專(zhuān)利名稱(chēng)：巴豆根、莖、葉提取物,其抗炎鎮(zhèn)痛有效成分和它們的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及藥用植物巴豆的根、莖、葉提取物及其抗炎鎮(zhèn)痛有效成分，所述提取物的提取方法以及有效成分的分離純化方法，含有該提取物或有效成分的藥物組合物，以及所述提取物和有效成分用于制備治療疼痛和炎癥的藥物的用途。
背景技術(shù)：
巴豆(Croton tiglium L.)為大戟科(Euphorbiaceae)巴豆屬(Croton L.)植物，異名剛子(雷公炮炙論)、老陽(yáng)子(本草綱目)、江子(瑞竹堂經(jīng)驗(yàn)方)、雙眼龍(嶺南竹子)、猛子仁(中國(guó)藥用植物志)。原產(chǎn)印度、馬來(lái)西亞、臺(tái)灣中南部，我國(guó)主產(chǎn)于四川、廣西、云南、貴州等省。其種子為常用中藥，具有瀉下祛積、逐水消腫的功能。關(guān)于巴豆的根、莖、葉的化學(xué)成分及藥物用途少見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人經(jīng)過(guò)廣泛的植物抗炎、鎮(zhèn)痛活性篩選，首次發(fā)現(xiàn)巴豆根、莖、葉提取物能夠顯著地抑制醋酸引起的小鼠扭體反應(yīng)、延長(zhǎng)熱板試驗(yàn)中小鼠的痛閾，并能顯著抑制巴豆油誘導(dǎo)的耳腫脹反應(yīng)，顯示出良好的鎮(zhèn)痛和抗炎生物活性，表明其具有用于治療外周神經(jīng)或中樞神經(jīng)疼痛如創(chuàng)傷、手術(shù)及癌癥等所致的劇痛和牙痛、頭痛、神經(jīng)痛、關(guān)節(jié)痛、月經(jīng)痛等慢性鈍痛以及炎性疾病如風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎或類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等的藥用前景。進(jìn)一步地，通過(guò)對(duì)所述提取物中的化學(xué)成分的研究，確定了其中具有抗炎、鎮(zhèn)痛活性的主要化學(xué)成分。
因此，本發(fā)明的第一個(gè)方面涉及一種提取物，其特征在于含有至少一種如下式I、II、III所示的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽
式I 式II其中，Tiglin A R1＝乙?；?；R2＝2-甲基丁?；?；Tiglin B R1＝乙?；籖2＝2-甲基丙?；?； 式III
本發(fā)明的第二個(gè)方面涉及所述提取物的制備方法，該方法包括用50-95％的乙醇提取藥用植物例如巴豆根、莖、葉的粗粉，過(guò)濾回收乙醇，濃縮后得到所述提取液；或者用水加熱回流提取，提取液減壓濃縮，再加入無(wú)水乙醇，除去沉淀物并蒸發(fā)溶劑，得到所述提取物。
本發(fā)明的第三個(gè)方面涉及式I、II、III所示的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽 式I 式II其中，Tiglin A R1＝乙?；籖2＝2-甲基丁?；?；Tiglin B R1＝乙?；籖2＝2-甲基丙?；?
式III本發(fā)明的第四個(gè)方面涉及式I、II、III化合物的制備方法，所述方法包括對(duì)藥用植物例如巴豆根、莖、葉的粗粉進(jìn)行提取，得到提取物后，再用常規(guī)手段對(duì)所述提取物進(jìn)行分離純化，得到式I、II、III化合物的單體。
本發(fā)明的第五個(gè)方面涉及含有所述提取物或其有效成分以及一種或多種藥學(xué)上可接受載體或賦形劑的藥物組合物。
本發(fā)明的第六個(gè)方面涉及所述提取物或其有效成分用于制備治療疼痛和炎癥的藥物的用途。
本發(fā)明的提取物及鎮(zhèn)痛抗炎活性成分可按如下方法提取及制備提取物的制備方法取藥用植物例如巴豆根、莖、葉粉碎成20目左右粗粉，加入3-10倍的50-95％乙醇提取，并過(guò)濾回收乙醇，水浴濃縮得提取物和水濃縮液。
提取物中活性成分的制備方法巴豆根、莖、葉醇提取物用水分散，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，水浴減壓濃縮回收溶劑，分別得到石油醚部位、乙酸乙酯部位、水部位。水部位濃縮后上大孔樹(shù)脂，用乙醇∶水梯度洗脫得到醇洗濃縮膏，上硅膠柱層析，洗脫劑為氯仿∶甲醇∶水梯度洗脫，洗脫物再上硅膠柱層析，洗脫劑為氯仿∶甲醇(10∶1)，洗脫物經(jīng)過(guò)SephadexLH-20純化，甲醇洗脫，得到單體成分化合物Crotonine。
石油醚部位經(jīng)過(guò)硅膠柱層析，以環(huán)己烷∶乙酸乙酯梯度洗脫，得到得洗脫物再上硅膠柱層析，以氯仿∶甲醇梯度洗脫，得到得洗脫再經(jīng)過(guò)Sephadex LH-20純化得到單體成分化合物Tiglin A、Tiglin B。
乙酸乙酯部位經(jīng)過(guò)硅膠柱層析，以氯仿∶甲醇梯度洗脫后，再上硅膠柱層析，用氯仿∶乙酸乙酯(1∶1)洗脫分離，洗脫物經(jīng)過(guò)SephadexLH-20純化得到單體成分化合物Tiglin C。
本發(fā)明的巴豆根、莖、葉提取物具有如下特征(1)醋酐濃硫酸實(shí)驗(yàn)(Liebermann-Burchard反應(yīng))巴豆根、莖、葉提取物以適量95％乙醇浸取，取浸出液將乙醇蒸干，殘?jiān)屑尤?毫升冰醋酸使其溶解，再加1毫升醋酐，最后滴入濃硫酸。試管顏色依次經(jīng)黃-紅-紫-藍(lán)-墨綠進(jìn)行變化，表示有巴豆根、莖、葉甾醇或甾體皂苷存在。
(2)3，5-二硝基苯甲酸反應(yīng)(Kedde反應(yīng))巴豆根、莖、葉提取物以適量95％乙醇浸取，取浸出液1毫升于試管中，加入3-4滴3，5-二硝基苯甲酸試劑(按以下方法制備1克3，5-二硝基苯甲酸溶于50ml甲醇，在加50毫升2N氫氧化鈉溶液，用時(shí)新配)，產(chǎn)生紫紅色。
(3)巴豆根、莖、葉提取物以適量95％乙醇浸取，取浸出液1毫升于試管中，加2毫升1％氫氧化鈉，于沸水浴中煮3～4分鐘，液體比未加熱前清晰多。在加2％鹽酸酸化，液體變?yōu)闇啙帷?br> (4)巴豆根、莖、葉提取物以水分散后，分別用石油醚、乙酸乙酯萃取后，經(jīng)水浴加熱濃縮除去溶劑后，分別得到石油醚部位、乙酸乙酯部位和水部位。三個(gè)部位可分別具有以下的薄層色譜特征
石油醚部分經(jīng)硅膠柱層析，以環(huán)己烷-乙酸乙酯梯度洗脫，洗脫物的硅膠薄層層析，以環(huán)己烷∶乙酸乙酯(1∶1或1∶2)或石油醚∶丙酮(1∶1)展開(kāi)，噴25％磷鉬酸乙醇溶液，斑點(diǎn)顯綠色，與濃硫酸乙醇溶液反應(yīng)呈棕色斑點(diǎn)，即為T(mén)iglin A和B(Rf＝0.25-0.65)。
乙酸乙酯部分經(jīng)硅膠柱層析，以乙酸乙酯洗脫，洗脫物在硅膠薄層板上以石油醚∶丙酮(2∶1)、石油醚∶異丙醇(12∶1)、正己烷∶丙酮(3∶1)、氯仿∶乙酸乙酯(1∶1)展開(kāi)，噴25％磷鉬酸乙醇溶液，斑點(diǎn)顯綠色，濃硫酸乙醇顯色斑點(diǎn)呈棕色，為T(mén)iglin C(Rf＝0.2-0.7)。
水部位上大孔樹(shù)脂，30％醇洗脫物上硅膠柱層析，以氯仿∶甲醇∶水(7∶3∶0.5)洗脫的部分硅膠薄層層析，氯仿∶甲醇(10∶1)展開(kāi)后與30％硫酸乙醇溶液反應(yīng)呈黃色斑點(diǎn)，即為Ctotonine(Rf＝0.2-0.6)。
本發(fā)明提取物中的活性成分Crotonine[其化學(xué)名稱(chēng)為2-(呋喃基-2-基)-5-(2，3，4-三羥基-丁基)-1，4-二嗪，結(jié)構(gòu)見(jiàn)式I]具有如下特征黃色固體，分子式為C12H14N2O4，分子量為250，易溶解于甲醇、水、二甲基亞砜等溶劑；與磷鉬酸試劑反應(yīng)生成沉淀，與碘化鉍劑試劑不反應(yīng)，與濃硫酸乙醇試劑反應(yīng)成黃色斑點(diǎn)。巴豆根、莖、葉提取物以水分散后用石油醚、乙酸乙酯提取后，水溶液上大孔樹(shù)脂，30％醇洗脫物上硅膠柱層析，以氯仿∶甲醇∶水(7∶3∶0.5)洗脫的部分硅膠薄層層析，氯仿∶甲醇(10∶1)展開(kāi)后與30％硫酸乙醇溶液反應(yīng)呈黃色斑點(diǎn)。
本發(fā)明提取物中的活性成分Tiglin A[其化學(xué)名稱(chēng)為1，1a，7b，8，9，9a-六氫-4a，7b-二羥基-3-(羥甲基)-1，1，6，8-四甲基-9-(1-氧代-乙酰氧基(-9a-(2-甲基-1-氧代-丁氧基)-1bH-雙環(huán)[4.1.0]庚-1(6)-烯醇[3，2-e]奧-2，5(4aH，7aH)-二酮，結(jié)構(gòu)見(jiàn)式II]具有如下特征淡黃色膠狀物，分子式為C27H36O9，分子量為504，溶解于氯仿；與磷鉬酸試劑反應(yīng)成綠色斑點(diǎn)，與偏釩酸-硫酸溶液反應(yīng)成陽(yáng)性。巴豆根、莖、葉提取物以水分散后石油醚、乙酸乙酯萃取。石油醚部分經(jīng)硅膠柱層析，以環(huán)己烷-乙酸乙酯梯度洗脫，洗脫物的硅膠薄層層析，以環(huán)己烷∶乙酸乙酯(1∶1或1∶2)或石油醚∶丙酮(1∶1)展開(kāi)，噴25％磷鉬酸乙醇溶液，斑點(diǎn)顯綠色，與濃硫酸乙醇溶液反應(yīng)呈棕色斑點(diǎn)，即為T(mén)iglin A。
本發(fā)明提取物中的活性成分Tiglin B[其化學(xué)名稱(chēng)為1，1a，7b，8，9，9a-六氫-4a，7b-二羥基-3-(羥甲基)-1，1，6，8-四甲基-9-(1-氧代-乙酰氧基(-9a-(2-甲基-1-氧代-丙氧基)-1bH-雙環(huán)[4.1.0]庚-1(6)-烯醇[3，2-e]奧-2，5(4aH，7aH)-二酮，結(jié)構(gòu)見(jiàn)式II]具有如下特征淡黃色膠狀物，分子式為C26H34O9，分子量為490，溶解于氯仿；與磷鉬酸試劑反應(yīng)成綠色斑點(diǎn)，與偏釩酸-硫酸溶液反應(yīng)成陽(yáng)性。巴豆根、莖、葉提取物以水分散后石油醚、乙酸乙酯萃取。石油醚部分經(jīng)硅膠柱層析，以環(huán)己烷-乙酸乙酯梯度洗脫，洗脫物的硅膠薄層層析，以環(huán)己烷∶乙酸乙酯(1∶1或1∶2)或石油醚∶丙酮(1∶1)展開(kāi)，噴25％磷鉬酸乙醇溶液，斑點(diǎn)顯綠色，與濃硫酸乙醇溶液反應(yīng)呈棕色斑點(diǎn)，即為T(mén)iglin B。
本發(fā)明提取物中的活性成分Tiglin C具有如下特征(化學(xué)結(jié)構(gòu)見(jiàn)式III)白色粉末，分子式為C21H28O5，分子量為360，溶解于氯仿、甲醇；與磷鉬酸試劑反應(yīng)成綠色斑點(diǎn)，與偏釩酸-硫酸溶液反應(yīng)成陽(yáng)性。巴豆根、莖、葉提取物以水分散后石油醚、乙酸乙酯萃取。乙酸乙酯部分以石油醚∶乙酸乙酯洗脫硅膠柱層析，洗脫物以石油醚∶丙酮(2∶1)、石油醚∶異丙醇(12∶1)、正己烷∶丙酮(3∶1)、氯仿∶乙酸乙酯(1∶1)展開(kāi)，噴25％磷鉬酸乙醇溶液，斑點(diǎn)顯綠色，濃硫酸乙醇顯色斑點(diǎn)呈棕色，為T(mén)iglin C。
本發(fā)明的巴豆根、莖、葉提取物和單體化合物Crotonine、TiglinA、Tiglin B、Tiglin C單獨(dú)或混合使用時(shí)具有顯著的鎮(zhèn)痛、抗炎活性，可用于制備治療外周神經(jīng)和中樞神經(jīng)疼痛、如創(chuàng)傷、手術(shù)及晚期癌癥等所致的劇痛及牙痛、頭痛、神經(jīng)痛、關(guān)節(jié)痛、月經(jīng)痛等慢性鈍痛的鎮(zhèn)痛藥物以及炎性疾病、如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等的抗炎藥物。
本發(fā)明的提取物和式I、II、III化合物單獨(dú)或混合使用時(shí)具有顯著的抗炎生物活性，可用于制備治療炎性病癥如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病的藥物。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明提取物、其有效成分可單獨(dú)或以藥物組合物的形式使用，給藥方式可根據(jù)具體情況而定，并可根據(jù)需要按照藥劑學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)方法制成適合口服、直腸給藥、肌肉注射等給藥方式的劑型，如片劑、膠囊、膏劑、貼劑、注射劑等。
本發(fā)明的藥物組合物含有所述提取物或其有效成分以及一種或多種藥學(xué)上可接受載體或賦形劑，所述的載體或賦形劑包括藥劑學(xué)常規(guī)應(yīng)用的載體和賦形劑，例如填充劑、粘合劑、防腐劑、矯味劑、稀釋劑、著色劑等。
本發(fā)明提取物及其有效成分的用量取決于使用對(duì)象的年齡、體重和疾病的類(lèi)型及嚴(yán)重程度等因素。
具體實(shí)施例方式
下面的實(shí)施例和生物活性實(shí)驗(yàn)是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，但不意味著對(duì)本發(fā)明的任何限制。
實(shí)施例1巴豆根、莖、葉提取物的制備將巴豆根、莖、葉粗粉3kg，粉碎后，用95％乙醇加熱回流提取，每次用95％乙醇10L，提取3次，合并提取液，減壓蒸發(fā)至干，得到乙醇提取物300g，其具有前述的定性反應(yīng)特征。
實(shí)施例2
巴豆根、莖、葉提取物中有效成分Crotonine的制備將300g上述提取物在水中分散，分別用石油醚、乙酸乙酯萃取，回收溶劑后得到石油醚、乙酸乙酯和水溶性三個(gè)部位。
水溶部位以大孔樹(shù)脂吸附后，用乙醇/水梯度洗脫，得到醇洗濃縮膏，上硅膠柱層析，以氯仿/甲醇/水梯度洗脫，洗脫物再上硅膠柱層析，洗脫劑為氯仿/甲醇(10∶1)，洗脫物經(jīng)過(guò)Sephadex LH-20純化，甲醇洗脫，得到單體成分化合物Crotonine(EOL GX-400型核磁共振儀(TMS內(nèi)標(biāo))，1HNMR400MHz；13CNMR100MHz)。黃色固體，[α]D20-6.8(c＝0.25，MeOH).UVλmaxMeOHnm205，280，335.IRνmaxKBrcm-11560，875.1H和13C-NMR數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。EIMS m/z 250，232，219，189，160，220，215，201，173，133，105，92，93.HREIMS m/z 250.0954(C12H14N2O4，Cal.250.0954，M+).1H-NMR(CD3OH 400MHz)δ8.88(1H，d，1.4，H-3)，8.49(1H，d，1.4，H-6)，7.15(1H，dd，0.6，3.4，H-3′)，6.61(1H，dd，1.7，3.4，H-4′)，7.69(1H，dd，0.6，1.7，H-5′)，2.91(1H，dd，14.2，9.5，H-1″)，3.21(1H，dd，14.2，3.1，H-1″)，3.95(1H，m，H-2″)，3.56(1H，m，H-2″)，3.62(1H，dd，11.2，6.4，H-4″)，3.77(1H，dd，11.2，3.8，H-4″)；13C-NMR(CD3OH，100MHz)δ143.(C-2)，140.1(C-3)，154.8(C-4)，145.7(C-5)，152.3(C-2′)，111.2(C-3′)，113.3(C-4′)，145.9(C-5′)，39.6(C-1″)，72.9(C-2″)，76.1(C-3″)，64.6(C-4″)實(shí)施例3巴豆根、莖、葉提取物中有效成分Tiglin A、Tiglin B的制備將實(shí)施例2中的石油醚部位經(jīng)過(guò)硅膠柱層析，以環(huán)己烷/乙酸乙酯梯度洗脫，洗脫物再經(jīng)硅膠柱層析，以氯仿/甲醇梯度洗脫，再經(jīng)過(guò)Sephadex LH-20純化得到單體化合物Tiglin A、Tiglin B(INOVA600超導(dǎo)核磁共振儀，1HNMR600MHz；13CNMR150MHz)。
Tiglin A淡黃色膠狀物，溶于氯仿。[α]D25+44.2°(c1.415，CHCl3)。IRνmaxKBrcm-13384，2976，2933，2879，1745，1714，1680，1656，1407，1340，1273，1232，1194，1157，1111，1084，1020，982，922，891，806，650。UVλMeOHmaxnm226，248。FAB-MS m/z505[M-1]+，445[M+1-CH3COOH]+，427[M+1-CH3COOH-H2O]+，409，343[M+1-CH3COOH-CH3CH2CH(CH3)COOH]+，325[M+1-CH3COOH-CH3CH2CH(CH3)COOH-H2O]+和307。HRESI-MS實(shí)測(cè)值503.2287，理論值503.2281[M-H]-。1H-NMR(CDCl3500MHz)δ0.94(3H，t，J＝7.5，7.5Hz，CH2-CH3，2-甲基丁?；?，0.95(3H，d，J＝7.5Hz，H3-18)，1.16(3H，d，J＝7.5Hz，COCH(CH3)-，2-甲基丁?；?，1.22(3H，s，H3-17)，1.21(3H，s，H3-16)，1.46(1H，m，COCH(CH3)CH2CH3，2-甲基丁酰基)，1.75(1H，m，COCH(CH3)CH2CH3，2-甲基丁?；?，1.77(1H，d，J＝5.5Hz，H-14)，1.80(3H，s，H3-19)，2.09(3H，s，COCH3)，2.27(1H，m，H-11)，2.39(1H，q，J＝2.5，7.5Hz，COCH(CH3)-，2-甲基丁酰基)，3.26(1H，br t，H-10)，3.81(1H，d，J＝5.5Hz，H-8)，4.28(1H，d，J＝15.0Hz，H-20b)，4.41(1H，d，J＝15.0Hz，H-20a)，5.41(1H，d，J＝10.5Hz，H-12)，6.97(1H，s，H-5)，7.66(1H，s，H-1)。13C-NMR(CDCl3150MHz)δ10.3(C-19)，11.6(CH2-CH3，2-甲基丁?；?，14.5(C-18)，16.1(COCH(CH3)-，2-甲基丁?；?，16.7(C-16)，20.9(COCH3)，23.4(C-17)，25.7(C-15)，26.1(COCH(CH3)CH2CH3，2-甲基丁?；?，29.6(C-14)，41.2(COCH(CH3)-，2-甲基丁?；?，44.5(C-11)，54.5(C-8)，59.1(C-10)，62.4(C-20)，65.1(C-13)，72.9(C-4)，75.6(C-9)，77.3(C-12)，135.0(C-2)，136.8(C-5)，148.3(C-6)，159.9(C-1)，170.7(C＝O，COCH3)，179.1(C＝O，2-甲基丁?；?，201.1(C-7)，205.5(C-3)。
Tiglin B淡黃色膠狀物，溶于氯仿。[α]D25+32.5°(c0.67，CHCl3)。IRνmaxKBrcm-13386，2976，2927，1743，1714，1678，1654，1408，1342，1273，1234，1199，1161，1111，1082，1020，981，924，891，806，650。UVλMeOHmaxnm226，248。FAB-MS m/z491[M+1]+，431[M+1-CH3COOH]+，343[M+1-CH3COOH-(CH3)2CHCOOH]+和325。HRESI-MS實(shí)測(cè)值489.2134，理論值489.2125[M-H]-。1H-NMR(CHCl3600MHz)δ0.95(3H，d，J＝6.6Hz，H3-18)，1.12-1.31(12H，m，H3-16，H3-17，2×CH3)，1.81(1H，d，J＝5.4Hz，H-14)，1.83(3H，s，H3-19)，2.08(3H，s，COCH3)，2.24(1H，m，H-11)，2.59(1H，m，CO-CH-，2-甲基丙?；?，3.29(1H，br t，H-10)，3.76(1H，d，J＝5.4Hz，H-8)，4.39(1H，d，J＝14.4Hz，H-20a)，4.29(1H，d，J＝14.4Hz，H-20b)，5.40(1H，d，J＝10.2Hz，H-12)，6.92(1H，s，H-5)，7.66(1H，s，H-1)。13C-NMR(CDCl3150MHz)δ10.3(C-19)，14.5(C-18)，16.7(C-16)，18.5(CH3，2-甲基丙酰基)，18.6(CH3，2-甲基丙?；?，20.9(COCH3)，23.5(C-17)，25.7(C-15)，29.7(C-14)，34.2(COCH-，2-甲基丙酰基)，44.6(C-11)，54.8(C-8)，59.2(C-10)，63.2(C-20)，65.2(C-13)，73.0(C-4)，75.6(C-9)，76.5(C-12)，135.0(C-2)，137.2(C-5)，148.4(C-6)，159.8(C-1)，170.6(C＝O，COCH3)，179.4(C＝O，2-甲基丙?；?，201.3(C-7)，205.1(C-3)。
實(shí)施例4將實(shí)施例2中的乙酸乙酯部位經(jīng)過(guò)硅膠柱層析，以氯仿/甲醇梯度洗脫后，再上硅膠柱層析，用氯仿/乙酸乙酯(1∶1)洗脫分離，洗脫物經(jīng)過(guò)Sephadex LH-20純化得到單體成分化合物Tiglin C(EOL GX-400型核磁共振儀(TMS內(nèi)標(biāo))，1HNMR400MHz；13CNMR100MHz)。
白色粉末，易溶解于甲醇，磷鉬酸現(xiàn)色呈藍(lán)色，硫酸現(xiàn)色呈棕色。IRνmaxKBrcm-13386，2976，2927，1743，1714，1678，1654，1408，1342，1273，1234，1199，1161，1111，1082，1020，981，924，891，806，650。UVλMeOHmaxnm230，273。EIMS m/z360[M]+，1H-NMR(CD3OH，400MHz)δ7.6(1H，s)，6.9(1H，s)4.2(2H，s)，3.8(1H，dd，J＝3.6，9.8)，3.7(1H，d，J＝5.6)，3.0(1H，t，J＝4.7，1.2)，2.1(1H，q，J＝6.5，9.8，16.2)，1.8(3H，d，J＝1.2)，1.6(1H，d，J＝5.6)，1.2(12H，m)，1.1(3H，d，J＝6.5)；13C-NMR(CD3OH，100MHz)δ205.8，202.3，181.3(3×C＝O)，158.9，149.7，138.3，136.8(雙鍵碳)，74.3，77.1，68.9(連氧碳)，62.6(CH2)，55.5，47.8，42.6，31.0(4×CH)，10.8，15.4，16.8，17.2，19.1，24.03(6×CH3)實(shí)施例5將巴豆根、莖、葉粗粉3kg粉碎后，用水加熱回流提取，每次用水20L，提取三次，合并提取液，減壓濃縮至5L，加無(wú)水乙醇35L，靜置沉淀，離心除去沉淀物后，上清液減壓蒸發(fā)至干，得到水提取物200g，其具有前述的定性反應(yīng)特征。
實(shí)施例6巴豆根、莖、葉提取物及單體化合物的生物活性實(shí)驗(yàn)觀察指標(biāo)小鼠醋酸扭體反應(yīng)；小鼠熱板反應(yīng)；巴豆油致小鼠耳腫脹反應(yīng)。
生物活性實(shí)驗(yàn)中所采用的巴豆根、莖、葉提取物及單體化合物按照實(shí)施例1-4的方法制備得到。
巴豆根、莖、葉提取物對(duì)小鼠醋酸誘導(dǎo)的扭體反應(yīng)的影響巴豆根、莖、葉提取物灌胃給藥對(duì)小鼠醋酸扭體反應(yīng)的影響昆明種小鼠(由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心提供，下同)，雌雄各半，20±2g，每組10只。灌胃給藥，1h后向動(dòng)物腹腔內(nèi)注射新配制的0.6％醋酸溶液(0.4ml/鼠)，5分鐘后觀察小鼠扭體反應(yīng)(腹部?jī)?nèi)凹、軀干與后腿伸張、臀部高起)，記錄15分鐘內(nèi)的扭體次數(shù)。以生理鹽水作對(duì)照，以扭體抑制率(％)作為活性評(píng)價(jià)指標(biāo)。結(jié)果見(jiàn)表1。
表1 巴豆根、莖、葉提取物灌胃給藥對(duì)小鼠醋酸誘導(dǎo)的扭體反應(yīng)的影響

**p＜0.01，與生理鹽水組比較；n＝10實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，以灌胃方式給藥，在1g/kg～0.25g/kg劑量范圍內(nèi)，巴豆根、莖、葉提取物對(duì)醋酸誘導(dǎo)的小鼠扭體反應(yīng)具有顯著的抑制作用，并有明顯的量效關(guān)系。
巴豆根、莖、葉提取物腹腔注射給藥對(duì)小鼠醋酸扭體反應(yīng)的影響昆明種小鼠，雌雄各半，20±2g，每組10只。腹腔注射給藥，30分鐘后向動(dòng)物腹腔內(nèi)注射新配制的0.6％醋酸溶液(0.4ml/鼠)，5分鐘后觀察小鼠扭體反應(yīng)(腹部?jī)?nèi)凹、軀干與后腿伸張、臀部高起)，記錄15分鐘內(nèi)的扭體次數(shù)。以生理鹽水作對(duì)照，以扭體抑制率(％)作為活性評(píng)價(jià)指標(biāo)。結(jié)果見(jiàn)表2。
表2 巴豆根、莖、葉提取物腹腔給藥對(duì)小鼠醋酸誘導(dǎo)的扭體反應(yīng)影響

**p＜0.01，與生理鹽水組比較；n＝10
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，以腹腔注射方式給藥，在0.1g/kg～0.025g/kg劑量范圍內(nèi)，巴豆根、莖、葉提取物對(duì)醋酸誘導(dǎo)的小鼠扭體反應(yīng)具有顯著的抑制作用，并有明顯的量效關(guān)系。以濃度轉(zhuǎn)換成對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，抑制率轉(zhuǎn)換成幾率值為縱坐標(biāo)，擬合線性方程Y＝1.5418x+4.5573(r＝0.9773)。由回歸方程計(jì)算抑制50％時(shí)的濃度為ED50＝1.94mg/kg。
巴豆根、莖、葉提取物對(duì)小鼠熱板反應(yīng)的影響昆明種小鼠，雌性，22±2g。放在預(yù)熱50±0.5℃恒溫金屬板，測(cè)定各小鼠的基礎(chǔ)痛閾，挑選合格小鼠(5-30s)隨機(jī)分組，每組10只。腹腔注射方式給藥，給藥前測(cè)定每只小鼠的痛閾，在與給藥后不同時(shí)間點(diǎn)(15、30、60min)測(cè)定小鼠的痛閾。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3和表4。
表3 巴豆根、莖、葉提取物腹腔注射給藥對(duì)小鼠熱板反應(yīng)的影響

***P＜0.001，與給藥前基礎(chǔ)痛閾比較；n＝10
表4 巴豆根、莖、葉提取物腹腔給藥對(duì)小鼠熱板反應(yīng)痛閾延長(zhǎng)率

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，巴豆根、莖、葉提取物在各劑量組都能顯著地提高小鼠的痛閾。尤其在200mg/kg劑量下，基本上完全抑制小鼠的痛覺(jué)。其作用效果具有良好的量效關(guān)系，隨時(shí)間的延長(zhǎng)，鎮(zhèn)痛效果表現(xiàn)出一定的時(shí)效關(guān)系，在給藥后15min分鐘鎮(zhèn)痛活性最強(qiáng)，給藥后30-60min鎮(zhèn)痛活性開(kāi)始下降，但是30min、60min分鐘鎮(zhèn)痛活性基本一致，顯示藥物的持效性較長(zhǎng)。提示巴豆根、莖、葉延長(zhǎng)小鼠痛閾可能有高位的中樞神經(jīng)參與。
巴豆根、莖、葉提取物對(duì)巴豆油所致小鼠耳腫脹的影響昆明種小鼠，雄性，19-22g，每組10只。用2％巴豆油混合制劑涂抹右耳，左耳為正常對(duì)照，每只0.03ml，正反兩面各涂0.015ml。在致炎當(dāng)天上午、傍晚及次日上午各腹腔注射巴豆根、莖、葉提取物一次，共給藥3次，32h后處死小鼠，稱(chēng)耳重，結(jié)果見(jiàn)表5。
表5 巴豆根、莖、葉提取物對(duì)巴豆油所致小鼠耳腫脹的影響

上述結(jié)果表明，巴豆根、莖、葉提取物對(duì)巴豆油所致小鼠耳腫脹具有抑制作用，并表現(xiàn)出良好的量效關(guān)系。提示其對(duì)炎性疾病如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等具有治療作用。
4.Crotonine、Tiglin A、Tiglin B、Tiglin C對(duì)小鼠醋酸誘導(dǎo)的扭體反應(yīng)的影響上述成分分別以5mg/kg劑量給實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ托∈?，結(jié)果表明Crotonine、Tiglin A、Tiglin B、Tiglin C具有較好的鎮(zhèn)痛作用，是巴豆根、莖、葉提取物中主要的藥理活性物質(zhì)。結(jié)果見(jiàn)表6。
表6 Crotonine、Tiglin A、Tiglin B、Tiglin C腹腔給藥對(duì)小鼠醋酸誘導(dǎo)的扭體反應(yīng)的影響

權(quán)利要求
1.提取物，其特征在于含有至少一種如下式I、II、III所示的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽 式I 式II其中，Tiglin A R1＝乙?；?；R2＝2-甲基丁?；?；Tiglin B R1＝乙?；籖2＝2-甲基丙?；?； 式III。
2.權(quán)利要求1所述提取物的制備方法，該方法包括a.用50-95％的乙醇提取藥用植物例如巴豆根、莖、葉的粗粉，過(guò)濾回收乙醇，濃縮后得到所述提取液，或者b.用水加熱回流提取藥用植物例如巴豆根、莖、葉的粗粉，提取液減壓濃縮，再加入無(wú)水乙醇，除去沉淀物并蒸發(fā)溶劑，得到所述提取物。
3.式I化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽 式I。
4.式II化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽 式II其中，Tiglin A R1＝乙酰基；R2＝2-甲基丁?；?；Tiglin B R1＝乙酰基；R2＝2-甲基丙酰基。
5.式III化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽 式III。
6.權(quán)利要求3-5所述化合物的制備方法，該方法包括用水分散按照權(quán)利要求2所述方法制得的提取物，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，分別得到石油醚部位、乙酸乙酯部位、水部位，水部位濃縮后依次通過(guò)大孔樹(shù)脂、硅膠層析，再經(jīng)Sephadex LH-20純化，得到權(quán)利要求3的單體化合物；上述的石油醚部位經(jīng)硅膠柱層析，再經(jīng)Sephadex LH-20純化得到權(quán)利要求4的單體化合物；上述的乙酸乙酯部位經(jīng)硅膠柱層析，再經(jīng)Sephadex LH-20純化得到權(quán)利要求5的單體化合物。
7.含有權(quán)利要求1所述提取物和/或權(quán)利要求3-5所述式I、II、III化合物以及一種或多種藥學(xué)上可接受載體或賦形劑的藥物組合物。
8.權(quán)利要求1所述提取物和/或權(quán)利要求3-5所述式I、II、III化合物用于制備治療疼痛和炎癥的藥物的用途。
9.權(quán)利要求8的用途，所述的疼痛為中樞神經(jīng)和外周神經(jīng)疼痛，如創(chuàng)傷、手術(shù)及晚期癌癥等所致的劇痛以及牙痛、頭痛、神經(jīng)痛、關(guān)節(jié)痛及月經(jīng)痛等慢性鈍痛。
10.權(quán)利要求8所述的用途，其中的炎性疾病為風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
全文摘要
本發(fā)明涉及藥用植物巴豆的根、莖、葉提取物及其抗炎鎮(zhèn)痛有效成分，所述提取物的提取方法以及有效成分的分離純化方法，含有該提取物或有效成分的藥物組合物，以及所述提取物和有效成分用于制備治療疼痛和炎癥的藥物的用途。
文檔編號(hào)A61K36/185GK1872066SQ20051007480
公開(kāi)日2006年12月6日 申請(qǐng)日期2005年6月3日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月3日
發(fā)明者趙毅民, 吳新安, 任鳳霞 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所