專利名稱：一種雙層人工神經(jīng)導(dǎo)管及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種雙層人工神經(jīng)導(dǎo)管及其制備方法。
背景技術(shù)：
周?chē)窠?jīng)損傷或缺損時(shí)，人們首先選用的方法是將兩側(cè)神經(jīng)斷端直接吻合。如果不能直接吻合，由于周?chē)Y(jié)締組織等的障礙作用，則會(huì)導(dǎo)致新生的神經(jīng)纖維無(wú)法通過(guò)缺損部位到達(dá)其靶組織所在部位，在再生神經(jīng)的殘端形成增生的神經(jīng)瘤樣組織，其結(jié)果是造成創(chuàng)傷所在肢體的功能障礙。另外，也有采用自體神經(jīng)移植的方法修復(fù)周?chē)窠?jīng)損傷。但采用這種方法不但會(huì)造成取材部位的功能缺損，而且，被移植神經(jīng)的部位功能恢復(fù)也不理想，而異體神經(jīng)移植存在著無(wú)法克服的免疫排斥反應(yīng)等問(wèn)題。
因此，人們開(kāi)始嘗試著采用人工材料導(dǎo)管橋接缺損神經(jīng)的兩斷端，試圖誘導(dǎo)斷端的神經(jīng)纖維再生到達(dá)遠(yuǎn)端并與靶組織重新建立聯(lián)系。例如，化學(xué)材料硅酮、聚乙烯、聚乙醇酸、聚乳酸等；生物材料殼聚糖、明膠、膠原蛋白等；生物體管狀支架動(dòng)脈、靜脈和肌膜管等都用來(lái)制備導(dǎo)管。但是，由于化學(xué)材料生物相容性較差，生物材料的力學(xué)性能較差，生物體管也存在著力學(xué)性能較差等一系列的問(wèn)題，迄今為止，以導(dǎo)管誘導(dǎo)神經(jīng)再生的長(zhǎng)度≤3厘米。
脊髓損傷修復(fù)的研究已經(jīng)有近百年的歷史，究其原因主要是損傷局部的微環(huán)境不利于神經(jīng)纖維的再生和向靶部位延伸。近年來(lái)，人們采用坐骨神經(jīng)移植、人工材料導(dǎo)管等方法已經(jīng)證明大鼠脊髓損傷后，只要改善局部的微環(huán)境，離斷的神經(jīng)纖維是可以再生的。但是，由于導(dǎo)管的生物相容性、力學(xué)性能等問(wèn)題，現(xiàn)在還沒(méi)有較為理想的用于脊髓再生的人工神經(jīng)導(dǎo)管。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種雙層人工神經(jīng)導(dǎo)管及其制備方法。
本發(fā)明所提供的雙層人工神經(jīng)導(dǎo)管，包括均由生物體內(nèi)可分解吸收性材料制成的一內(nèi)層導(dǎo)管和一外層導(dǎo)管，所述內(nèi)層導(dǎo)管套裝于所述外層導(dǎo)管內(nèi)部，所述內(nèi)層導(dǎo)管與所述外層導(dǎo)管的管隙間填充有纖維蛋白膠。
這些管隙間的纖維蛋白膠不僅可以保證雙層導(dǎo)管之間的相互粘接，還能為再生的神經(jīng)組織或血管等提供再生的支架結(jié)構(gòu)。為了使管內(nèi)的神經(jīng)組織能夠更好地生長(zhǎng)，在纖維蛋白膠中還添加有細(xì)胞外基質(zhì)和與神經(jīng)組織再生密切相關(guān)的生物大分子物質(zhì)，這些添加物的用量為膠原蛋白50-100μg/ml、昆布氨酸60-100ng/ml、Nogo抗體30-60ng/ml、生長(zhǎng)因子10-300ng/ml、L-多聚賴氨酸60-100μg/ml。也可以添加雪旺氏細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞中的一種或幾種。關(guān)于這些附加細(xì)胞的導(dǎo)入量，按照常規(guī)方法進(jìn)行即可。
常用的生物體內(nèi)可分解吸收性材料包括殼聚糖及其衍生物、膠原蛋白、明膠、L-多聚賴氨酸、聚乙二醇酸、聚乳酸或乳酸和ε-己內(nèi)脂的共聚物等，其網(wǎng)狀具有大約10-500μm的網(wǎng)孔徑。
更優(yōu)選的，外層導(dǎo)管可由殼聚糖制成，內(nèi)層導(dǎo)管可由膠原蛋白制成。
上述雙層人工神經(jīng)導(dǎo)管的制備方法，包括如下步驟1)制備殼聚糖導(dǎo)管將殼聚糖醋酸溶液倒入芯膜模具中，加溫到80-160℃，蒸餾水浸泡后取出，然后在殼聚糖的醋酸溶液中反復(fù)浸漬、風(fēng)干，得到殼聚糖導(dǎo)管；2)制備膠原蛋白導(dǎo)管將膠原蛋白鹽酸溶液倒入芯膜模具中成型，經(jīng)過(guò)冷凍干燥后，再進(jìn)行機(jī)械擠壓成型，得到膠原蛋白導(dǎo)管；3)填充纖維蛋白膠將所得膠原蛋白導(dǎo)管插入到殼聚糖導(dǎo)管中，然后將纖維蛋白膠注射入兩層導(dǎo)管的管隙間，得到所述雙層人工神經(jīng)導(dǎo)管。
步驟1)所述殼聚糖為脫乙酰度為80-85％的殼聚糖；所述殼聚糖醋酸溶液是將200mg溶于100-200ml 2％醋酸溶液得到的。制備完殼聚糖導(dǎo)管后，還可經(jīng)過(guò)NaOH溶液浸泡。
步驟2)中所述的膠原蛋白鹽酸溶液是將100毫克膠原蛋白溶于30-100毫升1mol/L鹽酸中得到的。
本發(fā)明層人工神經(jīng)導(dǎo)管可以通過(guò)手術(shù)移植到神經(jīng)損傷的部位。如當(dāng)用于周?chē)窠?jīng)損傷修復(fù)時(shí)，可以將離斷的神經(jīng)兩斷端插入到導(dǎo)管內(nèi)約2-5毫米并用手術(shù)縫合線進(jìn)行縫合處理；當(dāng)用于脊髓損傷修復(fù)時(shí)，可以將導(dǎo)管移植并固定到缺損的部位。其長(zhǎng)度和直徑可根據(jù)神經(jīng)切除長(zhǎng)度和粗細(xì)的不同而差異。例如，以羊坐骨神經(jīng)10厘米缺損為模型，所使用的人工神經(jīng)導(dǎo)管的內(nèi)徑為6-10毫米，長(zhǎng)度11-12厘米。另外，在用于脊髓損傷修復(fù)時(shí)，該管的長(zhǎng)度和直徑仍然需要根據(jù)手術(shù)的部位和手術(shù)的脊髓節(jié)段來(lái)確定。例如，大鼠胸部脊髓損傷時(shí)所采用的導(dǎo)管內(nèi)徑優(yōu)選為約1.5-2.5毫米；而在大動(dòng)物和人時(shí)則應(yīng)選為2-15毫米，特別是約10毫米。
臨床上，周?chē)窠?jīng)和脊髓損傷以后可以采用本發(fā)明的雙層人工神經(jīng)導(dǎo)管進(jìn)行搭橋手術(shù)，并在神經(jīng)再生完成后，在動(dòng)物體內(nèi)逐步降解吸收。與以往的神經(jīng)導(dǎo)管相比，切斷神經(jīng)的再生速度較快，再生神經(jīng)的質(zhì)量也較好。本發(fā)明的雙層人工神經(jīng)導(dǎo)管由于采用雙層結(jié)構(gòu)，具有良好的彈性和強(qiáng)度，所使用材料的降解時(shí)間和神經(jīng)纖維生長(zhǎng)的速度相適應(yīng)(約1-6個(gè)月)，可以應(yīng)用于臨床上周?chē)窠?jīng)損傷和脊髓損傷后的修復(fù)。


圖1為殼聚糖導(dǎo)管和膠原蛋白導(dǎo)管照片；圖2為雙層人工神經(jīng)導(dǎo)管；圖3為新生的羊坐骨神經(jīng)；圖4為新生的大鼠脊髓組織。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1、制備雙層人工神經(jīng)導(dǎo)管本實(shí)施例中外層導(dǎo)管用殼聚糖制備，內(nèi)層導(dǎo)管以膠原蛋白制備，然后將內(nèi)層導(dǎo)管插入到外層導(dǎo)管中，最后，將纖維蛋白凝膠注射入雙層導(dǎo)管的間隙之中，即制得雙層人工神經(jīng)導(dǎo)管。
其中，殼聚糖導(dǎo)管的制備方法是1、將殼聚糖溶于醋酸溶液中；2、將殼聚糖溶液倒入芯材模具中成型，并進(jìn)行熱脫水交聯(lián)處理；3、將所得導(dǎo)管在殼聚糖溶液中反復(fù)浸漬和風(fēng)干操作數(shù)次。
膠原蛋白導(dǎo)管的制備方法是1、將膠原蛋白溶于鹽酸溶液中；2、將膠原蛋白溶液倒入芯材模具中成型，并進(jìn)行冷凍干燥處理；3、將所得導(dǎo)管進(jìn)行機(jī)械壓縮，得到高密度的微細(xì)纖維化膠原蛋白導(dǎo)管。
在纖維蛋白膠中還可以含有一些附加成分，如膠原蛋白、昆布氨酸、Nogo抗體、生長(zhǎng)因子、L-多聚賴氨酸、雪旺氏細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、和神經(jīng)干細(xì)胞等，這些添加物的導(dǎo)入方法按常規(guī)方法進(jìn)行即可。
該制備過(guò)程的具體操作如下1、將殼聚糖制成管狀準(zhǔn)備長(zhǎng)度約11厘米，內(nèi)徑9毫米，厚度約1毫米的導(dǎo)管。將脫乙酰度為80-85％的殼聚糖200mg溶于2％醋酸溶液100ml中，將上述溶液注射到芯棒直徑9毫米，套筒的內(nèi)徑為10毫米的模具中，加溫至120℃，以蒸餾水浸泡，取出導(dǎo)管。再將導(dǎo)管在上述殼聚糖溶液中反復(fù)浸漬和風(fēng)干操作10次，并在1N的NaOH溶液中浸泡，直到導(dǎo)管浸出液的pH值達(dá)到pH7，該導(dǎo)管如圖1中A所示。
2、制備膠原蛋白管將I型膠原蛋白100mg溶于60ml 1N鹽酸溶液中，而后將該溶液注入芯棒直徑8毫米，套筒的內(nèi)徑為8.5毫米的模具中成型，并采用冷凍干燥機(jī)進(jìn)行真空干燥(-70℃下干燥24小時(shí))；然后，將制得的導(dǎo)管進(jìn)行機(jī)械擠壓成型，得到高密度的微細(xì)纖維化膠原蛋白管，該導(dǎo)管如圖1中B所示。
3、將膠原蛋白管插入到殼聚糖導(dǎo)管中，并在管隙間注射填充纖維蛋白膠，即制得雙層人工神經(jīng)導(dǎo)管，如圖2所示。
其中，所用的纖維蛋白膠配方為市場(chǎng)所售的醫(yī)用蛋白膠，按說(shuō)明書(shū)使用即可。
實(shí)施例2、雙層人工導(dǎo)管用于羊坐骨神經(jīng)的修復(fù)按照實(shí)施例1的方法制備雙層人工神經(jīng)導(dǎo)管，其中每毫升纖維蛋白膠中加有100ng神經(jīng)生長(zhǎng)因子NGF。
切除羊(體重20kg)的腓總神經(jīng)10厘米，將兩側(cè)的神經(jīng)斷端插入上述導(dǎo)管中，將該導(dǎo)管與神經(jīng)重疊的部分用10-0尼龍線縫合，動(dòng)態(tài)觀察1年，并進(jìn)行形態(tài)學(xué)、電生理學(xué)和行為學(xué)的評(píng)價(jià)。
研究結(jié)果表明，進(jìn)行移植手術(shù)后第3個(gè)月，動(dòng)物的行為障礙開(kāi)始恢復(fù)，第6個(gè)月已經(jīng)無(wú)明顯行動(dòng)障礙，第12個(gè)月在無(wú)負(fù)重的情況下已經(jīng)恢復(fù)正常。采用WGA-HRP進(jìn)行神經(jīng)示蹤、Neurfilament(NF)免疫組織化學(xué)染色證明有形態(tài)結(jié)構(gòu)的重建；氯化金染色證明有運(yùn)動(dòng)終板的恢復(fù)。在電生理學(xué)的研究中也證明了軀體感覺(jué)誘發(fā)電位(SEP)和運(yùn)動(dòng)誘發(fā)電位(MEP)的恢復(fù)。新生的羊坐骨神經(jīng)如圖3所示。
實(shí)施例3、雙層人工導(dǎo)管用于大鼠脊髓組織的修復(fù)按照實(shí)施例1的方法，制備長(zhǎng)5毫米，外徑2.5毫米的導(dǎo)管。
以成年wistar大鼠脊髓全橫斷為模型即進(jìn)行常規(guī)外科手術(shù)，打開(kāi)椎板，將大鼠脊髓胸9-10節(jié)段完全切除5毫米，把上述導(dǎo)管移植到損傷的局部，縫合硬脊膜。動(dòng)態(tài)觀察1年，并進(jìn)行形態(tài)學(xué)、電生理學(xué)和BBB21行為學(xué)的評(píng)價(jià)。
研究結(jié)果表明，采用BDA進(jìn)行順行神經(jīng)示蹤、Neurfilament(NF)免疫組織化學(xué)染色、Gless鍍銀染色等均證明有形態(tài)結(jié)構(gòu)的重建；采用電子顯微鏡觀察到大量的有髓和無(wú)髓神經(jīng)纖維形成；在電生理學(xué)的研究中也證明了軀體感覺(jué)誘發(fā)電位(SEP)和運(yùn)動(dòng)誘發(fā)電位(MEP)的恢復(fù)；BBB21評(píng)分可以達(dá)到13分；新生的大鼠脊髓組織如圖4所示。
權(quán)利要求
1.一種雙層人工神經(jīng)導(dǎo)管，包括均由生物體內(nèi)可分解吸收性材料制成的一內(nèi)層導(dǎo)管和一外層導(dǎo)管，所述內(nèi)層導(dǎo)管套裝于所述外層導(dǎo)管內(nèi)部，所述內(nèi)層導(dǎo)管與所述外層導(dǎo)管的管隙間填充有纖維蛋白膠。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙層人工神經(jīng)導(dǎo)管，其特征在于所述生物體內(nèi)可分解吸收性材料為殼聚糖及其衍生物、膠原蛋白、明膠、L-多聚賴氨酸、乳酸和ε-己內(nèi)脂的共聚物、聚乳酸或聚乙二醇酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的雙層人工神經(jīng)導(dǎo)管，其特征在于所述外層導(dǎo)管由殼聚糖制成；所述內(nèi)層導(dǎo)管由膠原蛋白制成。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的雙層人工神經(jīng)導(dǎo)管，其特征在于所述纖維蛋白膠中還含有添加物，所述添加物選自膠原蛋白、昆布氨酸、Nogo抗體、生長(zhǎng)因子、L-多聚賴氨酸、雪旺氏細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞中的一種或幾種；所述添加物的用量為膠原蛋白50-100μg/ml、昆布氨酸60-100ng/ml、Nogo抗體30-60ng/ml、生長(zhǎng)因子10-300ng/ml、L-多聚賴氨酸60-100μg/ml。
5.權(quán)利要求3所述雙層人工神經(jīng)導(dǎo)管的制備方法，包括如下步驟1)制備殼聚糖導(dǎo)管將殼聚糖醋酸溶液倒入芯膜模具中，加溫到80-160℃，蒸餾水浸泡后取出，然后在殼聚糖醋酸溶液中反復(fù)浸漬、風(fēng)干，得到殼聚糖導(dǎo)管；2)制備膠原蛋白導(dǎo)管將膠原蛋白鹽酸溶液倒入芯膜模具中成型，經(jīng)過(guò)冷凍干燥后，再進(jìn)行機(jī)械擠壓成型，得到膠原蛋白導(dǎo)管；3)填充纖維蛋白膠將所得膠原蛋白導(dǎo)管插入到殼聚糖導(dǎo)管中，然后將纖維蛋白膠注射入兩層導(dǎo)管的管隙間，得到所述雙層人工神經(jīng)導(dǎo)管。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于步驟1)所述殼聚糖為脫乙酰度為80-85％的殼聚糖；所述殼聚糖醋酸溶液是將200mg溶于100-200ml 2％醋酸溶液得到的。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于所述步驟1)中經(jīng)過(guò)浸漬、風(fēng)干后的殼聚糖導(dǎo)管還需經(jīng)過(guò)NaOH溶液浸泡。
8.根據(jù)權(quán)利要求5或6或7所述的制備方法，其特征在于步驟2)中所述的膠原蛋白鹽酸溶液是將100毫克膠原蛋白溶于30-100毫升1mol/L鹽酸中得到的。
9.根據(jù)權(quán)利要求5或6或7所述的制備方法，其特征在于所述纖維蛋白膠中還含有添加物，所述添加物選自膠原蛋白、昆布氨酸、Nogo抗體、生長(zhǎng)因子、L-多聚賴氨酸、雪旺氏細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、和神經(jīng)干細(xì)胞中的一種或幾種。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的制備方法，其特征在于所述添加物的用量為膠原蛋白50-100μg/ml、昆布氨酸60-100ng/ml、Nogo抗體30-60ng/ml、生長(zhǎng)因子10-300ng/ml、L-多聚賴氨酸60-100μg/ml。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種雙層人工神經(jīng)導(dǎo)管及其制備方法。本發(fā)明所提供的雙層人工神經(jīng)導(dǎo)管，包括均由生物體內(nèi)可分解吸收性材料制成的一內(nèi)層導(dǎo)管和一外層導(dǎo)管，所述內(nèi)層導(dǎo)管套裝于所述外層導(dǎo)管內(nèi)部，所述內(nèi)層導(dǎo)管與所述外層導(dǎo)管的管隙間填充有纖維蛋白膠(為神經(jīng)組織和血管等的再生提供支持作用)。臨床上，周?chē)窠?jīng)和脊髓損傷以后可以采用本發(fā)明的雙層人工神經(jīng)導(dǎo)管進(jìn)行搭橋手術(shù)，并在神經(jīng)再生完成后，在動(dòng)物體內(nèi)逐步降解吸收。本發(fā)明的雙層人工神經(jīng)導(dǎo)管由于采用雙層結(jié)構(gòu)，具有良好的彈性和強(qiáng)度，所使用材料的降解時(shí)間和神經(jīng)纖維生長(zhǎng)的速度相適應(yīng)(約1－6個(gè)月)，可以應(yīng)用于臨床上周?chē)窠?jīng)損傷和脊髓損傷后的修復(fù)。
文檔編號(hào)A61L29/00GK1843307SQ20051006341
公開(kāi)日2006年10月11日 申請(qǐng)日期2005年4月7日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月7日
發(fā)明者李曉光, 楊朝陽(yáng) 申請(qǐng)人:首都醫(yī)科大學(xué)北京神經(jīng)科學(xué)研究所