專利名稱：抗sars冠狀病毒細胞疫苗及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及預(yù)防和治療由SARS冠狀病毒引起的非典型性肺炎疫苗的領(lǐng)域，尤其涉及表達SARS冠狀病毒S及5個特異性蛋白的細胞疫苗。還涉及該疫苗在抗SARS冠狀病毒中的用途。
背景技術(shù)：
嚴重急性呼吸綜合征(SARS)作為新興的烈性傳染病在國內(nèi)蔓延，有效的預(yù)防、治療SARS是目前國家最重要的任務(wù)，而目前尚未發(fā)現(xiàn)十分有效的治療藥物，因此，有效的預(yù)防和治療SARS已迫在眉睫。
在預(yù)防以及治療方面，疫苗制備是最具前景的方法之一，該方法包括如下幾種技術(shù)減毒或滅活病毒體、基因工程重組疫苗、多肽疫苗和DNA疫苗等。治療性疫苗除了誘導機體產(chǎn)生特異性抗體之外，還能促進T細胞對病毒的殺滅作用。因此在SARS相關(guān)冠病毒序列明確之后，可以針對性選取各方案設(shè)計預(yù)防性疫苗和治療性疫苗。
國內(nèi)外對SARS病毒疫苗研制所采用的方法大致分為減毒或滅活活疫苗、基因工程蛋白質(zhì)或多肽疫苗和DNA疫苗。雖然減毒或滅活活疫苗的制備是經(jīng)典的制備疫苗的方法，但由于其所需條件高，周期長，而且有毒力恢復(fù)的潛在可能性，具有非常大的危險性；基因工程蛋白質(zhì)或多肽疫苗是將SARS冠狀病毒的部分抗原基因在酵母、大腸桿菌等細胞內(nèi)表達，得到的蛋白質(zhì)經(jīng)過純化后作為疫苗。但由于得不到正確的翻譯后加工和半衰期短的缺點，使用該蛋白質(zhì)制成的疫苗抗原性往往較差，不能使機體產(chǎn)生良好的保護性免疫反應(yīng)；而DNA疫苗制備簡單，周期短，隨著SARS病毒基因組全序列的公布，使制備DNA疫苗成為可能，上海對外宣稱的不久將問世的SARS疫苗就是DNA疫苗，雖然DNA疫苗有很多的優(yōu)點，但其安全性仍然是公認的隱患，尤其對有高度變異傾向的SARS病毒，其安全性更值得考慮。
本發(fā)明的細胞疫苗是通過分子生物學的方法，將SARS冠狀病毒基因組中S及5個特有的cDNA序列克隆到真核表達載體上，將制備好的含不同cDNA序列的重組真核表達載體在體外分別感染靶細胞，將感染后的靶細胞培養(yǎng)2～3天，以便讓靶細胞表達SARS冠狀病毒所特有的各相應(yīng)蛋白，并通過這些靶細胞的內(nèi)源性(MHCI)及外源性(MHCII)抗原遞呈途徑對SARS冠狀病毒所特有的各相應(yīng)蛋白進行處理，使其能夠被T細胞直接識別，并遞呈到細胞膜表面。再滅活細胞并保持其完全的抗原性。與其他方法比較，抗SARS細胞疫苗同時具備快速、安全、有效誘導宿主免疫保護反應(yīng)的優(yōu)點。
所述5個特有的cDNA序列均來源于Genebank中，ACCESSIONAY278489GI31416290，具有唯一性和權(quán)威性。其中a.原始序列信息見Genebank中ACCESSIONAY278489 GI31416290其編碼的蛋白為BGI-PUP1蛋白idAAP51228.1，cDNA片段為1 atggatttgt ttatgagatt ttttactctt ggatcaatta ctgcacagcc agtaaaaatt61 gacaatgctt ctcctgcaag tactgttcat gctacagcaa cgataccgct acaagcctca121 ctccctttcg gatggcttgt tattggcgtt gcatttcttg ctgtttttca gagcgctacc181 aaaataattg cgctcaataa aagatggcag ctagcccttt ataagggctt ccagttcatt241 tgcaatttac tgctgctatt tgttaccatc tattcacatc ttttgcttgt cgctgcaggt301 atggaggcgc aatttttgta cctctatgcc ttgatatatt ttctacaatg catcaacgca361 tgtagaatta ttatgagatg ttggctttgt tggaagtgca aatccaagaa cccattactt
421 tatgatgcca actactttgt ttgctggcac acacataact atgactactg tataccatat481 aacagtgtca cagatacaat tgtcgttact gaaggtgacg gcatttcaac accaaaactc541 aaagaagact accaaattgg tggttattct gaggataggc actcaggtgt taaagactat601 gtcgttgtac atggctattt caccgaagtt tactaccagc ttgagtctac acaaattact661 acagacactg gtattgaaaa tgctacattc ttcatcttta acaagcttgt taaagaccca721 ccgaatgtgc aaatacacac aatcgacggc tcttcaggag ttgctaatcc agcaatggat781 ccaatttatg atgagccgac gacgactact agcgtgcctt tgtaab.原始序列信息見Genebank中ACCESSIONAY278489 GI31416290其編碼的蛋白為BGI-PUP2蛋白idAAP51229.1，cDNA片段為1 atgatgccaa ctactttgtt tgctggcaca cacataacta tgactactgt ataccatata61 acagtgtcac agatacaatt gtcgttactg aaggtgacgg catttcaaca ccaaaactca121 aagaagacta ccaaattggt ggttattctg aggataggca ctcaggtgtt aaagactatg181 tcgttgtaca tggctatttc accgaagttt actaccagct tgagtctaca caaattacta241 cagacactgg tattgaaaat gctacattct tcatctttaa caagcttgtt aaagacccac301 cgaatgtgca aatacacaca atcgacggct cttcaggagt tgctaatcca gcaatggatc361 caatttatga tgagccgacg acgactacta gcgtgccttt gtaagcacaa gaaagtgagt421 acgaacttat gtactcattc gtttcggaag aaacaggtac gttaac.原始序列信息見Genebank中ACCESSIONAY278489 GI31416290其編碼的蛋白為BGI-PUP3蛋白idAAP51232.1，cDNA片段為1 atgtttcatc ttgttgactt ccaggttaca atagcagaga tattgattat cattatgagg61 actttcagga ttgctatttg gaatcttgac gttataataa gttcaatagt gagacaatta121 tttaagcctc taactaagaa gaattattcg gagttagatg atgaagaacc tatggagtta181 gattatccat aad.原始序列信息見Genebank中ACCESSIONAY278489 GI31416290，其編碼的蛋白為BGI-PUP4蛋白idAAP51233.1，cDNA片段為
1 atgaaaatta ttctcttcct gacattgatt gtatttacat cttgcgagct atatcactat61 caggagtgtg ttagaggtac gactgtacta ctaaaagaac cttgcccatc aggaacatac121 gagggcaatt caccatttca ccctcttgct gacaataaat ttgcactaac ttgcactagc181 acacactttg cttttgcttg tgctgacggt actcgacata cctatcagct gcgtgcaaga241 tcagtttcac caaaactttt catcagacaa gaggaggttc aacaagagct ctactcgcca301 ctttttctca ttgttgctgc tctagtattt ttaatacttt gcttcaccat taagagaaag361 acagaatgae.原始序列信息見Genebank中ACCESSIONAY278489 GI31416290其編碼的蛋白為BGI-PUP7蛋白idAAP51235.1，cDNA片段為1 atggacccca atcaaaccaa cgtagtgccc cccgcattac atttggtgga cccacagatt61 caactgacaa taaccagaat ggaggacgca atggggcaag gccaaaacag cgccgacccc121 aaggtttacc caataatact gcgtcttggt tcacagctct cactcagcat ggcaaggagg181 aacttagatt ccctcgaggc cagggcgttc caatcaacac caatagtggt ccagatgacc241 aaattggcta ctaccgaaga gctacccgac gagttcgtgg tggtgacggc aaaatga發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種抗SARS冠狀病毒的細胞疫苗，該疫苗安全穩(wěn)定，能夠方便地運輸儲存，可同時引起人體對SARS冠狀病毒體液免疫和細胞免疫。
本發(fā)明的另一個目的在于提供一種抗SARS冠狀病毒的細胞疫苗在預(yù)防和治療非典型性肺炎中的應(yīng)用。
本發(fā)明中的細胞疫苗是通過分子生物學的方法，將SARS冠狀病毒基因組中S及5個特有的cDNA序列克隆到真核表達載體上，將制備好的含不同cDNA序列的重組真核表達載體在體外分別感染異種抗原遞呈靶細胞，將感染后的靶細胞培養(yǎng)2～3天，以便讓異種抗原遞呈靶細胞表達SARS冠狀病毒所特有的各相應(yīng)蛋白，并通過這些靶細胞的內(nèi)源性(MHCI)及外源性(MHCII)抗原遞呈途徑對SARS冠狀病毒所特有的各相應(yīng)蛋白進行處理，使其能夠被T細胞直接識別，并遞呈到細胞膜表面。再滅活細胞并保持其完全的抗原性。
與其他方法比較，抗SARS細胞疫苗同時具備快速、安全、有效誘導宿主免疫保護反應(yīng)的優(yōu)點。
本發(fā)明提供的技術(shù)方案實施步驟為1.根據(jù)SARS冠狀病毒的基因組序列分析結(jié)果，找到SARS基因組中所特有的5個cDNA序列，它們是冠狀病毒所特有的，可能也是SARS發(fā)病機制和傳染能力異于其他冠狀病毒的物質(zhì)基礎(chǔ)之一。因此，首先進行全基因合成這些cDNA序列。
根據(jù)其他冠狀病毒的研究結(jié)果，位于病毒表面的輻條樣蛋白(S蛋白)是病毒的主要中和性抗原，核衣殼蛋白(N蛋白)和膜蛋白(M蛋白)也可以誘導免疫效應(yīng)，因此S蛋白及M、N蛋白均可應(yīng)用于抗SARS冠狀病毒疫苗研究。因此，也可使用編碼SARS冠狀病毒S蛋白及M、N蛋白的cDNA制備本發(fā)明的抗SARS冠狀病毒細胞疫苗。
2.構(gòu)建SARS冠狀病毒所特有的cDNA序列的真核表達載體。
a、用腺病毒表達載體b、使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體c、使用真核表達質(zhì)粒3.將構(gòu)建好的SARS冠狀病毒所特有的cDNA序列的真核表達載體導入異種抗原遞呈靶細胞中，使異種抗原遞呈靶細胞表達相應(yīng)SARS冠狀病毒蛋白。
a、導入方式
i.病毒載體通過感染方式使靶細胞表達相應(yīng)SARS冠狀病毒蛋白。
ii.真核表達質(zhì)粒通過電轉(zhuǎn)或脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染靶細胞，使其表達相應(yīng)SARS冠狀病毒蛋白。
b、靶細胞的選擇B細胞具有強大的抗原處理遞呈功能和能大規(guī)模培養(yǎng)，是抗SARS冠狀病毒的細胞疫苗理想的靶細胞。
4.滅活表達相應(yīng)SARS冠狀病毒蛋白的靶細胞，并保持其抗原性。
i.物理方法 通過γ射線滅活固定靶細胞。
ii.化學方法 通過多聚甲醛或福爾馬林液固定滅活靶細胞。
5.將d步所得到的滅活靶細胞充分洗滌去除其他抗原成分后，加入到合適的制劑中，如生理鹽水，調(diào)節(jié)細胞濃度，范圍為105～107細胞/ml，即可得到抗SARS冠狀病毒的細胞疫苗。
與其他方法制備的抗SARS冠狀病毒疫苗相比，本發(fā)明中的細胞疫苗具有以下優(yōu)點①簡單快速隨著SARS病毒基因組全序列的公布，以及SARS冠狀病毒基因組中5個特有的cDNA序列的確認，使制備相應(yīng)細胞疫苗成為可能，而細胞疫苗的制備所需的全過程不超過1個月，因此，在目前這種緊迫的環(huán)境下，細胞疫苗有其優(yōu)勢；而目前認為SARS冠狀病毒是一類容易產(chǎn)生變異的病毒，快速有效的針對變異病毒制備疫苗也是細胞疫苗的優(yōu)勢之一；在對SARS冠狀病毒了解不多的前提下，將其基因組中5個特有的cDNA序列制備細胞疫苗而不必分析是其中那一段是引起免疫反應(yīng)的主要因素，這樣減少了篩選過程，加速了疫苗的制備過程。
②更加安全在對SARS冠狀病毒了解不多的前提下，疫苗的安全性是極其重要的。細胞疫苗的制備只需要知道病毒基因組，而不必直接接觸病毒，減少了由實驗室途徑傳播病毒的危險性；通過甲醛滅活后，細胞疫苗不帶有活性蛋白和活性核酸物質(zhì)，以及不帶有全長的病毒基因組，從而極大地避免促使病毒變異、病毒回復(fù)的危險，增加了細胞疫苗的可靠性；③更加有效B細胞是專業(yè)的抗原遞呈細胞，有強大的抗原處理遞呈能力，重組腺病毒載體在B細胞內(nèi)大量表達SARS冠狀病毒所特有的各相應(yīng)蛋白，由于T細胞不能夠識別這些蛋白，必須通過B細胞的內(nèi)源性(MHCI)及外源性(MHCII)抗原遞呈途徑對這些蛋白進行處理并表達在膜上，才能使其能夠被T細胞識別，這樣，經(jīng)甲醛滅活細胞并保持完全的抗原性細胞疫苗不但可以誘導機體產(chǎn)生特異性抗體，還能促進T細胞對細胞內(nèi)病毒的殺滅作用。因此，該細胞疫苗不但作為預(yù)防性疫苗有效，還可作為治療性疫苗。
由于B細胞是專業(yè)的抗原遞呈細胞，其本身高表達的免疫共刺激分子能夠加強機體對疫苗的免疫反應(yīng)，使疫苗更加有效。


本發(fā)明由如下附圖附圖1為細胞疫苗直接刺激T淋巴細胞增值的比較柱狀圖；附圖2為免疫后小鼠T淋巴細胞對表達PUP1-5基因片段的正常血管內(nèi)皮細胞殺傷活性(％)柱狀圖；
附圖3為流式細胞儀檢測抗體結(jié)果圖。
具體實施例1.全基因合成SARS基因組中所特有的5個cDNA序列，它們是冠狀病毒所特有的，可能也是SARS發(fā)病機制和傳染能力異于其他冠狀病毒的物質(zhì)基礎(chǔ)之一。
a.1 atggatttgt ttatgagatt ttttactctt ggatcaatta ctgcacagcc agtaaaaatt61 gacaatgctt ctcctgcaag tactgttcat gctacagcaa cgataccgct acaagcctca121 ctccctttcg gatggcttgt tattggcgtt gcatttcttg ctgtttttca gagcgctacc181 aaaataattg cgctcaataa aagatggcag ctagcccttt ataagggctt ccagttcatt241 tgcaatttac tgctgctatt tgttaccatc tattcacatc ttttgcttgt cgctgcaggt301 atggaggcgc aatttttgta cctctatgcc ttgatatatt ttctacaatg catcaacgca361 tgtagaatta ttatgagatg ttggctttgt tggaagtgca aatccaagaa cccattactt421 tatgatgcca actactttgt ttgctggcac acacataact atgactactg tataccatat481 aacagtgtca cagatacaat tgtcgttact gaaggtgacg gcatttcaac accaaaactc541 aaagaagact accaaattgg tggttattct gaggataggc actcaggtgt taaagactat601 gtcgttgtac atggctattt caccgaagtt tactaccagc ttgagtctac acaaattact661 acagacactg gtattgaaaa tgctacattc ttcatcttta acaagcttgt taaagaccca721 ccgaatgtgc aaatacacac aatcgacggc tcttcaggag ttgctaatcc agcaatggat781 ccaatttatg atgagccgac gacgactact agcgtgcctt tgtaab.1 atgatgccaa ctactttgtt tgctggcaca cacataacta tgactactgt ataccatata61 acagtgtcac agatacaatt gtcgttactg aaggtgacgg catttcaaca ccaaaactca
121 aagaagacta ccaaattggt ggttattctg aggataggca ctcaggtgtt aaagactatg181 tcgttgtaca tggctatttc accgaagttt actaccagct tgagtctaca caaattacta241 cagacactgg tattgaaaat gctacattct tcatctttaa caagcttgtt aaagacccac301 cgaatgtgca aatacacaca atcgacggct cttcaggagt tgctaatcca gcaatggatc361 caatttatga tgagccgacg acgactacta gcgtgccttt gtaagcacaa gaaagtgagt421 acgaacttat gtactcattc gtttcggaag aaacaggtac gttaac.1 atgtttcatc ttgttgactt ccaggttaca atagcagaga tattgattat cattatgagg61 actttcagga ttgctatttg gaatcttgac gttataataa gttcaatagt gagacaatta121 tttaagcctc taactaagaa gaattattcg gagttagatg atgaagaacc tatggagtta181 gattatccat aad.1 atgaaaatta ttctcttcct gacattgatt gtatttacat cttgcgagct atatcactat61 caggagtgtg ttagaggtac gactgtacta ctaaaagaac cttgcccatc aggaacatac121 gagggcaatt caccatttca ccctcttgct gacaataaat ttgcactaac ttgcactagc181 acacactttg cttttgcttg tgctgacggt actcgacata cctatcagct gcgtgcaaga241 tcagtttcac caaaactttt catcagacaa gaggaggttc aacaagagct ctactcgcca301 ctttttctca ttgttgctgc tctagtattt ttaatacttt gcttcaccat taagagaaag361 acagaatgae.1 atggacccca atcaaaccaa cgtagtgccc cccgcattac atttggtgga cccacagatt61 caactgacaa taaccagaat ggaggacgca atggggcaag gccaaaacag cgccgacccc
121 aaggtttacc caataatact gcgtcttggt tcacagctct cactcagcat ggcaaggagg181 aacttagatt ccctcgaggc cagggcgttc caatcaacac caatagtggt ccagatgacc241 aaattggcta ctaccgaaga gctacccgac gagttcgtgg tggtgacggc aaaatga根據(jù)其他冠狀病毒的研究結(jié)果，位于病毒表面的輻條樣蛋白(S蛋白)是病毒的主要中和性抗原，核衣殼蛋白(N蛋白)和膜蛋白(M蛋白)也可以誘導免疫效應(yīng)，因此S蛋白及M、N蛋白均可應(yīng)用于抗SARS冠狀病毒疫苗研究。因此，編碼SARS冠狀病毒S蛋白及M、N蛋白的cDNA制備也可應(yīng)用于本發(fā)明的抗SARS冠狀病毒細胞疫苗。
全基因合成SARS基因組cDNA序列整合于pUC18質(zhì)粒的SmaI位點上。
2.構(gòu)建SARS冠狀病毒所特有的cDNA序列的真核表達載體。
本發(fā)明中的真核表達載體主要作用是能夠使上述步驟1目標基因穩(wěn)定地導入靶細胞中并穩(wěn)定表達蛋白。本發(fā)明的抗SARS冠狀病毒細胞疫苗可以使用腺病毒表達載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、和一般的真核表達質(zhì)粒來制備。
(1)、使用腺病毒表達載體含有目標基因的pUC18質(zhì)粒和腺病毒穿梭質(zhì)粒pShuttle-CMV經(jīng)Kpn I及Xho I雙酶切，0.8％瓊脂糖電泳膠回收獲得約9.2kb的載體DNA和相應(yīng)長度的目標基因。目的基因與載體DNA在16℃下經(jīng)DNA快速連接酶連接17h，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化新鮮感受態(tài)大腸桿菌DH5α，接種卡那霉素LB平板培養(yǎng)16h，挑取陽性克隆擴增培養(yǎng)，用小量質(zhì)粒提取試劑盒按說明書提取并純化pAdTrack-sCD40LIg質(zhì)粒，獲得重組穿梭質(zhì)粒。
分別對重組穿梭質(zhì)粒酶切鑒定正確后，將正確重組的穿梭質(zhì)粒用Pme I酶切線性化，轉(zhuǎn)化含腺病毒骨架質(zhì)粒的感受態(tài)pAdEasy-1-BJ5183細菌。卡那霉素選擇培養(yǎng)基和PCR篩選陽性克隆，擴增培養(yǎng)，提純質(zhì)粒。用Pac I酶切重組質(zhì)粒，0.5％瓊脂糖凝膠電泳鑒定，酶切后產(chǎn)生約30kb和4.5kb左右的兩條帶。鑒定成功的重組子轉(zhuǎn)化超感受態(tài)XL10-Gold菌，篩選陽性克隆并提取純化，得到重組腺病毒基因組質(zhì)粒。
重組腺病毒基因組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293細胞重組腺病毒基因組質(zhì)粒用Pac I酶切線性化，回收約30kb的大片段8μg，以無抗生素無血清的L-DMEM稀釋為250μL；取LipofectamineTM2000脂質(zhì)體10μL，無抗生素無血清的L-DMEM稀釋為250μL，室溫下放置5min后同前回收稀釋的DNA混合，室溫下放置20min，加入6孔培養(yǎng)板中的293包裝細胞，輕輕混勻，37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中孵育，13天后便可觀察到細胞病變效應(yīng)(cytopathiceffectCPE)。收集完全病變培養(yǎng)孔中的細胞及培養(yǎng)液，-20℃和37℃反復(fù)凍融3次，上清加入293細胞中繼續(xù)感染。收集病變的293細胞及培養(yǎng)液，按上述方法反復(fù)凍融3次，離心，上清加入1mg蛋白酶K、2mL1％SDS、10mmol/L EDTA和20mmol/LTris-HCl消化2h。離心取上清，酚氯仿抽提，無水乙醇沉淀，獲得病毒的DNA，以此為模板進行PCR鑒定。
鑒定正確后獲得含有SARS冠狀病毒所特有的cDNA序列的腺病毒表達載體(2)使用逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體分別提取酶切含有目標基因的pUC18質(zhì)粒和pLXSN表達載體質(zhì)粒DNA，經(jīng)XhoI、StuI雙酶切后，瓊脂糖凝膠電泳分別回收5.7Kb pLXSN載體片段和相應(yīng)長度的目標基因片段，以載體∶插入片段為1∶3的摩爾比按DNA快速連接試劑盒說明連接，轉(zhuǎn)化冷凍保存的JM109感受態(tài)菌，挑選陽性轉(zhuǎn)化克隆，擴增，提取質(zhì)粒，XhoI、StuI雙酶切鑒定重組子。
PA317細胞培養(yǎng)于含10％NCS的DMEM培養(yǎng)基中，37℃，5％CO2培養(yǎng)，胰酶/EDTA消化傳代。取生長狀態(tài)良好、增殖活躍的PA317細胞胰酶/EDTA常規(guī)消化，計數(shù)，以1×105細胞/孔接種6孔塑料培養(yǎng)板，37℃，5％CO2培養(yǎng)24h后(約70％匯合)，無血清DMEM洗3次去除殘余血清，然后加入無血清DMEM，37℃，5％CO2 20min；另取DNA/脂質(zhì)體比例為1ug/1μl的DOSPER和pLXSN-CTLA4Ig-IRES2-EGFP DNA加入HBS中，以100μl/孔的量制備DNA-DOSPER混合液，室溫放置15min，緩慢滴加至細胞中，培養(yǎng)6h，DMEM徹底洗去DOSPER，繼續(xù)培養(yǎng)24h后，常規(guī)消化傳代，以不同稀釋比例接種于9cm培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶中，加入G418(500ug/ml)，隔天換液，洗去死細胞，12-14天后待抗性克隆長出，在顯微鏡下標記出生長良好的G418抗性克隆，以克隆環(huán)蘸取少許凡士林分隔細胞克隆，向克隆環(huán)中加入消化液消化細胞，轉(zhuǎn)入24孔板內(nèi)培養(yǎng)，然后轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶中擴增。
分別收獲轉(zhuǎn)基因PA317細胞和對照細胞，按107/ml加入異硫氰酸胍變性液，勻漿，轉(zhuǎn)移至15ml離心管中，加入1∶10體積10mol/L乙酸鈉溶液，充分混勻，再加1.2倍體積的飽和酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)溶液，顛倒充分混合，振蕩10sec，于冰上靜置15min，離心12000rpm/10min(4℃)取上清入另一離心管，加入等體積的異丙醇，混勻，于-20℃放置1hr以上，離心12000rpm/20min(4℃)沉淀RNA，加入原體積的1/10變性液，旋轉(zhuǎn)搖動充分溶解，加入等體積的異丙醇，混勻，-20℃放置1hr以上，離心12000rpm/20min(4℃)所得RNA沉淀用75％冷乙醇洗滌兩次(注意勿打散沉淀物)，同上離心，真空抽干，溶于適量無RNase的去離子水中，紫外分光光度計測RNA含量和純度。
RNA濃度(ug/μl)＝OD260×核酸稀釋倍數(shù)×40/1000RNA純度OD260/OD280不小于1.8-2.0，低于此值則重新抽提，-20℃短期保存。反轉(zhuǎn)錄合成DNA反應(yīng)條件；25℃×10min→42℃×60min→99℃×5min→4℃×5min以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進行PCR鑒定。
鑒定正確后獲得含有SARS冠狀病毒所特有的cDNA序列的逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體(3)一般的真核表達質(zhì)粒分別提取酶切含有目標基因的pUC18質(zhì)粒和真核表達載體質(zhì)粒pDNA3.1，經(jīng)EcoRI、BamHI雙酶切后，瓊脂糖凝膠電泳分別回收pDNA3.1載體片段和相應(yīng)長度的目標基因片段后，以載體∶插入片段為1∶3的摩爾比按DNA快速連接試劑盒說明連接，轉(zhuǎn)化冷凍保存的JM109感受態(tài)菌，挑選陽性轉(zhuǎn)化克隆，擴增，提取質(zhì)粒，EcoRI、BamHI雙酶切鑒定重組子。
鑒定正確后獲得含有SARS冠狀病毒所特有的cDNA序列的真核表達載體3.將構(gòu)建好的SARS冠狀病毒所特有的cDNA序列的真核表達載體導入豬B細胞中，使豬B細胞表達相應(yīng)SARS冠狀病毒蛋白。
(1)、一般的真核表達質(zhì)粒提取含有目標基因的真核表達載體質(zhì)粒pDNA3.1并經(jīng)酶切鑒定、DNA濃度和純度鑒定后備用。將豬B細胞于10％熱滅活胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。在DOTAP轉(zhuǎn)染前1天傳代于6孔板中，接種密度為1.5×105/ml。
①脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法取6μg含有目標基因的真核表達載體質(zhì)粒pDNA3.1入無菌EP管①中，HBS液稀釋至60μl(DNA濃度為0.1μg/μl)；取36μl DOTAP液入另一EP管②中，HBS液稀釋至120μl；將①和②輕柔混合后室溫孵育15min；然后與6ml培養(yǎng)基混合備用。離心去除所有培養(yǎng)基，每孔中加入1ml轉(zhuǎn)染液進行轉(zhuǎn)染，6h后更換培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。
②NucleofectorTM轉(zhuǎn)染方法離心收集豬B細胞，細胞數(shù)為106，選擇針對B細胞的轉(zhuǎn)染液100μl重懸細胞，加入2μg含有目標基因的真核表達載體質(zhì)粒pDNA3.1混合后移入Amaxa特制小杯；然后將小杯放入NucleofectorTM轉(zhuǎn)染儀中，選擇B細胞轉(zhuǎn)染程序電轉(zhuǎn)3s，取出小杯用500μl培養(yǎng)基沖洗后移入6孔板的一孔中培養(yǎng)。
通過RT-PCR鑒定目的基因在豬B細胞中的表達。
(2)、腺病毒表達載體步驟2所述重組腺病毒經(jīng)293細胞大量擴增和氯化銫梯度離心濃縮純化后，病毒滴度可達到1010-1011pfu，通過空斑形成實驗檢測確切的病毒滴度后，以MOI 50的濃度感染豬B細胞，感染率大于80％。繼續(xù)培養(yǎng)3天后，可通過RT-PCR鑒定目的基因在豬B細胞中的表達。
(3)、逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體步驟2所述重組腺病毒經(jīng)PA317細胞大量擴增，將多聚賴氨酸加入過濾后的病毒上清后離心2h以濃縮病毒，病毒滴度可達到106-107pfu，通過空斑形成實驗檢測確切的病毒滴度后，將豬B細胞接種于培養(yǎng)瓶，加入濃縮病毒100μl、polybrene(聚凝胺)1.6μl，培養(yǎng)3h后續(xù)加培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24h后加入G418培養(yǎng)液選擇培養(yǎng)，3天后純化豬B細胞，可通過RT-PCR鑒定目的基因在豬B細胞中的表達。
4.滅活表達相應(yīng)SARS冠狀病毒蛋白的異種抗原遞呈靶細胞(豬B細胞)，并保持其抗原性。
(1)、物理方法大量收集步驟3獲得的表達相應(yīng)SARS冠狀病毒蛋白的豬B細胞，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，細胞沉淀通過6000radγ射線滅活固定表達相應(yīng)SARS冠狀病毒蛋白的豬B細胞。用0.9％的生理鹽水制備細胞懸液，濃度為2×106/ml。既制備出抗SARS冠狀病毒的細胞疫苗。
ii.化學方法大量收集步驟3獲得的表達相應(yīng)SARS冠狀病毒蛋白的豬B細胞，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，細胞沉淀加入1～3％多聚甲醛或1～10％甲醛固定，于4℃冰箱內(nèi)作用24小時，用PBS洗滌后，加入PBS液制成細胞懸液，于4℃冰箱內(nèi)放置24小時，再用PBS液洗滌，以除去固定液，用血細胞記數(shù)板記數(shù)細胞后，用0.9％的生理鹽水制備細胞懸液，濃度為5×106/ml。既制備出抗SARS冠狀病毒的細胞疫苗。
實例2混合淋巴細胞培養(yǎng)實驗檢測抗SARS冠狀病毒的細胞疫苗直接激活人T淋巴細胞抽取健康人外周血20ml，肝素抗凝，無菌下將血置于50ml的塑料離心管中，加入等體積的0.01MPBS稀釋，另外于兩個50ml的塑料管中加入20ml淋巴細胞分離液，輕輕將上述20ml稀釋全血加入淋巴細胞分離液上，保持淋巴細胞分離液與血樣品之間界面清晰，2500rpm離心30min，取出離心管，輕輕吸出界限清晰的白膜層于另一塑料管中，予以0.01MPBS，1500rpm離心7min洗滌淋巴細胞，反復(fù)洗滌4次，至洗滌液清亮為至，再加入Hanks液懸浮細胞，1000rpm，離心5min，洗滌細胞2次，即獲得單個核細胞。把單個核細胞加入培養(yǎng)瓶，37℃，5％CO2孵箱培養(yǎng)3小時，然后輕輕沖吸培養(yǎng)基(含非貼壁細胞)1000rpm，離心5min，以含10％小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基懸浮并調(diào)整細胞濃度為1×107/ml。取1ml細胞懸液裝入經(jīng)預(yù)處理后尼龍毛柱，關(guān)閉閥門；37℃、5％CO2孵育1小時。然后用20ml預(yù)溫37℃的含20％小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基洗柱，流速1滴/秒(洗脫液中富含T淋巴細胞)。收集最初流出的5ml洗脫液即為富含T淋巴細胞的懸液。以a-醋酸萘酯酶染色法鑒定分離T淋巴細胞懸液純度。常規(guī)臺盼藍染色法檢測分離T淋巴細胞存活率。
用RPMI 1640完全培養(yǎng)基懸浮抗SARS冠狀病毒的細胞疫苗、人T淋巴細胞，并調(diào)整兩種細胞濃度為1×107/ml。在96孔板上，抗SARS冠狀病毒的細胞疫苗和人T淋巴細胞分別以1×105/孔，5×105/孔加入，每實驗組3個復(fù)孔。另設(shè)陰性對照組，加5×105人T淋巴細胞和1×105豬血管內(nèi)皮細胞；空白對照組，加5×105人T淋巴細胞。終體積為200μl，不足者以培養(yǎng)基補足。37℃，5％CO2、飽和濕度條件，培養(yǎng)96小時。培養(yǎng)結(jié)束前18小時加0.5uCi/孔3H-TdR。用細胞收集器將細胞收集于玻璃纖微濾紙上，蒸餾水反復(fù)沖洗，80℃烘干。液閃計數(shù)CPM值，結(jié)果用3孔平均值表示。
結(jié)果見圖1結(jié)果表明抗SARS冠狀病毒的細胞疫苗能夠直接激活人T淋巴細胞。
實例3免疫后小鼠T淋巴細胞對表達SARS基因片段的正常細胞殺傷活性檢測將6～8周齡、雄性BALB/C小鼠隨機分為實驗組和對照組(每組十只)，實驗組小鼠每只腹腔內(nèi)注射200ul(含有1×106)抗SARS冠狀病毒的細胞疫苗，同時對照組小鼠每只腹腔內(nèi)注射200ul0.9％的生理鹽水，每周一次，共4次。收集抗SARS冠狀病毒的細胞疫苗免疫后的小鼠T淋巴細胞作為效應(yīng)細胞，用1640培養(yǎng)液洗滌2遍，計數(shù)，調(diào)整細胞濃度為1×106/ml。SARS基因片段重組腺病毒感染的正常人原代培養(yǎng)血管內(nèi)皮細胞作為靶細胞，調(diào)整細胞濃度為1×105/ml。效應(yīng)細胞做3個復(fù)孔，每孔100ul，加入96孔U型板中，并按照效靶比10∶1加入靶細胞，200ul/孔，每組3個復(fù)孔，離心250g 4分鐘，37℃、5％CO2孵箱培養(yǎng)6小時，設(shè)僅有淋巴細胞和僅有SARS基因片段重組腺病毒感染的正常人原代培養(yǎng)血管內(nèi)皮細胞為對照孔。培養(yǎng)4小時后加10ul噻唑藍(MTT，5mg/ml)，置37℃、5％CO2孵箱中培養(yǎng)4小時。半小時后，每孔加入二甲基亞砜(DMSO)100ul溶解紫蘭色顆粒。半小時后用酶標儀(Bio-RadModel3550-UV)測量595nm的光密度值(OD595nm)，并計算細胞毒百分率。
結(jié)果見圖2結(jié)果顯示免疫組小鼠脾細胞對SARS基因片段重組腺病毒感染的正常人原代培養(yǎng)血管內(nèi)皮細胞有很強的殺傷活性。
實例4用流式細胞儀檢測免疫后小鼠血清中抗SARS基因片段重組腺病毒感染的正常人原代培養(yǎng)血管內(nèi)皮細胞抗體免疫組和對照組小鼠于第三次免疫后的第5天經(jīng)眼眶采血，收集小鼠血清，分別取1×106個SARS基因片段重組腺病毒感染的正常人原代培養(yǎng)血管內(nèi)皮細胞、正常人原代培養(yǎng)血管內(nèi)皮細胞、空腺病毒感染的正常人原代培養(yǎng)血管內(nèi)皮細胞移入流式樣品管，用PBS液洗滌，每管加入稀釋度為1∶500的小鼠治療組和對照組血清100ul。以PBS液代替小鼠血清作為一抗空白對照。于4℃冰箱內(nèi)避光作用1小時，用PBS液洗滌，每管又分別加入羊抗鼠GoatF(ab’)2 Fragment mouse IgG(H+L)-FITC(ImmunoTECH)，工作濃度1∶50，室溫避光作用30分鐘，用PBS液洗滌3次，細胞沉淀加PBS液1ml，上流式細胞儀(Coulter Elite ESP)檢測，分析其抗Mel526、MCF-7、K562抗體表達水平和平均熒光強度。
流式細胞儀檢測抗體結(jié)果見圖3從圖3可以看出，用免疫組血清染色SARS基因片段腺病毒感染的正常人原代培養(yǎng)血管內(nèi)皮細胞強陽性，而正常人原代培養(yǎng)血管內(nèi)皮細胞、空腺病毒感染的正常人原代培養(yǎng)血管內(nèi)皮細胞染色陽性，說明免疫組小鼠產(chǎn)生了抗SARS基因片段腺病毒感染的正常人原代培養(yǎng)血管內(nèi)皮細胞抗體。未免疫組小鼠血清染色上述細胞均為陰性。
權(quán)利要求
1.一種抗SARS冠狀病毒的細胞疫苗，其特征在于①含有SARS冠狀病毒S蛋白的全長基因序列的全部或部分基因片段及5個特有的cDNA片段的真核表達載體；②表達上述SARS冠狀病毒基因相應(yīng)蛋白的異種抗原遞呈細胞；③將表達SARS冠狀病毒相關(guān)蛋白的異種抗原遞呈細胞滅活。
2.根據(jù)權(quán)利1所述的一種抗SARS冠狀病毒的細胞疫苗，其特征在于含有SARS冠狀病毒S蛋白的全長基因序列的全部或部分基因片段及5個特有的cDNA片段，5個特有的cDNA片段為a.1 atggatttgt ttatgagatt ttttactctt ggatcaatta ctgcacagcc agtaaaaatt61 gacaatgctt ctcctgcaag tactgttcat gctacagcaa cgataccgct acaagcctca121 ctccctttcg gatggcttgt tattggcgtt gcatttcttg ctgtttttca gagcgctacc181 aaaataattg cgctcaataa aagatggcag ctagcccttt ataagggctt ccagttcatt241 tgcaatttac tgctgctatt tgttaccatc tattcacatc ttttgcttgt cgctgcaggt301 atggaggcgc aatttttgta cctctatgcc ttgatatatt ttctacaatg catcaacgca361 tgtagaatta ttatgagatg ttggctttgt tggaagtgca aatccaagaa cccattactt421 tatgatgcca actactttgt ttgctggcac acacataact atgactactg tataccatat481 aacagtgtca cagatacaat tgtcgttact gaaggtgacg gcatttcaac accaaaactc541 aaagaagact accaaattgg tggttattct gaggataggc actcaggtgt taaagactat601 gtcgttgtac atggctattt caccgaagtt tactaccagc ttgagtctac acaaattact661 acagacactg gtattgaaaa tgctacattc ttcatcttta acaagcttgt taaagaccca721 ccgaatgtgc aaatacacac aatcgacggc tcttcaggag ttgctaatcc agcaatggat781 ccaatttatg atgagccgac gacgactact agcgtgcctt tgtaab.1 atgatgccaa ctactttgtt tgctggcaca cacataacta tgactactgt ataccatata61 acagtgtcac agatacaatt gtcgttactg aaggtgacgg catttcaaca ccaaaactca121 aagaagacta ccaaattggt ggttattctg aggataggca ctcaggtgtt aaagactatg181 tcgttgtaca tggctatttc accgaagttt actaccagct tgagtctaca caaattacta241 cagacactgg tattgaaaat gctacattct tcatctttaa caagcttgtt aaagacccac301 cgaatgtgca aatacacaca atcgacggct cttcaggagt tgctaatcca gcaatggatc361 caatttatga tgagccgacg acgactacta gcgtgccttt gtaagcacaa gaaagtgagt421 acgaacttat gtactcattc gtttcggaag aaacaggtac gttaac.1 atgtttcatc ttgttgactt ccaggttaca atagcagaga tattgattat cattatgagg61 actttcagga ttgctatttg gaatcttgac gttataataa gttcaatagt gagacaatta121 tttaagcctc taactaagaa gaattattcg gagttagatg atgaagaacc tatggagtta181 gattatccat aad.1 atgaaaatta ttctcttcct gacattgatt gtatttacat cttgcgagct atatcactat61 caggagtgtg ttagaggtac gactgtacta ctaaaagaac cttgcccatc aggaacatac121 gagggcaatt caccatttca ccctcttgct gacaataaat ttgcactaac ttgcactagc181 acacactttg cttttgcttg tgctgacggt actcgacata cctatcagct gcgtgcaaga241 tcagtttcac caaaactttt catcagacaa gaggaggttc aacaagagct ctactcgcca301 ctttttctca ttgttgctgc tctagtattt ttaatacttt gcttcaccat taagagaaag361 acagaatgae.1 atggacccca atcaaaccaa cgtagtgccc cccgcattac atttggtgga cccacagatt61 caactgacaa taaccagaat ggaggacgca atggggcaag gccaaaacag cgccgacccc121 aaggtttacc caataatact gcgtcttggt tcacagctct cactcagcat ggcaaggagg181 aacttagatt ccctcgaggc cagggcgttc caatcaacac caatagtggt ccagatgacc241 aaattggcta ctaccgaaga gctacccgac gagttcgtgg tggtgacggc aaaatga
3.根據(jù)權(quán)利1所述的一種抗SARS冠狀病毒的細胞疫苗，其特征在于含有SARS冠狀病毒S蛋白的全長基因序列的全部或部分基因片段及5個特有的cDNA片段的真核表達載體，包括各種病毒表達載體和真核表達質(zhì)粒。
4.根據(jù)權(quán)利1所述的一種抗SARS冠狀病毒的細胞疫苗，其特征在于采用與宿主不同種屬的異種抗原遞呈細胞作為細胞疫苗的細胞載體，包括但不限于原代培養(yǎng)和已建系的異種B細胞。
5.根據(jù)權(quán)利1所述的一種抗SARS冠狀病毒的細胞疫苗，其特征在于異種抗原遞呈細胞表達上述SARS冠狀病毒基因相應(yīng)蛋白。
6.根據(jù)權(quán)利1所述的一種抗SARS冠狀病毒的細胞疫苗，其特征在于將表達SARS冠狀病毒相關(guān)蛋白的靶細胞滅活，包括通過多聚甲醛或福爾馬林液固定滅活靶細胞，通過γ射線滅活固定靶細胞。
7.根據(jù)權(quán)利1所述的一種抗SARS冠狀病毒的細胞疫苗在預(yù)防和治療非典型肺炎中的應(yīng)用
全文摘要
本發(fā)明公開一種抗SARS冠狀病毒的細胞疫苗及應(yīng)用，所述細胞疫苗①含有SARS冠狀病毒S蛋白的全長基因序列的全部或部分基因片段及5個特有的cDNA片段的真核表達載體；②表達上述SARS冠狀病毒基因相應(yīng)蛋白的異種抗原遞呈細胞；③將表達SARS冠狀病毒相關(guān)蛋白的異種抗原遞呈細胞滅活。將上述細胞疫苗用于包括人類和嚙齒類動物如小鼠在內(nèi)的宿主進行免疫，使其產(chǎn)生保護性的體液免疫和細胞免疫，以抵抗引起非典型性肺炎傳染病的SARS冠狀病毒的感染。本發(fā)明安全性和穩(wěn)定性好，生產(chǎn)方便，價格便宜，能誘導機體同時產(chǎn)生針對引起非典的SARS冠狀病毒的有效體液免疫和細胞免疫，為治療和預(yù)防非典型性肺炎提供了有效且價廉的疫苗。
文檔編號A61K45/00GK1990042SQ20051005709
公開日2007年7月4日 申請日期2005年5月31日 優(yōu)先權(quán)日2005年5月31日
發(fā)明者賀偉峰, 吳軍 申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院