專利名稱：：一種燈盞花素注射液及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種燈盞花素注射液及其制備方法。
背景技術(shù)：
：燈盞花素是從菊科植物短葶飛蓬[Erigeronbreviscapus(Vant)Hand-Mazz]植物中提取的總黃酮類物質(zhì)，其90％以上含量為燈盞花乙素，具有擴(kuò)張微血管、改善微循環(huán)、提高心肌功能和心腦供血、降低血粘度、抑制血小板聚集、防栓及溶栓、降低血脂等功能。目前，燈盞花素的臨床應(yīng)用主要是小針劑，但臨床應(yīng)用發(fā)現(xiàn)低劑量的燈盞花素效果不佳，只有大劑量應(yīng)用才顯效。臨床應(yīng)用需將多支小針鋸開后倒入生理鹽水或葡萄糖注射液中進(jìn)行靜滴，不但操作麻煩，而且更容易造成二次污染。另外，已上市的燈盞花素凍干制劑，雖然在穩(wěn)定性方面有較大改善，但其生產(chǎn)條件要求高，且使用更為不便，臨使用時需將安瓿瓶鋸開后注入注射用水或生理鹽水振溶后再加入生理鹽水或葡萄糖注射液中進(jìn)行輸注。燈盞花素主要成分燈盞乙素不穩(wěn)定，貯藏中容易變質(zhì)，目前臨床上使用的燈盞花素注射液均存在著這樣的問題，因此急需解決燈盞花素的穩(wěn)定性問題。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明即是為了提供一種穩(wěn)定性好的燈盞花素注射液及其制備方法。為達(dá)到發(fā)明目的本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種燈盞花素注射液，其特征在于所述的燈盞花素注射液每1000份質(zhì)量組成如下燈盞花素0.5～0.9份硫代硫酸鈉0.01～2份葡萄糖50～100份乙二胺四乙酸二鈉鈣0.01～1份針用活性碳0.1～0.3份注射用水補(bǔ)足至1000份。進(jìn)一步，所述的燈盞花素注射液每1000mL質(zhì)量組成如下燈盞花素0.5～0.9g硫代硫酸鈉0.01～2g葡萄糖50～100g乙二胺四乙酸二鈉鈣0.01～1g針用活性碳0.1～0.3g注射用水補(bǔ)足至1000mL。優(yōu)選的，所述的燈盞花素注射液每1000mL質(zhì)量組成如下燈盞花素0.6g硫代硫酸鈉1.0g葡萄糖50g乙二胺四乙酸二鈉鈣0.3g針用活性碳0.2g注射用水補(bǔ)足至1000mL。制備所述的燈盞花素注射液的方法，所述的燈盞花素注射液質(zhì)量組成如下燈盞花素0.5～0.9份，硫代硫酸鈉0.01～2份，葡萄糖50～100份，乙二胺四乙酸二鈉鈣0.01～1份，針用活性碳0.1～0.3份，注射用水1000份；所述的方法如下將處方量的硫代硫酸鈉、乙二胺四乙酸二鈉鈣溶解于注射用水中；接著加入燈盞花素，邊攪拌邊滴力1N的NaOH使全溶；然后加入葡萄糖，充分?jǐn)嚢?；補(bǔ)充注射用水至近1000份，用10％的NaHCO3調(diào)節(jié)PH到7.6～8.0，定容；最后加入針用活性碳，攪拌，靜置，脫碳，加注射用水定容至1000份，精濾，充氮分劑量灌封，滅菌，即得所述的燈盞花素注射液。具體的，所述的燈盞花素注射液每1000mL質(zhì)量組成如下燈盞花素0.5～0.9g，硫代硫酸鈉0.01～2g，葡萄糖50～100g，乙二胺四乙酸二鈉鈣0.01～1g，針用活性碳0.1～0.3g，補(bǔ)足注射用水至1000mL；并按如下方法制備得到將處方量的硫代硫酸鈉、乙二胺四乙酸二鈉鈣溶解于注射用水中；接著加入燈盞花素，邊攪拌邊滴加1N的NaOH使全溶；然后加入葡萄糖，充分?jǐn)嚢瑁谎a(bǔ)充注射用水至近足量，用10％的NaHCO3調(diào)節(jié)PH到7.6～8.0，加注射用水定容至足量；最后加入針用活性碳，攪拌，靜置，脫碳，精濾，充氮灌封，滅菌，即得所述的燈盞花素注射液。優(yōu)選的，所述的燈盞花素注射液每1000mL質(zhì)量組成如下燈盞花素0.6g，硫代硫酸鈉1g，葡萄糖50g，乙二胺四乙酸二鈉鈣0.3g，針用活性碳0.2g，補(bǔ)足注射用水至1000mL；并按如下方法制備得到將處方量的硫代硫酸鈉、乙二胺四乙酸二鈉鈣溶解于注射用水中；接著加入燈盞花素，邊攪拌邊滴加1N的NaOH使全溶；然后加入葡萄糖，充分?jǐn)嚢瑁谎a(bǔ)充注射用水至近足量，即接近配制量，用10％的NaHCO3調(diào)節(jié)PH到7.8，最后加入針用活性碳，攪拌，靜置，脫碳，加注射用水定容至足量；精濾，充氮分劑量灌封，通常按每瓶50ml、100ml或250ml規(guī)格分裝，100℃滅菌半小時，即得所述的燈盞花素注射液。本發(fā)明所述的燈盞花素注射液的有益效果主要體現(xiàn)在不僅溶液的穩(wěn)定性高、藥效好，解決了臨床中燈盞花素大劑量使用的穩(wěn)定問題，并且避免了小針抽取注入葡萄糖大輸液的中間環(huán)節(jié)，使用方便，避免了二次污染，保障了用藥安全。(四)說明書附1為燈盞花素指紋圖譜；圖2為表10中處方1所述注射液指紋圖譜；圖3為表10中處方2所述注射液指紋圖譜；圖4為表10中處方3所述注射液指紋圖譜；圖5為表10中處方4所述注射液指紋圖譜；圖6為燈盞花素注射液對冠脈結(jié)扎狗心電圖ST段升高的影響(變化％，n＝5)；圖7為實施例4中試驗4的實驗裝置圖；圖8為燈盞花素注射液對血栓形成的影響；具體實施方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此實施例1燈盞花素注射液制備處方燈盞花素60gNa2S2O3100gEDTANa-Ca30g葡萄糖5kg針用活性碳20g注射用水補(bǔ)足至100L。工藝將Na2S2O3、EDTANa-Ca溶解在90L注射用水中；加入原料，邊攪拌邊滴加1N的NaOH適量，使全溶。加入葡萄糖，充分?jǐn)嚢?；補(bǔ)充注射用水至近100L，用10％的NaHCO3調(diào)節(jié)PH到7.8，加入針用活性碳，攪拌，放置半小時，脫碳，定容至100L；精濾，充氮灌封，每瓶100mL；100℃滅菌半小時，即得所述的燈盞花素注射液。實施例2燈盞花素注射液制備處方燈盞花素80gNa2S2O3150gEDTANa-Ca50g葡萄糖8kg針用活性碳30g注射用水補(bǔ)足至100L。工藝將Na2S2O3、EDTANa-Ca溶解在90L注射用水中；加入原料，邊攪拌邊滴加1N的NaOH適量，使全溶。加入葡萄糖，充分?jǐn)嚢瑁谎a(bǔ)充注射用水至近100L，用10％的NaHCO3調(diào)節(jié)PH到8.0，加入針用活性碳，攪拌，放置半小時，脫碳，定容至100L；精濾，充氮灌封，每瓶100mL；100℃滅菌半小時，即得所述的燈盞花素注射液。實施例3燈盞花素注射液制備處方燈盞花素50gNa2S2O350gEDTANa-Ca10g葡萄糖6kg針用活性碳10g注射用水補(bǔ)足至100L。工藝將Na2S2O3、EDTANa-Ca溶解在90L注射用水中；加入原料，邊攪拌邊滴加1N的NaOH適量，使全溶。加入葡萄糖，充分?jǐn)嚢?；補(bǔ)充注射用水至近100L，用10％的NaHCO3調(diào)節(jié)PH到7.7，加入針用活性碳，攪拌，放置半小時，脫碳，定容至100L；精濾，充氮灌封，每瓶100mL；100℃滅菌半小時，即得所述的燈盞花素注射液。實施例4不同處方穩(wěn)定性實驗處方(以100mL為例)燈盞花素、EDTANa-Ca、葡萄糖、硫代硫酸鈉/亞硫酸鈉/維生素C/L-精氨酸用量見表1，針用活性碳0.2g，注射用水補(bǔ)足至100ml。一、不同抗氧劑的穩(wěn)定性比較表1不同抗氧劑處方以上四處方按實施例1所述方法配制灌封，經(jīng)高溫(100℃)破壞，從色澤、PH、含量及指紋圖譜方面來考察各處方的穩(wěn)定性，見表2和表3～7表2指紋圖譜相關(guān)參數(shù)ODS柱，甲醇-乙腈-0.1％三乙胺(用磷酸調(diào)節(jié)pH4.0)(12∶12∶76)為流動相；檢測波長284nm；進(jìn)樣體積2.00μL，對照品為燈盞花素60mg加注射用水配成的100mL溶液。不同抗氧劑注射液指紋圖譜色譜峰結(jié)果見表3～7。表3對照品指紋圖譜色譜峰結(jié)果表4抗氧劑為硫代硫酸鈉時注射液指紋圖譜色譜峰結(jié)果表5抗氧劑為亞硫酸鈉時注射液指紋圖譜色譜峰結(jié)果表6抗氧劑為維生素C時注射液指紋圖譜色譜峰結(jié)果<tablesid="table5"num="005"><tablewidth="612">12.8641408554.821059323.383228190.78188137.65138740.1324348.76458700.20348513.410358051.231507614.112254959887.32103518722.7751098373.763212826.745513141.761314</table></tables>表7抗氧劑為L-精氨酸時注射液指紋圖譜色譜峰結(jié)果<tablesid="table6"num="006"><tablewidth="613">峰數(shù)保留時間面積面積含量(％)峰高12.85845950413.904013923.383288880.87574233.847658251.991056047.67646900.1433558.75255140.17340613.442339441.031454714.154254492576.98102945822.9071116973.383172926.934510871.551309</table></tables>結(jié)論以指紋圖譜判斷，1較好，3與之相近，但結(jié)合pH值等因素，以1最佳。二、不同硫代硫酸鈉用量的穩(wěn)定性比較處方(以100mL為例)燈盞花素、EDTANa-Ca、葡萄糖、硫代硫酸鈉用量見表8，針用活性碳0.2g，注射用水補(bǔ)足至100ml。表8以上四處方按實施例1所述方法配制灌封，經(jīng)高溫(100℃)破壞，從色澤、PH、含量來考察各處方的穩(wěn)定性，見表9表9結(jié)論綜合各指標(biāo)，以3最佳。三、不同EDTA鈣鈉用量的穩(wěn)定性比較處方(以100mL為例)燈盞花素、EDTANa-Ca、葡萄糖、硫代硫酸鈉用量見表10，針用活性碳0.2g，注射用水補(bǔ)足至100ml。表10以上四處方按實施例1所述方法配制灌封，經(jīng)高溫(100℃)破壞，從色澤、PH、含量及指紋圖譜方面來考察各處方的穩(wěn)定性，見表11和表12表11指紋圖譜相關(guān)參數(shù)0DS柱，甲醇-乙腈-0.1％三乙胺(用磷酸調(diào)節(jié)pH4.0)(12∶12∶76)為流動相；檢測波長284nm，進(jìn)樣體積20.00μL，對照品為燈盞花素60mg加注射用水配成的100mL溶液。不同EDTACaNa含量注射液指紋圖譜見圖1～5，色譜峰結(jié)果見表12。表12不同EDTACaNa含量注射液指紋圖譜色譜峰結(jié)果結(jié)論以指紋圖譜為主，綜合各指標(biāo)，以處方2最佳。實施例5藥效實驗摘要實驗結(jié)果證明，燈盞花素注射液1-3mg/kg靜脈注射給藥使冠狀動脈結(jié)扎狗心電圖有顯著改善，心肌缺血范圍縮小，定量組織學(xué)檢測結(jié)果與心電圖測定結(jié)果一致，燈盞花素注射液各劑量組與對照組比較梗塞范圍顯著減小。燈盞花素注射液可使心肌耗氧量下降。實驗結(jié)果證實，燈盞花素注射液對狗冠脈結(jié)扎引起的心肌梗塞有明顯的治療作用，提示燈盞花素注射液對胸痹心痛等癥具有治療作用。1燈盞花素注射液對狗心肌梗塞的治療作用研究1.1試驗?zāi)康挠^察燈盞花素注射液對狗冠狀動脈結(jié)扎心梗治療作用。1.2試驗材料1.2.1受試藥物實施例1所得燈盞花素注射液，性狀本品為棕黃色澄清液體。1.2.2陽性藥物葛根素注射液，購自廣東燕塘生物化學(xué)藥業(yè)有限公司，批號010823，含量100mg/2ml，性狀無色澄清液體1.2.3其他藥品巴比妥鈉，批號820301，上海試劑三廠，用生理鹽水配成20％溶液。硫噴妥鈉，批號010702，上海新亞藥業(yè)有限公司進(jìn)口分裝。利多卡因注射液，100mg/5ml，批號20011203，江蘇常州國營武進(jìn)制藥廠。0.9％氯化鈉注射液，500ml瓶裝，批號01041606，國營張家港市制藥廠。氯化硝基四氮唑藍(lán)，批號930423，上海前進(jìn)試劑廠，用0.1MpH7.4磷酸緩沖液配成0.1％溶液。1.2.3、試驗動物雜種狗25條，雌雄兼用，體重7.2±1.3kg，隨機(jī)分為5組。由浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供。動物飼養(yǎng)合格證浙實驗動物準(zhǔn)字(2001)001號。1.2.4、試驗儀器MEDLAB生物信號采集處理系統(tǒng)，南京美易科技有限公司生產(chǎn)。DH-150型動物人工呼吸機(jī)，浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)儀器廠生產(chǎn)。電子分析天平，瑞士63GIESSEII。1.2.5、劑量設(shè)置本實驗設(shè)置五組，受試藥物的高(3mg/kg)、中(2mg/kg)、低(1mg/kg)三個劑量組，以注射液中含燈盞花素質(zhì)量計算，陽性對照組和陰性對照組。本品臨床給藥途徑為靜脈注射給藥，故本實驗采用與臨床途徑一致的靜脈注射給藥。1.3實驗方法將狗用硫噴妥鈉(30mg/kg，靜脈注射)+巴比妥鈉(300mg/kg，腹腔注射)麻醉，同時氣管插管，接人工呼吸機(jī)，以20次/分頻率，呼吸時比2∶1進(jìn)行人工呼吸，調(diào)節(jié)潮氣量至呼吸正壓為15cmH2O。將動物仰臥固定于手術(shù)臺上，于右側(cè)腹股溝處分離股靜脈，插入導(dǎo)管作輸液用。左側(cè)胸壁第4、5肋間開胸，用擴(kuò)張器張開胸腔，距迷走神經(jīng)2cm處沿神經(jīng)走向剪開心包，然后將心包縫合于胸壁，充分暴露心臟；在冠狀動脈左前降支第二至第三分枝間游離冠狀動脈，其下穿線二根，同時用MEDLAB生物信號處理系統(tǒng)描記正常肢體導(dǎo)聯(lián)II心電圖。采用Harris兩步結(jié)扎法首次結(jié)扎前2分鐘，從股靜脈iv利多卡因5mg/kg，在結(jié)扎時加入一6號注射針，結(jié)扎后拔去；在首次結(jié)扎后30分鐘，行第二次結(jié)扎。第二次結(jié)扎后10分記錄心電圖為給藥前數(shù)據(jù)，然后以1ml/kg靜脈注射試驗樣品，陰性對照組給予同體積生理鹽水。分別于給藥后5、15、30、60、90、120和180分鐘記錄心電圖，測出各點心電圖ST段升高值。在第3小時處死動物，迅速取出心臟，稱出全心重量，切去心房及右心室，稱出左心室重量，放入冰箱速凍1小時，在冠脈結(jié)扎線下，平行于冠狀溝將心室等厚切成5片，放入0.1％硝基四氮唑藍(lán)(N-BT)溶液中，于37℃恒溫水浴振搖染色10分鐘。正常心肌染為暗藍(lán)色，梗塞區(qū)心肌不著色為淺紅色，仔細(xì)切下梗塞部分，稱出梗塞區(qū)重量，計算出梗塞區(qū)重量占全心及左室重量的百分比。試驗數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。給藥前后變化的統(tǒng)計檢驗用各組不同時間點變化百分率同生理鹽水組同一時間變化率作方差分析(F檢驗)及各實驗組與對照組比較的q′(Dunnett法)檢驗。1.4實驗結(jié)果(1)燈盞花素注射液對心電圖心肌缺血程度的影響結(jié)扎后10分鐘，各組心電圖ST段明顯升高。燈盞花素注射液中、高劑量組及陽性對照葛根素注射液組從給藥后5分鐘起就可使心電圖sT段顯著下降(P＜0.01)；低劑量組ST段下降在給藥后15分鐘(P＜0.05)和60分鐘以后(P＜0.01)有顯著差異。結(jié)果見表13及圖6。實驗結(jié)果表明，燈盞花素注射液1～3mg/kg靜脈注射給藥對狗冠脈結(jié)扎引起的心電圖的心電圖sT段明顯升高有顯著的治療作用。(2)燈盞花素注射液對心肌梗塞范圍的定量組織學(xué)檢測影響用N-BT染色顯示燈盞花素注射液對心肌梗塞范圍的影響與心電圖測定結(jié)果一致。燈盞花素注射液各劑量組及陽性對照葛根素注射液組與陰性對照組比較，心肌梗塞范圍顯著減小(低劑量組P＜0.05，其余P＜0.01)。結(jié)果見表14。表13燈盞花素注射液對冠脈結(jié)扎狗心電圖ST段升高的影響(mv，X±s，n＝5)*p＜0.05，**p＜0.01，與陰性對照組同時間點的改變值比較。表14.燈盞花素注射液對N-BT染色測定心肌梗塞范圍的影響(X±s，n＝5)*P＜0.05，**P＜0.01同生理鹽水組比較2燈盞花素注射液對狗離體培養(yǎng)心肌耗氧量的影響2.1實驗?zāi)康挠^察燈盞花素注射液對狗心肌耗氧量的影響2.2試驗材料2.2.1、供試樣品實施例1所得燈盞花素注射液濃縮后，按注射液中燈盞花素質(zhì)量含量，配制成不同劑量的加藥臺式液(小劑量加藥臺氏液1mg/70ml，中劑量加藥臺氏液2mg/70ml，大劑量加藥臺氏液3mg/70ml，含量以燈盞花素質(zhì)量計算)、葛根素2.2.2、其他藥品同實驗12.2.3、動物同實驗12.2.4、儀器CIBA850型血氣/電解質(zhì)分析儀，美國Corning公司生產(chǎn)電熱恒溫水浴，上海醫(yī)療器械三廠生產(chǎn)電子分析天平，瑞士63GIESSEII。2.3實驗方法將正常狗麻醉處死，迅速取出心臟，于低溫臺氏(Tyrodes)液中洗盡淤血，取左心室心肌組織一塊，在冰浴盤上切片，在電子天平上精確稱取若干60mg心肌塊，分別放入10ml玻璃注射器，根據(jù)分組加入新鮮配制的不同心肌孵育液(純臺氏液，小劑量加藥臺氏液1mg/70ml，中劑量加藥臺氏液2mg/70ml，大劑量加藥臺氏液3mg/70ml，加葛根素臺氏液10mg/70ml，加藥量根據(jù)血液占體重的百分比換算)5.0ml，排盡空氣，用橡皮帽封住出口，于37℃恒溫水浴中平衡30分鐘，并經(jīng)常轉(zhuǎn)動。孵育液氧分壓用CIBA850型血氣分析儀測定，測量前儀器預(yù)熱1小時。實驗時，先用新鮮孵育液測定孵育前氧分壓，樣品測定完后再測定新鮮孵育液氧分壓，將前后共2次測定值平均作為孵育前氧分壓，樣品孵育完后各組織孵育液分別測孵育后氧分壓值，二者差即為該心肌組織耗氧量，以mmHgO表示。統(tǒng)計檢驗用方差分析(F檢驗)及各實驗組與對照組比較的q′(Dunnett法)檢驗。2.4實驗結(jié)果燈盞花素注射液各劑量組及陽性對照葛根素組與不加藥的陰性對照組比較心肌耗氧量顯著降低(p＜0.05)。結(jié)果見表15。表中劑量以注射液中燈盞花素質(zhì)量計算。實驗結(jié)果表明，燈盞花素注射液能降低正常心肌耗氧量。表15.燈盞花素注射液對狗離體培養(yǎng)心肌耗氧量的影響(n＝8，X±s)*P＜0.05，**P＜0.01同陰性對照組比較3燈盞花素注射液對狗冠狀動脈結(jié)扎前后血粘度的影響3.1試驗?zāi)康挠^察燈盞花素注射液對狗冠狀動脈結(jié)扎前后血粘度的影響3.2試驗材料3.2.1、供試樣品實施例1所得燈盞花素注射液、葛根素，同實驗13.2.2、其他藥品同實驗13.2.3、動物同實驗13.2.4、儀器R-80型血粘度分析儀3.3試驗方法將實驗1所用狗，在結(jié)扎前和結(jié)扎后3個小時各取血一次，然后在血粘度分析儀上測定全血血粘度。統(tǒng)計檢驗用方差分析(F檢驗)及q′(Dunnett法)檢驗比較結(jié)扎前后全血血粘度的比值。3.4試驗結(jié)果燈盞花素注射液各劑量組及陽性對照葛根素組與陰性對照組比較結(jié)扎前后全血血粘度無顯著變化。結(jié)果見表16。實驗結(jié)果表明，燈盞花素注射液對冠脈結(jié)扎狗的血粘度無明顯影響。表16.燈盞花素注射液對冠脈結(jié)扎狗血粘度的影響(X±s)4燈盞花素注射液抗血栓作用4.1試驗?zāi)康挠^察燈盞花素注射液對血液血栓形成的影響。4.2試驗材料4.2.1受試藥物實施例1所得燈盞花素注射液，性狀本品為棕黃色澄清液體。4.2.2陽性藥物阿斯匹林，購自安徽蚌埠安寶制藥廠，含量100mg/2ml，性狀無色澄清液體4.2.3其他藥品熒光素鈉(日本小林株式會社)，生理鹽水，戊巴比妥鈉(中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司)，肝素鈉注射液(南京生物化學(xué)制藥廠)4.2.3、試驗動物SD大鼠，雌雄各半，體重在250克左右，浙江醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物實驗中心提供(合格證醫(yī)動字第22-2001001號)。4.2.4、試驗儀器OLYMPUS熒光顯微鏡監(jiān)視器，錄像機(jī)，記時器，彩色攝像鏡頭注射器，標(biāo)本盒，靜脈插管，動物手術(shù)器械一套。4.2.5、劑量設(shè)置本實驗設(shè)置五組，受試藥物的高(8.1mg/kg)、中(5.4mg/kg)、低(2.7mg/kg)三個劑量組，用藥劑量以注射液中燈盞花素質(zhì)量計算。陽性對照組和陰性對照組。4.3試驗方法4.3.1試驗原理采用光-化學(xué)法，靜脈注射一定量熒光素鈉，在激發(fā)光照射下快速損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞誘發(fā)微血管內(nèi)血栓模型形成，通過熒光顯微鏡-攝相系統(tǒng)采集血栓形成的變化過程。4.3.2試驗過程SD大鼠，雌雄各半，體重250g左右，隨機(jī)分5組，每組10只，分別為生理鹽水對照組(1ml/只)、燈盞花素注射液低劑量(2.7mg/kg)組、中劑量(5.4mg/Kg)組、高劑量(8.1mg/kg)組和阿斯匹林(1mg/kg)組。取大鼠稱重，1％戊巴比妥鈉4ml/kg麻醉、固定于手術(shù)板。分離一側(cè)頸外靜脈，插管備用；腹部正中切開后將大鼠放入標(biāo)本盒，輕輕拉出腸系膜浸入裝有溫?zé)嵘睇}水的標(biāo)本槽內(nèi)。打開熒光顯微鏡、監(jiān)視器、記時器、錄像機(jī)并將動物腸系膜標(biāo)本置于熒光顯微鏡下，找出一條約20-40um粗的靜脈作為目標(biāo)血管進(jìn)行觀察。將熒光照射目標(biāo)血管1分鐘后注入實驗藥物，6分鐘后注入1.5％熒光素鈉2ml/kg大鼠，通過光-色素刺激造成血管內(nèi)血栓。觀察并記錄血栓完全堵住血管的時間，將各組時間進(jìn)行比較(t-檢驗)。實驗裝置見圖7。4試驗結(jié)果3個不同劑量的試藥組和阿斯匹林與生理鹽水組的大鼠血栓形成時間相比，均有顯著差異(p＜0.01)，見圖8、表17。表17.燈盞花素注射液對血栓形成的影響*p＜0.05**P＜0.01，與陰性對照生理鹽水組比較5燈盞花素注射液抗小鼠腦缺血作用的研究5.1試驗?zāi)康挠^察燈盞花素注射液抗小鼠腦缺血作用5.2試驗材料5.2.1受試藥物實施例1所得燈盞花素注射液5.2.2陽性藥物金納多注射液，批號4970350，來源德國威瑪舒培大藥廠生產(chǎn)，規(guī)格17.5mg/5ml/支5.2.3試驗試劑天門冬氨酸(Asp)，谷氨酸(Glu)，?；撬?Tau)，γ-氨基丁酸(GABA)標(biāo)準(zhǔn)品，衍生劑(OPA)，巰基乙醇，KH2PO4，硼酸鈉均為Sigma公司產(chǎn)品。甲醇為國產(chǎn)HPLC色譜純，乙醇為國產(chǎn)分析純。Millipore超純水配制流動相。5.2.4試驗動物ICR小鼠，體重18～22g，雌雄各半，由浙江省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供。5.2.5儀器與色譜條件島津LC-10Atvp系列，7725進(jìn)樣閥，RF-10AXL熒光檢測器。色譜柱HypersilC18BDS柱，流動相為一定比例的KH2PO4緩沖液及甲醇，PH約6.6，梯度洗脫。流量1.0ml/min，進(jìn)樣環(huán)體積20ul，柱溫為室溫，RF的激發(fā)波長357nm，發(fā)射波長455nm。柱前OPA衍生反應(yīng)法測氨基酸水平。5.3劑量設(shè)置受試藥設(shè)置高(11.7mg/kg)中、(7.8mg/kg)、低(3.9mg/kg)三個劑量組(用藥劑量以注射液中燈盞花素質(zhì)量計算)及陽性藥物組(銀杏23mg/kg)、模型組和假手術(shù)組。5.3試驗方法5.3.1原理在腦缺血狀態(tài)下，腦內(nèi)興奮性氨基酸遞質(zhì)Glu與抑制性氨基酸遞質(zhì)GABA釋放量都顯著增加。在深度腦缺血情況下，由于GABA水平升高大大高于Glu水平升高，故Glu/GABA的比值會顯著降低。這一指標(biāo)可以作為深度腦缺血的判斷標(biāo)準(zhǔn)。我們利用小鼠雙側(cè)頸動脈結(jié)扎造成急性腦缺血模型，并采用小鼠腦勻漿結(jié)合HPLC的檢測方法，可以較好地反應(yīng)出Glu/GABA在腦缺血前后的變化，在這一基礎(chǔ)上，我們利用GLU/GABA這一指標(biāo)，可以檢驗藥物抗小鼠腦缺血的保護(hù)作用5.3.2給藥取小鼠，隨機(jī)分組分為六組。組別為假手術(shù)，模型組，陽性對照組(銀杏)，試藥小劑量，試藥中劑量和試藥大劑量。按劑量一一尾靜脈注射給藥，給藥后1個小時，進(jìn)行手術(shù)。假手術(shù)與模型組注射等量的生理鹽水。5.3.3缺血實驗取ICR小鼠，以水合氯醛麻醉，小心分離，結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈及迷走神經(jīng)，15分鐘后立即斷頭，在冰臺上剝離出小鼠全腦(保留大腦及間腦)，稱重。取無水乙醇20ml，用篩網(wǎng)仔細(xì)勻漿。取勻漿液收集于1.5ml離心管，12,000rpm離心5分鐘，取上清，-30℃保存待測。并采用所建立的HPLC-RF法，對樣品進(jìn)行稀釋，OPA衍生后檢測腦勻漿液中Glu與GABA的水平。5.3.4結(jié)果處理計算各組Glu/GABA值，分別與模型組進(jìn)行統(tǒng)計比較。結(jié)果用X±SD表示，顯著性差異用ttest檢驗。5.4試驗結(jié)果試驗結(jié)果表明小鼠腦缺血后，試藥高劑量能夠升高GLU/GABA(p＜0.05)。結(jié)果見表18。表18燈盞花素注射液對小鼠雙側(cè)頸動脈結(jié)扎造成Glu/GABA變化的影響*p＜0.05vs模型**p＜0.01vs模型6結(jié)論試驗結(jié)果證明，燈盞花素注射液靜脈注射給藥能顯著改善冠脈結(jié)扎狗的心電圖表現(xiàn)，縮小心肌缺血范圍，定量組織學(xué)檢測結(jié)果與心電圖結(jié)果一致，與對照組比較梗塞區(qū)域顯著減小，證明燈盞花素注射液對狗冠狀動脈結(jié)扎引起的心肌梗塞有明顯的治療效果。血粘度實驗結(jié)果表明，燈盞花素注射液對冠脈結(jié)扎狗的血粘度無明顯影響。燈盞花素注射液對實驗動物血液血栓形成有顯著的延緩作用，說明燈盞花素注射液具有很好的抗血栓作用。試驗結(jié)果提示，燈盞花素注射液對胸痹心痛等癥具有一定的治療作用。試驗結(jié)果表明小鼠腦缺血后，燈盞花素注射液高劑量能夠升高GLU/GABA，對小鼠腦缺血也有改善作用。權(quán)利要求1.一種燈盞花素注射液，其特征在于所述的燈盞花素注射液每1000份質(zhì)量組成如下燈盞花素0.5～0.9份硫代硫酸鈉0.01～2份葡萄糖50～100份乙二胺四乙酸二鈉鈣0.01～1份針用活性碳0.1～0.3份注射用水補(bǔ)足至1000份。2.如權(quán)利要求1所述的燈盞花素注射液，其特征在于所述的燈盞花素注射液每1000mL質(zhì)量組成如下燈盞花素0.5～0.9g硫代硫酸鈉0.01～2g葡萄糖50～100g乙二胺四乙酸二鈉鈣0.01～1g針用活性碳0.1～0.3g注射用水補(bǔ)足至1000mL。3.如權(quán)利要求2所述的燈盞花素注射液，其特征在于所述的燈盞花素注射液每1000mL質(zhì)量組成如下燈盞花素0.6g硫代硫酸鈉1.0g葡萄糖50g乙二胺四乙酸二鈉鈣0.3g針用活性碳0.2g注射用水補(bǔ)足至1000mL。4.制備如權(quán)利要求1～3之一所述的燈盞花素注射液的方法，其特征在于所述的燈盞花素注射液質(zhì)量組成如下燈盞花素0.5～0.9份，硫代硫酸鈉0.01～2份，葡萄糖50～100份，乙二胺四乙酸二鈉鈣0.01～1份，針用活性碳0.1～0.3份，注射用水1000份；所述的方法如下將處方量的硫代硫酸鈉、乙二胺四乙酸二鈉鈣溶解于注射用水中；接著加入燈盞花素，邊攪拌邊滴加1N的NaOH使全溶；然后加入葡萄糖，充分?jǐn)嚢?；補(bǔ)充注射用水至近1000份，用10％的NaHCO3調(diào)節(jié)PH到7.6～8.0，最后加入針用活性碳，攪拌，靜置，脫碳，加注射用水定容至足量；精濾，充氮分劑量灌封，滅菌，即得所述的燈盞花素注射液。5.如權(quán)利要求4所述的燈盞花素注射液的制備方法，其特征在于所述的燈盞花素注射液每1000mL質(zhì)量組成如下燈盞花素0.5～0.9g，硫代硫酸鈉0.01～2g，葡萄糖50～100g，乙二胺四乙酸二鈉鈣0.01～1g，針用活性碳0.1～0.3g，補(bǔ)足注射用水至1000mL；所述的方法如下將處方量的硫代硫酸鈉、乙二胺四乙酸二鈉鈣溶解于注射用水中；接著加入燈盞花素，邊攪拌邊滴加1N的NaOH使全溶；然后加入葡萄糖，充分?jǐn)嚢?；補(bǔ)充注射用水至近足量，用10％的NaHCO3調(diào)節(jié)PH到7.6～8.0，最后加入針用活性碳，攪拌，靜置，脫碳，加注射用水定容至足量；精濾，充氮分劑量灌封，滅菌，即得所述的燈盞花素注射液。6.如權(quán)利要求4所述的燈盞花素注射液的制備方法，其特征在于所述的燈盞花素注射液每1000mL質(zhì)量組成如下燈盞花素0.6g，硫代硫酸鈉1g，葡萄糖50g，乙二胺四乙酸二鈉鈣0.3g，針用活性碳0.2g，補(bǔ)足注射用水至1000mL；所述的方法如下將處方量的硫代硫酸鈉、乙二胺四乙酸二鈉鈣溶解于注射用水中；接著加入燈盞花素，邊攪拌邊滴加1N的NaOH使全溶；然后加入葡萄糖，充分?jǐn)嚢瑁谎a(bǔ)充注射用水至近足量，用10％的NaHCO3調(diào)節(jié)PH到7.8，最后加入針用活性碳，攪拌，靜置，脫碳，加注射用水定容至足量；精濾，充氮分劑量灌封，100℃滅菌半小時，即得所述的燈盞花素注射液。全文摘要本發(fā)明提供了一種燈盞花素注射液，所述的燈盞花素注射液每1000份質(zhì)量組成如下燈盞花素0.5～0.9份，硫代硫酸鈉0.01～2份，葡萄糖50～100份，乙二胺四乙酸二鈉鈣0.01～1份，針用活性炭0.1～0.3份，注射用水補(bǔ)足至1000份。本發(fā)明所述的燈盞花素注射液的有益效果主要體現(xiàn)在不僅溶液的穩(wěn)定性高、藥效好，解決了臨床中燈盞花素大劑量使用的穩(wěn)定問題，并且避免了小針抽取注入葡萄糖大輸液的中間環(huán)節(jié)，使用方便，避免了二次污染，保障了用藥安全。文檔編號A61P9/00GK1732970SQ200510060409公開日2006年2月15日申請日期2005年8月13日優(yōu)先權(quán)日2005年8月13日發(fā)明者唐禮可,郭殿武,嚴(yán)易青,吳春霞申請人:杭州民生藥業(yè)集團(tuán)有限公司