專利名稱：含脂質(zhì)體的癌癥治療用藥物組合物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及含抗腫瘤活性物質(zhì)的脂質(zhì)體制劑，其抗腫瘤活性物質(zhì)表現(xiàn)出優(yōu)良的腫瘤細胞滯留性和血液中的滯留性。
背景技術：
脂質(zhì)體是由雙重脂膜形成的脂類囊，其作為各種藥物的載體主要圍繞注射劑進行研究。
但是，已知道的是脂質(zhì)體是由生物體適應性脂類構成的，由于受免疫系統(tǒng)的異物識別，被攝入以肝臟和脾臟等為代表的細網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)中，迅速在血液中消失。因此給藥后的藥物作用不能持久成為最大的缺陷。
為了解決這種缺陷，已報道了在脂質(zhì)體表面上進行糖蛋白和糖脂類化學修飾的方法、使其與葡糖醛酸衍生物結合的方法等，但是還不能實現(xiàn)制劑化。對此，到了二十世紀90年代，廣泛地進行著這樣的研究通過對脂質(zhì)體表面上用親水性聚乙二醇進行化學修飾，使受免疫系統(tǒng)的異物識別減弱，提高了脂質(zhì)體在血液中的滯留性，從而使藥物作用能夠持久。
現(xiàn)已開發(fā)了應用這種技術的脂質(zhì)體制劑，抗真菌藥兩性霉素B、抗癌藥阿霉素、柔紅霉素、造影劑銦等作為脂質(zhì)體制劑在市場上有售(非專利文獻1)。最近，對順鉑、長春新堿、喜樹堿等抗癌藥也在進行廣泛的應用研究(非專利文獻2)，作為遺傳基因治療時的遺傳基因載體的應用也正在研究中。
鹽酸阿霉素作為抗腫瘤活性物質(zhì)現(xiàn)在正被廣泛地應用。已知該物質(zhì)靜脈內(nèi)給藥后，通過膽汁排泄迅速地從血液中消失，顯示出以心臟蓄積為代表的嚴重副作用。因此，給藥該藥物時，必須頻繁地進行臨床檢查(血液檢查，肝功能·腎功能檢查、心功能檢查)等，以充分觀察患者的狀態(tài)。
到目前為止，為了提高鹽酸阿霉素在血液中的滯留性和避免在心臟中蓄積的目的，將該物質(zhì)封閉在連接聚乙二醇鏈的脂質(zhì)體中所形成的制劑已經(jīng)上市(參見非專利文獻3)。
此外，脂質(zhì)體表面修飾以使藥物靶向于癌細胞和肝臟實質(zhì)細胞為目的的研究也在熱烈地進行，已經(jīng)報道了使其與抗體和轉(zhuǎn)鐵蛋白結合來識別癌細胞的方法、與各種糖鏈結合使其被攝入到肝臟實質(zhì)細胞中的方法等。在這些化學修飾中，已報道了使用白蛋白作為間隔基團(非專利文獻4)。
本發(fā)明者們發(fā)現(xiàn)封入了各種生理活性物質(zhì)、并與白蛋白結合的脂質(zhì)體，其在血液中滯留性顯著提高(WO2004-45583A)。
但是，還沒有有關含有抗腫瘤活性物質(zhì)并與白蛋白結合的脂質(zhì)體制劑的研究報道，并且，也沒有使抗腫瘤活性物質(zhì)被攝入到癌細胞中的研究報道。
非專利文獻1Troy O.Harasym，Marcel B.Bally，Paul Tardi，“Clearance properties of liposomes involving conjugated proteinsfor targeting”，Advanced Drug Delivery Reviews，1998，vol.32，p.99-118.
非專利文獻2Naoto Oku，Yoshihiro Tokudome，TomohiroAsai and Hideo Tsukada，“Evaluation of Drug Targeting Strategiesand Liposomal Trafficking”，Current Pharmaceutical Design，2000，vol.6，p.1669-1691.
非專利文獻3Alberto Gabizon，Hilary Shmeeda andYechezkel Barenholz，“Pharmacokinetics of Pegylated LiposomalDoxorubicin”，Clinical.Pharmacokinetics，2003，42(5)，p.419-436.
非專利文獻4小島周二，曾川祐介，田尻芳香、山嵜登、“シアル酸修飾による糖蛋白質(zhì)結合リポソ一ムの細網(wǎng)內(nèi)皮系(RES)への取り込み抑制と促進に関する検討”，Drug DeliverySystem.2002，vol.17-1，p.63-68.

發(fā)明內(nèi)容
迄今使用脂質(zhì)體作為藥物載體的抗腫瘤制劑在血液中的滯留性和腫瘤細胞中的滯留性還不夠好，還發(fā)現(xiàn)嚴重的副作用。
為此需要開發(fā)抗腫瘤活性物質(zhì)的腫瘤細胞滯留性有所提高、且基本上無副作用的脂質(zhì)體制劑。
本發(fā)明者們對脂質(zhì)體制劑進行了深入的研究，發(fā)現(xiàn)如果使封入了鹽酸阿霉素(阿霉素的鹽酸鹽)的脂質(zhì)體表面上同時結合聚乙二醇(以下，也簡稱為PEG)鏈和白蛋白，不僅脂質(zhì)體和內(nèi)封的阿霉素鹽酸鹽血液中的滯留性協(xié)同效應地提高，而且被大量地攝入到癌細胞中，進而這種脂質(zhì)體制劑能夠抑制阿霉素在心臟中的蓄積，同時高濃度地遷移至癌細胞中，從而發(fā)揮心毒性的降低和優(yōu)良的治療效果。本發(fā)明者們基于這種認識，進行了各種研究，結果完成了本發(fā)明。
也就是說，本發(fā)明涉及(1)一種用于治療癌癥的藥物組合物(以下，也會稱之為本發(fā)明脂質(zhì)體制劑)，其特征在于包括含有抗腫瘤活性物質(zhì)的、與聚二醇類和白蛋白結合的脂質(zhì)體，能夠被大量攝入到癌細胞中；(2)上述(1)所述的藥物組合物，其中抗腫瘤活性物質(zhì)為抗腫瘤抗生素；(3)上述(2)所述的藥物組合物，其中抗腫瘤抗生素為蒽環(huán)霉素類抗生素抗腫瘤藥；(4)上述(3)所述的藥物組合物，其中蒽環(huán)霉素類抗生素抗腫瘤藥為阿霉素或其鹽酸鹽；(5)上述(1)所述的藥物組合物，其中白蛋白為遺傳基因重組型人血清白蛋白；(6)上述(1)所述的藥物組合物，其中白蛋白的含量相對于構成脂質(zhì)體的總脂類量約為0.0001～10摩爾％；(7)上述(1)所述的藥物組合物，其中脂質(zhì)體的體積平均粒徑為約10～5,000nm；(8)上述(1)所述的藥物組合物，其中聚二醇類的分子量約為200～4,000,000；(9)上述(1)所述的藥物組合物，其中聚二醇類為聚乙二醇；(10)上述(1)所述的藥物組合物，其為注射劑；(11)一種癌癥的治療方法，其特征在于將上述(1)所述的藥物組合物給藥；(12)上述(11)所述的藥物組合物，其非經(jīng)口服給藥。


圖1為給予實施例1的脂質(zhì)體后，比較血液中阿霉素鹽酸鹽量的曲線示意圖。
圖2為給予實施例1的脂質(zhì)體后，比較癌細胞中阿霉素鹽酸鹽量的曲線示意圖。
圖3為實施例1的脂質(zhì)體藥物制劑的制備工序的模式圖。使DOPE與SPDP結合，制備DTP-DOPE，用此DTP-DOPE和PEG結合DSPE作為構成脂類制備模式圖(A)(圖中，R’表示油?；?表示的脂質(zhì)體。在模式圖(A)中，僅僅DTP-DOPE顯示了化學式。在脂質(zhì)體(A)中培育阿霉素鹽酸鹽(以下簡稱DXR)，制造含DTP-DOPE的PEG修飾的封入DXR的脂質(zhì)體。接著，使該脂質(zhì)體(A)與模式圖(B)表示的3-巰基丙酰基-rHSA反應，制備模式圖(C)(圖中，R表示硬脂?；?表示的rHSA·PEG修飾的封入DXR的脂質(zhì)體。在模式圖(C)中，DTP-DOPE與rHSA的鍵中，雖然僅1個鍵用化學式進行具體地表示，其它鍵也相同。此外，對DSPE與PEG的鍵，雖然也只有1個鍵用化學式進行具體地表示，但其它鍵也相同。
具體實施例方式
本發(fā)明的脂質(zhì)體制劑與已知的僅結合聚乙二醇鏈的封入抗腫瘤活性物質(zhì)的脂質(zhì)體相比，不僅抗腫瘤活性物質(zhì)在血液中的滯留性顯著地提高，且大量地遷移至癌細胞中。這樣擴大了治療窗口，不僅減輕了副作用如阿霉素的心臟蓄積所致的心毒性，還可以減少抗腫瘤活性物質(zhì)的給藥量，且能夠獲得長久持續(xù)的藥理作用。
通常，所謂“脂質(zhì)體”，是指由膜狀聚集的脂類和內(nèi)部水相構成的封閉小胞(參見D.D.Lasic，“Liposomesfrom basic toapplications”，Elsevier Science Publishers，pp.1-171(1993))，但在本發(fā)明中，與是否含有內(nèi)部水相沒有特別的關系，脂類是指聚集的全部微粒。此外，對本發(fā)明脂質(zhì)體的結構也沒有特別的限制，可以是多層脂質(zhì)體，也可以是單層膜脂質(zhì)體。
對本發(fā)明脂質(zhì)體制劑中脂質(zhì)體的大小沒有特別的限制，體積平均粒徑為約10～5,000nm，優(yōu)選為約50～500nm。脂質(zhì)體的體積平均粒徑可以根據(jù)動態(tài)光散射法等原理求出(參見D.D.Lasic，“Liposomesfrom basic to applications”，Elsevier SciencePublishers，pp.1-171(1993))。
對本發(fā)明脂質(zhì)體制劑中的構成脂質(zhì)體的脂類也沒有特別的限制，可以使用已知的脂類。作為上述脂類，可以列舉例如磷脂類、糖脂類、脂肪酸、 兩親性二烷基二甲基銨(dialkyl dimethylammnoniumamphiphiles)、聚甘油烷基醚、聚環(huán)氧乙烷烷基醚等(LiposomeTechnology，2nd edition，vol.1，141，1993)、烷基糖甙、烷基甲基葡糖酰胺(アルキルメチルグルカミド)、烷基蔗糖酯、二烷基聚環(huán)氧乙烷醚、二烷基聚甘油醚等(Liposome Technology，2nd e dition，vol.1，141，1993)、聚環(huán)氧乙烷-聚乳酸等兩親性嵌段共聚物等(專利表平6-508831號公報)，長鏈烷基胺類(十四烷胺、十六烷胺、十八烷胺等)、或者長鏈脂肪酸酰肼類(肉豆蔻酸酰肼、軟脂酸酰肼、硬脂酸酰肼等)等。
作為上述磷脂類，可以列舉天然或者合成磷脂類，例如磷脂酰膽堿(大豆磷脂酰膽堿、蛋黃磷脂酰膽堿、二月桂酰磷脂酰膽堿、二肉豆寇酰磷脂酰膽堿、二棕櫚酰磷脂酰膽堿或二硬脂酰磷脂酰膽堿等)、磷脂酰乙醇胺(二油酰磷脂酰乙醇胺、二月桂酰磷脂酰乙醇胺、二肉豆寇酰磷脂酰乙醇胺、二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺或二硬脂酰磷脂酰乙醇胺等)、磷脂酰絲氨酸(二月桂酰磷脂酰絲氨酸、二肉豆寇酰磷脂酰絲氨酸、二棕櫚酰磷脂酰絲氨酸或二硬脂酰磷脂酰絲氨酸等)、磷脂酸、磷脂酰丙三醇(二月桂酰磷脂酰丙三醇、二肉豆寇酰磷脂酰丙三醇、二棕櫚酰磷脂酰丙三醇或二硬脂酰磷脂酰丙三醇等)、磷脂酰肌醇(二月桂酰磷脂酰肌醇、二肉豆寇酰磷脂酰肌醇、二棕櫚酰磷脂酰肌醇或二硬脂酰磷脂酰肌醇等)、溶血磷脂酰膽堿、神經(jīng)鞘髓磷脂、蛋黃卵磷脂、大豆卵磷或者加氫磷脂類等。
作為上述糖脂類，可以列舉例如甘油糖脂類、鞘糖脂類、甾醇類等。作為上述甘油糖脂類，可以列舉二半乳糖二甘油酯類(二半乳糖二月桂酰甘油酯、二半乳糖二肉豆寇酰甘油酯、二半乳糖二棕櫚酰甘油酯或二半乳糖二硬脂酰甘油酯等)、或者半乳糖二甘油酯類(半乳糖二月桂酰甘油酯、半乳糖二肉豆寇酰甘油酯、半乳糖二棕櫚酰甘油酯或半乳糖二硬脂酰甘油酯等)等。作為上述鞘糖脂類，可以列舉例如半乳糖腦苷脂、乳糖腦苷脂或者神經(jīng)節(jié)苷脂等。作為上述甾醇類，可以列舉例如膽固醇、膽固醇半琥珀酸酯、3β-[N-(N’，N’-二甲基氨基乙烷)氨甲酰基]膽固醇、麥角甾醇或者羊毛甾醇等。
在本發(fā)明中，這些脂類可以單獨或者兩種或更多組合使用。
作為本發(fā)明中所用的聚二醇類，對其沒有特別的限制，優(yōu)選亞烷基鏈碳原子數(shù)為1～6。此外，亞烷基鏈可以被不受本發(fā)明限制的取代基例如羥基、羧基、氨基、烷氧基等取代。具體例如可以使用聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇等，特別優(yōu)選使用聚乙二醇。對聚二醇類的分子量沒有特別的限制，分子量為約200～4,000,000，優(yōu)選為約1,000～50,000。當使用聚乙二醇時，特別優(yōu)選上述分子量的。
在本發(fā)明中，對聚二醇類的含量沒有特別的限制，但相對于構成脂質(zhì)體的總脂類量優(yōu)選為約0.5～30摩爾％。
對本發(fā)明中所用的白蛋白沒有特別的限制，可以列舉例如卵清蛋白、血清白蛋白、乳清蛋白或者肌清蛋白(肌漿蛋白)等動物性白蛋白，或者例如麥清蛋白、豆白蛋白或蓖麻蛋白等植物性白蛋白等。其中，在本發(fā)明中優(yōu)選使用與給藥對象相同動物的血清白蛋白，特別優(yōu)選使用人血清白蛋白。此外，本發(fā)明中所用白蛋白還可以使用利用遺傳基因重組技術獲得的白蛋白。上述白蛋白還有具有與野生型白蛋白相同的氨基酸序列。只要不違背本發(fā)明的目的，還可以使用缺失、置換或者添加1至多個、優(yōu)選1至幾個氨基酸的變異型白蛋白。這種白蛋白可以通過已知的技術容易地制得。在本發(fā)明中，由于沒有感染的危險性，優(yōu)選使用遺傳基因重組白蛋白。
在本發(fā)明中，對白蛋白的含量沒有特別的限制，但相對于構成脂質(zhì)體的脂類總量，優(yōu)選為約0.0001～10摩爾％。
本發(fā)明脂質(zhì)體制劑中所用脂質(zhì)體，若含有上述聚二醇類和白蛋白，采取怎樣的結構都可以。聚二醇類與白蛋白結合的空間連接的形式可以是任何形式。但是，優(yōu)選脂質(zhì)體在表面上具有聚二醇類和白蛋白的。此外，聚二醇類和白蛋白與脂質(zhì)體可以通過例如吸附、電結合、物理結合(范德瓦耳斯力等)、化學鍵等任何形式進行結合，但優(yōu)選通過化學鍵進行結合。
作為本發(fā)明脂質(zhì)體制劑中所用的脂質(zhì)體優(yōu)選的形式，可以列舉(a)聚二醇類和白蛋白分別與脂質(zhì)體結合的情況。此外，還可以列舉(b)脂質(zhì)體與白蛋白通過聚二醇類進行結合的情況。即，脂質(zhì)體連接在聚二醇類上，白蛋白在與該結合部位不同的部位連接在聚二醇類上的情況。進一步，(c)還可以列舉脂質(zhì)體與聚二醇類通過白蛋白進行結合的情況。即，脂質(zhì)體連接在白蛋白上，聚二醇類在與該連接部位不同的部位連接在白蛋白上的情況。在本發(fā)明中，上述(a)～(c)形式的脂質(zhì)體也可以同時存在。
本發(fā)明中所用脂質(zhì)體可以通過本身已知的技術制備。以下對這種脂質(zhì)體的優(yōu)選制備方法(a)～(c)進行說明。
(a)在聚二醇類與白蛋白分別結合在脂質(zhì)體上的情況中，本發(fā)明中所用脂質(zhì)體的制造方法為(i)使白蛋白結合在結合有聚二醇類的脂質(zhì)體上的方法。
(ii)使聚二醇類結合在結合有白蛋白的脂質(zhì)體上的方法。
(iii)使用結合有聚二醇類的脂類與結合有白蛋白的脂類制造脂質(zhì)體的方法。
上述(i)方法中，結合有聚二醇類的脂質(zhì)體可以通過已知的方法容易地制得?？梢粤信e例如使用結合有聚二醇類的脂類制造脂質(zhì)體的方法。作為上述“結合有聚二醇類的脂類”，可以列舉聚二醇類修飾的磷脂、聚二醇烷基醚、聚二醇蓖麻油衍生物或者聚二醇山梨聚糖脂肪酸酯類等。這些脂類的“聚二醇”部分優(yōu)選為聚乙二醇。作為“結合有聚二醇類的脂類”，優(yōu)選聚乙二醇修飾的磷脂，磷脂更優(yōu)選為磷脂酰乙醇胺類。
具體地，可以列舉例如PEG-DSPE[1，2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷脂酰乙醇胺-N-(聚乙二醇)]、下式(11)CH3O-(CH2CH2O)n-CO-CH2CH2-CO-NH-PE (11)(式中，n表示5～100,000的整數(shù)，優(yōu)選為10～1,200的整數(shù)，-NH-PE表示磷脂酰乙醇胺殘基)表示的N-(單甲氧基聚乙二醇琥珀酰)磷脂酰乙醇胺類、下式(12) (式中，n和-NH-PE與上述含義相同)表示的N-[單甲氧基聚乙二醇(2-氯-1，3，5-三氮雜苯-4，6-二基)]磷脂酰乙醇胺類、下式(13)
CH3O-(CH2CH2O)n-1-CO-NH-PE(13)(式中，n和-NH-PE與上述含義相同)表示的N-(單甲氧基聚乙二醇羰基)磷脂酰乙醇胺類、下式14CH3O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-NH-PE (14)(式中，n和-NH-PE與上述含義相同)表示的N-(單甲氧基聚乙二醇亞乙基)磷脂酰乙醇胺類。
上述“結合有聚二醇類的脂類”可以通過已知的技術容易地制備，還可以使用市售品。對于使用這種脂類作為構成脂類的制備脂質(zhì)體的方法，沒有特別的限制，可以使用已知的方法。例如，可以使用上述脂類和水相，通過薄膜法、反相蒸發(fā)法、乙醇注入法、醚注入法、脫水-再水化法等，制備脂質(zhì)體，通過超聲波照射法、凍結融化后的超聲波照射法、擠壓法、法式?jīng)_床法、均化法等方法，可以調(diào)節(jié)體積平均粒徑(參見D.D.Lasic，“Liposomesfrom basic to applications”，Elsevier Science Publishers，pp.1-171(1993))。這里，所謂“水相”是指構成脂質(zhì)體內(nèi)部的水溶液，只要是本技術領域中常用的水相，對其沒有特別的限制，氯化鈉水溶液、磷酸緩沖液或醋酸緩沖液等緩沖液、葡萄糖水溶液、海藻糖等糖水溶液或者它們的混合溶液最佳。通常，為了使給予生物體內(nèi)的脂質(zhì)體結構保持穩(wěn)定，優(yōu)選脂質(zhì)體制備中所用的水相與脂質(zhì)體外部即體液接近等張力，脂質(zhì)體內(nèi)外的滲透壓小。
將白蛋白結合于所得的結合有聚二醇類的脂質(zhì)體可以使用例如巰基-馬來酰亞胺偶合技術(Sulfhydryl-maleimide couplingtechnique)(Derksen，J.T.P.and Scherphof，G.L.(1985)Biochem.Biophys.Acta 814，p.151-155)等已知的技術容易地進行。其中，可以適當?shù)厥褂猛ㄟ^反應性中介基團使上述脂質(zhì)體與白蛋白結合的方法。作為反應性中介基團，對其沒有特別的限制，可以使用該技術領域中公知的基團。
作為優(yōu)選的方式，可以列舉以下方法。在制備上述結合有聚二醇類的脂質(zhì)體時，作為構成脂類，使用添加在結合有聚二醇類的脂類中的具有反應性中介基團的脂類。作為具有反應性中介基團的脂類，優(yōu)選1，2-二油酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-(戊二酰)(1，2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine-N-(Glutaryl)，以下簡稱為“NGPE”)。用這種構成脂類制備上述結合有聚二醇類的脂質(zhì)體后，通過上述脂質(zhì)體所具備的反應性中介基團使白蛋白結合。當使用NGPE時，優(yōu)選使白蛋白的氨基結合在NGPE末端羧基上。此時，還可以預先結合使上述脂質(zhì)體所具有的反應性中介基團的反應性提高的官能基團，再以與這種官能基團置換的方式結合白蛋白。例如，當使用NGPE時，使用水溶性碳化二亞胺在NGPE上預先結合碳化二亞氨基，再以與上述碳化二亞氨基置換的方式使白蛋白結合在NGPE上。
作為其它優(yōu)選的方式，可以列舉使用在1，2-二油酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(1，2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine，以下簡稱為“NOPE”)的氨基上結合3-(2-吡啶二硫)丙?；?3-(2-pyridyldithio)propionyl，以下簡稱為“DTP基”)的脂類(以下簡稱為DTP-DOPE)的方法。具體地說，使用在結合有聚二醇類的脂類中添加的DTP-DOPE作為構成脂類，制備上述結合有聚二醇類的脂質(zhì)體。另一方面，在白蛋白上導入巰基。對巰基的導入方法沒有特別的限制，可以使用公知的方法。優(yōu)選地，通過在白蛋白上導入DTP，接著與二硫蘇糖醇(dithiothreitol)反應，可以制得導入巰基的白蛋白。通過使上述脂質(zhì)體與白蛋白反應，可以使結合有聚二醇類的脂質(zhì)體上結合白蛋白。
上述(ii)和(iii)中所述的方法可以根據(jù)以上所述內(nèi)容容易地進行。
本發(fā)明的脂質(zhì)體制劑可以通過例如，上述(i)中，在結合有聚二醇類的脂質(zhì)體中裝載抗腫瘤活性物質(zhì)后再結合白蛋白的方法，上述(ii)中，在結合有白蛋白的脂質(zhì)體中裝載抗腫瘤活性物質(zhì)后，再結合聚二醇類的方法、或者(iii)使用結合有聚二醇類的脂類、結合有白蛋白的脂類、抗腫瘤活性物質(zhì)和鹽制備脂質(zhì)體的方法等進行制備。
對上述脂質(zhì)體抗腫瘤活性物質(zhì)的裝載形式?jīng)]有特別的限制，例如，抗腫瘤活性物質(zhì)可以被封裝在該脂質(zhì)體內(nèi)，也可以吸附或結合在該脂質(zhì)體的表面上。此外，抗腫瘤活性物質(zhì)也可以吸附或結合在白蛋白或聚二醇類上。
裝載抗腫瘤活性物質(zhì)的結合有聚二醇類的脂質(zhì)體可以通過本身已知的方法制備。更具體地，可以通過例如使結合有聚二醇類的脂質(zhì)體與抗腫瘤活性物質(zhì)的溶液或混懸液接觸，使抗腫瘤活性物質(zhì)被攝入脂質(zhì)體中而制備。
例如，向結合有聚二醇類的脂質(zhì)體中加入抗腫瘤活性物質(zhì)的水溶液或水混懸液，對所得混合液進行劇烈的振蕩、攪拌、進行超聲波處理，使其分散均勻，靜置。此時，也可以用含硫酸銨等鹽的水代替水。沒有從分散液中被攝取的抗腫瘤活性物質(zhì)可以通過已知的分離純化方法(例如過濾等)除去，得到裝載抗腫瘤活性物質(zhì)的、結合有聚二醇類的脂質(zhì)體。
裝載抗腫瘤活性物質(zhì)的、結合有白蛋白的脂質(zhì)體使用結合有白蛋白的脂質(zhì)體和抗腫瘤活性物質(zhì)，與上述制備方法同樣地制備。
此外，本發(fā)明的脂質(zhì)體制劑，可以通過在脂類混合物(例如，PEG結合DSPE、DTP-DOPE、蛋黃卵磷脂和膽固醇的混合物等)中添加抗腫瘤活性物質(zhì)和含鹽(例如，氯化銨等)的水溶液，加熱使其水化，在形成脂質(zhì)體的同時，使抗腫瘤活性物質(zhì)被攝入脂質(zhì)體內(nèi)部而制得。
還可以在制備結合有聚二醇類和白蛋白的脂質(zhì)體后，通過本身已知的方法使抗腫瘤活性物質(zhì)被攝入到脂質(zhì)體內(nèi)部中。
(以下(b)、(c)中也采用與上述同樣的方法)(b)通過聚二醇類使脂質(zhì)體與白蛋白結合的情況作為本發(fā)明中使用的脂質(zhì)體的制備方法，可以列舉(i)制備結合有聚二醇類的脂質(zhì)體，在該脂質(zhì)體的聚二醇類上結合白蛋白的方法，(ii)使結合有白蛋白的聚二醇類在與白蛋白結合部位不同的部位與脂質(zhì)體結合的方法等。
上述(i)方法中，結合有聚二醇類的脂質(zhì)體的制備方法與上述相同。在上述脂質(zhì)體的聚二醇類上結合白蛋白，可以通過已知的技術進行。其中，可以采用通過反應性中介基團使烷二醇類與白蛋白結合的方法。作為反應性中介基團，對其沒有特別的限制，可以是該技術領域中公知的基團，作為優(yōu)選的例子可以列舉馬來酰氨基。
具體地說，可以列舉以下方法。在結合有聚二醇類的脂類中，使聚二醇類上結合反應性官能基團。例如，優(yōu)選在聚二醇類的羥基上結合馬來酰亞氨基。使用所得脂類，與上述同樣地制備脂質(zhì)體。通過使所得脂質(zhì)體與白蛋白反應，通過脂質(zhì)體上結合的聚二醇類的反應性官能基團結合白蛋白，得到目標脂質(zhì)體。此時，為了使上述反應性官能基團與白蛋白容易結合，還可以進行在白蛋白上根據(jù)上述反應性官能基團導入取代基等已知的處理。當上述反應性官能基團為馬來酰亞氨基時，優(yōu)選在白蛋白上預先導入巰基。對巰基的導入方法沒有特別的限制，可以采用公知的方法。更具體地說，使白蛋白與乙酰硫乙酸酯反應，使白蛋白的氨基與乙酰硫乙酰基結合，接著通過脫除乙?；频脤霂€基乙?；陌椎鞍住?br> 上述(ii)方法中，對聚二醇類與白蛋白結合的方法沒有特別的限制，可以使用公知的技術，優(yōu)選通過反應性中介基團使其結合。作為反應性中介基團，對其沒有特別的限制，可以是該技術領域中公知的基團，作為優(yōu)選的例子可以列舉馬來酰亞氨基。接著，使所得結合有白蛋白的聚二醇類在與白蛋白結合部位不同的部位與脂質(zhì)體結合。對此方法也沒有特別的限制，可以使用公知的技術。優(yōu)選可以列舉使用預先結合脂類的聚二醇類，將上述工序中制得的白蛋白-聚二醇類-脂類復合物插入脂質(zhì)體中的方法。
更具體地說，使前述聚二醇類結合在脂類上。接著，在所得脂類的聚二醇類上結合反應性官能基團。例如，優(yōu)選在聚二醇類的羥基上結合馬來酰亞氨基。然后，通過反應性官能基團使白蛋白與所得脂類的聚二醇類反應。此時，為了使上述反應性官能基團容易與白蛋白結合，還可以進行在白蛋白上根據(jù)上述反應性官能基團導入取代基等已知的處理。當上述反應性基團為馬來酰亞氨基時，優(yōu)選在白蛋白上預先導入巰基。對巰基的導入方法沒有特別的限制，可以采用公知的方法。更具體地說，使白蛋白與乙酰硫乙酸酯反應，使白蛋白的氨基與乙酰硫乙?；Y合，接著通過脫除乙?；频脤霂€基乙?；陌椎鞍?。另一方面，脂質(zhì)體通過公知的方法制備，通過使所得白蛋白-聚二醇類-脂類復合物插入脂質(zhì)體中，可以得到目標脂質(zhì)體。
(c)通過白蛋白，使脂質(zhì)體與聚二醇類結合的情況作為本發(fā)明中所用的脂質(zhì)體的制備方法，可以列舉(i)使結合有聚二醇類的白蛋白在與聚二醇類結合部位不同的部位與白蛋白結合的方法，(ii)制備結合有白蛋白的脂質(zhì)體，在上述脂質(zhì)體的白蛋白上結合聚二醇類的方法等。
在上述(i)方法中，對使聚二醇類與白蛋白結合的方法沒有特別的限制，可以使用公知的技術，優(yōu)選通過反應性中介基團使其結合。作為反應性中介基團，對其沒有特別的限制，可以是該技術領域中公知的基團，作為優(yōu)選的例子可以列舉馬來酰亞氨基。更具體地說，在聚二醇類上結合反應性官能基團。例如，優(yōu)選在聚二醇類的羥基上結合馬來酰亞氨基。然后，通過反應性官能基團使聚二醇類與白蛋白反應。此時，為了使上述反應性官能基團與白蛋白容易結合，還可以進行在白蛋白上根據(jù)上述反應性官能基團導入取代基等已知的處理。當上述反應性官能基團為馬來酰亞氨基時，優(yōu)選在白蛋白上預先導入巰基的。對巰基的導入方法沒有特別的限制，可以采用公知的方法。更具體地說，使白蛋白與乙酰硫乙酸酯反應，使白蛋白的氨基與乙酰硫乙?；Y合，然后通過脫除乙?；频脤霂€基乙?；陌椎鞍住?br> 然后，使結合有已得到的聚二醇類的白蛋白與脂質(zhì)體結合。其方法同上述方法。
上述(ii)方法中，使白蛋白結合于脂質(zhì)體的方法同上述方法。然后，在上述白蛋白上結合聚二醇類。其方法也與上述的相同。
作為上述制備方法，可以列舉例如使具有下式(1) (式中，R表示碳原子數(shù)為2～35的脂肪酸衍生的酰基)表示的化合物作為構成脂類的脂質(zhì)體與白蛋白結合，或者，使具有下式(2) (式中，R與上述定義相同)表示的化合物作為構成脂類的脂質(zhì)體與下式(3)(Alb-NH)-CO-CH2-CH2-SH (3)(式中，Alb-NH表示白蛋白和白蛋白中的氨基)表示的化合物結合，或者，
使具有下式(4) (式中，n表示5～100,000的整數(shù)。R與上述定義相同)表示的化合物作為構成脂類的脂質(zhì)體與式(5)(Alb-NH)-CO-CH2-SH (5)(式中，Alb-NH與上述定義相同)表示的化合物結合，或者，使下式(6) (式中，n、R和Alb-NH與上述定義相同)表示的化合物插入到脂質(zhì)體中，或者，使具有上述式(1)表示的化合物作為構成脂類的脂質(zhì)體與下式(7)
(式中，-NH-Alb-NH2表示白蛋白和白蛋白的兩個不同的氨基，n與上述定義相同)表示的化合物結合，或者，使具有上述式(2)表示的化合物作為構成脂類的脂質(zhì)體與下式(8) (式中，-NH-Alb-NH-表示白蛋白和白蛋白的兩個不同的氨基，n與上述定義相同)表示的化合物結合等方法。
其中，上式表示的制備方法中，原料脂質(zhì)體中優(yōu)選裝載抗腫瘤活性物質(zhì)進行使用。例如，抗腫瘤活性物質(zhì)可以被封裝在脂質(zhì)體中，也可以吸附或者結合在脂質(zhì)體的表面上。此外，抗腫瘤活性物質(zhì)也可以吸附或結合與白蛋白或聚二醇類上。作為上述抗腫瘤活性物質(zhì)，只要是可以給予動物、優(yōu)選人的任意化合物或物質(zhì)組合物，對其沒有特別的限制。
作為本發(fā)明脂質(zhì)體制劑中的抗腫瘤活性物質(zhì)，可以列舉例如抗腫瘤抗生素、其它抗腫瘤藥物、烷化劑、各種代謝拮抗劑、抗腫瘤植物成分、BRM(生物學應答性調(diào)節(jié)物質(zhì))、血管新生抑制劑、細胞粘附抑制劑、基質(zhì)·金屬蛋白酶抑制劑或激素等。其中優(yōu)選使用抗腫瘤抗生素。
作為抗腫瘤抗生素的具體例子，可以列舉例如絲裂霉素C、博萊霉素、培洛霉素、柔紅霉素、阿柔比星、阿霉素、吡柔比星、THP-阿霉素、4’-環(huán)阿霉素、表阿霉素等蒽環(huán)霉素類抗生素抗腫瘤藥、色霉素A3、放線菌素D等，以及他們的鹽或復合物。其中優(yōu)選恩環(huán)霉素類抗生素抗腫瘤藥、其鹽(堿鹽或酸加成鹽)或復合物。特別優(yōu)選阿霉素或其酸加成鹽(例如鹽酸鹽等)。
作為其它抗腫瘤藥物，可以列舉例如順鉑、卡鉑、蛇莫西芬、喜樹堿、異環(huán)磷酰胺、環(huán)磷酰胺、苯丙氨酸氮芥、L-門冬酰胺酶、醋葡內(nèi)酯(アセクラトン)、西佐喃、溶鏈菌(ピシバニ一ル)、二甲胺基甲基苯甲醇(ウベニメクス)、云芝多糖等，以及其鹽或復合物。此外，還可以列舉丙卡巴肼、哌泊溴烷、新制癌菌素、羥基脲等。
作為烷化劑，可以列舉例如氮芥、氮芥N-氧化物、苯丁酸氮芥等烷化劑；例如卡巴醌、噻替哌等氮丙啶類烷化劑；例如二溴甘露醇(デイブロモマンニト一ル)、二溴半乳糖醇(デイブロモダルシト一ル)等環(huán)氧化合物類烷化劑；例如卡氮芥、羅氮介、賽氮芥(セムスチン)、尼氮芥(ニムスチンハイドロクロライド)、鏈脲霉素、氯脲菌素、雷莫司汀等亞硝基脲類烷化劑；白消安；甲苯磺酸胺丙磺酯(インプロスルフアン)；達卡巴嗪等。作為各種代謝拮抗劑，可以列舉例如6-巰基嘌呤、6-硫鳥嘌呤、巰嘌呤苷等代謝拮抗劑氟尿嘧啶、喃氟啶、喃氟啶·尿嘧啶、卡莫氟、脫氧氟尿苷、溴尿苷、阿糖胞苷、依諾他濱等嘧啶代謝拮抗劑、氨甲喋呤、三甲曲沙等葉酸代謝拮抗劑等，以及其鹽或復合物。
作為抗腫瘤植物成分，可以列舉例如長春地辛、長春新堿、長春花堿等長春生物堿類、依托泊苷、替尼泊苷等表鬼臼毒素類，以及其鹽或復合物。作為BRM，可以列舉例如腫瘤壞死因子、消炎痛等，以及其鹽或復合物。作為血管新生抑制劑，可以列舉例如醋酸生育酚(フマジロ一ル)衍生物，以及其鹽或復合物。作為細胞粘附抑制劑，可以列舉例如具有RGD序列的物質(zhì)，以及其鹽或復合物。作為基質(zhì)·金屬蛋白酶抑制劑，可以列舉例如馬利馬斯特(マリマスタツト)、巴其馬斯特(バチマスタツト)等，以及其鹽或復合物。作為激素，可以列舉例如氫化可的松、地塞米松、甲基強的松龍、潑尼松龍、普拉睪酮、倍他米松、去炎松、康復龍、南諾龍、美替諾龍、磷雌酚、乙炔雌二醇、氯地孕酮、甲羥孕酮等，以及其鹽或復合物等。
本發(fā)明的脂質(zhì)體制劑可以是僅僅由裝載抗腫瘤活性物質(zhì)的脂質(zhì)體構成，但是，通?？赏ㄟ^將該脂質(zhì)體與藥學上可接受的載體根據(jù)本身已知的方法[制劑技術領域中慣用的方法，例如日本藥典(例如第13修訂版)中所記載的方法等]進行混合而制備。
作為藥學上可接受的載體，使用制劑材料中常用的各種有機或無機載體物質(zhì)，固體制劑中可以列舉賦形劑、潤滑劑、粘合劑、崩解劑；液體制劑中可以列舉溶劑、溶解助劑、混懸劑、等張化劑、緩沖劑、止痛劑等。根據(jù)需要，還可以使用表面活性劑、發(fā)泡劑、色素、酸味劑、防腐劑、抗氧化劑、著色劑、甜味劑、矯味劑等制劑添加物、作為固體制劑中藥學上可接受的載體，更具體地說，可以列舉檸檬酸鈣、磷酸鈣等無機鹽賦形劑；例如硬脂酸鎂、硬脂酸鈣、輕質(zhì)硅酸酐、含水二氧化硅等潤滑劑；羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、α化淀粉、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、阿拉伯橡膠粉末、明膠或支鏈淀粉等粘合劑；低取代度羥丙基纖維和結晶纖維素等纖維素類、玉米淀粉、部分α化淀粉或羥丙基纖維素等各種淀粉或淀粉衍生物、交聯(lián)聚烯吡酮或膨潤土等崩解劑等。
此外，作為液體制劑中藥學上可接受的載體，可以列舉鹽溶液、葡萄糖溶液或鹽溶液與葡萄糖溶液的混合物等溶劑；例如葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、安息香鈉、乙二胺、水楊酰胺、煙酰胺、聚環(huán)氧乙烷固化蓖麻油衍生物等溶解助劑；例如硼酸緩沖液、磷酸緩沖液、檸檬酸緩沖液、酒石酸緩沖液、醋酸緩沖液等緩沖液；例如白蛋白、甘油、丙二醇等多元醇、利多卡因鹽酸鹽、芐醇等止痛劑等。
作為另外的制劑添加劑，可以列舉例如脫水山梨糖醇脂肪酸酯、聚環(huán)氧乙烷脂肪酸酯、磷脂、甘油脂肪酸酯、聚乙二醇脂肪酸酯、聚環(huán)氧乙烷固化蓖麻油、聚環(huán)氧乙烷烷基醚、蔗糖脂肪酸酯等表面活性劑；例如碳酸氫鈉、碳酸鈉、碳酸鈣等發(fā)泡劑；例如檸檬酸、酒石酸、蘋果酸等酸味劑；例如三氧化二鐵、黃色三氧化二鐵、焦油類色素等色素；例如檸檬、檸檬粉(レモンライム)、柑橘、薄荷、薄荷醇等香料；例如糖精鈉、甘草素二鉀、糖精、斯替維(ステビア)、竹芋蛋白(ソ一マチン)等甜味劑；例如檸檬酸、檸檬酸鈉、琥珀酸、酒石酸、富馬酸、谷氨酸等矯味劑。
另外，作為穩(wěn)定劑，可以列舉例如糖類和亞硫酸鈉等。作為糖類，可以列舉葡萄糖、果糖、木糖醇、巖藻糖、半乳糖等單糖類；麥芽糖、蔗糖、乳糖、乳果糖、蜜二糖等二糖類；果糖低聚物(フルクトオリゴ)糖、半乳糖低聚物(ガラクトオリゴ)糖、乳糖低聚物(ラクトオリゴ)糖等低聚糖；葡聚糖等多糖等。作為防腐劑，可以列舉例如對羥基安息香酸酯、芐醇、氯甲酚、苯乙醇、苯索氯銨等。作為螯合劑，可以列舉例如依地(エデト)酸鈉、檸檬酸鈉等。作為抗氧化劑，可以列舉例如亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉、抗壞血酸鈉、硫代硫酸鈉等。
作為本發(fā)明的脂質(zhì)體制劑的劑型，可以列舉例如錠劑、膠囊劑(包括軟膠囊、微膠囊、腸溶膠囊)、散劑、顆粒劑、糖漿劑等口服制劑；以及注射劑(例如皮下注射劑、靜脈注射劑、肌內(nèi)注射劑、腹腔內(nèi)注射劑等)、外用制劑(例如經(jīng)鼻給藥制劑、經(jīng)皮制劑、軟膏劑等)、栓劑(例如直腸栓劑、陰道栓劑等)、丸劑、滴劑、緩釋制劑(例如緩釋微膠囊等)等非口服給藥制劑。本發(fā)明的脂質(zhì)體制劑特別優(yōu)選注射劑劑型。
本發(fā)明的脂質(zhì)體制劑的給藥量，由于根據(jù)脂質(zhì)體所含抗腫瘤活性物質(zhì)的種類、藥物劑型、需治療疾病狀態(tài)的種類、癥狀和疾病的嚴重程度、患者年齡、性別或體重、給藥方法等而不同，不能一概而論，醫(yī)師可通過對上述狀況進行綜合判斷而決定。
對本發(fā)明脂質(zhì)體制劑的給藥途徑?jīng)]有特別的限制，根據(jù)上述本發(fā)明脂質(zhì)體制劑的劑型，可以口服給藥，也可以非經(jīng)口服給藥，優(yōu)選非口服給藥，特別是通過注射給藥。當本發(fā)明的脂質(zhì)體制劑是注射劑時，可以例示例如靜脈注射、皮下注射、皮內(nèi)注射、肌內(nèi)注射或腹腔內(nèi)注射之類的藥療上合適的給藥方式。
本發(fā)明的脂質(zhì)體制劑，根據(jù)脂質(zhì)體中所裝載的抗腫瘤活性物質(zhì)的種類，可以對各種疾病進行預防和治療。例如，本發(fā)明脂質(zhì)體制劑可以用于例如大腸癌、腦腫瘤、頭頸部腫瘤、乳腺癌、肺癌、食道癌、胃癌、肝癌、膽囊癌、膽管癌、胰腺癌、胰島細胞癌、絨毛膜癌、結腸癌、腎細胞癌、腎上腺皮質(zhì)腺癌、膀胱癌、睪丸癌、前列腺癌、睪丸腫瘤、卵巢癌、子宮癌、甲狀腺癌、惡性類癌(瘤)、皮膚癌、惡性黑色腫、骨肉腫、軟組織肉腫、神經(jīng)胚細胞癌、維爾姆斯瘤、網(wǎng)膜胚細胞瘤、黑霉、扁平上皮癌等腫瘤的預防或治療。
以下，列舉實施例、試驗例對本發(fā)明進行詳細的說明。
以下實施例中所用rHSA為獲自株式會社バイフア。其中，本實施例中所述的簡稱定義如下DOPE1，2-二油酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺DSPE1，2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷脂酰乙醇胺DTP基3-(2-吡啶二硫)丙?；鵇TT二硫蘇糖醇
DXR阿霉素鹽酸鹽EDTA乙二胺四乙酸鈉鹽HEPESN-2-羥乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸NGPE1，2-二油酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-(戊二酰)NHSN-羥基琥珀酰亞胺PBSpH為7.4的磷酸緩沖液(由氯化鈉、氯化鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉組成)PEG聚乙二醇rHSA重組人血清白蛋白(遺傳基因重組型人血清白蛋白)SATAN-琥珀酰亞氨基-S-乙酰硫乙酰酯SPDPN-琥珀酰亞氨基3-(2-吡啶二硫)丙酸酯WSC水溶性碳化二亞胺的簡稱，是指1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亞胺實施例1(1)磷脂(DTP-DOPE)的制備向0.34ml含10μmol DOPE的氯仿溶液中加入12μmolSPDP(Pierce公司制，美國)，攪拌2小時。向反應液中加入2ml PBS，劇烈振蕩5分鐘后，以3000rpm轉(zhuǎn)速離心分離10分鐘。除去PBS層后，進一步向氯仿層加入純化水，劇烈振蕩3分鐘后，進行離心分離，除去水層。再次同樣地進行這種純化水洗滌。將下層殘留的白色半固體狀物質(zhì)在蒸發(fā)儀中減壓蒸餾90分鐘除去溶劑并干燥。向殘留物加入1.0ml氯仿，再次溶解，獲得DTP結合的DOPE氯仿溶液。
(2)含DTP-DOPE的PEG修飾脂質(zhì)體的制備將溶解有脂類的氯仿溶液(總脂類115μmol，以蛋黃卵磷脂(旭化成制)∶膽固醇(和光純藥公司制)PEG結合DSPE(Avanti公司制，美國)＝62∶33∶5的摩爾比溶解)加入到燒瓶中。向其中加入含4.8μmol上述所得DTP-DOPE的氯仿溶液，進一步加入氯仿使總量達到7ml后，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中減壓蒸餾除去溶劑，干燥一夜。向生成的脂膜加入6.0ml含250mM硫酸銨的水溶液，加熱至60℃，同時通過渦流進行水化。再用擠壓機進行定徑，使粒徑為100nm，得到含DTP-DOPE的PEG修飾脂質(zhì)體的硫酸銨水混懸液。
(a)脂質(zhì)體粒度分布測定(粒度分布測定儀，NICOMP 370ZLS，Particle Sizing System公司制，美國)確認粒徑為100nm。
(b)脂質(zhì)體表面存在的PEG修飾的量的測定(通過苦味酸鹽法測定)脂質(zhì)體表面存在3.5％的PEG。
通過苦味酸鹽法對PEG的定量按照International journal ofpharmaceutics，203(2000)，255-263所述的定量方法進行。
向10ml脂質(zhì)體中加入20ml的硝酸鈉-苦味酸溶液并混合。再加入10ml 1，2-二氯乙烷，充分混合(萃取)，以1500g離心分離10分鐘。分出有機層，測定378nm的吸光度。根據(jù)吸光度值，相對于5.75μmolPEG脂類，表面的PEG為4.01μmol，由此可知，總量的70％存在于表面。
(3)將DXR封入脂質(zhì)體中將制備的含DTP-DOPE的PEG修飾脂質(zhì)體的硫酸銨水混懸液進行凝膠過濾(Sepharose CL-6B，Bio-Rad公司制，美國，柱內(nèi)徑1.5×30cm；洗脫液PB S)得到含DTP-DOPE的PEG修飾脂質(zhì)體的PB S混懸液。向其中加入3.5mg DXR，在65℃下靜置保溫1小時，再與上述同樣地進行凝膠過濾，將未被封入的DXR除去，得到含DTP-DOPE的PEG修飾的封入DXR的脂質(zhì)體。
凝膠過濾(Sepharose CL-6B，Bio-Rad公司制)是根據(jù)分子量的大小進行分離純化，首先，脂質(zhì)體中封入阿霉素，然后將未封入的阿霉素分離。由于阿霉素顯示紅色熒光，所以是否存在未封入的阿霉素通過目測進行確定。進一步通過HPLC法(島津公司制，熒光檢測器RF-10A，泵LC-10AS)確認不存在未封入的阿霉素。
(4)3-巰基丙?；?rHSA的制備向0.67μmol rHSA(バイフア公司制)的水溶液中加入13μmol SPDP后，攪拌，制得DPT-rHSA。然后進行凝膠過濾(填充劑Sepharose CL-6B，Bio-Rad公司制；洗脫液醋酸緩沖液(pH4.5))，分離收集DTP-rHSA的部分。加入DTT(關東化學公司制)，使其在DTP-rHSA中的終濃度為50mM，攪拌20分鐘使其反應，使DTP-rHSA的DTP上的取代基2-吡啶二硫基置換成巰基。進行凝膠過濾(填充劑Sepharose CL-6B，Bio-Rad公司制；洗脫液PBS(pH 8.0))以除去未反應的DTT，分離收集3-巰基丙?；?rHSA部分。
對于DTP-rHSA與DTT反應的副產(chǎn)物2-硫代吡啶酮(2-TP)，用分光光度計(日立公司制，U-3300)測定反應液在343nm處的吸光度(2-TP特異的吸收峰)，與加入DTT前相比，吸光度大約0.5，確認生成了2-TP，即，DTP-rHSA與DTT發(fā)生了反應。
(5)rHSA·PEG修飾的封入DXR的脂質(zhì)體的制備向含DTP-DOPE的PEG修飾的封入DXR的脂質(zhì)體中加入3-巰基丙酰基-rHSA溶液，在室溫下攪拌約24小時，使rHSA修飾脂質(zhì)體。然后凝膠過濾反應液(填充劑Sepharose CL-6B，Bio-Rad公司制；洗脫液PBS(pH8.0))，使脂質(zhì)體與未反應的rHSA分離，分離收集脂質(zhì)體部分，得到目標rHSA·PEG修飾的封入DXR的脂質(zhì)體。
產(chǎn)物的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳發(fā)現(xiàn)rHSA單體位置帶，確認rHSA為良好修飾的單體。
粒徑的測定粒徑與上述2同樣地測定，約為100nm(測定裝置，NICOMP 370ZLS)。
試驗例1 血漿中DXR的滯留性向3只大鼠移植癌細胞(大鼠腹水肝癌)。向每只大鼠通過尾靜脈給予實施例1中所得的脂質(zhì)體樣品6mg/kg(DXR量)。經(jīng)一定時間后，通過頸動脈取血約200μl，立即進行離心分離(4℃下1500×g，5分鐘)。收集上清液100μl，加入900μl硫酸銨飽和水溶液并混合，加入2ml氯仿∶2-丙醇＝1∶1的混合溶液，振蕩10分鐘。將該樣品以1500×g離心分離10分鐘，收集油層。將油層通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸餾除去溶劑后，用流動相進行再溶解，用液相色譜(島津制作所社制，SCL-10A)進行定量測定。
作為比較，使用表面被PEG修飾的封入DXR的脂質(zhì)體及DXR水溶液(800μg/ml)，進行相同的試驗。
其結果見圖1。
由圖1可清楚地看出，實施例1的rHSA·PEG修飾的封入DXR的脂質(zhì)體，與僅僅被PEG修飾的封入DXR的脂質(zhì)體和DXR水溶液相比，在血漿中的滯留性有著顯著的提高。
試驗例2 癌細胞中DXR的滯留性將上述試驗例1中血液收集結束的大鼠立即脫血處死。脫血后，收集腫瘤，稱重后，用2.0ml PBS進行勻漿。收集1ml該液體，加入硫酸銨飽和水溶液3.0ml并混合。加入6ml氯仿∶2-丙醇＝1∶1的混合溶液，振蕩10分鐘。將該樣品以1500×g離心分離10分鐘，收集油層。將油層通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸餾除去溶劑后，用流動相進行再溶解，用液相色譜(島津制作所社制，SCL-10A)進行測定。
作為比較，使用表面被PEG修飾的封入DXR的脂質(zhì)體以及DXR水溶液(800μg/ml)，進行相同的試驗。
其結果見圖2。
由圖2可清楚地看出，實施例1的rHSA·PEG修飾的封入DXR的脂質(zhì)體，與僅僅被PEG修飾的封入DXR的脂質(zhì)體和DXR水溶液相比，在癌細胞中的滯留性有著顯著的提高。
本發(fā)明的脂質(zhì)體制劑，與現(xiàn)有的封入了抗腫瘤活性物質(zhì)的脂質(zhì)體相比，在血中的滯留性顯著地提高，且具有大量抗腫瘤活性物質(zhì)遷移至癌細胞的優(yōu)良效果。本發(fā)明的脂質(zhì)體制劑適合用于癌癥的治療，不僅能夠改善副作用，例如心毒性(阿霉素在心臟中蓄積等)，還可以減少抗腫瘤活性物質(zhì)的給藥量，且能夠獲得長時間持續(xù)的藥理效果。
權利要求
1.一種用于治療癌癥的藥物組合物，其特征在于，包括含有抗腫瘤活性物質(zhì)的、與聚二醇類和白蛋白結合的脂質(zhì)體，能夠被大量地攝入到癌細胞中。
2.權利要求1所述的藥物組合物，其中抗腫瘤活性物質(zhì)為抗腫瘤抗生素。
3.權利要求2所述的藥物組合物，其中抗腫瘤抗生素為蒽環(huán)霉素類抗生素抗腫瘤藥。
4.權利要求3所述的藥物組合物，其中蒽環(huán)霉素類抗生素抗腫瘤藥為阿霉素或其鹽酸鹽。
5.權利要求1所述的藥物組合物，其中白蛋白為遺傳基因重組型人血清白蛋白。
6.權利要求1所述的藥物組合物，其中白蛋白的含量相對于構成脂質(zhì)體的總脂類量約為0.0001～10摩爾％。
7.權利要求1所述的藥物組合物，其中脂質(zhì)體的體積平均粒徑為約10～5,000nm。
8.權利要求1所述的藥物組合物，其中聚二醇類的分子量約為200～4,000,000。
9.權利要求1所述的藥物組合物，其中聚二醇類為聚乙二醇。
10.權利要求1所述的藥物組合物，其為注射劑。
11.一種癌癥的治療方法，其特征在于，將權利要求1所述的藥物組合物給藥。
12.如權利要求11所述的癌癥的治療方法，其非經(jīng)口服給藥。
全文摘要
本發(fā)明提供一種含有抗腫瘤活性物質(zhì)的脂質(zhì)體制劑，其抗腫瘤活性物質(zhì)在血液中的滯留性、向腫瘤細胞的遷移性更加提高，在心臟中的殘留性等副作用降低。一種用于治療癌癥的藥物組合物，其特征在于包括含有抗腫瘤活性物質(zhì)的、與聚二醇類和白蛋白結合的脂質(zhì)體，能夠被大量地攝入到癌細胞中。
文檔編號A61K47/48GK1679957SQ20051005389
公開日2005年10月12日 申請日期2005年3月14日 優(yōu)先權日2004年3月15日
發(fā)明者木村聰城郎, 檜垣和孝, 大河原賢一, 甲斐俊哉, 橫江淳一, 櫻木志保, 佐藤誠 申請人:尼普洛株式會社