專利名稱：自玉足海參中提取玉參多糖的方法,該玉參多糖及其藥物用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及自玉足海參中提取玉參多糖的方法，該玉參多糖本身及該玉參多糖的藥物用途。
背景技術(shù)：
缺血性腦中風(fēng)及血液栓塞性疾病是常見而多發(fā)的疾病，這類病嚴(yán)重地威脅著人類的健康。為防治這類疾病，人們開發(fā)了多種藥物。中醫(yī)藥界為此做出了自己的貢獻(xiàn)。按照中醫(yī)理論，海參具有滋陰養(yǎng)血、活血通絡(luò)、補腎益精的功效。然而簡單地通過食用海參并不能有效地防治缺血性腦中風(fēng)及血栓性疾病，其原因在于1.不同種類的海參中所含的有效物質(zhì)的量以及其組成有很大的差異；2.簡單地食用海參無法準(zhǔn)確地控制有效物質(zhì)的攝入量。因此，選擇適宜的海參，從中提出有效物質(zhì)并將其用于制藥是本發(fā)明的目的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的自玉足海參中提取玉參多糖的方法，包括以下步驟(1)將玉足海參破碎成粉；(2)用NaHCO3將所得玉足海參粉堿解，然后再用木瓜蛋白酶使其酶解；(3)將上述堿解、酶解產(chǎn)物經(jīng)低溫靜置后取上清液；(4)在PH值為2的條件下，去除所得上清液中的酸性蛋白后，將其濃縮至1.05-1.10的相對密度；(5)往所得濃縮物中加入乙醇后，提取沉淀物；(6)將所得沉淀物經(jīng)溶解，脫色和低溫處理后，提取上清液；(7)往所得上清液加乙醇，使其產(chǎn)生沉淀，然后提取該沉淀物，即玉參多糖。
所述玉參多糖的用途為制造用于治療缺血性腦中風(fēng)及血液栓塞性疾病的藥物。
本發(fā)明所用的玉足海參Holothuria(Mertensiothuria)Leucospilota(Brandt)是經(jīng)本發(fā)明人多次篩選后發(fā)現(xiàn)的一適用的海參。所述的玉參多糖是本發(fā)明人定義的用本發(fā)明的方法自玉足海參中得到的提取物，它含有55％(重量)以上的玉足海參總多糖，其余主要是玉足海參蛋白、無機鹽和水等非活性物質(zhì)。所述的玉足海參多糖是有效物質(zhì)，它具有延長凝血時間、推遲血栓形成、降低血粘度和血小板聚集率及改善軟腦膜微循環(huán)和縮小腦梗塞面積的功效。玉參多糖中的玉足海參總多糖由占72％(重量，下同)的硫酸粘多糖和占28％的聚巖藻糖硫酸酯組成。所述的硫酸粘多糖是一種抗凝活性最強的一種多糖，但其提純工藝十分復(fù)雜，而且成本高昂，而玉參多糖的提取工藝則相對簡單，成本也低，盡管其中含有玉參蛋白等非有效物質(zhì)，但用其制備用于口服的藥物已足以達(dá)到發(fā)明目的了。
用本發(fā)明的方法提取的玉參多糖對治療缺血性腦中風(fēng)及血液栓塞性疾病的動物實驗已經(jīng)完成，結(jié)果表明經(jīng)灌服玉參多糖后，大鼠因三氯化鐵所致大腦缺血的行為障礙得到明顯改善，梗塞面積縮小，腦部血流量增加；小鼠灌服玉參多糖后，其凝血時間明顯延長。
本發(fā)明藥物的急毒性實驗表明，該藥基本無毒。小鼠的最大耐受量為109.2g/kg體重，相當(dāng)于70kg體重成人日用量的471倍。長期毒性試驗表明，實驗動物的臟器系數(shù)與對照組比較無明顯改變。系統(tǒng)尸檢結(jié)果表明，全部實驗動物均無異常，可見本發(fā)明的藥品是安全可靠的。
本發(fā)明的藥物的制備工藝由于只提取玉參多糖而相對簡單，而用所得的玉參多糖來制備口服制劑其純度已是足夠的了。
按本發(fā)明的方法提取的玉參多糖可按需要制成適于口服的各種固體劑型，如膠囊、片劑或顆粒。
下面通過具體實施方式
具體地說明本發(fā)明。
具體實施例方式
實施例1，取玉足海參干品1000g，粉碎成粉(粒度在20目以下)，用10％的NaHCO3溶液8000ml，將其于55-60℃堿解8h；用60mol/L HCL將PH調(diào)至8，加木瓜蛋白酶10g于55-60℃酶解10h，95℃滅活30min，于0-5℃靜置過夜，取清液，用6mol/L HCL調(diào)整PH至2.0后，靜置1h，取清液，再用1mol/LNaOH調(diào)整PH至8.0后，清液于薄膜蒸發(fā)器中濃縮至相對密度1.05-1.10(室溫)。濃縮液中加乙醇，調(diào)整到含醇為50％，靜置過夜，收集沉淀物，即為粗品。
將粗品溶于適量水中，用1mol/L NaOH調(diào)整PH至8-9，加NaHSO3及30％H2O2脫色，置于0-5℃冰箱中過夜。次日，取上清液加乙醇調(diào)整含醇量至50％，靜置過夜。次日，收集沉淀物，用無水乙醇洗滌三次，干燥后即得40-50g玉參多糖粉末，其中，含玉足海參總多糖在55％以上。
實施例2，1.受試藥品及配置(1)將得自實施例1的玉參多糖粉末用1％羥甲基纖維素鈉(CMC-Na)配成的，10、20、40mg/ml的混懸液；(2)阿司匹林天津力生制藥廠生產(chǎn)，批號971009，含量99.74％。
(3)紅四氰唑(TTC)上海試劑三廠，批號970410。
(4)三氯化鐵天津化學(xué)試劑三廠，批號920410。
(5)高分子右旋糖苷中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液研究所提供，分子量300,000，為10％的消毒生理鹽水溶液，安瓶封裝，每支10ml。
(6)天保寧銀杏葉片中國科學(xué)院藥物研究所、浙江康恩貝制藥有限公司生產(chǎn)，批號980601，每片含銀杏葉片精提物40mg。實驗時以1％的羥甲基纖維素鈉(CMC-Na)配成40mg/ml和5mg/ml的混懸液；(7)人工腦脊液葡萄糖0.67g，KCl 0.22g，NaCl 7.3g，NaHCO32.1g，CaCl20.28g，MgCl22H2O 0.24g，尿素0.36g，以蒸餾水溶解并配成1000ml的溶液。
(8)二磷酸腺苷(ADP)SIGMA公司產(chǎn)品；(9)花生四烯酸SIGMA公司產(chǎn)品；(10)膠原稱取大鼠腹部去毛皮膚1g，加入10ml生理鹽水，于冰水浴中研磨成勻漿，3000rpm離心10min，取上清液，再以8000rpm離心10min，取上清液制得100mg/ml母液；2.實驗動物(1)昆明種小鼠動物合格證津?qū)崉釉O(shè)施準(zhǔn)第001號；(2)Wistar大鼠動物合格證津?qū)崉釉O(shè)施準(zhǔn)第001號；3.實驗方法與結(jié)果一.對局灶性腦缺血影響的檢測Wistar雄性大鼠，體重278±13kg(250-300g)，按體重隨機分為5組，每組10只，對照組每天灌服1％CMC-Na，給藥組分別灌服玉參多糖50、100、200mg/kg，陽性對照組灌服阿斯匹林200mg/kg。給藥體積均為0.5ml/100g，每天一次，連續(xù)7天，于末次給藥后1h腹腔注射12％水合三氯乙醛350mg/kg麻醉，側(cè)臥位固定，在手術(shù)顯微鏡下，于外耳道與眼外眥連線中點切開皮膚，暴露額骨，鉸斷，于顱骨底處開約2mm直徑小顱窗，暴露大腦中動脈，置一片塑料薄膜保護血管周圍組織，將吸有10毫升50％三氯化鐵的直徑約2mm濾紙敷在該段動脈上，30分鐘后去掉濾紙，用生理鹽水棉球沖洗局部組織數(shù)次，逐層縫合后，回籠飼養(yǎng)。于術(shù)后4、8、12h進行動物行為評分，以此作為腦功能障礙的指標(biāo)。評分采用盲法，即評分者不知道給藥的情況，評分標(biāo)準(zhǔn)如下(1)提鼠尾離開地面約一尺，觀察前肢屈曲情況，如雙前肢對稱伸向地面，計為0分，如手術(shù)對側(cè)前肢出現(xiàn)腕屈曲、肘屈曲、肩內(nèi)旋或既有腕、肘的屈曲又有肩內(nèi)旋者，分別計為1、2、3和4分；(2)將動物置于平地面上，分別推雙肩向?qū)?cè)移動，檢查阻力，如雙側(cè)阻力對等且有力者，記為0分；如向手術(shù)對側(cè)推動阻力下降者，根據(jù)下降的程度不同分為輕、中、重3度，分別記為1、2、3分；(3)將動物置一金屬網(wǎng)上，觀察前兩肢的張力，雙側(cè)肌力對等有力者計為0分；同樣，根據(jù)手術(shù)對側(cè)前肢張力的下降程度不同記為1-3分；(4)動物無轉(zhuǎn)圈者計為0分，有向一側(cè)轉(zhuǎn)圈行為者計1分，向一側(cè)不停轉(zhuǎn)者計為2分，根據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)滿分為12分，分?jǐn)?shù)越高，表明動物行為障礙越嚴(yán)重。24小時評分結(jié)束后，斷頭取腦，肉眼觀察對照組動物病灶側(cè)腦表面蒼白、無光，腦組織水腫明顯，給藥組大多數(shù)動物腦水腫較對照組輕，且病灶側(cè)腦蒼白無光不明顯。而后將腦放入生理鹽水中，保留雙側(cè)大腦半球稱重，沿冠狀面切成5片，將腦切片放入1％的TTC染液中，37℃避光溫孵30min，正常組織呈玫瑰紅色，梗塞區(qū)呈白色，將梗塞部位剪下稱重，以“重量求面積法”計算梗塞組織重量占雙側(cè)大腦半球重的百分比作為梗塞范圍。結(jié)果見表1、2。
表1玉參多糖對局部腦缺血大鼠行為的影響(X±SD)

注1.與假手術(shù)組比較+++p＜0.01；2.與對照組比較*p＜0.05；**p＜0.01；***p＜0.001；3.與等劑量的阿斯匹林組比較無顯著差異。
從表1的結(jié)果可以看出，假手術(shù)組動物行為無明顯改變，給與1％CMC-Na模型組動物與假手術(shù)組動物的行為評分比較有明顯的差異(p皆＜0.001)，大鼠灌服玉參多糖50、100、200mg/kg后，其行為變化與對照組比較有明顯的改善，24h后行為評分分別降低了42.9％(p＜0.01)，64.8％(p＜0.001)、69.2％(p＜0.001)。陽性藥阿斯匹林作用明顯。
表2玉參多糖對局部腦缺血大鼠腦梗塞面積的影響(X±SD)

注與模型對照組比較*p＜0.05；**p＜0.01；***p＜0.001；與等劑量的阿斯匹林組比較無顯著差異。
表2結(jié)果表明，給予1％CMC-Na模型組動物與假手術(shù)組動物比較梗塞范圍明顯，灌服玉參多糖50、100、200mg/kg后可明顯減少腦缺血大鼠腦梗塞面積。與對照組比較平均縮小了49.0％(p＜0.05)，68.5％(p＜0.01)、81.1％(p＜0.001)，且隨劑量增高梗塞范圍縮小，陽性藥阿斯匹林作用明顯。
二.對軟腦膜微循環(huán)障礙大鼠局部血流量的影響體重286±18g(260-310g)雄性Wistar大鼠，按體重隨機分5組，每組10只，對照組每天灌服1％CMC-Na，給藥組分別灌服玉參多糖50、100、200mg/kg，陽性藥灌服天保寧200mg/kg，給藥體積均為0.5ml/100g，每天一次，連續(xù)7天，于末次給藥后30分鐘腹腔注射12％水合氯醛350mg/kg麻醉，臥位固定于立體定位儀上，在大鼠左側(cè)頂骨中央開一直徑約5mm的顱窗，暴露軟腦膜，37℃人工腦脊液間斷滴注以保持腦膜表面濕潤，用Jl-200A激光微循環(huán)動態(tài)分析儀測定軟腦膜微血流量、流速激光多普勒值(laser Doppler，LD)，此為造型前值，而后給大鼠靜脈快速推基芐基氯(通式(2)化合物)加入一個25ml的三口燒瓶中，并加入18冠6(20mg，0.07mmol)，碘化鉀(25mg，0.15mmol)，氫氧化鉀(137mg，2mmol，82％)，丙酮(干燥)(8ml，0.11mol)，60℃攪拌2小時，冷卻至室溫(25℃)，常壓過濾，并用二氯甲烷洗掉吸附在生成鹽(如氯化鉀)上的有機物，將濾液旋干(旋干條件60℃，0.1大氣壓)至看不見明顯溶劑，柱色譜分析，得到10，10-二(3，4，5-三甲氧基)芐基蒽酮。
實施例7化合物h 10，10-二(3-甲基)芐基蒽酮的合成在氮氣保護下，將1mmol蒽酮(式(1)化合物)和2.2mmol 3-甲基芐基氯(通式(2)化合物)加入一個25ml的三口燒瓶中，并加入18冠6(20mg，0.07mmol)，碘化鉀(25mg，0.15mmol)，氫氧化鉀(137mg，2mmol，82％)，丙酮(干燥)(8ml，0.11mol)，55℃攪拌2小時，冷卻至室溫(10℃)，常壓過濾，并用二氯甲烷洗掉吸附在生成鹽(如氯化鉀)上的有機物，將濾液旋干(旋干條件40℃，0.3大氣壓)至看不見明顯溶劑，柱色譜分析，得到10，10-二(3-甲基)芐基蒽酮。
實施例8化合物I 10，10-二(4-甲基)芐基蒽酮的合成在氮氣保護下，將1mmol蒽酮(式(1)化合物)和2.2mmol 4-甲基芐基氯(通式(2)化合物)加入一個25ml的三口燒瓶中，并加入18冠6(20mg，0.07mmol)，碘化鉀(25mg，0.15mmol)，氫氧化鉀(137mg，2mmol，82％)，丙酮(干燥)(8ml，0.11mol)，70℃攪拌1小時，冷卻至室溫(30℃)，常壓過濾，并用二氯甲烷洗掉吸附在生成鹽(如氯化鉀)上的有機物，將濾液旋干(旋干條件60℃，0.1大氣壓)至看不見明顯溶劑，柱色譜分析，得到10，10-二(4-甲基)芐基蒽酮。
表2

<p>與等劑量天保寧組比較#p＜0.05。
結(jié)果表明，靜脈推注高分子右旋糖苷15、30、45、60min后，對照組大鼠腦膜局部流量、流速明顯減少(p＜0.05，p＜0.01，p＜0.001)，給藥組流量、流速未見明顯變化(p＞0.05)，其中高劑量組流速還有所增加(p＜0.05)，與對照組比較，給藥組流量明顯增加；流速明顯加快(p＜0.05，p＜0.01，p＜0.001)，與等劑量天保寧組比較流速有所增加(P＜0.05)，流量亦無明顯差異；灌服天保寧后大鼠流量、流速亦無明顯減少，與對照組比較流量有明顯增加(P＜0.05.P＜0.001)。
三.對微循環(huán)障礙大鼠血粘度的影響待上述試驗結(jié)束后，大鼠腹主動脈取血，3.8％枸櫞酸鈉與全血按體積1∶9混合抗凝，用錐板型血液粘度計，在不同切速下(7.5--75s-1)測定大鼠全血粘度；另取10只正常大鼠；麻醉后作同樣處理直接取血測定全血粘度作為空白對照組(表5)表5.玉參多糖對微循環(huán)障礙大鼠全血粘度的影響(X±SD，n＝10)

注1.與空白對照組比較+++P＜0.001；2.與模型對照組比較*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001；3.與等劑量天保寧組比較#P＜0.05。
結(jié)果表明，玉參多糖明顯降低血粘度；與空白對照組比較，造型組大鼠在靜脈推注高分子右旋糖苷后，在不同切速下血粘度明顯高于正常大鼠；給與玉參多糖50、100、200mg/kg后再切速為7.5-37.5s-1時大鼠血粘度均明顯低于模型對照組(P＜0.05；P＜0.001)，且有一定的劑量相關(guān)性；在切速為75-1時，玉參多糖仍有降低血粘度的趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)差異，200mg/kg玉參多糖降低血粘度作用強于等劑量天保寧(P＜0.05)。
四.對大鼠試驗性動脈血栓形成的影響

表2 灌胃對雄鼠體重的影響

7、結(jié)論7.1兩性別小鼠一次性給予以本發(fā)明的配方提取的戒毒浸膏后，平均體重逐日增加，無一例死亡。
7.2小鼠一次性給予以本發(fā)明的配方提取的戒毒浸膏，其最大耐受量＞59.29/kg(生藥)約相當(dāng)臨床推薦用量的247倍。
二、本發(fā)明藥物的臨床觀察及判定1、病例選擇治療病例158例，按年齡分最小17歲，最大34歲，17-27歲112人，28-34歲46人；按煙齡分類最短吸毒1年，最長吸毒10年，其中吸毒1-5年132人，6-10年26人。
2、臨床癥狀心煩失眠，焦慮生活無規(guī)律，頭痛納差，怕冷怕光，周身癱軟，頭面部丘疹破潰，久不封口，便秘等中毒癥狀。
3、治療方法分別以本發(fā)明戒毒藥物的湯劑、膠囊劑、顆粒劑服用，七天為一個治療周期，服藥期間禁食生冷，辛辣食物，禁食羊肉等熱性食物，清<p>試驗8、氨柔比星和氨柔比星增效劑(緩釋植入劑)的抑瘤作用以大白鼠為試驗對象，將2×105個乳腺腫瘤細(xì)胞皮下注射于其季肋部，待腫瘤生長14天后將其分為陰性對照(空白)、單藥治療組、聯(lián)合治療組。緩釋植入劑經(jīng)瘤內(nèi)放置。劑量均為5mg/kg。治療后第10天測量腫瘤體積大小，用腫瘤生長抑制率作指標(biāo)比較治療效果(見表6)。
表6

以上結(jié)果表明，所用氨柔比星(多柔比星)及氨柔比星增效劑(扎西他濱、恩曲他濱、加洛他濱、伊巴他濱)在該濃度單獨應(yīng)用時對多種腫瘤細(xì)胞生長均有明顯的抑制作用，當(dāng)聯(lián)合應(yīng)用時可表現(xiàn)出顯著的增效作用。增效作用在50-90％(P＜0.01)。
結(jié)論1.大鼠分別灌服玉參多糖50、100、200mg/kg，每天一次，連續(xù)7天可明顯減少FeCl3引起的模型鼠腦缺血面積，并可明顯改善其行為障礙。
2.大鼠灌服玉參多糖50、100、200mg/kg，每天一次，連續(xù)7天可對靜脈推注高分子右旋糖苷所致的軟腦膜微循環(huán)障礙有明顯改善作用，與對照組比較血流量增加；血流速度加快，血黏度下降，說明該藥具有改善腦部微循環(huán)的作用。
3.大鼠灌服玉參多糖50、100、200mg/kg，每天一次；連續(xù)7天能明顯延遲大鼠試驗性動脈血栓形成時間；并能明顯抑制ADP、花生四烯酸、膠原誘導(dǎo)的血小板聚集、表明玉參多糖有一定的抗血小板聚集及血栓形成作用。
4.小鼠灌服玉參多糖400、800mg/kg后，能明顯延長凝血時間，說明其有明顯的抗凝作用。
權(quán)利要求
1.自玉足海參中提取玉參多糖的方法，該方法包括以下步驟(1)將玉足海參破碎成粉；(2)用NaHCO3將所得玉足海參粉堿解，然后再用木瓜蛋白酶使其酶解；(3)將上述堿解、酶解產(chǎn)物經(jīng)低溫靜置后取上清液；(4)在PH值為2的條件下，去除所得上清液中的酸性蛋白后，將其濃縮至1.05-1.10的相對密度；(5)往所得濃縮物中加入乙醇后，提取沉淀物；(6)將所得沉淀物經(jīng)溶解，脫色和低溫處理后，提取上清液；(7)往所得上清液加乙醇，使其產(chǎn)生沉淀，然后提取該沉淀物，即玉參多糖。
2.按權(quán)利要求1所述方法得到的玉參多糖。
3.權(quán)利要求2所述的玉參多糖在制造用于治療缺血性腦中風(fēng)及血液栓塞性疾病的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供自玉足海參中提取玉參多糖的方法，該方法包括使玉足海參粉堿解、酶解、去除酸性蛋白、醇沉等步驟。所得的玉參多糖含有55％(重量)以上的玉足海參總多糖。所述的玉參多糖具有減少腦缺血、改善軟腦膜微循環(huán)、防止血小板聚集及血栓形成和明顯的抗凝作用，因而該玉參多糖可用于制備治療缺血性腦中風(fēng)及血液栓塞性疾病的藥物。
文檔編號A61P9/00GK1858067SQ20051006795
公開日2006年11月8日 申請日期2005年4月30日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月30日
發(fā)明者陳任重 申請人:陳任重