專利名稱：一種隱孔菌多糖及其制備與應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種隱孔菌多糖及其制備方法，以及這種隱孔菌多糖在制備治療過敏性鼻炎、過敏性哮喘和成人型呼吸窘迫綜合征藥物中的應用。
背景技術：
隱孔菌俗名松橄欖、樹荷苞、樹疙瘩、荷色菌、木魚菌、香木蘭、黑邁子(云南)、一口茸(日本)。屬于真菌界、擔子菌亞門(Basidiomycotina)、層菌綱(Hymenomycetes)、非褶目[Aphyllophorales，舊系統(tǒng)作多孔菌目(Polyporales)]、多孔菌科(Polyporaceae)、隱孔菌屬(Cryptoporus)。分布于中國的四川、江蘇、浙江、湖北、吉林、云南、海南、福建等省，朝鮮、日本、歐洲、北美洲也有分布。
關于隱孔菌的藥用價值早有報道，藍茂(1397-1476)《滇南本草》記載味苦、甘，性微寒。治大腸下血，積熱之毒。療(內外)九種痔瘡，(附方)治牙齒疼，將松橄欖于疼牙上咬住，疼即止。韓國李氏等人(1981)得到的熱水提取物中的多糖蛋白具有抗癌活性。江蘇省植物研究所等編著(1990)的《新華本草綱目》記載味微苦，性平。有止咳、平喘、解毒等功能。用于治氣管炎、哮喘，還可用于小兒斷奶(云南麗江民間常用)，徐錦堂等編《中國藥用真菌學》(1997)第三十二章隱孔菌全面記載了隱孔菌的國內外的報道、藥用價值、形態(tài)結構、生活習性、生活史、生活條件、培養(yǎng)技術等。
關于隱孔菌的人工栽培未見報道，但華啟洪等對隱孔菌的液體發(fā)酵培養(yǎng)進行了研究，并申請了中國專利(專利號94117227.9)，而后杭州泰士生物技術有限公司對隱孔菌的液體發(fā)酵技術和藥用價值進行了進一步研究，發(fā)現隱孔菌的液體發(fā)酵物對過敏性哮喘和過敏性鼻炎有很好的療效，并中請了中國專利(已公開01126498.5)。
關于隱孔菌的化學成分也有報道華啟洪、金國梁等《中國藥學雜志》1993.28(2)P75～76報道了隱孔菌19種揮發(fā)油成分研究；華啟洪、金國梁等《植物資源與環(huán)境》1993.2(1)P60～61報道了隱孔菌糖、氨基酸、微量元素等化學成分研究；馬偉光等《云南植物研究》1994.16(2)P196～200報道了從野生隱孔菌中分離的四個麥角甾醇類化合物；吳錦忠、黃年來《福建中醫(yī)學院學報》1997.7(2)P21～26報道了隱孔菌發(fā)酵培養(yǎng)物和野生隱孔菌中氨基酸、糖類和水提取物、乙醇提取物、石油醚提取物之間的薄層分析結果比較。
但對于隱孔菌的有效成分研究的很少。

發(fā)明內容本發(fā)明即是為了提供一種隱孔菌多糖及制備方法，和這種隱孔菌多糖在制備治療過敏性鼻炎、過敏性哮喘和成人型呼吸窘迫綜合征藥物中的應用。
為達到發(fā)明目的本發(fā)明采用的技術方案是一種隱孔菌多糖(CFSP)，所述隱孔菌多糖由含隱孔菌或隱孔菌發(fā)酵物的原料提取制得，分子量范圍為2000～200000，主要由甘露糖、半乳糖、木糖、巖藻糖四種單糖組成，主鏈由1→6連接的甘露糖，1→6連接的半乳糖，1→3連接的巖藻糖和1→4、1→3連接的木糖構成。
所述隱孔菌多糖可由如下方法制備得到將含隱孔菌多糖的原料加水提取，水提液濃縮后加入聚乙二醇(PEG)混勻，靜置沉淀，取沉淀物用乙醇洗滌，沉淀物水溶，離心后去除蛋白質，再離心、膜分離截留2000～200000分子量范圍，濃縮后干燥得隱孔菌多糖。
所述的含隱孔菌多糖的原料為下列之一或下列兩種或兩種以上任意形式的組合①天然隱孔菌；②隱孔菌液體培養(yǎng)液；③隱孔菌菌絲體；④隱孔菌固體培養(yǎng)物；⑤隱孔菌菌粉。
一種制備上述隱孔菌多糖的方法，所述的方法如下將含隱孔菌多糖的原料加水提取，水提液濃縮后加入聚乙二醇(PEG)混勻，靜置沉淀，取沉淀物用乙醇洗滌，沉淀物水溶，離心后去除蛋白質，再離心、膜分離截留2000～200000分子量范圍，濃縮后干燥得隱孔菌多糖。
進一步，所述的方法如下將含隱孔菌多糖的原料加入5～10質量倍的水，70～90℃下提取1～4小時，水提液離心得上清液濃縮至比重為1.0～1.3，得濃縮液，每100mL濃縮液加入聚乙二醇5～50g，充分攪拌后靜置過夜沉淀，離心得沉淀物用95％乙醇洗滌，沉淀物水溶、離心后去除蛋白質，再離心、膜分離截留2000～200000分子量范圍，濃縮后干燥即得所述的隱孔菌多糖。
上述方法中，所述的含隱孔菌多糖的原料為下列之一或下列兩種或兩種以上任意形式的組合①天然隱孔菌；②隱孔菌液體培養(yǎng)液；③隱孔菌菌絲體；④隱孔菌固體培養(yǎng)物；⑤隱孔菌菌粉。
目前提取純化多糖的方法主要有1)乙醇沉淀法這種方法使用最普遍，也最具有通用性，但是操作能耗高，需要乙醇量大，費時費力，得率低。2)超濾法通過超濾膜截留提取一定分子量的多糖。這種方法也有很廣的應用范圍，能耗低，提取速度快，不需要有機溶劑。但是提取的多糖含量低，多種分子量物質殘留高。3)絡合法這種方法主要利用某些酸性多糖的特異結合性加入絡合劑使之析出，常用的絡合劑有氯化鈣、硫酸銅、十六烷基三甲基溴化銨等。這種方法能耗低，提取的多糖含量較高，但應用范圍窄，僅限于酸性多糖或者某些特性的雜多糖。4)柱分離法這種方法利用各種柱填料性質的差異來純化多糖。比如目前流行的大孔樹脂純化多糖，離子交換純化糖蛋白等等。這種方法提取的多糖純度較高，但是操作復雜，對柱子進行預處理，分步洗脫，柱子的再生，生產過程中大量的廢液處理等，得率低，成本高。且提取物常含有柱料殘留物，如大孔樹脂提取后的多糖要檢測甲苯、二甲苯的殘留量。
本發(fā)明所采用的提取方法是用PEG沉淀多糖，具體的說就是將含隱孔菌多糖的原料水提，加入聚乙二醇(PEG)，攪拌，溶解，靜置，沉淀，離心得沉淀物，沉淀物用95％乙醇洗滌，沉淀物水溶，離心，蛋白酶水解，煮沸，離心，膜分離，濃縮后干燥得質量含量在50％以上的隱孔菌多糖。本發(fā)明所解決的技術難點在于如何從水提取液中分離出粗多糖。發(fā)現用PEG沉淀多糖所得產品多糖含量要遠高于用乙醇沉淀所得多糖含量，且用PEG的量僅為乙醇用量的二十分之一左右，所以本發(fā)明得率高，含量高，成本低，且操作簡便。本發(fā)明中所用95％乙醇指乙醇體積百分含量為95％的水溶液。
所述的聚乙二醇優(yōu)選為PEG1000～20000。
所述的去除蛋白質方法可以是蛋白酶解如內切酶、外切酶或復合酶，減小蛋白質的分子量并使與糖結合的蛋白游離出來，也可以用有機溶劑如三氯乙酸，大孔樹脂吸附，加重金屬鹽，煮沸等方法沉淀蛋白質。本發(fā)明中優(yōu)選為為蛋白酶水解。
優(yōu)選的，所述的方法如下隱孔菌菌粉加入5倍質量的水，80℃提取2小時，提取液取上清液；沉淀加適量水充分攪拌提取，提取液離心得上清液，兩次上清液合并，減壓濃縮至體積縮小一倍得濃縮液，不斷攪拌下，每100mL濃縮液加入15克PEG6000，攪拌使充分溶解，室溫放置過夜，使沉淀完全，離心得沉淀用95％乙醇回流提取至提取液基本無色，得沉淀溶解于適量水中，離心除去不溶物，上清加蛋白內切酶，水解后把水解液煮沸，放冷至室溫，離心除去不溶物，上清用截流分子量50萬的超濾膜過濾，濾液用截流分子量2萬的超濾膜濃縮，濃縮液凍干即得所述的隱孔菌多糖。
或者，所述的方法如下天然隱孔菌粉碎后加入2.5倍質量的水，80℃提取2小時，提取液得上清液；沉淀加適量水充分攪拌提取，提取液離心取上清液，兩次上清液合并，減壓濃縮至體積縮小一倍得濃縮液，不斷攪拌下，每100mL濃縮液加入25克PEG20000，攪拌使充分溶解，室溫放置過夜，使沉淀完全，離心得沉淀用95％乙醇回流提取至提取液基本無色，得沉淀溶解于適量水中，離心除去不溶物，上清加蛋白內切酶，水解后把水解液煮沸，放冷至室溫，離心除去不溶物，上清用截流分子量5000的透析袋流水透析48小時，透析內液用0.45微米的膜過濾后60℃蒸干即得所述得隱孔菌多糖。
所述的隱孔菌多糖可應用于制備治療過敏性鼻炎藥物、過敏性哮喘藥物以及成人型呼吸窘迫綜合征藥物，當然也可將這種隱孔菌多糖用于制成食品、保健食品或食品添加物，應用于過敏性鼻炎、過敏性哮喘、及成人型呼吸窘迫綜合征的病人。所述的藥物可制成膠囊、片劑、顆粒劑、口服液、注射液等多種人體可接收的劑型。
過敏性鼻炎和哮喘在免疫學發(fā)病機制上非常相近，致敏原可分別在上下呼吸道激發(fā)相似的組織病理學反應，鼻腔和支氣管粘膜均有大量表達Th2細胞因子的輔助性T細胞、嗜酸性粒細胞和肥大細胞浸潤，同時產生的組胺、白三烯、前列腺素、血小板活化因子、趨化因子和緩激肽等炎性介質，在上呼吸道和下呼吸道引發(fā)相似的炎性反應過程。對患者進行鼻部變應原激發(fā)試驗后，下呼吸道粘膜中嗜酸性粒細胞浸潤增加，同時表達粘附分子的細胞數量增加，表明局部粘膜的變應性炎癥反應可能在其它部位產生相似的反應。隱孔菌多糖能夠顯著抑制嗜酸性粒細胞是其治療過敏性鼻炎和哮喘的機制之一。
成人型呼吸窘迫綜合征(adult respiratory distress syndrome，ARDS)是由急性肺損傷引起的呼吸衰竭。其發(fā)病機制很復雜，目前認為是大量中性粒細胞在趨化因子及粘附分子作用下聚集于肺、粘附于肺泡毛細血管內皮，釋放氧自由基、蛋白酶和炎癥介質等，損傷肺泡上皮細胞及毛細血管內皮細胞。肺泡毛細血管膜的損傷及炎癥介質的作用使肺泡上皮和毛細血管內皮通透性增高，引起滲透性肺水腫，致使肺彌散功能障礙。成人型呼吸窘迫綜合征的發(fā)病特征是中性粒細胞的聚集。隱孔菌多糖能夠顯著抑制多形核白細胞的聚集、多核粒細胞和淋巴單核細胞的聚集，是治療成人型呼吸窘迫綜合征的機制之一。
本發(fā)明從隱孔菌發(fā)酵物中提取一種雜多糖(CFSP)，通過采用對致敏大鼠抗原攻擊后支氣管肺灌流液中炎癥細胞(嗜酸性粒細胞EOS)的影響的藥效學研究為指標，確認了這種雜多糖是隱孔菌發(fā)酵物中的主要藥效成分；通過Sephadex G 200誘導小鼠腹腔炎癥的抗炎作用實驗進一步證實了此隱孔菌多糖是隱孔菌發(fā)酵物中的主要活性成分。
進而對此雜多糖進行了結構研究，發(fā)現此多糖主要由甘露糖、半乳糖、木糖、巖藻糖四種單糖組成，其分子中主鏈由1→6連接的甘露糖，1→6半乳糖，1→3連接的巖藻糖和1→4、1→3連接的木糖組成。
CFSP1、CFSP2、CFSP3灌胃(10mg/kg)以及靜脈注射(10mg/kg)都顯著抑制了Sephadex G 200(2mg/kg)腹腔注射引起的小鼠腹腔炎癥細胞聚集，與模型組相比，P＜0.05～0.001，見

圖1。CFSP1、CFSP2、CFSP3灌胃(10mg/kg)和靜脈注射(10mg/kg)都顯著抑制了腹腔內多形核白細胞的聚集，P＜0.05～0.01，結果見圖2。CFSP1、CFSP2、CFSP3灌胃(10mg/kg)以及靜脈注射(10mg/kg)都顯著抑制了多核粒細胞和淋巴單核細胞的聚集，與模型組相比，P＜0.05～0.001，見圖3。
本發(fā)明所述的隱孔菌多糖及其制備與應用的有益效果主要體現在(1)本發(fā)明所述隱孔菌多糖細化了具體藥效成分，能非常顯著地抑制致敏大鼠抗原攻擊后肺部嗜酸性炎癥的作用；顯著抑制了Sephadex G 200(2mg/kg)腹腔注射引起的小鼠腹腔炎癥細胞聚集，多形核白細胞的聚集，多核粒細胞和淋巴單核胞的聚集。更明確指出了隱孔菌多糖具體的藥效成分，可以開發(fā)成新藥或功能性食品或保健品用于過敏性鼻炎和過敏性哮喘及成人型呼吸窘迫綜合征，具有廣闊應用前景；(2)所述隱孔菌多糖制備方法用PEG沉淀多糖所得產品多糖含量要遠高于用乙醇沉淀所得多糖含量，且用PEG的量僅為乙醇用量的二十分之一左右，得率高，含量高，成本低，且操作簡便。
(四)說明書附1為CFSP1、CFSP2、CFSP3及地塞米松對Sephadex G 200(2mg/kg)腹腔注射引起的小鼠腹腔白細胞總數的抑制作用；(T檢驗，mean±SD；與模型組比較*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，與CFSP1組(10mg/kg，iv)比較##P＜0.01，###P＜0.001)圖2為CFSP1、CFSP2、CFSP3及地塞米松對Sephadex G 200誘導小鼠腹腔炎癥細胞分類的影響；(T檢驗，mean±SD；與模型組比較*P＜0.05，**P＜0.01)圖3為CFSP1、CFSP2、CFSP3對多核粒細胞和淋巴單核細胞的影響，與模型組比較*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，與CFSP1(10mg/kg，iv)組比較##P＜0.01，###P＜0.001。
具體實施方式
下面結合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于此
實施例1隱孔菌多糖的制備取隱孔菌菌粉2000克，加入10升水，80℃提取2小時。提取液3500轉/分離心10分鐘，得上清液1。沉淀加2升水，充分攪拌提取，3500轉/分離心10分鐘，得上清液2。將上清液1與上清液2合并，減壓濃縮至約6升，在不斷攪拌下加入1000克PEG6000，繼續(xù)攪拌1小時使PEG充分溶解。室溫放置過夜，使沉淀完全，然后將溶液3500轉/分離心10分鐘，得沉淀，棄上清。沉淀用95％乙醇在索氏提取器中回流提取6小時至提取液基本無色，揮干沉淀中的乙醇，稱重，得沉淀82克。將沉淀用2升水溶解，3500轉/分離心除去不溶物，上清加500mg蛋白內切酶，調節(jié)合適的pH值和溫度，水解5小時后把水解液煮沸10分鐘，放冷至室溫，3500轉/分離心除去不溶物，上清用截流分子量50萬的超濾膜過濾，濾液用截流分子量2萬的超濾膜濃縮，濃縮液凍干得隱孔菌多糖46克。用硫酸-苯酚法測量結果為總多糖含量87％，顏色灰白，易溶于水，分子量分布20,000～200,000。
實施例2隱孔菌多糖的制備取天然隱孔菌200克，粉碎，加入500毫升水，80℃提取2小時。提取液3500轉/分離心10分鐘，得上清液1。沉淀加200毫升水，充分攪拌提取，3500轉/分離心10分鐘，得上清液2。將上清液1與上清液2合并，減壓濃縮至約200毫升，在不斷攪拌下加入50克PEG20000，繼續(xù)攪拌1小時使PEG充分溶解。室溫放置過夜，使沉淀完全，然后將溶液3500轉/分離心10分鐘，得沉淀，棄上清。沉淀用95％乙醇在索氏提取器中回流提取6小時至提取液基本無色，揮干沉淀中的乙醇，稱重，得沉淀4.2克。將沉淀用200毫升水溶解，3500轉/分離心除去不溶物，上清加50mg蛋白內切酶，調節(jié)合適的pH值和溫度，水解5小時后把水解液煮沸10分鐘，放冷至室溫，3500轉/分離心除去不溶物，上清用截流分子量5000的透析袋流水透析48小時，透析內液用0.45微米的膜過濾后60度蒸干即得隱孔菌多糖2克。用硫酸-苯酚法測量結果為總多糖含量65％。
實施例3隱孔菌多糖的制備取隱孔菌菌絲體2000克，加入10升水，80℃提取2小時。提取液3500轉/分離心10分鐘，得上清液1。沉淀加2升水，充分攪拌提取，3500轉/分離心10分鐘，得上清液2。將上清液1與上清液2合并，減壓濃縮至約1升，在不斷攪拌下加入200克PEG6000，繼續(xù)攪拌1小時使PEG充分溶解。室溫放置過夜，使沉淀完全，然后將溶液3500轉/分離心10分鐘，得沉淀，棄上清。沉淀用95％乙醇回流提取6小時，提取后的沉淀烘干，稱重，得沉淀8.2克。將沉淀用500毫升水溶解，3500轉/分離心除去不溶物，上清加100mg蛋白內切酶，調節(jié)合適的pH值和溫度，水解5小時后把水解液煮沸10分鐘，放冷至室溫，3500轉/分離心除去不溶物，上清用截流分子量50萬的超濾膜過濾，濾液用截流分子量2萬的超濾膜濃縮，濃縮液凍干得隱孔菌多糖4克。用硫酸-苯酚法測量結果為總多糖含量88％，顏色灰白，易溶于水，分子量分布20,000～200,000。
實施例4取實施例1中的隱孔菌多糖50克，加淀粉45.5克、藥用二氧化硅0.5克，混勻，裝膠囊1000粒，即得隱孔菌多糖膠囊(每粒含隱孔菌多糖50mg)。
實施例5
將400克蔗糖用熱溶法制成單糖漿，備用。取實施例1所得隱孔菌多糖5克，加水溶解，稀釋至2000毫升，加入單糖漿及山梨酸8克，混勻，加水至5000毫升，分裝，滅菌，即得隱孔菌多糖口服液(1mg/ml)。
實施例6取實施例1中的隱孔菌多糖0.5克，奶粉5千克，混勻，分裝，即得功能性奶粉(10mg/100g)。
實施例7隱孔菌多糖組成分析采用水解、還原、乙酰化法對實施例1制得隱孔菌多糖(CFSP1)，實施例2制得隱孔菌多糖(CFSP2)，實施例3制得隱孔菌多糖(CFSP3)進行組成糖分析，結果見表1表1隱孔菌多糖的組成糖
表1表明本發(fā)明制得的隱孔菌多糖的組成糖有6種，即巖藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖，但含量大于10％的主要組成糖只有4種即甘露糖、半乳糖、木糖、巖藻糖，其中甘露糖含量最高。
對本發(fā)明所得的隱孔菌多糖部分甲基化，采用GC-MS分析部分甲基化產物，結果表明CFSP1、CFSP2、CFSP3的主鏈均由甘露糖、半乳糖、木糖構成，甘露糖和半乳糖主要連接方式為1→6，在2位上存在分支點，巖藻糖為1→3連接，木糖為1→4和1→3連接不存在分支點。多糖的末端主要為甘露糖和半乳糖，連接方式為1→。
需要說明的是，本測試結果是我們采用的方法只是測定多糖結構的方法之一，對于有這方面技術的人來說完全可以采用其它方法對隱孔菌多糖進行結構分析。由于分析的人員不同，采用的分析方法不同，儀器的靈敏度不同，得出的結果可能會有所不同，比如CFSP2中阿拉伯糖含量較低，CFSP3中測不出阿拉伯糖，組成糖和甲基化結果定量的結果不同等，這對于含量較低的組分相對影響較大。
實施例8隱孔菌多糖對支氣管肺灌流液中炎癥細胞的抑制作用1、實驗名稱隱孔菌多糖對致敏大鼠抗原攻擊后支氣管肺灌流液中的炎癥細胞的作用。
2、實驗目的評價隱孔菌多糖對致敏大鼠抗原攻擊后支氣管肺灌流液中的炎癥細胞的作用。
3、材料3.1受試物實施例1、2、3所得隱孔菌多糖(CFSP1、CFSP2、CFSP3)及隱孔菌菌粉(CFS)3.2albumin，egg(V grade)，美國Sigma chemical Co.
3.3地塞米松磷酸鈉，高郵制藥廠3.4烏拉坦(Urethane)，中國醫(yī)藥公司上?；瘜W試劑公司3.5PARI MASTER壓縮吸入機(Type084G6305)，Made in Germany3.6SD大鼠，♀，清潔級，購于浙江大學醫(yī)學院實驗動物中心，合格證號浙實驗動物實施條件準字22-96010184、方法1)分組SD大鼠共60只，分6組，見表2。
2)致敏將albumin溶于10％氫氧化鋁凝膠中，配成2％卵白蛋白凝膠溶液。每只大鼠四足掌皮下注射，每點0.1ml；10天后再重復致敏一次。
3)給藥從致敏第10天開始給藥。受試物CFS生理鹽水溶液0.5g/kg灌胃(ig)，CFSP1、CFSP2、CFSP3生理鹽水溶液10mg/kg灌胃(ig)(給藥劑量按照生理鹽水溶液中隱孔菌多糖質量計算)，地塞米松(DXM)0.5mg/kg腹腔注射(ip)，以上受試物均給藥10天。
4)抗原攻擊致敏第18天，給藥后1小時將致敏大鼠置于4L玻璃鐘罩內，用PARI MASTER壓縮吸入機氣霧1.0％卵蛋白30min，次日重復攻擊一次。將大鼠放回鼠籠再養(yǎng)24h后供實驗用。
5)支氣管肺泡灌流支氣管肺泡灌流按文獻方法，烏拉坦1g/kg ip大鼠，麻醉后切開頸部皮膚，分離出氣管，切開氣管，插入氣管插管，用含肝素的Hanks溶液10ml，分2次，每次5ml，從氣管插管注入氣道，每次來回沖洗3回，沖洗液收集于試管內，回收率約70-80％(7-8ml)。
6)白細胞計數和分類計數1％冰醋酸1∶1稀釋灌流液，用計數板在顯微鏡下計總數。將灌流液涂于玻片上，干后用Wright-Giemsa染色液染色，然后在油鏡下分類計數。
5、結果模型組經1.0％卵蛋白2次攻擊后，嗜酸性粒細胞明顯增多、淋巴單核細胞百分率明顯降低。表明致敏大鼠抗原攻擊有非常明顯的過敏性炎癥反應過程。CFS和從中分離的CFSP1、CFSP2、CFSP3能明顯抑制致敏大鼠抗原攻擊后支氣管肺泡灌流液中嗜酸性粒細胞升高，其效果相當，證明CFSP1、CFSP2、CFSP3是CFS中主要的藥效成分。具體結果見表2。
表2隱孔菌菌粉和隱孔菌多糖對致敏大鼠抗原攻擊后支氣管肺灌流液中炎癥細胞的抑制作用(x±SD)統(tǒng)計方法Mann-Whitney Rank Sum Test或T-test，與模型組比較*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。
實施例9隱孔菌多糖對Sephadex G 200誘導小鼠腹腔炎癥的作用1、實驗名稱隱孔菌多糖對Sephadex G 200誘導小鼠腹腔炎癥的作用。
2、實驗目的評價隱孔菌多糖對Sephadex G 200誘導小鼠腹腔炎癥的抑制作用。
3、材料3.1動物ICR小鼠，雌雄各半，體重20±2克。購于中國科學院上海藥物所，合格證號醫(yī)動字第220010014。
3.2藥品與試劑受試樣品實施例1、2、3所得隱孔菌多糖(CFSP1、CFSP2、CFSP3)用無菌生理鹽水溶解后，儲存于4℃冰箱備用；地塞米松磷酸鈉注射液(DXM)5mg/mL，湖北天藥藥業(yè)股份有限公司，批號20030605；Sephadex G 200Pharmacia進口分裝 批號79-09-19；肝素華美生物工程公司，批號0203；羥丙基甲基纖維素上虞海申惠贈；小牛血清杭州四季青公司出品，批號20041008。
3.3主要儀器光學顯微鏡日本Olympus公司C011型928388Eppendorf高速冷凍離心機德國Eppendorf公司。
電子天平上海天平儀器廠FA1104型3.4試劑配制Sephadex G 200用1％羥丙基甲基纖維素溶液將Sephadex G 200配制為0.1mg/ml的混懸液，并高壓滅菌。
灌洗液1％小牛血清D-Hanks緩沖液(含5IU/ml肝素)，臨用前配制。
4、實驗方法4.1Sephadex G 200誘導小鼠腹腔炎癥細胞聚集試驗4.1.1分組本實驗共分5組，即模型組；CFSP1組(10mg/kg，ig)；CFSP2組(10mg/kg，ig)；CFSP3組(10mg/kg，ig)；CFSP1靜脈注射組(10mg/kg，iv)；DXM陽性對照組(0.5mg/kg，ig)，所述用量按生理鹽水溶液中隱孔菌多糖的量計算。
4.1.2給藥方法致炎前對各組小鼠每天給藥1次，連續(xù)3天。致炎后每天給藥1次，連續(xù)2天。模型組生理鹽水0.3mL/10g灌胃，每天1次，連續(xù)5天；各給藥組依據分組分別進行給藥。
4.1.3動物致炎第4次給藥前致炎。模型組、給藥組及陽性對照藥組，均用Sephadex G200(0.1mg/mL)腹腔注射，每只小鼠2mg/kg。
4.1.4腹腔灌洗于腹腔致炎48h后采用頸椎脫臼法處死小鼠。每只小鼠腹腔注射灌洗液5mL，輕揉片刻后吸出腹腔灌洗液。
4.1.5白細胞計數將腹腔灌洗液搖勻后取出50μL，用白細胞稀釋液稀釋4倍，取少量滴于細胞計數板上，在顯微鏡下計數白細胞總數。
4.1.6白細胞分類計數將腹腔灌洗液低溫2000rpm離心10min后，棄去上清液，用移液器打勻后涂片。待涂片在室溫下干后，Wright染色6～8min，姬姆薩復染1分鐘。用自來水小心將染料沖洗干凈，在光學顯微鏡40倍鏡下進行細胞分類計數。
5、結果CFSP1、CFSP2、CFSP3灌胃(10mg/kg)以及靜脈注射(10mg/kg)都顯著抑制了Sephadex G 200(2mg/kg)腹腔注射引起的小鼠腹腔炎癥細胞聚集，與模型組相比，P＜0.05～0.001，見圖1。CFSP1、CFSP2、CFSP3灌胃(10mg/kg)和靜脈注射(10mg/kg)都顯著抑制了腹腔內多形核白細胞的聚集，P＜0.05～0.01，結果見圖2。CFSP1、CFSP2、CFSP3灌胃(10mg/kg)以及靜脈注射(10mg/kg)都顯著抑制了多核粒細胞和淋巴單核細胞的聚集，與模型組相比，P＜0.05～0.001，見圖3。
權利要求
1.一種隱孔菌多糖，其特征在于所述隱孔菌多糖由含隱孔菌或隱孔菌發(fā)酵物的原料提取制得，分子量范圍為2000～200000，主要由甘露糖、半乳糖、木糖、巖藻糖四種單糖組成，主鏈由1→6連接的甘露糖，1→6半乳糖，1→3連接的巖藻糖和1→4、1→3連接的木糖構成。
2.如權利要求1所述的隱孔菌多糖，其特征在于所述的隱孔菌多糖由如下方法制備得到將含隱孔菌多糖的原料加水提取，水提液濃縮后加入聚乙二醇混勻，靜置沉淀，取沉淀物用乙醇洗滌，沉淀物水溶，離心，除蛋白質，再離心、膜分離截留2000～200000分子量范圍，濃縮后干燥得隱孔菌多糖。
3.如權利要求2所述的隱孔菌多糖，其特征在于所述的含隱孔菌多糖的原料為下列之一或下列兩種或兩種以上任意形式的組合①天然隱孔菌；②隱孔菌液體培養(yǎng)液；③隱孔菌菌絲體；④隱孔菌固體培養(yǎng)物；⑤隱孔菌菌粉。
4.制備如權利要求1～3之一所述的隱孔菌多糖的方法，其特征在于所述的方法如下將含隱孔菌多糖的原料加水提取，水提液濃縮后加入聚乙二醇混勻，靜置沉淀，取沉淀物用乙醇洗滌，沉淀物水溶，離心，去除蛋白質，再離心、膜分離截留2000～200000分子量范圍，濃縮后干燥得隱孔菌多糖。
5.如權利要求4所述的隱孔菌多糖的制備方法，其特征在于所述的方法如下將含隱孔菌多糖的原料加入5～10質量倍的水，70～90℃下提取1～4小時，水提液離心得上清液濃縮至比重為1.0～1.3，得濃縮液，每100mL濃縮液加入聚乙二醇5～50g，充分攪拌后靜置過夜沉淀，離心得沉淀物用95％乙醇洗滌，沉淀物水溶、離心后去除蛋白質，再離心、膜分離截留2000～200000分子量范圍，濃縮后干燥即得所述的隱孔菌多糖。
6.如權利要求5所述的隱孔菌多糖的制備方法，其特征在于所述的含隱孔菌多糖的原料為下列之一或下列兩種或兩種以上任意形式的組合①天然隱孔菌；②隱孔菌液體培養(yǎng)液；③隱孔菌菌絲體；④隱孔菌固體培養(yǎng)物；⑤隱孔菌菌粉。
7.如權利要求5所述的隱孔菌多糖的制備方法，其特征在于所述的聚乙二醇為PEG1000～20000。
8.如權利要求5所述的隱孔菌多糖的制備方法，其特征在于所述的方法如下隱孔菌菌粉加入5倍質量的水，80℃提取2小時，提取液取上清液；沉淀加適量水充分攪拌提取，提取液離心得上清液，兩次上清液合并，減壓濃縮至體積縮小一倍得濃縮液，不斷攪拌下，每100mL濃縮液加入15克PEG6000，攪拌使充分溶解，室溫放置過夜，使沉淀完全，離心得沉淀用95％乙醇回流提取至提取液基本無色，得沉淀溶解于適量水中，離心除去不溶物，上清加蛋白內切酶，水解后把水解液煮沸，放冷至室溫，離心除去不溶物，上清用截流分子量50萬的超濾膜過濾，濾液用截流分子量2萬的超濾膜濃縮，濃縮液凍干即得所述的隱孔菌多糖。
9.如權利要求5所述的隱孔菌多糖的制備方法，其特征在于所述的方法如下天然隱孔菌粉碎后加入2.5倍質量的水，80℃提取2小時，提取液取上清液；沉淀加適量水充分攪拌提取，提取液離心得上清液，兩次上清液合并，減壓濃縮至體積縮小一倍得濃縮液，不斷攪拌下，每100mL濃縮液加入25克PEG20000，攪拌使充分溶解，室溫放置過夜，使沉淀完全，離心得沉淀用95％乙醇回流提取至提取液基本無色，得沉淀溶解于適量水中，離心除去不溶物，上清加蛋白內切酶，水解后把水解液煮沸，放冷至室溫，離心除去不溶物，上清用截流分子量5000的透析袋流水透析48小時，透析內液用0.45微米的膜過濾后60℃蒸干即得所述得隱孔菌多糖。
10.如權利要求1～3之一所述的隱孔菌多糖在制備治療過敏性鼻炎藥物中的應用。
11.如權利要求1～3之一所述的隱孔菌多糖在制備治療過敏性哮喘藥物中的應用。
12.如權利要求1～3之一所述的隱孔菌多糖在制備治療成人型呼吸窘迫綜合征藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種隱孔菌多糖及其制備方法，以及這種隱孔菌多糖在制備治療過敏性鼻炎藥物與過敏性哮喘藥物中的應用及在制備治療成人型呼吸窘迫綜合征藥物中的應用。本發(fā)明所述的隱孔菌多糖及其制備與應用的有益效果主要體現在(1)本發(fā)明所述隱孔菌多糖藥用成分更明確，并能非常顯著地抑制致敏大鼠抗原攻擊后肺部嗜酸性炎癥的作用，可以開發(fā)成新藥或功能性食品或保健品用于過敏性鼻炎和過敏性哮喘，具有廣闊應用前景；(2)所述隱孔菌多糖制備方法用PEG沉淀多糖所得產品多糖含量要遠高于用乙醇沉淀所得多糖含量，且用PEG的量僅為乙醇用量的二十分之一左右，得率高，含量高，成本低，且操作簡便。
文檔編號A61K31/715GK1919875SQ20051006046
公開日2007年2月28日 申請日期2005年8月23日 優(yōu)先權日2005年8月23日
發(fā)明者柯傳奎, 楊勇杰, 謝強敏, 陳黎, 歐陽小軍, 柴黎燕 申請人:杭州賜富生物技術有限公司, 柯傳奎, 楊勇杰