專利名稱：大鼠睪丸高表達(dá)基因rDJL參與精子頂體形成的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明為一個(gè)在精子發(fā)生過程中參與網(wǎng)格蛋白(clathrin)復(fù)合體介導(dǎo)的囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)和頂體形成的基因/蛋白(命名為rDJL基因/蛋白)，涉及生物醫(yī)學(xué)高技術(shù)中新基因、新蛋白質(zhì)的開發(fā)與應(yīng)用領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
大約半個(gè)世紀(jì)以前，Leblond和Clermont通過對(duì)曲細(xì)精管截面上不同發(fā)育階段的精細(xì)胞頂體進(jìn)行Schiff酸性染色，描述了曲細(xì)精管上皮細(xì)胞的周期性變化。曲細(xì)精管內(nèi)生精細(xì)胞呈規(guī)律、有序的排列，為我們進(jìn)行不同發(fā)育階段的基因表達(dá)研究提供了較為理想的模型。
目前為止分離生精細(xì)胞群的方法有多種，曲細(xì)精管分段分離是經(jīng)常采用且比較成熟的一種方法。大鼠的生精細(xì)胞在曲細(xì)精管排列極為有序大鼠睪丸每條曲細(xì)精管含有12個(gè)生精上皮波，每個(gè)生精上皮波由14個(gè)節(jié)段組成，不同節(jié)段中存在著不同發(fā)育階段的精原細(xì)胞、精母細(xì)胞和各級(jí)精子細(xì)胞的組合。由于這種不同的細(xì)胞組合，于透光解剖鏡下觀察，不同節(jié)段的曲細(xì)精管呈現(xiàn)不同的光吸收度。即A段(II～VI期)呈現(xiàn)強(qiáng)斑點(diǎn)帶，B段(VII～VIII期)呈現(xiàn)深黑帶，C段(IX～XII期)呈現(xiàn)淺帶，D段(XII～I(xiàn)期)呈現(xiàn)淡斑點(diǎn)帶。據(jù)此分別截取A，B，C，D段曲細(xì)精管，收集于變性液中，以提取各段曲細(xì)精管組織RNA。在各段之間作差異展示RT-PCR得到差異表達(dá)EST。以這些EST作為探針，篩選大鼠睪丸cDNA文庫，便可得到生精細(xì)胞不同發(fā)育階段的特異表達(dá)基因。而分離并克隆精子發(fā)生階段特異性基因，深入研究其功能是認(rèn)識(shí)精子發(fā)生的基本策略之一，也是現(xiàn)代生殖生物學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。同時(shí)，深入了解與精子發(fā)生有關(guān)的差異基因表達(dá)及相應(yīng)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，對(duì)人類的生殖健康、避孕疫苗的研制及男性不育的防治均有十分重要的意義。
rDJL基因就是采用曲細(xì)精管分段分離結(jié)合差異展示RT-PCR的方法得到的一條精子發(fā)生階段特異性基因。該基因全長(zhǎng)950bp，編碼一個(gè)223氨基酸的蛋白。該蛋白質(zhì)N端包含的保守J結(jié)構(gòu)域，故該蛋白屬于DnaJ蛋白家族。
DnaJ家族蛋白作為Hsp70蛋白的輔助分子伴侶發(fā)揮作用，并且為激活Hsp70ATP酶活性所必需。Hsp70-底物-DnaJ組成三蛋白復(fù)合物發(fā)揮作用，參與多種細(xì)胞功能，如輔助蛋白折疊、蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)、參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、調(diào)控基因表達(dá)等。在胞質(zhì)和亞細(xì)胞器中存在不同的Hsp70-DnaJ蛋白組合，形成特異的分子伴侶對(duì)協(xié)同發(fā)揮作用。Hsp70和DnaJ蛋白作為分子伴侶在哺乳動(dòng)物精子發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用。如睪丸特異表達(dá)的Hsp70-2為維持聯(lián)會(huì)復(fù)合體的功能、CDC2與cyclinB1復(fù)合體形成所必需。該基因缺失會(huì)導(dǎo)致減數(shù)分裂無法完成而使生精過程受到阻滯[43]。目前已分離得到多種精子發(fā)生相關(guān)的DnaJ蛋白MSJ-1是睪丸特異的主要表達(dá)于單倍體階段生精細(xì)胞的DnaJ蛋白，與mUBPy相互作用，在頂體形成和中心體組織過程中發(fā)揮功能。小鼠DiA1基因缺失會(huì)導(dǎo)致雄激素信號(hào)傳導(dǎo)異常。因而，rDJL作為一種階段特異表達(dá)的DnaJ家族成員，可能在精子發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用。
發(fā)明目的克隆在睪丸曲細(xì)精管區(qū)段差異表達(dá)、在精子細(xì)胞發(fā)育過程中可能起重要作用的基因rDJL，表達(dá)其編碼蛋白質(zhì)，了解其轉(zhuǎn)錄與表達(dá)的時(shí)期，闡明其生理生化功能，更清楚地了解精子細(xì)胞的發(fā)生機(jī)理以及基因表達(dá)調(diào)控規(guī)律，從而為相關(guān)疾病的基因診斷和基因治療以及新藥篩選和抗生育研究提供可能的目標(biāo)基因。
內(nèi)容與要求應(yīng)用曲細(xì)精管分段分離技術(shù)、差異顯示逆轉(zhuǎn)錄PCR、斑點(diǎn)雜交、分子克隆、cDNA文庫篩選、DNA序列測(cè)定技術(shù)、Northern印跡雜交、蛋白質(zhì)表達(dá)與純化技術(shù)、抗血清制備、免疫組織化學(xué)和免疫熒光技術(shù)、Western blot檢測(cè)、細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)、以及激光共聚焦顯微技術(shù)、免疫共沉淀技術(shù)等，克隆鑒定編碼rDJL蛋白的新基因全長(zhǎng)cDNA，通過Real Time PCR和Northern印跡雜交進(jìn)行組織表達(dá)譜和睪丸發(fā)育階段表達(dá)分析，純化原核表達(dá)的目標(biāo)蛋白質(zhì)并免疫家兔制備抗血清，進(jìn)而進(jìn)行免疫組織化學(xué)和免疫熒光分析，綜合運(yùn)用細(xì)胞免疫熒光和激光共聚焦顯微技術(shù)及免疫共沉淀技術(shù)初步確定rDJL基因/蛋白的功能。
該基因/蛋白達(dá)到的技術(shù)指標(biāo)為1.rDJL基因cDNA序列全長(zhǎng)950bp，GenBank接收號(hào)AF154849。此序列有一個(gè)669bp的開放閱讀框，編碼一個(gè)223氨基酸的蛋白質(zhì)。位于131-133位的ATG是編碼氨基酸的起始密碼子，上游-9核苷酸處是框內(nèi)終止密碼。說明這段序列是一完整的全長(zhǎng)cDNA序列。
2.rDJL蛋白N端3-69氨基酸構(gòu)成經(jīng)典的J結(jié)構(gòu)域，因而屬于DnaJ蛋白家族。
3.rDJL基因的表達(dá)具有組織特異性和睪丸組織發(fā)育階段特異性。Real Time PCR結(jié)果顯示該基因僅在大鼠睪丸、肝組織有轉(zhuǎn)錄表達(dá)，且在睪丸組織的表達(dá)水平遠(yuǎn)高于肝組織(見圖1)。Northern印跡雜交結(jié)果顯示，rDJL基因從生后30天的大鼠睪丸開始出現(xiàn)明顯表達(dá)，以后逐漸升高，到60天達(dá)到成年水平，之后便保持在高水平直到120天(見圖2)。
4.以rDJL閱讀框3’端423bp片段(編碼141個(gè)氨基酸)構(gòu)建原核表達(dá)載體，在大腸桿菌中獲得大量表達(dá)。經(jīng)親和純化后產(chǎn)物免疫新西蘭大耳白兔，制備了高滴度抗rDJL抗體(見圖3)。
5.rDJL蛋白的表達(dá)具有精子發(fā)生周期的階段特異性。rDJL蛋白從精母細(xì)胞開始出現(xiàn)表達(dá)，在精子細(xì)胞和成熟精子高表達(dá)，而在精原細(xì)胞中沒有表達(dá)(見圖4)。
6.rDJL蛋白在精母細(xì)胞中彌漫分布于胞漿，在精子細(xì)胞呈偏核分布，在成熟精子位于頂體區(qū)(見圖5)。
7.EGF刺激細(xì)胞內(nèi)吞后，rDJL-RFP融合蛋白在CHO細(xì)胞中呈囊泡狀分布，且與網(wǎng)格蛋白(clathrin)呈完全共定位(見圖6)。
8.免疫共沉淀驗(yàn)證rDJL蛋白與網(wǎng)格蛋白相互作用(見圖7)，證明該基因及其編碼蛋白質(zhì)與網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)過程、精子頂體形成等生命現(xiàn)象密切相關(guān)。


圖1.大鼠rDJL基因組織表達(dá)譜的Real Time PCR分析結(jié)果1腦，2骨骼肌，3心，4腸，5腎，6肝，7肺，8脾，9睪丸；結(jié)果顯示在9種成年大鼠組織中，睪丸組織有最高水平的rDJL基因表達(dá)，肝組織有一般水平表達(dá)，其余組織表達(dá)量甚微或?yàn)殛幮浴?br> 圖2.大鼠rDJL基因在不同發(fā)育天齡的大鼠睪丸組織中表達(dá)情況的Northern印跡分析結(jié)果上圖中從左到右依次為7、10、20、30、45、60、80、120天大鼠睪丸組織總RNA；下圖β-actin對(duì)照結(jié)果顯示出生后直到20天的大鼠尚無rDJL基因表達(dá)，30天、45天的大鼠均有rDJL基因表達(dá)，而60天即成年大鼠的睪丸rDJL基因表達(dá)量明顯較高。
圖3.pGEX-4T3-rDJL重組質(zhì)粒在大腸桿菌BL21(DE3)中的誘導(dǎo)表達(dá)圖1低分子量蛋白質(zhì)Marker；2未誘導(dǎo)pGEX-4T3-rDJL-BL21(DE3)菌體蛋白；3誘導(dǎo)的pGEX-4T3-rDJL-BL21(DE3)菌體蛋白；4純化的GST-rDJL蛋白。
圖4.免疫組化方法檢測(cè)rDJL蛋白在大鼠睪丸組織的表達(dá)A.以抗rDJL抗體對(duì)大鼠睪丸組織切片進(jìn)行免疫組化結(jié)果；B.免疫前血清對(duì)照可見rDJL蛋白在精原細(xì)胞和組織間質(zhì)沒有表達(dá)，而從精母細(xì)胞開始出現(xiàn)表達(dá)，在精子細(xì)胞和成熟精子中表達(dá)量明顯增加，尤其在精子頂體區(qū)濃染。
圖5.細(xì)胞免疫熒光觀察rDJL蛋白在大鼠睪丸生精細(xì)胞內(nèi)的亞細(xì)胞定位每組圖從左到右rDJL，細(xì)胞核，疊加圖上圖精母細(xì)胞；中圖精子細(xì)胞；下圖成熟精子圖中顯示rDJL蛋白在精母細(xì)胞中彌漫分布于胞漿；在精子細(xì)胞漿中呈偏核一側(cè)分布，類似于高爾基器在細(xì)胞中的定位特點(diǎn)；在成熟精子中，rDJL蛋白清楚地定位于頂體區(qū)，另外在精子尾也有分布。
圖6.rDJL蛋白與網(wǎng)格蛋白(clathrin)在CHO細(xì)胞中的共定位研究RFP-rDJL和GFP-clathrin真核質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，EGF刺激后激光共聚焦顯微鏡觀察。圖中由左至右網(wǎng)格蛋白、rDJL、疊加圖，Bar＝20μm圖中顯示EGF刺激誘導(dǎo)內(nèi)吞后，可見網(wǎng)格蛋白(綠色熒光)和RFP-rDJL(紅色熒光)均聚集成明亮的斑點(diǎn)，代表內(nèi)吞小泡形成，照片疊加后二者在細(xì)胞中呈完全共定位。上述結(jié)果顯示rDJL的功能與網(wǎng)格蛋白復(fù)合體介導(dǎo)的內(nèi)吞過程密切相關(guān)。
圖7.免疫共沉淀驗(yàn)證rDJL與網(wǎng)格蛋白(clathrin)相互作用將HA-rDJL和GFP-clathrin真核質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞。免疫共沉淀驗(yàn)證rDJL與網(wǎng)格蛋白(clathrin)相互作用。親和抗體為抗HA抗體，印跡抗體為抗GFP抗體。1.實(shí)驗(yàn)組，網(wǎng)格蛋白能與rDJL蛋白共沉淀；2.陽性對(duì)照，轉(zhuǎn)染后在HEK293細(xì)胞中表達(dá)的GFP-clathrin蛋白；3.陰性對(duì)照，將空質(zhì)粒與GFP-clathrin質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，網(wǎng)格蛋白未檢出。
此結(jié)果表明rDJL能與網(wǎng)格蛋白(clathrin)相互作用。進(jìn)一步證明rDJL參與網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)，因而其功能和精子發(fā)生過程中頂體形成有關(guān)。
具體實(shí)施例方式1.cDNA文庫的篩選大鼠生精小管的不同節(jié)段的mRNA差異顯示獲取差異表達(dá)的EST，進(jìn)行放射性標(biāo)記并用作探針篩選Clontech Laboratories公司的大鼠睪丸λgt10 5’-stretch cDNA文庫。斑點(diǎn)雜交法共篩選了1×106個(gè)克隆，采用噬菌體載體通用引物擴(kuò)增陽性克隆的插入片段。擴(kuò)增產(chǎn)物克隆入Promega公司的pGEM-TEasy載體并進(jìn)行序列測(cè)定，獲得一個(gè)全長(zhǎng)為950bp的cDNA克隆。此序列有一個(gè)669bp的開放閱讀框，一段130bp的5’非編碼區(qū)和148bp的3’非編碼區(qū)，編碼一個(gè)223氨基酸的蛋白質(zhì)。位于131-133位的ATG是編碼氨基酸的起始密碼子，上游-9核苷酸處是框內(nèi)終止密碼。說明這段序列是一完整的全長(zhǎng)cDNA序列。將此基因命名為rDJL，并且提交至GenBank，獲得接收號(hào)為AF154849。
2.RNA的制備、Real Time PCR和Northern印跡分析RNA的制備取成年大鼠一只。引頸處死后，快速切取睪丸、肌肉、腸、肝、肺、脾、腦、心、腎組織，裝入1.5ml離心管，紗布包裹后迅速液氮冷凍。然后用鈍器砸碎，稱取100mg組織加入有1ml Trizol試劑(Life Technologies)的微量組織勻漿器中。分別取7天、10天、20天、30天、45天、60天、80天、120天齡的大鼠睪丸50-100mg(組織處理同上)置于加有1ml Trizol試劑的微量組織勻漿器中，按照Trizol試劑說明所述提取總RNA。
Real Time PCR采用Invitrogen SuperScript First-strand Synthesis System進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成cDNA。以RT產(chǎn)物為模板，進(jìn)行RealTime PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件50℃ 2min，95℃ 10min，60℃ 1min，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。PCR反應(yīng)結(jié)束后采用Applied Biosystems SDS1.2軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。
Northern印跡分析采用甲醛變性的1％瓊脂糖凝膠電泳，每個(gè)泳道上樣所提組織總RNA 25μg，電泳結(jié)束后，用DEPC處理過的水淋洗凝膠數(shù)次，50mM的NaOH處理20min以水解RNA，無RNA酶的水淋洗數(shù)次，并用20X SSC浸泡凝膠45min，用20X SSC轉(zhuǎn)膜16-20h，轉(zhuǎn)移結(jié)束后，于6X SSC中漂洗濾膜，晾干，80℃干烤固定1-2h。室溫存放待雜交用。
用PCR擴(kuò)增rDJL片段，擴(kuò)增片段回收、定量，探針標(biāo)記DNA用量為25ng，采用隨機(jī)引物標(biāo)記試劑盒(Boehringer Mannheim)對(duì)探針進(jìn)行放射性標(biāo)記，雜交液使用Clontech公司Express Hyb TMHybridization Solution。將雜交液68℃預(yù)熱，使液體均勻。將Northern膜放入6X SSC中浸濕，然后置于雜交管中。固定有核酸的一面朝上，膜與雜交管之間勿留氣泡，加入5ml雜交液，68℃預(yù)雜交30min。將標(biāo)記探針于100℃處理10min，然后冰浴10min，繼而與預(yù)熱的雜交液混勻，加到雜交管中。68℃雜交1-2h。雜交結(jié)束后，小心將膜自雜交管中取出。置于2XSSC/0.5％SDS中室溫洗三次，每次15min。然后再用0.1XSSC/0.1％SDS 68℃洗膜兩次，每次20min。將濕膜置于保鮮膜內(nèi)，壓X光膠片，-70℃曝光(圖1，圖2)。
3.rDJL基因片段的原核表達(dá)及純化將編碼rDJL蛋白的C端的cDNA克隆到pGEX-4T3載體中，并用CaCl2法轉(zhuǎn)化BL21細(xì)胞，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后獲得高效表達(dá)的GST-rDJL融合蛋白。
首先小量培養(yǎng)鑒定GST-rDJL融合蛋白表達(dá)水平及該融合蛋白在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)形式，然后進(jìn)行大量表達(dá)，自經(jīng)過鑒定的質(zhì)粒保存板中挑單菌落入100ml新鮮LB的錐形瓶(含氨芐青霉素100μg/ml)。37℃，劇烈搖動(dòng)，培養(yǎng)過夜。將過夜菌液按1/10比例接種到一個(gè)含500ml LB(含氨芐青霉素)的2000ml錐形瓶中，37℃，劇烈搖動(dòng)，培養(yǎng)1-1.5h，使菌液的A600nm值達(dá)0.4-0.6。加入終濃度為0.5mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達(dá)3-4h。收集培養(yǎng)液，5000rpm離心10min，棄上清。PBS洗菌體沉淀，用PBS按照5ml/g重懸，冰浴下以工作10s/冷卻20s/300W/20次的參數(shù)，超聲破碎細(xì)胞。12000rpm離心20min，分別取少量上清和沉淀，進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，分析蛋白質(zhì)在胞內(nèi)表達(dá)形式。其余于-70℃凍存?zhèn)溆谩?br> GST-rDJL融合蛋白的純化采用Pharmacia公司純化試劑盒進(jìn)行。用預(yù)冷的3倍柱床體積PBS緩沖液平衡glutathione-Sepharose親和柱后，4℃下將破菌液過柱。50～80倍柱床體積PBS緩沖液緩慢沖洗層析柱，用考馬斯亮蘭G250檢測(cè)流出液至沒有蛋白質(zhì)為止。用還原型谷胱苷肽洗脫掛柱蛋白，收集洗脫液。取少量進(jìn)行SDS-PAGE鑒定。(圖3)。
4.rDJL抗血清的制備三只2kg重的新西蘭大白兔。兩只作為實(shí)驗(yàn)組，一只為對(duì)照。免疫前從耳緣靜脈取0.5ml正常血清做對(duì)照。
將純化的GST-rDJL蛋白與福氏完全佐劑混合，采用背部皮內(nèi)多點(diǎn)注射，約20-30點(diǎn)。對(duì)照組取泡膠液與佐劑混合。初始免疫后2、4、8周采用抗原和福氏不完全佐劑混合進(jìn)行加強(qiáng)免疫。酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)抗體滴度，Western Blot檢測(cè)抗體特異性。
5.睪丸組織切片的免疫組織化學(xué)分析5μm厚睪丸組織冰凍切片，改良Bouin液固定10min。PBS洗2次，每次5min。3％H2O2室溫孵育10min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。5-10％正常羊血清(PBS配)，室溫封閉10min。傾去血清，滴加適當(dāng)稀釋的抗rDJL血清，4℃過夜。PBS洗3次，每次5min。滴加適當(dāng)稀釋的生物素標(biāo)記二抗，37℃孵育30min。PBS洗3次，每次5min。滴加適當(dāng)稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈親和素，37℃孵育30min。PBS洗3次，每次5min。AEC顯色(4mgAEC溶于1ml二甲基甲酰胺中，加入14ml 0.1M乙酸緩沖液，pH5.2，加入15μl30％H2O2，過濾后即可)40min。自來水充分沖洗，蘇木素復(fù)染，封片。(圖4)6.大鼠生精細(xì)胞涂片的制備取成年雄性大鼠一只，引頸處死。從腹腔取出睪丸，置于干凈平皿中，用PBS洗凈。去除白膜和血管后置于D-Hanks液中。吹打數(shù)次以使曲細(xì)精管分散。吸去D-Hanks液，加入1M甘氨酸，室溫10min。棄去甘氨酸，加入膠原酶I，37℃ 15min以消化基底膜。棄去膠原酶I，加入D-Hanks液，吹打數(shù)次以使細(xì)胞分散。300目尼龍網(wǎng)過濾，濾液既為大鼠生精細(xì)胞。1500rpm離心5min，棄上清。PBS重懸細(xì)胞，取適量均勻涂布于載玻片，室溫晾干。4％多聚甲醛室溫固定10min，晾干。
7.細(xì)胞免疫熒光觀察rDJL在大鼠睪丸生精細(xì)胞內(nèi)的亞細(xì)胞定位封閉PBS洗滌5min×3次；0.5％TritonX-100/PBS透化，室溫10min；PBS洗滌5min×3次；3％BSA/PBS封閉，37℃ 0.5hr，或4℃過夜，或室溫1h。
一抗孵育除空白對(duì)照外，其他片子傾去封閉液；用PBS以1∶50稀釋一抗，37℃ 0.5h，或4℃過夜，或室溫1h；PBS洗滌5min×3次。
二抗孵育加以PBS 1∶50稀釋的FITC標(biāo)記二抗，37℃ 0.5h，或室溫1h；PBS洗滌5min×3次。
Hoechst33258染核4min，PBS洗滌5min×3次。
封片ddH2O洗滌5min×2次，自然晾干；取10 1封片劑滴在載玻片上，用蓋玻片封片，周圍用指甲油封住。激光共聚焦顯微鏡觀察(圖5)。
8.以EGFR介導(dǎo)的內(nèi)吞作用為例，應(yīng)用細(xì)胞免疫熒光結(jié)合激光共聚焦技術(shù)進(jìn)行共定位研究將rDJL克隆入pDsRed1-N1(Clontech公司)構(gòu)建融合紅色熒光蛋白表達(dá)載體；將網(wǎng)格蛋白(clathrin)克隆入pEGFP-N1(Clontech公司)構(gòu)建融合綠色熒光蛋白表達(dá)載體并對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序鑒定。將上述重組載體共同轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，進(jìn)行Western blot和細(xì)胞熒光檢測(cè)，確認(rèn)兩種融合蛋白得到表達(dá)。
將蓋玻片分次置于濃酸中浸泡2小時(shí)，用去離子水洗凈后室溫干燥。將經(jīng)酸處理的蓋玻片置于10倍稀釋的多聚賴氨酸溶液中，室溫放置5分鐘后取出，置于60℃干燥1小時(shí)或室溫過夜。用前將蓋玻片浸泡于75％乙醇中至少30分鐘。
實(shí)驗(yàn)前兩天將處理過的蓋玻片放置于6孔培養(yǎng)板板中，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CHO細(xì)胞接種于6孔板中，每孔3×105個(gè)細(xì)胞，37℃，5％CO2培養(yǎng)至70％飽和度。用50μl無抗生素?zé)o血清DMEM分別稀釋3μg質(zhì)粒和3.5μl Lipofectamine2000。室溫放置2分鐘后將稀釋的質(zhì)粒和Lipofectamine 2000混勻，室溫放置20分鐘。將上述混合物滴加到6孔培養(yǎng)板中，37℃，5％CO2孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)。
轉(zhuǎn)染后24小時(shí)將培養(yǎng)基換為無血清DMEM培養(yǎng)基，37℃，5％CO2培養(yǎng)6小時(shí)。
對(duì)于相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)組采用EGF誘導(dǎo)內(nèi)吞作用取出經(jīng)饑餓處理的細(xì)胞，6孔板置于冰上5分鐘。加入rhEGF至終濃度為100ng/ml，冰上10分鐘。將細(xì)胞置于37℃，5％CO2培養(yǎng)30分鐘。
細(xì)胞免疫熒光1)細(xì)胞固定用PBS清洗細(xì)胞兩次，取出蓋玻片，用濾紙將殘留液體吸干，以4％多聚甲醛固定液室溫固定10分鐘。2)PBS漂洗，3×5分鐘。3)去離子水漂洗，2×5分鐘。4)封片取10μl封片劑滴在載玻片上，將蓋玻片有細(xì)胞的一面朝下封片，周圍用指甲油封住。5)用激光共聚焦顯微鏡觀察(圖6)。
9.免疫共沉淀驗(yàn)證rDJL蛋白與網(wǎng)格蛋白相互作用1)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染前兩天將75cm2培養(yǎng)瓶中處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞以1∶3傳入75cm2培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。待細(xì)胞長(zhǎng)至70～80％時(shí)，將pcDNA6/V5-HisB-HA-rDJL(經(jīng)本組改造，在pcDNA6/V5-HisB載體中加入了HA標(biāo)簽序列)與pEGFP-N1-clathrin用Lipofectamine 2000共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞。以轉(zhuǎn)染pcDNA6/V5-HisB-HA空質(zhì)粒的細(xì)胞作為陰性對(duì)照。
2)細(xì)胞的裂解轉(zhuǎn)染48h后收集細(xì)胞，每瓶中加入1.5ml裂解液。放置冰上裂解1h。其間追加一次PMSF，并且間隔10min用細(xì)胞刮攪動(dòng)一次。細(xì)胞裂解物于4℃ 14000rpm離心20min，收集上清并凍存于-70℃。
3)免疫共沉淀向1ml細(xì)胞裂解液中加入10μl抗HA單克隆抗體，4℃振搖1h后再加入20μl protein Aagarose，4℃振搖過夜。Protein A agarose用NETN溶液漂洗后，重懸于50μl 1×SDS上樣緩沖液中，100℃煮沸10min。
4)Western Blot檢測(cè)行10％SDS-PAGE，然后用鼠源抗GFP抗體作為一抗，辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG作為二抗進(jìn)行Western Blot檢測(cè)。
10.全長(zhǎng)rDJL cDNA序列及其編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列1AATTCCGGTCTTGGGGTGAAATTCAAACCTGTGAACCTGAGTAGTTGAACACCTTCCGTT6061CTGAAGTTATATGGAAATTCTTCAGAATCTCAACCCTGCATCTTGGTGGGGCCAGGCTAT 120121TTGAAGAAACATGGTGAACTATTACAAAGTACTCGGGGTGCCACAGGACGCGTCGTCCTC 1801 M V N Y Y K V L G U P Q D A S S S17181TGATATCAAGAAGGCTTTCCACCAGCTGGCTCTGCAGGTACACCCAGATAAGAACCCCGG 24018 D I K K A F H Q L A L Q V H P D K N P G37241AGACAGGGAAGCAGCCGAGGAGAAATTCAAGCAAGTCGCAGAAGCCTATCAAATTTTATC 30038 D R E A A E E K F K Q V A E A Y Q I L S57301TGATGCCAAGAAGCGAAAGGACTATGACAGGTCCCGATGGAGCCGGACCAAAGAGGAGCT 36058 D A K K R K D Y D R S R W S R T K E E L77361CATCAGGGGTGACGGCAGAGACGAAACCAATTGGGAAGAAGAAATATGCTCTCGGAGGCC 42078 I R G D G R D E T N W E E E I C S R R P97421ACGCCGCACCTTCCAGACGGTCATCGAAGATGAAGACCTTTTTTCAGGAGATTATTTATT 48098 R R T F Q T V I E D E D L F S G D Y L F 117481CACTGGTCCCATGACGCATTCCAGAAGAGGTTCTTCCAACTTCTTTACAGTCACCCCCAT 540118 T G P M T H S R R G S S N F F T V T P I 137541TATAGACACAGGGTTTTCTACTTTTGTGTCCCAAGAATCCAAATCGAGTCCCGATGACTC 600138 I D T G F S T F V S Q E S K S S P D D S 157601TGAAGCCTTTGTGCCGTATATAAGCCATGGAATGGGAAAGTTCAGACTGGTCACCACTTG 660158 E A F V P Y I S H G M G K F R L V T T C 177661TAGCCAGATAATGAATGGTAAGAGAGTTGTCACAAAGAGAGTTGTAGAGAACATTCAAGG 720178 S Q I M N G K R V V T K R V V E N I Q G 197721ACCAAAGAAAATAGAGAACGAACGGCTATTTCGTTGGAATCCCTCACGTGGTTGGAAATT 780198 P K K I E N E R L F R W N P S R G W K L 217781GATGGAAAATCCCTGCTCTTGATGACGAGAAATGACGTGTTGACGGGACTTCAGTTAAAA 840218 M E N P C S * 223841CTGGGGCCTGCTCTGAAAATCTATGAGTATCATGTAAAACCTCTTCAGACCAAGCATTTA 900901AAGAACATCTCTTCATAGTAAAATCACACTGAGGTCTCAGTCCTCAGCCG 950
權(quán)利要求
1.本發(fā)明涉及一個(gè)自大鼠睪丸曲細(xì)精管區(qū)段差異表達(dá)的、參與網(wǎng)格蛋白(clathrin)復(fù)合體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用的基因/蛋白，命名為rDJL基因/蛋白(GenBank注冊(cè)號(hào)AF154849)。包括互補(bǔ)脫氧核糖核酸(cDNA)序列，編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列。其特征在于rDJL的cDNA全長(zhǎng)為950bp，相應(yīng)編碼蛋白質(zhì)有223個(gè)氨基酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述之rDJL基因/蛋白，其特征在于該蛋白的氨基端第3-69氨基酸編碼J結(jié)構(gòu)域。
3.根據(jù)權(quán)利要求1、2所述之rDJL基因/蛋白，其特征在于該基因的表達(dá)具有組織特異性和睪丸組織發(fā)育階段特異性。該基因在大鼠睪丸組織呈高水平轉(zhuǎn)錄表達(dá)。大鼠于出生后20天其睪丸中尚無rDJL基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，30天時(shí)可檢出該基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，至60天即成年大鼠，睪丸中rDJL基因呈明顯高表達(dá)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3所述之rDJL基因/蛋白，其特征在于rDJL蛋白的表達(dá)具有精子發(fā)生周期的階段特異性。rDJL蛋白在精原細(xì)胞和組織間質(zhì)沒有表達(dá)，而從精母細(xì)胞開始出現(xiàn)表達(dá)，在精子細(xì)胞和成熟精子中表達(dá)量明顯增加，尤其在精子頂體區(qū)濃染。
5.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3、4所述之rDJL基因/蛋白，其特征在于該基因的編碼蛋白在精母細(xì)胞中彌漫分布于胞漿；在精子細(xì)胞漿中呈偏核一側(cè)分布，類似于高爾基器在細(xì)胞中的定位特點(diǎn)；在成熟精子中，rDJL蛋白清楚地定位于頂體區(qū)，另外在精子尾也有分布。
6.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3、4、5所述之rDJL基因/蛋白，其特征在于rDJL蛋白可以與網(wǎng)格蛋白相互作用并參與網(wǎng)格蛋白復(fù)合體的功能。
7.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3、4、5、6所述之rDJL基因/蛋白，其特征在于該基因及其編碼蛋白的功能與精子發(fā)生中網(wǎng)格蛋白復(fù)合體介導(dǎo)的內(nèi)吞、囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)等生命現(xiàn)象密切相關(guān)，在抗生育領(lǐng)域以及新藥的設(shè)計(jì)與開發(fā)中具有潛在的應(yīng)用前景。
全文摘要
本發(fā)明涉及一個(gè)自大鼠睪丸曲細(xì)精管區(qū)段差異表達(dá)的基因，命名為rDJL基因(GenBank注冊(cè)號(hào)AF154849)。內(nèi)容包括rDJL的互補(bǔ)脫氧核糖核酸(cDNA)序列，編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列；結(jié)構(gòu)分析顯示rDJL蛋白氨基端包含一個(gè)J結(jié)構(gòu)域；Real Time PCR和Northern印跡分析結(jié)果表明，該基因的表達(dá)具有組織特異性和睪丸組織發(fā)育階段特異性；免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，rDJL的表達(dá)具有精子發(fā)生周期的階段特異性；免疫熒光分析結(jié)果顯示，該蛋白在成熟精子位于頂體區(qū)；運(yùn)用細(xì)胞免疫熒光和激光共聚焦顯微技術(shù)及免疫共沉淀技術(shù)，初步確定rDJL蛋白能夠與網(wǎng)格蛋白(clathrin)相互作用，參與網(wǎng)格蛋白復(fù)合體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用。rDJL蛋白的功能與精子發(fā)生中的內(nèi)吞和頂體形成密切相關(guān)，闡明其功能對(duì)了解生殖細(xì)胞的發(fā)生機(jī)理、研制抗生育藥物具有重要意義。
文檔編號(hào)A61K38/17GK1869222SQ20051007106
公開日2006年11月29日 申請(qǐng)日期2005年5月24日 優(yōu)先權(quán)日2005年5月24日
發(fā)明者楊春波, 繆時(shí)英, 王琳芳, 楊居祥 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所