專利名稱：抗人嗜酸細胞趨化因子受體3抗體及制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)，主要涉及抗人嗜酸細胞趨化因子受體3抗體(CCR3)及制備方法，以及所制備的抗體的藥學(xué)用途。
背景技術(shù)：
過敏性哮喘是一種以氣道慢性炎癥、氣道高反應(yīng)性(AHR)、可逆性氣道阻塞和粘液高分泌為特征的氣道慢性疾病。隨著我國工業(yè)經(jīng)濟的快速發(fā)展，環(huán)境污染進一步加劇，發(fā)病率和死亡率均急速上升，嚴重地危害了人民群眾的身體健康。研究開發(fā)有效的哮喘治療藥物成為當(dāng)務(wù)之急。
近年來的研究顯示，嗜酸性細胞(Eos)是哮喘發(fā)病過程中主要的炎癥細胞。過敏性哮喘發(fā)病時，抗原提呈細胞將抗原傳遞給T淋巴細胞并激活Th2細胞，后者釋放炎癥介質(zhì)、細胞因子和趨化因子如白介素4(IL-4)、IL-5、Eotaxin等引起Eos在氣道的募集和活化引起支氣管平滑肌痙攣、氣管微血管通透性增加、氣道粘膜水腫、產(chǎn)生氣道高反應(yīng)性，從而引起哮喘的發(fā)病。在哮喘患者的血、痰、支氣管肺泡灌洗液(BALF)中均可見Eos的升高。
CCR3是Eos表面主要的趨化性細胞因子受體，IL-5、Eotaxin等炎癥因子和介質(zhì)通過對CCR3的選擇性作用而激活Eos，吸引大量Eos遷移到氣道，導(dǎo)致氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性的產(chǎn)生，引起哮喘的發(fā)作。因此，切斷該炎癥通路的信號傳導(dǎo)將直接抑制氣道炎癥的發(fā)生?？笴CR3抗體可與Eos表面的CCR3特異性結(jié)合，阻斷IL-5、Eotaxin等炎癥因子對Eos的作用，使Eos無法向氣道聚集，避免了Eos對氣道的破壞和哮喘的發(fā)病。
因此，當(dāng)前通過抑制Eos來防治哮喘日益受到重視，特別是拮抗或阻斷Eos表面受體被認為是最有希望的研究方向。但是，目前國內(nèi)尚無該方面的研究，國際上抗CCR3抗體對哮喘的治療作用的研究在目前才處于起步階段，主要通過在特定表達載體和表達細胞體系中表達獲得CCR3，并以表達了CCR3的細胞作為抗原免疫小鼠來制備抗CCR3抗體。該方法過程復(fù)雜，周期較長，且表達系統(tǒng)不穩(wěn)定，以此方法所獲得的抗CCR3抗體特異性差。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供抗人嗜酸性細胞表面趨化性細胞因子受體3(CCR3)抗體，免疫用抗原C位于CCR3細胞外區(qū)N端多肽，具有SEQ NO 1的氨基酸序列mttsldtvet fgttsyyddv gllcekadtr。
本發(fā)明的另一個目的是提供制備抗人嗜酸性細胞表面趨化性細胞因子受體3(CCR3)抗體的方法，通過以下步驟實現(xiàn)1.多肽的合成和偶聯(lián)選擇胞外區(qū)的多肽作為制備單抗的抗原。我們選擇了位于N端胞外區(qū)的一段多肽，它的序列如下NH2-MTTSLDTVETFGTTSYYDDVGLLCEKADTR2.抗CCR3抗體的制備免疫(1)用多肽偶聯(lián)物對BALB/c進行長程免疫(肌肉注射)和短程免疫(腹腔注射)。
(2)血清效價的測定免疫以后眼球取血測定血清效價，血清里的抗體效價要在1∶6250以上說明可進行細胞融合，如未達到此效價則需要進行加強免疫，直到達到此效價。
(3)融合取免疫小鼠脾臟，收集細胞與骨髓瘤細胞SP2/0進行融合。
(4)篩選通過ELISA有限稀釋法篩選陽性克隆，取陽性克隆里的上清，用Western進行檢測。選擇其中三株行進一步實驗，分別標(biāo)記為PBND03，PBND04，PBND05。
(5)抗體制備和純化用篩選獲得的細胞打腹水，得到腹水后取腹水，從中純化單抗。
對純化好的抗體進行ELISA檢測和濃度測定。結(jié)果為PBND03親和力＞1.28×109，PBND04親和力≥2×107，PBND05親和力≥3.2×108；ELISA最佳工作濃度分別為0.1μg、5μg、0.2μg；濃度分別為3.85mg/ml、2.63mg/ml、2.31mg/ml。
(6)鑒定以Daudi細胞破碎液對PBND03(3.85mg/ml)、PBND04(2.63mg/ml)、PBND05(2.31mg/ml)三株腹水進行Western-blot鑒定，結(jié)果變性膠實驗PBND03、04出現(xiàn)特異性條帶，05出現(xiàn)雜帶；非變性膠實驗PBND03、04、05均出現(xiàn)相應(yīng)位置的條帶。
本發(fā)明的又一個目的是抗CCR3抗體在制備阻斷氣道炎癥藥物中的用途。
CCR3是表達于多種炎癥細胞表面的趨化性細胞因子受體C-C亞族，該受體為G蛋白偶聯(lián)受體，具有7個富含疏水氨基酸的跨膜結(jié)構(gòu)。本發(fā)明采用多肽合成儀經(jīng)“固相合成法”合成了CCR3細胞外區(qū)N端30個氨基酸的多肽序列為mttsldtvet fgttsyyddv gllcekadtr(序列號為P516771)，并進行多肽偶聯(lián)和檢測序列。以該多肽對BALB/c小鼠進行免疫，取免疫小鼠脾細胞與骨髓瘤細胞SP2/0進行融合，篩選獲得陽性克隆后產(chǎn)生并純化抗體。Daudi細胞為人淋巴母細胞，表達有豐富的CCR3，因此對所獲得的抗體采用Daudi細胞破碎液進行Western-blot檢測，結(jié)果有特異性的條帶。以上結(jié)果表明所獲得的抗體為特異性的抗CCR3抗體。
以其中一個克隆所得的抗CCR3抗體研究了該抗體對哮喘小鼠氣道炎癥作用的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)抗CCR3抗體可明顯抑制哮喘小鼠的BALF和中Eos的數(shù)量，減少氣道粘液儲備指數(shù)和化生指數(shù)，粘液基因MUC5AC mRNA的表達明顯降低，肺組織的病理切片結(jié)果也表明該抗體明顯抑制了Eos在肺組織當(dāng)中的浸潤以及氣道粘液的產(chǎn)生。以上結(jié)果均表明抗CCR3抗體可抑制抗原攻擊后哮喘小鼠內(nèi)引起哮喘發(fā)病的主要炎癥細胞Eos的浸潤，從而阻礙氣道炎癥的發(fā)生，提示可用于哮喘疾病的治療。


圖1是對抗CCR3抗體進行Western-blot鑒定結(jié)果。
圖2是抗CCR3抗體對OVA致敏攻擊小鼠BALF炎癥細胞的作用。
圖3(A、B)是抗CCR3抗體對OVA致敏攻擊小鼠氣道粘液的儲備指數(shù)和化生指數(shù)的影響。
圖4是抗CCR3抗體對OVA致敏攻擊小鼠粘液分泌的影響。
圖5是抗CCR3抗體對OVA致敏攻擊小鼠MUC5AC mRNA的影響。
具體實施例方式
本發(fā)明結(jié)合附圖和實施例作進一步說明。
實施例11.多肽的合成和偶聯(lián)根據(jù)CCR3的跨膜特點，我們選擇胞外區(qū)的多肽作為制備單抗的抗原。我們選擇了位于N端胞外區(qū)的一段多肽我們稱之為MR30，它的序列如下MR30NH2-MTTSLDTVETFGTTSYYDDVGLLCEKADTR純度95％以上。
2.抗CCR3抗體的制備(1)免疫用多肽偶聯(lián)物對BALB/c進行長程免疫(肌肉注射)和短程免疫(腹腔注射)。
(2)血清效價的測定免疫以后眼球取血測定血清效價，血清里的抗體效價要在1∶6250以上說明可進行細胞融合，如未達到此效價則需要進行加強免疫，直到達到此效價。
(3)融合取免疫小鼠脾臟，收集細胞與骨髓瘤細胞SP2/0進行融合。
(4)篩選通過ELISA有限稀釋法篩選陽性克隆，取陽性克隆里的上清，用Western進行檢測。選擇其中三株行進一步實驗，分別標(biāo)記為PBND03，PBND04，PBND05。
(5)抗體制備和純化用篩選獲得的細胞打腹水，得到腹水后取腹水，從中純化單抗。對純化好的抗體進行ELISA檢測和濃度測定。結(jié)果為PBND03親和力＞1.28×109，PBND04親和力≥2×107，PBND05親和力≥3.2×108；ELISA最佳工作濃度分別為0.1μg、5μg、0.2μg；濃度分別為3.85mg/ml、2.63mg/ml、2.31mg/ml。
(6)鑒定以Daudi細胞破碎液對抗CCR3抗體PBND03(3.85mg/ml)、PBND04(2.63mg/ml)、PBND05(2.31mg/ml)三株腹水進行Western-blot鑒定，結(jié)果變性膠實驗PBND03、04出現(xiàn)特異性條帶，05出現(xiàn)雜帶；非變性膠實驗PBND03、04、05均出現(xiàn)相應(yīng)位置的條帶。結(jié)果表明所獲得的抗體為抗CCR3抗體，參見圖1actin(肌動蛋白)PBND03、04、05均出現(xiàn)相應(yīng)位置的條帶。
實施例2抗CCR3對哮喘小鼠氣道炎癥的抑制作用1.動物模型建立共分為7組，分別為空白對照組(Contrast)、哮喘模型組(OVA)、氨茶堿組(Am)、非特異性抗體組(IgG)、抗CCR3低劑量組(A1)、抗CCR3中劑量組(A2)、抗CCR3高劑量組(A3)。在第0天和第14天以O(shè)VA腹腔注射對C57BL/6小鼠進行致敏，在第24、25、26天以O(shè)VA霧化吸入進行抗原攻擊，制備哮喘小鼠模型；空白對照組則用生理鹽水代替致敏和抗原攻擊；第28天檢測動物肺功能、處死動物，收集標(biāo)本。
2.藥物給予均采用腹腔注射給藥A1、A2、A3組，分別按1mg/Kg、3mg/Kg、10mg/Kg劑量給藥；IgG組3mg/Kg劑量給藥；Am組按10mg/Kg給藥。給藥時間第23、24、25、26天，其中第24、25、26天均在OVA霧化攻擊前2小時給藥。
3.肺泡灌洗液(BALF)炎癥細胞計數(shù)取150μL BALF細胞懸液與白細胞計數(shù)液1∶1稀釋，顯微鏡下計數(shù)白細胞總數(shù)。余BALF液以4℃，2000rpm離心10分鐘，沉淀物涂片，以亞甲基藍-伊紅染色，所有細胞計數(shù)均由一個研究者完成，采用單盲法。每個標(biāo)本計數(shù)400個細胞，并計數(shù)其中EOS數(shù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)抗CCR3抗體可減少BALF中的炎癥細胞和Eos，A1、A2、A3各組對炎癥細胞的抑制作用分別為7.83±2.1，5.33±1.53，3.3±0.97×108/L，對Eos的抑制作用分別為5.5±1.62，3.61±1.1，2.25±0.96×108/L，該作用強于氨茶堿，且該作用在抗CCR3抗體各不同劑量組間存在量效關(guān)系，隨劑量增高而增強，結(jié)果參見圖2Contrast(空白對照組)、OVA(哮喘模型組)、Am(氨茶堿組)、IgG(非特異性抗體組)、A1、(抗CCR3低劑量組1mg/Kg)、A2(抗CCR3中劑量組3mg/Kg)、A3(抗CCR3高劑量組10mg/Kg)。#P＜0.05vsOVA，*P＜0.05 vsIgG，+P＜0.05 vsAm。
4.行PAS染色，用病理圖象分析儀選擇所有標(biāo)本直徑在300um-1000um之間，，測定氣道杯狀細胞數(shù)，氣道基底膜長度，氣道上皮總面積以及PAS染色陽性面積，具體指標(biāo)的設(shè)定如下杯狀細胞化生指數(shù)——指每mm長氣管上皮中杯狀細胞數(shù)目；上皮粘液儲備指數(shù)——上皮PAS陽性染色面積比氣管上皮總面積，以上述指標(biāo)作，為氣道粘液的定量觀察指標(biāo)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)抗CCR3抗體可降低儲備指數(shù)和化生指數(shù)。A1、A2、A3各組對粘液儲備指數(shù)的抑制作用分別為18.5±6.44，14.7±4.5，8.33±4.24％，，對杯狀細胞化生指數(shù)的抑制作用分別為42.7±12，30±6.8，19±7.32/mm，該作用強于氨茶堿，且該作用在抗CCR3抗體各不同劑量組間存在量效關(guān)系，隨劑量增高而增強，參見圖3、圖4。圖3A和圖3B中Contrast(空白對照組)、OVA(哮喘模型組)、Am(氨茶堿組)、IgG(非特異性抗體組)、A1(抗CCR3低劑量組1mg/Kg)、A2(抗CCR3中劑量組3mg/Kg)、A3(抗CCR3高劑量組10mg/Kg)。#P＜0.05 vs OVA，*P＜0.05vs IgG，+P＜0.05 vs Am。圖4中a為空白對照組(Contrast)，氣道上皮細胞少見粘液形成[PAS染色×100]，b為哮喘模型組(OVA)，氣道上皮杯狀細胞增生肥大，并有大量粘液形成[PAS染色×100]，c為抗CCR3低劑量組1mg/Kg(A1)，可見氣道上皮細胞內(nèi)杯狀細胞增生及肥大減少，粘液形成也減少[PAS染色×100]，d抗CCR3高劑量組10mg/Kg(A3)可見氣道上皮細胞內(nèi)杯狀細胞增生及肥大明顯減少，粘液形成也明顯減少[PAS染色×100]。
5.逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈方法(RT-PCR)檢測肺組織粘液基因MUC5AC mRNA的表達采用TRIZOL試劑一步法提取右肺組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以此為模板行PCR擴增引物
(1)MUC5AC上游引物5’-CAGCCGAGAGGAGGGTTTGATCT-3’，下游引物5’-AGTCTCTCTCCGCTCCTCTCAAT-3’；(2)磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)上游引物5’-CTGGTGCTGAGTATGTCGTG-3’，下游引物5’-CAGTCTTCTGAGTGGCAGTG-3’引物均由上海生工合成。PCR反應(yīng)條件94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，反應(yīng)30個循環(huán)后72℃延伸10分鐘。后將產(chǎn)物在2.0％瓊脂糖凝膠(0.5ug/mL溴化乙錠)中電泳，擴增產(chǎn)物片斷長分別是389bp，296bp，用凝膠數(shù)字成像系統(tǒng)掃描分析擴增產(chǎn)物條帶，分別測定各擴增帶A值，將目的基因MUC5AC擴增帶與內(nèi)參照GAPDH擴增帶的A值比作為其mRNA水平的指標(biāo)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)抗CCR3抗體抑制了肺組織粘液基因MUC5AC mRNA的表達，A1、A2、A3各組MUC5AC mRNA的A值比分別為0.86±0.08、0.82±0.03和0.61±0.05，P＜0.05 vs 1.12±0.05，參見圖5Contrast(空白對照組)、OVA(哮喘模型組)、Am(氨茶堿組)、A1、(抗CCR3低劑量組1mg/Kg)、A2(抗CCR3中劑量組3mg/Kg)、A3(抗CCR3高劑量組10mg/Kg)、Marker(標(biāo)記)。
權(quán)利要求
1.抗人嗜酸細胞趨化因子受體3抗體，其特征是免疫用抗原C位于人嗜酸性細胞表面趨化性細胞因子受體3細胞外區(qū)N端多肽，具有SEQ NO 1的氨基酸序列mttsldtvet fgttsyyddv gllcekadtr。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗人嗜酸細胞趨化因子受體3抗體的制備方法，通過以下步驟實現(xiàn)(1)多肽的合成和偶聯(lián)選擇胞外區(qū)的多肽作為制備單抗的抗原，其氨基酸序列mttsldtvet fgttsyyddv gllcekadtr；(2)抗體的制備1)免疫用多肽偶聯(lián)物對BALB/c進行長程免疫和短程免疫，2)血清效價的測定免疫以后眼球取血測定血清效價，血清里的抗體效價在1∶6250以上說明可進行細胞融合，如未達到此效價則需要進行加強免疫，直到達到此效價，3)融合取免疫小鼠脾臟，收集細胞與骨髓瘤細胞SP2/0進行融合，4)篩選通過ELISA有限稀釋法篩選陽性克隆，取陽性克隆里的上清，用Western進行檢測，選擇其中三株行進一步實驗，分別標(biāo)記為PBND03，PBND04，PBND05，5)抗體制備和純化用篩選獲得的細胞打腹水，得到腹水后取腹水，從中純化單抗，6)鑒定以Daudi細胞破碎液對濃度為3.85mg/ml的PBND03、2.63mg/ml的PBND04、2.31mg/ml的PBND05三株腹水進行Western-blot鑒定。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的抗人嗜酸性細胞表面趨化性細胞因子受體3抗體在制備阻斷氣道炎癥藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明提供抗人嗜酸細胞趨化因子受體3抗體，免疫用抗原C以該多肽對BALB/c小鼠進行免疫，取免疫小鼠脾細胞與骨髓瘤細胞SP2/0進行融合，篩選獲得陽性克隆后產(chǎn)生并純化抗體。研究表明該抗體可明顯抑制哮喘小鼠的BALF和中Eos的數(shù)量，減少氣道粘液儲備指數(shù)和化生指數(shù)，粘液基因MUC5AC mRNA的表達明顯降低，肺組織的病理切片結(jié)果也表明該抗體明顯抑制了Eos在肺組織當(dāng)中的浸潤以及氣道粘液的產(chǎn)生。以上結(jié)果均表明抗CCR3抗體可抑制抗原攻擊后哮喘小鼠內(nèi)引起哮喘發(fā)病的主要炎癥細胞Eos的浸潤，從而阻礙氣道炎癥的發(fā)生，可在制備治療哮喘疾病的藥物中應(yīng)用。
文檔編號A61K39/395GK1763101SQ20051006137
公開日2006年4月26日 申請日期2005年11月2日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月2日
發(fā)明者沈華浩, 王凱 申請人:浙江大學(xué)