCTTCCTGCGCATCCACCCCGACGGCCGAGTTGACGGGGTCCGGGAGAAGAGCGACCCTCACATCAAGCTACAACTTCAAGCAGAAGAGAGAGGAGTTGTGTCTATCAAAGGAGTGTGTGCTAACCGTTACCTGGCTATGAAGGAAGATGGAAGATTACTGGCTTCTAAATGTGTTACGGATGAGTGTTTCTTTTTTGAACGATTGGAATCTAATAACTACAATACTTACCGGTCAAGGAAATACACCAGTTGGTATGTGGCACTGAAACGAACTGGGCAGTATAAACTTGGATCCAAAACAGGACCTGGGCAGAAAGCTATACTTTTTCTTCCAATGTCTGCTAAGAGCTGA步驟八、質粒大量擴增1、選鑒定正確克隆的菌液接種于2,500ml LB培養(yǎng)基中(含氨芐青霉素70μg/ml)進行質粒pcDNA/V+b的大量擴增，用QIAGEN公司的質粒大量提取試劑盒提取純化。
2、純化的重組質粒用紫外分光廣度法檢測濃度，結果pcDNA/V+b濃度為2.6μg/μl，pcDNA3.1(+)濃度為3.36μg/μl，A260/A280介于1.8-2.0，表明質粒純化完全。
步驟九、融合基因表達載體轉染293細胞293細胞購自北京清源生物公司，細胞培養(yǎng)基DMEM、LipofectAMINETMReagent購自GIBCOBRL公司；胎牛血清購自HyClone公司；1、293細胞(人胚胎腎細胞)按1×104接種于6孔板，在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至50-80％的單層。
2、采用脂質體轉染法，用LipofectAMINETM Reagent將融合基因表達質粒pcDNA/V+b轉染293細胞，同時將pcDNA3.1(+)空質粒轉染293細胞，按GIBCOBRL公司提供的操作程序進行。
1)取大量提質粒pcDNA/V+b，15.4μl和pcDNA3.1(+)，11.9μl稀釋，稀釋過程中用無水乙醇沉淀DNA，再溶解DNA至終濃度0.1μg/μl。
2)配置轉染反應液(pcDNA/V+b1和pcDNA3.1(+)轉染量及條件相同)A液36μl質粒溶液+164μl DMEM培養(yǎng)液(原液不含血清及雙抗)B液24μl LipofectAMINETM Reagent+176μl DMEM培養(yǎng)液3)A液加入B液管中，充分混勻，室溫放置40分鐘。
4)PBS洗滌細胞一遍，洗滌細胞一遍。
5)A、B混合液加1,600μl DMEM培養(yǎng)液(原液不含血清及雙抗)至總體積2ml，每個樣品兩個孔，每個孔加1ml轉染液。剩余兩個孔各加1ml DMEM培養(yǎng)液(原液不含血清及雙抗)作空細胞對照。37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)4小時。
6)4小時后更換DMEM完全培養(yǎng)基(含血清及雙抗)，繼續(xù)培養(yǎng)。
步驟十、重組質粒細胞克隆的篩選及表達1、重組質粒轉染293細胞72小時后，用G418購自GIBCOBRL公司(800mg/ml)加壓選擇，同時用未轉染的293細胞作陰性對照。4周后出現(xiàn)G418抗性細胞克隆，未轉染質粒的293細胞基本死亡。挑選G418抗性細胞克隆，建立293-hVEGF/bFGF、293-pcDNA3.1(+)細胞株。
2、檢測重組蛋白的表達，將293空細胞株，293-hVEGF/bFGF細胞株，和293-pcDNA3.1(+)細胞株，在細胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。
3、待細胞長滿后，收集細胞培養(yǎng)上清和細胞裂解液。室溫12,000轉/分離心1分鐘，取上清20μl加入6×SDS凝膠加樣緩沖液4μl，混勻，100℃煮沸5分鐘，然后以12,000轉/分離心1分鐘。
4、在12％SDS聚丙烯酰胺凝膠中各加入15μl懸液，相同樣品加入兩塊凝膠中，同時進行電泳。
5、電泳后凝膠轉膜，用兔抗人VEGF多克隆抗體和兔抗人bFGF多克隆抗體，以及山羊抗兔堿性磷酸酶標記的二抗分別對兩塊膜進行Westren-blot檢測。
6、Westren-blot檢測結果(見圖7、8)，293空細胞、293-pcDNA3.1(+)細胞的對照細胞培養(yǎng)上清和細胞裂解液樣品均沒有特異條帶出現(xiàn)。293-hVEGF/bFGF細胞培養(yǎng)上清樣品在40KD位置有特異條帶出現(xiàn)，表明重組融合基因在293細胞中得到表達，表達產(chǎn)物與預計的重組融合蛋白分子量(VEGF約23,000，bFGF約17,000)相符，而且重組融合蛋白同時具有對人VEGF和人bFGF兩種抗體的免疫學活性。重組融合蛋白rhVEGF/bFGF的編碼序列如下(SEQ ID NO6)ATG AAC TTT CTG CTG TCT TGG GTG CAT TGG AGC CTT GCC TTGMet Asn Phe Leu Leu Ser Trp Val His Trp Ser Leu Ala LeuM N F L L S W V H W S L A LCTG CTC TAC CTC CAC CAT GCC AAG TGG TCC CAG GCT GCA CCCLeu Leu Tyr Leu His His Ala Lys Trp Ser Gln Ala Ala ProL L Y L H H A K W S Q A A PATG GCA GAA GGA GGA GGG CAG AAT CAT CAC GAA GTG GTG AAGMet Ala Glu Gly Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val LysM A E G G G Q N H H E V V KTTC ATG GAT GTC TAT CAG CGC AGC TAC TGC CAT CCA ATC GAGPhe Met Asp Val Tyr Gln Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile GluF M D V Y Q A S Y C H P I E
ACC CTG GTG GAC ATC TTC CAG GAG TAC CCT GAT GAG ATC GAGThr Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu Tyr Pro Asp Glu Ile GluT L V D I F Q E Y P D E I ETAC ATC TTC AAG CCA TCC TGT GTG CCC CTG ATG CGA TGC GGGTyr Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys GlyY I F K P S C V P L M A C GGGC TGC TGC AAT GAC GAG GGC CTG GAG TGT GTG CCC ACT GAGGly Cys Cys Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro Ile GluG C C N D E G L E C V P I EGAG TCC AAC ATC ACC ATG CAG ATT ATG CGG ATC AAA CCT CACGlu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile Met Arg Ile Lys Pro HisE S N I T M Q I M A I K P HCAA GGC CAG CAC ATA GGA GAG ATG AGC TTC CTA CAG CAC AACGln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln His AsnQ G Q H I G E M S F L Q H NAAA TGT GAA TGC AGA CCA AAG AAA GAT AGA GCA AGA CAA GAALys Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gln GluK C E C A P K K D A A A Q EAAT CCC TGT GGG CCT TGC TCA GAG CGG AGA AAG CAT TTG TTTAsn Pro Cys Gly Pro Cys Ser Glu Arg Arg Lys His Leu PheN P C G P C S E A A K H L FGTA CAA GAT CCG CAG ACG TGT AAA TGT TCC TGC AAA AAC ACAVal Gln Asp Pro Gln Thr Cys Lys Cys Ser Cys Lys Asn ThrV Q D P Q T C K C S C K N TGAC TCG CGT TGC AAG GCG AGG CAG CTT GAG TTA AAC GAA CGTAsp Ser Arg Cys Lys Ala Arg Gln Leu Glu Leu Asn Glu ArgD S A C K A A Q L E L N E AACT TGC AGA TGT GAC AAG CCG AGG CGG GGA GGC GGT GGT TCTIle Cys Arg Cys Asp Lys Pro Arg Arg Gly Gly Gly Gly SerI C A C D K P A A G G G G SAGA CCC GCC TTG CCC GAG GAT GGC GGC AGC GGC GCC TTC CCGArg Pro Ala Leu Pro Glu Asp Gly Gly Ser Gly Ala Phe ProA P A L P E D G G S G A F PCCC GGC CAC TTC AAG GAC CCC AAG CGG CTG TAC TGC AAA AACPro Gly His Phe Lys Asp Pro Lys Arg Leu Tyr Cys Lys AsnP G H F K D P K A L Y C K NGGG GGC TTC TTC CTG CGC ATC CAC CCC GAC GGC CGA GTT GACGly Gly Phe Phe Leu Arg Ile His Pro Asp Gly Arg Val AspG G F F L A I H P D G A V DGGG GTC CGG GAG AAG AGC GAC CCT CAC ATC AAG CTA CAA CTTGly Val Arg Glu Lys Ser Asp Pro His Ile Lys Leu Gln LeuG V A E K S D P H I K L Q LCAA GCA GAA GAG AGA GGA GTT GTG TCT ATC AAA GGA GTG TGTGln Ala Glu Glu Arg Gly Val Val Ser Ile Lys Gly Val Cys
Q A E E A G V V S I K G V CGCT AAC CGT TAC CTG GCT ATG AAG GAA GAT GGA AGA TTA CTGAla Asn Arg Tyr Leu Ala Met Lys Glu Asp Gly Arg Leu LeuA N A Y L A M K E D G A L LGCT TCT AAA TGT GTT ACG GAT GAG TGT TTC TTT TTT GAA CGAAla Ser Lys Cys Val Thr Asp Glu Cys Phe Phe Phe Glu ArgA S K C V T D E C F F F E ATTG GAA TCT AAT AAC TAC AAT ACT TAC CGG TCA AGG AAA TACLeu Glu Ser Asn Asn Tyr Asn Ile Tyr Arg Ser Arg Lys TyrL E S N N Y N I Y A S A K YACC AGT TGG TAT GTG GCA CTG AAA CGA ACT GGG CAG TAT AAAThr Ser Trp Tyr Val Ala Leu Lys Arg Ile Gly Gln Tyr LysT S W Y V A L K A I G Q Y KCTT GGA TCC AAA ACA GGA CCT GGG CAG AAA GCT ATA CTT TTTLeu Gly Ser Lys Thr Gly Pro Gly Gln Lys Ala Ile Leu PheL G S K T G P G Q K A I L FCTT CCA ATG TCT GCT AAG AGC TGALeu Pro Met Ser Ala Lys SerL P M S A K S實施例2MTT法檢測重組蛋白刺激血管內皮細胞增殖活性1、臍靜脈血管內皮細胞(HUVEC)、細胞培養(yǎng)基Medium-200購自北京清源生物公司，HUVEC為本實驗室傳代保存。HUVEC細胞按1×104接種于12孔板，在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至50％-80％的單層。
2、采用脂質體轉染法，用GIBCOBRL公司的LipofectAMINETM Reagent將融合基因表達質粒pcDNA/V+b轉染HUVEC細胞，按GIBCOBRL公司提供的操作程序進行。
1)取大量提質粒pcDNA/V+b，15.4μl和pcDNA3.1(+)，11.9μl稀釋，稀釋過程中用無水乙醇沉淀DNA，再溶解DNA至終濃度0.1μg/μl。
2)配置轉染反應液(pcDNA/V+b1和pcDNA3.1(+)轉染量及條件相同)A液18μl質粒溶液+82μl Medium-200培養(yǎng)液(原液不含血清及雙抗)B液12μlLipofectAMINETM Reagent+88μl Medium-200培養(yǎng)液3)A液加入B液管中，充分混勻，室溫放置40分鐘。
4)PBS洗滌細胞一遍，洗滌細胞一遍。
5)A、B混合液加600μl Medium-200培養(yǎng)液(原液不含血清及雙抗)至總體積800μl，每個樣品4個孔，每個孔加200μl轉染液。剩余4個孔各加200μl Medium-200培養(yǎng)液(原液不含血清及雙抗)作空細胞對照。37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)4小時。
6)4小時后更換Medium-200完全培養(yǎng)基(含血清及雙抗)，繼續(xù)培養(yǎng)。
3、重組質粒pcDNA/V+b轉染HUVEC細胞，于37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)72小時后，PBS清洗24孔板中的細胞。每孔加MTT反應液500μl，37℃孵育4小時，加二甲基亞砜(DMSO)500μl使沉淀溶解，24孔板中的樣品每1孔取100μl，分別加入96孔酶標板中，每4個孔為1個重復，用酶標儀讀取A570的值。
4、統(tǒng)計學方法數(shù)據(jù)用均值±標準差表示，用SPSS10.0做t檢驗，α＝0.05為顯著性水平。
5、MTT檢測根據(jù)酶標儀讀取的各樣品組的A570值(表1)，計算促細胞生長活性，公式為促生長率(％)＝(實驗組-對照組)/對照組×100％，與pcDNA3.1(+)空質粒對照組相比，pcDNA/V+b轉染HUVEC細胞后，表達產(chǎn)物能夠刺激HUVEC細胞對MTT的攝取，促生長率為11.67％；用SPSS10.0做t檢驗，兩組比較p＜0.05，差異有顯著性，表明pcDNA/V+b組表達產(chǎn)物具有刺激HUVEC細胞增殖的生物學活性。
表1 rhVEGF/bFGF促HUVEC增殖作用(MTT法)A570值(X±S)

*P＜0.05實施例3雞胚絨毛尿囊膜血管生成實驗1、利用雞胚絨毛尿囊膜法檢測rhVEGF/bFGF在293細胞中表達產(chǎn)物的生物學活性，實驗方法參照文獻[9]進行。
2、9日齡的雞胚在氣室下方開0.5cm2的小洞露出尿囊膜，分別把沾有10μl293-hVEGF/bFGF細胞的培養(yǎng)上清、細胞裂解液樣品的無菌濾紙小圓片(直徑4mm)放于尿囊膜上，并以等量的生理鹽水，293-pcDNA3.1(+)細胞的培養(yǎng)上清、細胞裂解液樣品為對照。
3、用無菌透明膠封口，于37℃孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)3天，觀察雞胚血管生成情況。
4、實驗結果(圖8)顯示與生理鹽水組和pcDNA3.1(+)空質粒對照組相比，pcDNA/V+b組的細胞培養(yǎng)上清樣品和細胞裂解液樣品，均有促進雞胚絨毛尿囊膜血管生成的作用，pcDNA/V+b組的細胞培養(yǎng)上清樣品作用更明顯。表明重組融合蛋白rhVEGF/bFGF具有促血管生成的生物學活性。
通過以上實驗結果證明我們成功構建了重組人血管內皮細胞生長因子與堿性成纖維細胞生長因子融合基因真核表達載體，并對其進行了表達，得到重組融合蛋白rhVEGF/bFGF。生物學活性研究證實重組融合基因質粒的表達產(chǎn)物具有刺激HUVEC增殖和促血管生成的作用，是治療缺血性疾病的極具發(fā)展?jié)摿Φ囊蜃又弧?br> 參考文獻[1]Isner JM，Walsh K，Symes J，et al.Aterial gene therapy for the therapeutic angiogenesispatients with peripheral artery disease[J].Cirulalicm，1995，91(11)2687-2692. Ferrara N，Davis-Smyth T.The biology of vascul ar endothelial growth factor[J].EndocrRev，1997，18(1)4-25. Symes JF，Losordo DW，Vale PR，et al.Gene therapy with vascular endothelial growthfactor for inoperable coronary artery disease.Ann Thorac Surg[J].1999，68(3)830-836. Sarkar N，Ruck A，Kallner G，et al.Effects of intramyocardial injection of phVEGF-A165as sole therapy in patients with refractory coronary artery disease-12-month follow-upangiogenic gene therapy[J].J Intern Med，2001，250(5)373-381. Connolly DT，Heuvelman DM，Nelson R，et al.Tumor vascular permeability factorstimulates endothelial cell growth and angiogenesis.J Clin Invest，1989，841470[6]Gospodarowiez D.Fibroblast growth factorfrom gene to clinical application.Cell BiolRev，1991，25307[7]祁雅慧，王雅梅，孫麗翠等.血管內皮生長因子基因的克隆、表達及生物活性分析解剖學報2004，35(4)396[8]祁雅慧，王雅梅，孫麗翠等.人堿性成纖維細胞生長因子基因的克隆、表達及生物活性分析 中華中西醫(yī)雜志2004，5(13)1217[9]姜志鋼，鄂征.雞胚絨毛尿囊膜檢測腫瘤促血管生長作用改良技術方法[J].解剖學雜志，1989，12(2)143-145
序列表<110>首都醫(yī)科大學<120>重組人VEGF與bFGF真核表達載體、融合蛋白及其用途<130>CP1050020<160>6<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>34<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>1cgaagcttcc accatgaact ttctgctgtc ttgg 34<210>2<211>35<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>2gctctagaac caccgcctcc ccgcctcggc ttgtc 35<210>3<211>29<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物
<400>3cgtctagacc cgccttgccc gaggatggc29<210>4<211>29<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>4gcgaattctc agctcttagc agacattgg 29<210>5<211>1032<212>DNA<213>人工的<220>
<223>融合基因<400>5atgaactttc tgctgtcttg ggtgcattgg agccttgcct tgctgctcta cctccaccat 60gccaagtggt cccaggctgc acccatggca gaaggaggag ggcagaatca tcacgaagtg 120gtgaagttca tggatgtcta tcagcgcagc tactgccatc caatcgagac cctggtggac 180atcttccagg agtaccctga tgagatcgag tacatcttca agccatcctg tgtgcccctg 240atgcgatgcg ggggctgctg caatgacgag ggcctggagt gtgtgcccac tgaggagtcc 300aacatcacca tgcagattat gcggatcaaa cctcaccaag gccagcacat aggagagatg 360agcttcctac agcacaacaa atgtgaatgc agaccaaaga aagatagagc aagacaagaa 420aatccctgtg ggccttgctc agagcggaga aagcatttgt ttgtacaaga tccgcagacg 480tgtaaatgtt cctgcaaaaa cacagactcg cgttgcaagg cgaggcagct tgagttaaac 540gaacgtactt gcagatgtga caagccgagg cggggaggcg gtggttctag acccgccttg 600
cccgaggatg gcggcagcgg cgccttcccg cccggccact tcaaggaccc caagcggctg 660tactgcaaaa acgggggctt cttcctgcgc atccaccccg acggccgagt tgacggggtc 720cgggagaaga gcgaccctca catcaagcta caacttcaag cagaagagag aggagttgtg 780tctatcaaag gagtgtgtgc taaccgttac ctggctatga aggaagatgg aagattactg 840gcttctaaat gtgttacgga tgagtgtttc ttttttgaac gattggaatc taataactac 900aatacttacc ggtcaaggaa atacaccagt tggtatgtgg cactgaaacg aactgggcag 960tataaacttg gatccaaaac aggacctggg cagaaagcta tactttttct tccaatgtct 1020gctaagagct ga 1032<210>6<211>343<212>PRT<213>人工的<220>
<223>融合蛋白<400>6Met Asn Phe Leu Leu Ser Trp Val His Trp Ser Leu Ala Leu Leu Leu1 5 10 15Tyr Leu His His Ala Lys Trp Ser Gln Ala Ala Pro Met Ala Glu Gly20 25 30Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln35 40 45Ala Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu50 55 60
Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu65 70 75 80Met Ala Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro85 90 95Ile Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile Met Ala Ile Lys Pro His100 105 110Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys Cys115 120 125Glu Cys Ala Pro Lys Lys Asp Ala Ala Ala Gln Glu Asn Pro Cys Gly130 135 140Pro Cys Ser Glu Ala Ala Lys His Leu Phe Val Gln Asp Pro Gln Thr145 150 155 160Cys Lys Cys Ser Cys Lys Asn Thr Asp Ser Ala Cys Lys Ala Ala Gln165 170 175Leu Glu Leu Asn Glu Ala Ile Cys Ala Cys Asp Lys Pro Ala Ala Gly180 185 190Gly Gly Gly Ser Ala Pro Ala Leu Pro Glu Asp Gly Gly Ser Gly Ala195 200 205Phe Pro Pro Gly His Phe Lys Asp Pro Lys Ala Leu Tyr Cys Lys Asn210 215 220Gly Gly Phe Phe Leu Ala Ile His Pro Asp Gly Ala Val Asp Gly Val225 230 235 240
Ala Glu Lys Ser Asp Pro His Ile Lys Leu Gln Leu Gln Ala Glu Glu245 250 255Ala Gly Val Val Ser Ile Lys Gly Val Cys Ala Asn Ala Tyr Leu Ala260 265 270Met Lys Glu Asp Gly Ala Leu Leu Ala Ser Lys Cys Val Thr Asp Glu275 280 285Cys Phe Phe Phe Glu Ala Leu Glu Ser Asn Asn Tyr Asn Ile Tyr Ala290 295 300Ser Ala Lys Tyr Thr Ser Trp Tyr Val Ala Leu Lys Ala Ile Gly Gln305 310 315 320Tyr Lys Leu Gly Ser Lys Thr Gly Pro Gly Gln Lys Ala Ile Leu Phe325 330 335Leu Pro Met Ser Ala Lys Ser340
權利要求
1.重組真核表達載體，其中在真核表達載體中含有重組人血管內皮細胞生長因子基因與堿性成纖維細胞生長因子基因。
2.權利要求1的重組載體，其中人血管內皮生長因子基因與堿性成纖維細胞生長因子基因串聯(lián)插入載體內。
3.權利要求2的重組載體，其中所述真核表達載體為pcDNA3.1(+)。
4.權利要求3的重組載體，其為pcDNA/V+b。
5.一種融合蛋白，由人血管內皮生長因子基因與堿性成纖維細胞生長因子組成。
6.權利要求5的融合蛋白，具有SEQ ID NO6的氨基酸序列。
7.權利要求1-4之一的重組載體在制備預防或治療缺血性疾病的藥物中的用途。
8.權利要求5或6的重組蛋白在制備預防或治療缺血性疾病的藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及重組真核表達載體，其中在真核表達載體上插入了人血管內皮細胞生長因子(VEGF)與堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)基因。本發(fā)明還涉及融合蛋白，由人血管內皮生長因子基因與堿性成纖維細胞生長因子組成。所述重組載體和融合蛋白可以用來預防或者治療缺血性疾病。
文檔編號A61P9/10GK1654663SQ20051005116
公開日2005年8月17日 申請日期2005年3月2日 優(yōu)先權日2005年3月2日
發(fā)明者王雅梅, 祁雅慧, 邴國英 申請人:首都醫(yī)科大學