專利名稱：含有白蛋白多聚體的重組蛋白的制作方法
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及一種蛋白，這種蛋白含有一種血清白蛋白多聚體，是通過重組技術(shù)獲得的。更具體而言，本發(fā)明涉及一種蛋白，這種蛋白含有一種血清白蛋白多聚體，是通過重組技術(shù)獲得的，并且能當(dāng)給藥載體等使用，在預(yù)防病毒等感染風(fēng)險的同時能增強藥物的潴留屬性。
背景技術(shù)：
人血清白蛋白(HSA)是成年人血清中發(fā)現(xiàn)的主要蛋白，它產(chǎn)生于肝，并且在人體中起著轉(zhuǎn)運不同血清分子的載體功能。此外，白蛋白在保持血漿膠體滲透壓正常中起著重要的作用，這種滲透壓由溶質(zhì)(膠體)引起，這些膠體不能通過毛細血管上的小孔，從而能保持血液中的液體含量。因此，白蛋白已被施用于各種不同的外科治療，精神損害，燒傷，以及引起浮腫的血液蛋白不足，還伴隨著血管中液體的流失。
血清白蛋白是血漿中含量最豐富的蛋白，它的平均水平能達到48mg/ml(0.67mmol/L)。白蛋白含量豐富的原因有兩個。第一，白蛋白的富集使得肝細胞通過組織特異的機制加速白蛋白前體mRNA的轉(zhuǎn)錄。第二，白蛋白釋放到血液循環(huán)中后，其排除和代謝相對較慢。白蛋白在人體中的代謝半壽期大約是19天，而在兔子中是4.6-6.2天。
根據(jù)上述的說法，就能知道血液中潴留了大量的血清白蛋白。把血清白蛋白用作一種給藥載體能改善藥物在血液中的潴留。
同時，含有來自血液的白蛋白的藥用制劑會被未知病毒污染。因此，對人體等施用這種藥用制劑會產(chǎn)生安全問題。然而，現(xiàn)已提出通過重組技術(shù)利用轉(zhuǎn)化微生物來生產(chǎn)血清白蛋白的方法(參看JP S58-56684A和JP H05-292993A)，因此能獲得安全的血清白蛋白制劑。
白蛋白是一種單鏈蛋白，由585個氨基酸組成，包括3個同源結(jié)構(gòu)域。已知當(dāng)天然白蛋白的三個結(jié)構(gòu)域被切割成一或兩個結(jié)構(gòu)域時，白蛋白會加速從腎臟中分泌出來。相反，當(dāng)給兔子施用含六個結(jié)構(gòu)域的血清白蛋白二聚體時，能加速血漿中天然白蛋白的消失，這也是已知的(參看McCurdy TR等人，Journal of Clinical Medicine(臨床醫(yī)學(xué)雜志)，143(2)，115-124，2004年2月)。
發(fā)明概述本發(fā)明的目的是提供一種安全的給藥載體，它和常規(guī)的給藥載體相比，不必擔(dān)心病毒污染，而且能延長藥物在血液中的半壽期。
為了解決上述問題，本發(fā)明的發(fā)明者通過重組技術(shù)建立了一種表達蛋白的系統(tǒng)，這種蛋白含有多聚血清白蛋白，而且發(fā)現(xiàn)，這種含有多聚血清白蛋白的蛋白在血液中潴留的時間比單體血清白蛋白要長，因此，完成了本發(fā)明。
換句話說，本發(fā)明涉及(1)一種含有多聚白蛋白的蛋白，其是通過重組技術(shù)產(chǎn)生的；(2)根據(jù)上述(1)條所述的蛋白，其中血清白蛋白的氨基酸序列和人血清白蛋白的氨基酸序列一樣；(3)含有根據(jù)上述(1)條所述的蛋白的藥用制劑；(4)DNA片段，含有至少兩段編碼血清白蛋白的DNA序列；(5)上述(4)條所述的DNA片段，在編碼血清白蛋白的DNA序列之間進一步含有至少一個酶切位點；(6)含有根據(jù)上述(4)條所述的DNA片段的重組載體；(7)用根據(jù)上述(6)條所述的重組載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞；(8)根據(jù)上述(1)條所述，產(chǎn)生蛋白的方法的特征包括將包括至少兩條血清白蛋白編碼序列的DNA整合到載體中，將該載體轉(zhuǎn)化宿主細胞，培養(yǎng)獲得的轉(zhuǎn)化子來生產(chǎn)蛋白，并收集產(chǎn)生的蛋白，而且，(9)根據(jù)上述第(4)條的DNA片段的生產(chǎn)方法，包括將DNA片段導(dǎo)入具有高增殖能力的宿主細胞中，在該DNA片段中，限制性酶切位點插入編碼血清白蛋白的多個DNA序列之間；培養(yǎng)獲得的轉(zhuǎn)化子，從增殖的細胞中提取DNA；并用特異的限制性酶切割DNA。
本發(fā)明的蛋白在體內(nèi)的半壽期延長，這歸因于其在血液中的消除速率降低，因此，當(dāng)這種蛋白被用作給藥載體時，能延長藥物在血液中的潴留時間。此外，由于利用重組技術(shù)產(chǎn)生蛋白，不存在諸如未知病毒污染等風(fēng)險，這是血液制劑的固有問題。因此，這種蛋白能安全的用于人體等。除此之外，該蛋白由人體內(nèi)在的成份組成。即便這種蛋白施用給人體，它對人體的影響，如副作用也是很小的。
附圖簡述

圖1是解釋圖，列舉的是實施例1中人血清白蛋白二聚體產(chǎn)生的一般過程。
圖2是pKF18K-HSA的示意圖。
圖3是實施例1中的DNA片段W-1的示意圖。
圖4是實施例2中的DNA片段W-2的示意圖。
圖5是測試實施例1中施用本發(fā)明蛋白所用的時間，以及給定劑量的殘余率。
圖6是實施例2中pPIC9K-HSA二聚體的示意圖。
圖7的分解圖表示實施例2中畢赤酵母基因組的重組過程，其中含有HSA二聚體cDNA。
圖8示出有義和反義引物，用于擴增實施例2中的部分pPIC9K，HSA cDNA-1和HSA cDNA-2。
在本發(fā)明中，多聚血清白蛋白是一種蛋白，在這種蛋白中，多個血清白蛋白直接或間接偶聯(lián)在一起。多聚血清白蛋白偶爾也叫做血清白蛋白多聚體或融合蛋白。血清白蛋白一般是人血清白蛋白。血清白蛋白包括的單鏈蛋白，由585個氨基酸組成，包括三個同源結(jié)構(gòu)域，該蛋白的片段和修飾蛋白或其片段。可以利用重組技術(shù)來生產(chǎn)血清白蛋白多聚體。多聚體包括二聚體或三聚體。
在本發(fā)明中，編碼血清白蛋白的DNA序列能在一種系統(tǒng)中生成血清白蛋白，該系統(tǒng)能使含有該DNA序列的基因表達。該DNA序列不僅限于生成完全血清白蛋白的DNA序列，也包括能生成血清白蛋白部分多肽的DNA序列。然而，優(yōu)選的DNA是編碼完全血清白蛋白的DNA序列。此外，優(yōu)選的編碼血清白蛋白多聚體的DNA序列不含任何內(nèi)含子，所述內(nèi)含子介于編碼血清白蛋白的cDNA序列之間，和編碼全部或部分血清白蛋白的mRNA同源。
在含有至少兩個編碼血清白蛋白的DNA序列的DNA片段中，上述DNA序列在整個DNA片段中是重復(fù)出現(xiàn)的。DNA片段中的多個DNA序列可以是相同的，或彼此互不相同。DNA片段指的是分離的片段。
此外，在兩段編碼血清白蛋白的DNA序列之間優(yōu)選插入的是含有至少一個限制性酶切位點的DNA片段。含有至少一個限制性酶切位點的DNA片段和編碼血清白蛋白多聚體的DNA序列與載體連接，并將該重組載體整合到具有很好增殖能力的宿主細胞，如大腸桿菌中，從而轉(zhuǎn)化該宿主細胞，然后培養(yǎng)轉(zhuǎn)化子。隨后，從增殖的轉(zhuǎn)化子中提取DNA(質(zhì)粒)，然后用限制性內(nèi)切酶*1切割，緊接著純化DNA片段。結(jié)果，能有效地獲得大量拷貝的編碼白蛋白多聚體的DNA序列。此外，這些拷貝的DNA事實上用于制備重組載體，并整合到宿主細胞中，用來有效生產(chǎn)含有血清白蛋白多聚體的蛋白。
*1該限制性酶和用來連接白蛋白單體的限制性酶不同。
可以用任何一種已知的方法將上述DNA片段整合到載體中。例如，有這么一種方法，它包括在多種多樣的限制性酶處理的DNA片段和載體的混合溶液中加入連接酶，從而將DNA片段和載體連接起來。這種載體可以是重組技術(shù)中使用的任何載體，但通常使用的是質(zhì)粒載體。
隨后，將上述重組載體導(dǎo)入宿主細胞獲得重組子。將重組載體導(dǎo)入宿主細胞的方法可以是本領(lǐng)域使用的任何常規(guī)方法，包括感受態(tài)細胞方法，原生質(zhì)體方法，磷酸鈣共沉淀方法，電穿孔方法，微注射方法，脂質(zhì)體融合方法，以及基因槍方法。使用哪種方法取決于使用的宿主。
宿主細胞優(yōu)選真核細胞。真核細胞的例子包括巴斯德畢赤酵母(Phichia pastoris)，釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和粟酒裂殖酵母(Shizo Saccharomyces pombe)。優(yōu)選的是巴斯德畢赤酵母。
培養(yǎng)這樣獲得的轉(zhuǎn)化子，然后，在培養(yǎng)物中生產(chǎn)含有血清白蛋白多聚體的融合蛋白。用一種已知的方法分離蛋白，并任選純化以獲得本發(fā)明的蛋白。
培養(yǎng)轉(zhuǎn)化子的培養(yǎng)基是一種已知的培養(yǎng)基，包括諸如YPD培養(yǎng)基的營養(yǎng)培養(yǎng)基，諸如MB培養(yǎng)基的基本培養(yǎng)基，BMMY培養(yǎng)基和BMGY培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)化子一般在16-46℃，優(yōu)選的是25-37℃，培養(yǎng)8-168小時，優(yōu)選的是24-120小時。轉(zhuǎn)化子可以振蕩或靜止培養(yǎng)，或者，如果需要的話，可以攪動和通風(fēng)培養(yǎng)。
分離和純化培養(yǎng)物中生產(chǎn)的融合蛋白的已知方法的例子包括利用溶解性差異的方法，如鹽析或溶劑沉淀法；利用分子量差異的方法，如透析，超濾，或凝膠電泳；利用電荷差異的方法，如離子交換層析，利用特異親和性的方法，如親和層析；利用疏水性差異的方法，如反相高效液相色譜；以及利用等電點差異的方法，如等電點聚焦。
對分離和純化的融合蛋白進行鑒定的已知方法的例子包括Western印跡方法和活性檢測方法。此外，純化的融合蛋白可以進行氨基酸分析，氨基末端分析，一級結(jié)構(gòu)分析等來闡明它的結(jié)構(gòu)。
實施例1圖1表示的是實施例1的大致過程(人血清白蛋白基因的擴增)把人血清白蛋白基因整合到質(zhì)粒pKF18K(下文稱作pKF18K-HSA，購自TonenGeneral Sekiyu K.K)(參看圖2)中，獲得的質(zhì)粒作為模板。以SEQ.ID.NO.1的W-1有義引物，SEQ.ID.NO.2的W-1反義引物，SEQ.ID.NO.3的W-2有義引物，SEQ.ID.NO.4的W-2反義引物(如圖8所示)為合成引物，和DNA聚合酶(KOD+DNA聚合酶，購自Toyobo公司)進行PCR。PCR的反應(yīng)條件是在94℃處理DNA(質(zhì)粒)2分鐘，進行連續(xù)的變性(94℃，15秒)，退火(63℃，30秒)以及延伸(68℃，2分鐘)反應(yīng)，30個循環(huán)，然后在68℃處理5分鐘。通過PCR擴增加上了DNA序列的DNA片段，而這些編碼人血清白蛋白的DNA序列的3’和5’端具有限制性酶切位點。因此，通過SEQ.ID.NO.1的有義引物和SEQ.ID.NO.2的反義引物(下文稱W-1，參看SEQ ID NO.5和圖3)擴增的DNA片段和通過SEQ.ID.NO.3的有義引物和SEQ.ID.NO.4的反義引物(下文稱W-2，參看SEQ ID NO.6和圖4)擴增的DNA片段就獲得了。
人血清白蛋白基因的連接PCR擴增的DNA片段W-1通過酚抽提和乙醇沉淀而純化后，用限制性酶AvaI(購自Takara Shuzo公司)進行切割。另一方面，用酚抽提和乙醇沉淀純化后，用限制性酶AvaI(購自Takara Shuzo公司)對DNA片段W-2進行切割。隨后，再次對W-2進行酚抽提和乙醇沉淀而純化，接著用限制性酶EcoRI(購自Takara Shuzo公司)進行切割。DNA片段W-1和W-2，以及質(zhì)粒pPIC9被限制酶處理后進行瓊脂糖凝膠電泳。然后，將對應(yīng)各個DNA片段的條帶切割下來，并用凝膠抽提試劑盒(QIAquick凝膠抽提試劑盒，由QIAGEN制造)進行凝膠抽提。凝膠抽提后，將DNA片段W-1，W-2和質(zhì)粒pPIC9混合在一起，利用DNA連接試劑盒(DNA連接試劑盒ver.1，由Takara Shuzo公司制造)在16℃連接4小時，制備重組質(zhì)粒(下文稱pBIC9-W2)，在這個重組質(zhì)粒中，編碼血清白蛋白二聚體的DNA(下文稱W2)和質(zhì)粒pPIC9連接在一起。
這樣獲得的pBIC9-W2被導(dǎo)入大腸桿菌JM109中進行轉(zhuǎn)化。在補充了氨芐青霉素的培養(yǎng)基上篩選導(dǎo)入了目的質(zhì)粒pBIC9-W2的轉(zhuǎn)化子，然后利用質(zhì)粒純化試劑盒(QIAprep Spin Miniprep試劑盒，由QIAGEN制造)純化質(zhì)粒。用限制性酶XhoI和EcoRI(購自Takara Shuzo公司)對質(zhì)粒進行雙酶切，然后用限制性酶XhoI，AvaI和EcoRI(購自Takara Shuzo公司)對質(zhì)粒進行三酶切，以制備限制性酶切圖譜，證明該質(zhì)粒是目的質(zhì)粒載體。
驗證和培養(yǎng)其中導(dǎo)入了目的質(zhì)粒的大腸桿菌。然后，利用質(zhì)粒純化試劑盒(QIAGEN質(zhì)粒Maxi試劑盒，由QIAGEN制造)從增殖的細菌細胞中提取和純化質(zhì)粒(pPIC9-W2)。用限制性酶BamHI和EcoRI(購自Takara Shuzo公司)對質(zhì)粒進行雙酶切。酚抽提和乙醇沉淀進行純化后，進行瓊脂糖凝膠電泳，將對應(yīng)W2的條帶(3.5kb)切下來，接著用凝膠抽提試劑盒(QIAquick凝膠抽提試劑盒，由QIAGEN制造)進行凝膠抽提。
人血清白蛋白基因的擴增隨后，用同樣的的方式將DNA片段W2整合到質(zhì)粒pPIC9K中。用兩種限制性酶BamHI和EcoRI(購自Takara Shuzo公司)切割pPIC9K，然后通過酚抽提和乙醇沉淀進行純化，接著進行瓊脂糖凝膠電泳，并用凝膠抽提試劑盒(QIAquick凝膠抽提試劑盒，由QIAGEN制造)進行抽提。DNA片段W2和質(zhì)粒pPIC9K混合在一起，利用DNA連接試劑盒(DNA連接試劑盒ver.1，由Takara Shuzo公司制造)在16℃連接4小時，制備重組質(zhì)粒(下文稱pBIC9k-W2)，在這個重組質(zhì)粒中，DNA片段W2和質(zhì)粒pPIC9K連接在一起。
質(zhì)粒pPIC9K-W2被導(dǎo)入大腸桿菌JM109中進行轉(zhuǎn)化。在補充了卡那霉素的培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)化子，然后利用質(zhì)粒純化試劑盒(QIAprepSpin Miniprep試劑盒，由QIAGEN制造)抽提和純化質(zhì)粒，接著證實質(zhì)粒pBIC9k-W2的導(dǎo)入。驗證導(dǎo)入了質(zhì)粒pPIC9K-W2的轉(zhuǎn)化子，并進一步培養(yǎng)。用同樣的方法從增殖的細菌細胞中抽提和純化質(zhì)粒。然后用限制性酶XhoI和EcoRI(購自Takara Shuzo公司)對質(zhì)粒進行雙酶切，然后用限制性酶XhoI，AvaI和EcoRI(購自Takara Shuzo公司)對質(zhì)粒進行三酶切，制備限制性酶切圖譜。同時，用DNA測序儀(ABIPrism 310 Genetic Analyzer，由Perkin-Elmer Applied Biosystems制造)鑒定DNA序列，來驗證目的DNA片段W2的擴增。
人血清白蛋白二聚體的表達用限制性酶SalI切割質(zhì)粒pPIC9K-W2，并通過酚抽提和乙醇沉淀進行純化，接著利用電穿孔系統(tǒng)(Gene Pulser II電穿孔系統(tǒng)，由Bio-Rad實驗室公司制造)，以電穿孔的方法將質(zhì)粒pPIC9K-W2導(dǎo)入巴斯德畢赤酵母GS115中，而實現(xiàn)轉(zhuǎn)化。篩選產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化子，只有陽性克隆表示出G418抗性，并被培養(yǎng)在BMMY液體培養(yǎng)基中。然后，驗證血清白蛋白的表達，并把轉(zhuǎn)化子保存在甘油中。
人血清白蛋白二聚體的純化轉(zhuǎn)化的巴斯德畢赤酵母GS115在BMGY液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時，然后在BMMY培養(yǎng)基中培養(yǎng)96小時，其間每隔12小時加入1％的甲醇。離心(6000g×10分鐘)分離酵母細胞，通過0.22μm濾膜過濾培養(yǎng)上清液，然后用Blie親和CL-6B柱純化。
測試實施例1
以和實施例1同樣的方式制備人血清白蛋白二聚體，用放射性銦同位素(111In)標記，制備111In重組人血清白蛋白二聚體。通過尾靜脈，將111In重組人血清白蛋白二聚體靜脈施用給三只實驗小鼠。給藥后，每隔恒定的時間取血樣，并利用輻射劑量儀檢測血液中白蛋白的水平。作為對照，用111In標記人血清白蛋白(單體)，制備111In人血清白蛋白，將其施用給小鼠，然后用同樣的方法檢測。圖5表示的是給藥后的時間以及給定劑量的殘余率。
圖5所示的結(jié)果很明顯，人血清白蛋白二聚體在血液中停留的時間比單體要長。前者的半壽期大約是后者的5倍。
本發(fā)明的白蛋白是通過基因工程制造的蛋白，它衍生自天然蛋白，并不可能被病毒等所污染，因此，它可用作一種無毒的藥物載體。本發(fā)明的白蛋白分子中結(jié)合了大量的藥物，因此它可用作給藥載體，這種載體能結(jié)合高分子量的藥物等。
實施例2pPIC9K中限制性位點BamHI和XhoI之間DNA序列的擴增以和實施例1相同的方式，利用圖8所示的有義和反義引物(SEQID.7和8)，質(zhì)粒pPIC9K為模板進行PCR。通過乙醇沉淀純化擴增的pPIC9K，用BamHI和XhoI(Takara Shuzo)對其進行雙酶切，將酶切的片段進行電泳，然后將對應(yīng)BamHI和XhoI之間的DNA序列的凝膠條帶切下來。利用凝膠抽提試劑盒(QIAquick凝膠抽提試劑盒，QIAGEN)從凝膠條帶中獲得抽提的DNA片段(2)。
人白蛋白基因的連接和擴增以和實施例1相同的方式，將DNA片段W-1(HSA cDNA-1，(3)，圖6)和W-2(HSA cDNA-2，(4)，圖6)從pKF18K-HSA中凝膠抽提出來。DNA片段W-1和W-2的有義和反義引物(對應(yīng)SEQ.ID.No.1-4)如圖8所示。利用DNA連接試劑盒(DNA連接試劑盒Ver.1，TakaraShuzo)，在16℃反應(yīng)4小時，將DNA片段(2)，W-1(3)和W-2(4)，以及質(zhì)粒，pPIK9連接成質(zhì)粒pPIC9K-HSA二聚體(圖6)，在這個質(zhì)粒中，DNA片段W-1(3)和W-2(4)與質(zhì)粒pPIC9K結(jié)合在一起。
將質(zhì)粒pPIC9K-HSA二聚體轉(zhuǎn)化到宿主細胞大腸桿菌JM109中。在含有卡那霉素的培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)化子，然后用質(zhì)粒純化試劑盒(QIAprep Spin Miniprep試劑盒，QIAGEN)提取和純化質(zhì)粒，接著驗證這些質(zhì)粒中包含了質(zhì)粒pPIC9K-HSA二聚體。進一步培養(yǎng)含有質(zhì)粒pPIC9K-HSA二聚體的轉(zhuǎn)化子，從增殖的細菌中提取和純化質(zhì)粒，并用限制性酶XhoI和EcoRI(Takara Shuzo)對其進行雙酶切，隨后用XhoI，AvaI和EcoRI(Takara Shuzo)進行三酶切。做成限制性圖譜，同時用DNA測序儀(ABI Prism 310 Genetic Analyzer，Perkin-ElmerApplied Biosystem)驗證其中的目的DNA片段是否擴增。
隨后通過重組的方法將質(zhì)粒pPIC9K-HSA二聚體導(dǎo)入畢赤酵母GS115基因組中(his 4)(參看圖7)。在畢赤酵母GS115中表達人血清白蛋白二聚體，并以和實施例1相同的方式從中分離和純化。
序列表<110>尼普洛株式會社(NIPRO CORPORATION)<120>含有白蛋白多聚體的重組蛋白(RECOMBINANT PROTEIN CONTAINING ALBUMIN MULTIMER)<130>SPI050800-47<160>8<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>41<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>1ggtaccctcg agaaaagaga tgcacacaag agtgaggttg c 41<210>2<211>47<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>2cagctgcccg agccaccacc acctaagcct aaggcagctt gacttgc47<210>3<211>48<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)
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1.一種包含人血清白蛋白多聚體的蛋白，其是通過重組技術(shù)制備的。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白，其中多個血清白蛋白直接或間接偶聯(lián)在一起。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白，其中血清白蛋白包含具有由585個氨基酸組成的單鏈結(jié)構(gòu)和三個同源結(jié)構(gòu)域的蛋白，蛋白的片段和修飾蛋白或其片段。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白，其中血清白蛋白包括具有由585個氨基酸組成的單鏈結(jié)構(gòu)和三個同源結(jié)構(gòu)域的蛋白。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白，其中的多聚體包括二聚體或三聚體。
6.一種藥用制劑，包括根據(jù)權(quán)利要求1所述的包含血清白蛋白多聚體的蛋白。
7.DNA片段，包括至少兩段編碼血清白蛋白的DNA序列。
8.權(quán)利要求7所述的DNA片段，在編碼血清白蛋白的DNA序列之間進一步包括至少一個限制性酶切位點。
9.重組載體，包括根據(jù)權(quán)利要求7所述的DNA片段。
10.宿主細胞，轉(zhuǎn)化有根據(jù)權(quán)利要求9所述的重組載體。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白的生產(chǎn)方法，其包括將含有至少兩個編碼血清白蛋白的DNA序列的DNA片段插入載體；用該載體轉(zhuǎn)化宿主細胞；培養(yǎng)獲得的轉(zhuǎn)化子，以生產(chǎn)蛋白；并收集生產(chǎn)的蛋白。
12.根據(jù)權(quán)利要求7所述的DNA片段的生產(chǎn)方法，其包括將DNA片段導(dǎo)入增殖能力強的宿主細胞，在該DNA片段中，限制性酶切位點插在兩段編碼血清白蛋白的DNA序列之間；培養(yǎng)獲得的轉(zhuǎn)化子；從增殖的細胞中抽提DNA；用具有不同限制性位點的限制性酶切割DNA，該限制性位點介于兩段編碼血清白蛋白的DNA序列之間。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種含有血清白蛋白多聚體的重組蛋白，在這個重組蛋白中，至少有兩個血清白蛋白編碼基因通過基因重組技術(shù)連接在一起，并且使它們在宿主細胞中生產(chǎn)。本發(fā)明還提供了人血清白蛋白多聚體的編碼基因和重組載體。這種蛋白能用作安全的給藥載體，和常規(guī)的給藥載體相比，這種載體能延長藥物在血液中的半壽期，而不會有病毒污染等的危險。
文檔編號A61K38/00GK1680443SQ200510051798
公開日2005年10月12日 申請日期2005年3月3日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月3日
發(fā)明者小田切優(yōu)樹, 木田善規(guī), 片山直久, 甲斐俊哉 申請人:尼普洛株式會社