專利名稱：用于評估和治療癌癥的方法
相關(guān)申請的相互參考本申請是于2003年7月1日提交的美國專利申請系列號10/611,446的部分接續(xù)并要求其優(yōu)先權(quán)。
關(guān)于聯(lián)邦資助研究或開發(fā)的聲明不可申請。
“序列表”的參考所附列出的“序列表”和在壓縮光盤上遞交的計算機(jī)程序在此引入作為參考。
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及以分子標(biāo)記的檢測和/或基因表達(dá)分析為基礎(chǔ)診斷、預(yù)后和治療癌癥。
一些與癌癥有關(guān)的分子，例如Ras，必須受到法尼基轉(zhuǎn)移酶的法尼基化而與細(xì)胞質(zhì)膜內(nèi)葉相互作用，并涉及多種信號通路。然而，Ras不是唯一與癌癥相關(guān)的這種蛋白質(zhì)。法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑(FTIs)是抑制碳法尼基部分與蛋白質(zhì)的C-末端CAAX基序共價結(jié)合的治療試劑。它們在癌癥和增殖性紊亂的治療，例如血液惡性腫瘤的治療中具有實(shí)用性。血液惡性腫瘤，例如白血病、淋巴瘤和骨髓瘤(例如，急性骨髓性白血??；AML)屬于可最有利地應(yīng)用FTIs的疾病。也可用FTIs治療實(shí)體瘤，例如乳腺癌和惡性膠質(zhì)瘤。
就多種治療方案來說，事實(shí)是一些患者對FTIs治療有應(yīng)答而另一些則不會。對不可能作出應(yīng)答的患者開處方進(jìn)行治療是不合乎需要的。因此，在給藥前知道如何預(yù)測患者對這種治療有反應(yīng)，因而非應(yīng)答者可不必接受不必要的治療是極為有用的，并且因此可正確地治療和監(jiān)測最佳受益于該藥物的患者。此外，對治療有應(yīng)答的患者中可能存在不同的應(yīng)答程度。對于那些不對FTIs有應(yīng)答或?qū)为?dú)的FTIs的應(yīng)答小于所需要的反應(yīng)的患者來說，使用除了FTIs外的治療劑或除了使用FTIs外還使用其它治療劑進(jìn)行治療可能是有益的。
發(fā)明概述本發(fā)明是使用FTI治療癌癥患者的方法。在這種方法中，分子標(biāo)記的存在或缺乏決定了患者是否可能對FTI作出應(yīng)答。如果其可能有應(yīng)答，則用FTI治療患者。如果患者不可能對FTI治療作出應(yīng)答，則可停止治療。在本發(fā)明的一個方面，獲得預(yù)示FTI應(yīng)答的一組基因的基因表達(dá)圖譜。在本發(fā)明的另一個方面，可組合使用分子標(biāo)記的存在和基因表達(dá)圖譜來確定對FTI治療應(yīng)答的可能性。在本發(fā)明的另一個方面，將表達(dá)圖譜與白血病胚細(xì)胞計數(shù)和/或白血病細(xì)胞抗原表達(dá)組合以確定應(yīng)答FTI治療的可能性。在本發(fā)明的另一個方面，從骨髓獲得測定樣品。
在本發(fā)明的另一個方面中，監(jiān)測癌癥患者的FTI治療，其中分析患者的基因表達(dá)圖譜和/或分子標(biāo)記的存在以確定患者是否應(yīng)答FTI，并且如果其可能以所需要的模式作出應(yīng)答，則用FTI治療該患者。
在本發(fā)明的另一個方面中，如果基因表達(dá)圖譜顯示調(diào)節(jié)了一個或多個預(yù)示為FTI應(yīng)答者的特定基因，則治療該患者。
在本發(fā)明的另一個方面中，如果基因表達(dá)圖譜顯示調(diào)節(jié)了一個或多個預(yù)示為FTI應(yīng)答者的特定基因，并且骨髓胚細(xì)胞計數(shù)為0-60％，或具有CD33細(xì)胞表面抗原陽性表達(dá)的細(xì)胞的存在量小于60％和/或具有CD34細(xì)胞表面抗原陽性表達(dá)的細(xì)胞的存在量小于10％，則治療該患者。
在本發(fā)明的另一個方面中，分子標(biāo)記是下列的一種或多種LBC癌基因、AHR、MINA53、IDS、GPR105、TEM6、TNFSF13、SVIL、C6orf56、FRAG1、GOSR1、KIAA1036、BTG3、MAPK8IP3、LILRB3、ARHH和NPTX2。該標(biāo)記也可以是OPN3和/或IL3RA與上述的一種或多種標(biāo)記的組合。
在本發(fā)明的另一個方面中，F(xiàn)TI是喹啉或喹啉衍生物。在本發(fā)明的另一個方面中，F(xiàn)TI是(R)-6-[氨基(4-氯苯基)(1-甲基-1H-咪唑-5-基)甲基]-4-(3-氯苯基)1-甲基-2(1H)-喹啉酮)。
用于實(shí)現(xiàn)本方法的制品也是本發(fā)明的一個方面。這種制品包括基因表達(dá)圖譜或其顯示物?？蓪@示物固定于計算機(jī)可讀的介質(zhì)上。根據(jù)本發(fā)明的其他制品包括用于確定本發(fā)明的基因表達(dá)圖譜的核酸陣列，以及用于實(shí)現(xiàn)其他核酸檢測技術(shù)的裝置和元件。
試劑盒也是本發(fā)明的一個方面。這種試劑盒包括用于檢測基因表達(dá)和/或區(qū)分FTI治療應(yīng)答者和非應(yīng)答者的分子標(biāo)記存在的試劑。該試劑盒可包括用法說明。
在本發(fā)明的另一個方面中，治療癌癥患者的方法包括施用FTI和調(diào)節(jié)MAPK/ERK信號通路、TGFβ、WNT、Rho、或凋亡途徑的治療組合物。
在本發(fā)明的另一個方面中，用FTI和選自酪氨酸激酶抑制劑、MEK激酶抑制劑、PI3K激酶抑制劑、MAP激酶抑制劑、凋亡調(diào)節(jié)劑及其組合的治療組合物治療患者。
在本發(fā)明的另一個方面中，分析患者的基因表達(dá)圖譜和/或分子標(biāo)記的存在或缺乏以確定該患者是否可能受益于FTI和其他藥物的組合。然后用這種組合物治療患者，或者如果患者不可能應(yīng)答FTI，則用另外的藥物，例如選自酪氨酸激酶抑制劑、MEK激酶抑制劑、PI3K激酶抑制劑、MAP激酶抑制劑、凋亡調(diào)節(jié)劑及其組合的藥物治療該患者。
在本發(fā)明的另一個方面，分析患者的基因表達(dá)圖譜和/或分子標(biāo)記的存在以確定該患者是否可能受益于FTI和其他形式治療的組合。然后用這種組合治療患者，或者如果患者不可能應(yīng)答FTI，則用不包含F(xiàn)TI的其他療法治療該患者。
附圖簡述

圖1是具有高和低CD33抗原表達(dá)的患者的Kaplan-Meier分析的圖示。
圖2是具有高和低胚細(xì)胞計數(shù)的患者的Kaplan-Meier分析的圖示。
圖3A是利用臨床反應(yīng)分類物的患者的Kaplan-Meier存活率分析的圖示。3B是利用致癌LBC基因表達(dá)來劃分患者的患者的Kaplan-Meier存活率分析的圖示。3C是利用癌LBC和AHR基因表達(dá)來劃分患者的患者Kaplan-Meier存活率分析的圖示。
圖4描繪了對最小組的預(yù)示標(biāo)記的鑒定。在圖板A中利用100％的靈敏度進(jìn)行LOOCV。測試了包含1至19個基因的獨(dú)立分類物。對所得到的誤差率作圖。圖板B顯示針對應(yīng)答者(R)和非應(yīng)答者(NR)使用3-基因標(biāo)記作為分類物進(jìn)行LOOCV所產(chǎn)生的2×2表格。圖板C顯示從3-基因分類物產(chǎn)生的積分。p-值顯示了應(yīng)答組之間在基因表達(dá)方面的顯著差異。圖板D描繪了對通過3-基因標(biāo)記劃分為應(yīng)答者和非應(yīng)答者的患者進(jìn)行的Kaplan-Meier曲線。也顯示了中值存活時間。
圖5描繪了對通過3-基因標(biāo)記劃分為應(yīng)答者和非應(yīng)答者的患者進(jìn)行的Kaplan-Meier分析。顯示了被臨床上定義為非應(yīng)答者、但利用3-基因標(biāo)記劃分為應(yīng)答者的患者的存活曲線。也顯示了中值存活時間。
發(fā)明詳述本發(fā)明所參考的治療劑是FTIs。它們具有多種形式但共同具有干擾或減小與癌癥和增殖性疾病有關(guān)的蛋白質(zhì)法尼基化的基本抑制功能。優(yōu)選地，F(xiàn)TIs指示對實(shí)體瘤，例如惡性膠質(zhì)瘤和乳腺癌的治療。更優(yōu)選地，F(xiàn)TIs指示對血液惡性腫瘤，例如白血病、淋巴瘤和骨髓瘤的治療。最優(yōu)選地，預(yù)期FTIs可用于AML、脊髓發(fā)育不良綜合癥(MDS)、慢性粒細(xì)胞性白血病(CML)、慢性單核細(xì)胞性白血病(CMML)、和多發(fā)性骨髓瘤(MM)。就血液惡性腫瘤來說，應(yīng)答FTI的患者是接受FTI治療后在骨髓中觀察到減少了50％以上的胚細(xì)胞的患者。在實(shí)體瘤中，應(yīng)答FTI的患者是其腫瘤停止生長的患者。備選地，可根據(jù)腫瘤學(xué)中常用的RECIST(實(shí)體瘤中的反應(yīng)評估標(biāo)準(zhǔn))標(biāo)準(zhǔn)來測量實(shí)體瘤患者的反應(yīng)。
許多種FTIs可包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)，并且包括下列的美國專利中所描述的FTIsBrown等人的5,976,851；Anthony等人的5,972,984；deSolms的5,972,966；Dinsmore等人的5,968,965；Venet等人的5,968,952；Venet等人的6,187,786；Venet等人的6,169,096；Venet等人的6,037,350；Angibaud等人的6,177,432；Graham等人的5,965,578；Sebti等人的5,965,539；Afonso等人的5,958,939；Anthony等人的5,939,557；Commercon等人的5,936,097；Anthony等人的5,891,889；Baudin等人的5,889,053；Anthony的5,880,140；deSolms的5,872,135；deSolms的5,869,682；Baudoin的5,861,529；Graham等人的5,859,015；Clerc的5,856,439；Anthony等人的5,856,326；Graham等人的5,852,010；Marsters等人的5,843,941；Doll的5,807,852；Dinsmore等人的5,780,492；Dong等人的5,773,455；Kim等人的5,767,274；Anthony等人的5,756,528；Baudoin等人的5,750,567；Bishop等人的5,721,236；Doll等人的5,700,806；Anthony等人的5,661,161；Sebti等人的5,602,098；Breslin等人的5,585,359；Ciccarone等人的5,578,629；Ciccarone等人的5,534,537；Marsters等人的5,532,359；Patel等人的5,523,430；deSolms等人的5,504,512；deSolms等人的5,491,164；Brown等人的5,420,245；和Graham等人的5,238,922；其每個在此引入作為參考。
非肽的、所謂“小分子”的治療劑是優(yōu)選的。更優(yōu)選的FTIs是喹啉或喹啉衍生物，例如7-(3-氯苯基)-9-[(4-氯苯基)-1H-咪唑-1-基]甲基]-2，3-二氫-1H，5H-苯并[ij]喹嗪-5-酮、7-(3-氯苯基)-9-[(4-氯苯基)-1H-咪唑-1-基]甲基]-1，2-二氫-4H-吡咯并[3，2，1-ij]喹啉-4-酮、8-[氨基(4-氯苯基)(1-甲基-1H-咪唑-5-基)，甲基]-6-(3-氯苯基)-1，2-二氫-4H-吡咯并[3，2，1-ij]喹啉-4-酮、以及8-[氨基(4-氯苯基)(1-甲基-1H-咪唑-5-基)，甲基]-6-(3-氯苯基)-2，3-二氫-1H，5H-苯并[ij]喹嗪-5-酮。
最優(yōu)選的FTIs是在Venet等人的美國專利6,420,387中描述的(+)對映體(R)-6-[氨基(4-氯苯基)(1-甲基-1-1H-咪唑-5-基)甲基]-4-(3-氯苯基)1-甲基-2(1H)-喹啉酮)。
另一種優(yōu)選的FTIs是在WO01/98302中所描述的(-)-5-(3-氯苯基)-α-(4-氯苯基)-α-(1-甲基-1H-咪唑-5-基)四唑并[1，5-a]喹唑啉-7-甲胺，及其藥物學(xué)上可接受的酸加成鹽。
其他有用的FTIs包括Arglabin，即1(R)-10-環(huán)氧-5(S)，7(S)-愈創(chuàng)-3(4)，11(13)-二烯-6，12-交酯(WO98/28303)、芥子醇(WO99/45912)、SCH-66336，即(+)-(R)-4-[2-[4-(3，10-二溴-8-氯-5，6-二氫-11H-苯并[5，6]環(huán)庚三烯并[1，2-b]吡啶-11-基)哌啶-1-基]-2-氧代乙基]哌啶-1-甲酰胺，(美國專利5874442)、L778123，即1-(3-氯苯基)-4-[1-(4-氰芐基)-5-咪唑基甲基]-2-哌嗪酮，(WO00/01691)、化合物2(S)-[2(S)-[2(R)-氨基-3-巰基]丙氨基-3(S)-甲基]-戊氧基-3-苯基丙?；?甲硫氨酸砜(WO94/10138)、BMS 214662，即(R)-2，3，4，5-四氫-1-(IH-咪唑-4-基甲基)-3-(苯甲基)-4-(2-噻吩基磺?；?-1H-1，4-苯并二氮雜-7-腈，(WO97/30992)、CP 609754，即N-(3-乙炔基苯基)6，7-雙(2-甲氧基乙氧基)-4-喹唑啉胺(美國專利5,747,498)、以及6-[氨基-(4-氯-苯基)-(3-甲基-3H-咪唑-4-基)-甲基]-4-(3-乙炔基-苯基)-1-甲基-1H-喹啉-2-酮(WO00/12499) 在基因組內(nèi)僅僅存在具有潛在表達(dá)蛋白質(zhì)或肽(“基因”)的核酸序列不會決定在給定的細(xì)胞中是否表達(dá)蛋白質(zhì)或肽。給定基因是否能夠表達(dá)蛋白質(zhì)或肽或轉(zhuǎn)錄RNA，以及這種表達(dá)或轉(zhuǎn)錄能夠達(dá)到何種程度根本上是由多種復(fù)雜因素決定的。然而，分析基因表達(dá)可提供關(guān)于對給定刺激，例如導(dǎo)入藥物或其他治療劑的細(xì)胞應(yīng)答的有用信息?？稍谶@種基因表達(dá)圖譜中發(fā)現(xiàn)有關(guān)基因活化或失活程度的相關(guān)指標(biāo)。在一些情況中，通過其自身或利用基因表達(dá)信息，分子標(biāo)記的存在也可提供關(guān)于治療功效的有用信息。本發(fā)明的基因表達(dá)圖譜和分子標(biāo)記可用于鑒定和治療可能受益于FTI治療的患者，或從FTI治療中排除可能很少或不能有利地應(yīng)答藥物或治療的患者。
癌癥，包括血液惡性腫瘤，一般是由于多種基因的突變產(chǎn)生的。相同類型的癌癥可能是由一個或多個突變產(chǎn)生的，或與一個或多個突變同時發(fā)生，而該突變與患有相同類型癌癥的另一個病人的突變可能有所不同。經(jīng)常存在多個分子基礎(chǔ)支持相同癌癥的事實(shí)與一些影響一個患者的治療未必同樣地影響另一個患有相同類型癌癥的患者的觀察是一致的。此外，就診斷的觀點(diǎn)來說，存在特定的突變，例如易位、缺失、或SNPs可能具有有力的暗示。在一些情況中，這種分子標(biāo)記本身是有用的用于診斷、預(yù)后或治療應(yīng)答確定的指示物。當(dāng)分子突變可能與特定治療的應(yīng)答相關(guān)的時候，這是特別真實(shí)的。在本發(fā)明中，同時缺乏LBC(淋巴胚細(xì)胞臨界)癌基因(也稱為AKIP13，SEQ ID NO2)的癌癥應(yīng)答FTI治療。因此，這個基因的表達(dá)、該基因表達(dá)的缺乏及其存在或缺失在實(shí)際開處方進(jìn)行這種治療前，在預(yù)測對FTI治療的抗性中是很有用的。
LBC癌基因是衍生自染色體15q上的LBC原癌基因(SEQ IDNOs23-27)與起源于染色體7q中的不相關(guān)序列的融合嵌合體。在該序列C-末端處的原癌基因的截短導(dǎo)致該基因獲得轉(zhuǎn)移能力。這個截短也可能是由于除了易位外的其他機(jī)制產(chǎn)生的。例如，異常拼接可導(dǎo)致具有C-末端截短的RNA轉(zhuǎn)錄本?；蚓哂性S多表達(dá)產(chǎn)物，包括mRNA和蛋白質(zhì)(SEQ ID NO28，人LBC蛋白質(zhì)，Genbank登錄號GI29791897)。然而尚未完全了解LBC癌基因發(fā)揮功能的準(zhǔn)確方式，已經(jīng)清楚其存在于廣泛的組織中，包括骨骼肌、心、肺、前列腺、卵巢、小腸和血液細(xì)胞。治療起源于其中癌基因可能是明顯的組織中的癌癥(但不是)在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
在格式化本發(fā)明的測試中存在很大的可獲得靈活性，因為基因是截短的產(chǎn)物，并且因為其產(chǎn)生可識別的表達(dá)產(chǎn)物。不僅可使用基因的缺乏或其產(chǎn)物，并且可以檢測這個基因的調(diào)控的表達(dá)。因此，基因表達(dá)圖譜可包括這個基因。優(yōu)選地，在血液惡性腫瘤，更優(yōu)選地在白血病，以及最優(yōu)選地在AML中使用基因的缺乏或調(diào)控作為FTI治療應(yīng)答的指示物。
任何合適的檢測方法都可用于鑒定LBC癌基因作為分子標(biāo)記。分子標(biāo)記的存在指示了對使用FTI治療的差的預(yù)后，而其缺乏則指示了應(yīng)答這種治療的更大可能性。用于檢測LBC癌基因存在的方法包括檢測已知的突變基因或序列的任何方法，包括而不限于，單鏈構(gòu)象多態(tài)性技術(shù)、化學(xué)和熱變性梯度分析、化學(xué)和酶促切割方法、質(zhì)譜法、RFLP和等位基因特異擴(kuò)增、比率測定PCR、基于珠子和基于微陣列的分析、ELISA、Western、熒光激活的細(xì)胞分揀術(shù)(FACS)、基于抗體的技術(shù)、基于甲基化的PCR，以及SNP檢測。
檢測LBC癌基因的存在或缺乏的最優(yōu)選方法是借助于PCR。在這個方法中，首先根據(jù)常規(guī)的樣品制備方法從患者獲得細(xì)胞。但惡性腫瘤是血液性的時，簡單的外周血樣品或骨髓樣品是優(yōu)選的。然后根據(jù)已普遍接受的方法提取RNA并如下擴(kuò)增。利用例如，250nM的引物和250nM的TaqMan探針在ABI TaqMan緩沖液中擴(kuò)增靶序列。如下進(jìn)行熱循環(huán)50℃2分鐘，95℃10分鐘，然后是50個循環(huán)的95℃15分鐘和62℃1分鐘。引物和探針的實(shí)例如表1所示。
這個技術(shù)測量了樣品中存在的LBC轉(zhuǎn)錄本的量。通過進(jìn)行相似的RT-PCR試驗使測量的數(shù)量標(biāo)準(zhǔn)化，在RT-PCR中使用相同的樣品來擴(kuò)增內(nèi)源的對照基因，例如HPRT。
表1
檢測LBC癌基因存在或缺乏的另一個方法是分析RNA轉(zhuǎn)錄本的長度。由于LBC癌基因具有3’易位，轉(zhuǎn)錄本的長度將比LBC原癌基因轉(zhuǎn)錄本更短。這個末端點(diǎn)有助于診斷。為了診斷轉(zhuǎn)錄本的大小，使用相應(yīng)于原癌-和癌LBC轉(zhuǎn)錄本的正向引物(例如，來自上述表1的LBC正向引物)，并與相應(yīng)于RNA轉(zhuǎn)錄本的通用polyA尾的反向引物結(jié)合。優(yōu)選地，起始的cDNA合成摻入polyA序列的附加獨(dú)特序列標(biāo)記3’以賦予對PCR反應(yīng)的附加特異性。
如果將測量基因組易位，則利用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)和特異于LBC癌基因的所使用的PCR引物來分離基因組DNA。例如，可使用相應(yīng)于癌-和原癌-LBC基因的正向引物結(jié)合上述的polyA序列。備選地，反向引物可相應(yīng)于3’易位的序列。顯示的結(jié)果將是擴(kuò)增子的大小，其中癌基因的存在與比原癌基因更短的產(chǎn)物、或存在或缺乏癌LBC特異的擴(kuò)增子相一致。
對細(xì)胞的LBC癌基因狀態(tài)的測試也可確定為了診斷目的利用例如免疫組化分析(IHC)的技術(shù)的正常/異常的組織分布。例如，抗LBC蛋白質(zhì)的抗體可用于與制備的用于IHC研究的、新鮮冷凍和福爾馬林固定的、石蠟包埋的組織塊結(jié)合。每個組織塊可由50mg剩余的“粉碎的”腫瘤組成。
簡而言之，如下制備冷凍切片在小的塑料膠囊中，使50ng的冷凍粉碎腫瘤于室溫在磷酸鹽緩沖的鹽(PBS)中再水合；通過離心沉淀顆粒；使其重懸在粘稠的包埋介質(zhì)(OCT)中；顛倒膠囊并通過離心再次沉淀；在-70℃的異戊烷中快速冷凍；切下膠囊并移出組織的冷凍圓柱體；將組織圓柱體固定在恒冷切片機(jī)的卡盤上；以及切割25-50個包含完整腫瘤細(xì)胞的系列切片。
通過相似的方法制備永久切片，包括使50mg的樣品在塑料的微離心管中再水合；沉淀；重懸在10％的福爾馬林中固定4小時；洗滌/沉淀；重懸在溫暖的2.5％瓊脂中；沉淀；在冰水中冷卻而使瓊脂變硬；從試管移出組織/瓊脂塊；使小塊在石蠟中滲透和包埋；以及切割成至多50個連續(xù)永久切片。
對于IHC測定，用在PBS中含3％牛血清白蛋白(BSA)或包含其他封閉試劑的封閉溶液覆蓋切片。封閉試劑包括非特異的血清或奶粉。在室溫下容許封閉進(jìn)行1小時。用含有3％BSA、0.1％TritonXTM-100和叔辛基苯氧基乙氧基乙醇的PBS緩沖液，以1∶100的比率稀釋抗-LBC蛋白質(zhì)的抗體。一般在4℃用抗體溶液覆蓋樣品切片16小時。
可根據(jù)所選擇的抗體和測試材料而變化持續(xù)時間和溫度條件。根據(jù)經(jīng)驗確定最佳條件。然后在PBS中洗滌抗體處理的切片15分鐘3次，每次都除去未結(jié)合的抗體，然后用含有3％BSA和以1∶2000稀釋的第二抗體的PBS覆蓋。第二抗體可與生色的酶，例如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、熒光素異硫氰酸、或其他合適的酶偶聯(lián)。備選地，第二抗體可與生物素結(jié)合以及用于與生色團(tuán)標(biāo)記的抗生物素蛋白結(jié)合。
檢測LBC癌基因存在的另一個例證性方法是借助于原位雜交。一般在原位雜交中包括下列主要步驟(1)固定待分析的組織或生物結(jié)構(gòu)；(2)預(yù)雜交處理生物結(jié)構(gòu)以增加靶DNA的可滲透性，并減少非特異性的結(jié)合；(3)將核酸的混合物與生物結(jié)構(gòu)和組織中的核酸雜交；(4)雜交后洗滌以除去雜交中未結(jié)合的核酸片段以及(5)檢測雜交的核酸片段。在這些步驟的每一個中所使用的試劑和所使用的條件可根據(jù)特定的應(yīng)用而變化。
在這種情況下，使包括至少一個能夠與LBC癌基因(在其染色體位點(diǎn))雜交的可檢測核酸探針的雜交溶液在雜交條件下與細(xì)胞接觸。然后檢測任何雜交，并與來自正常和對照細(xì)胞的預(yù)定雜交模式相比較。優(yōu)選地，探針是α-著絲粒探針。可從許多來源(例如，從Visys Inc.，Downers Grove，IL)商業(yè)購買來獲得這種探針。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，雜交溶液包含特異于染色體上相應(yīng)于產(chǎn)生嵌合體的序列易位區(qū)域(例如，15q24-25)的多個探針。
下列文獻(xiàn)中描述了適合用于本發(fā)明方法的雜交方案，例如，Albertson(1984)EMBO J.31227-1234；Pinkel(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 859138-9142；EPO Pub.No.430,402；和Methodsin molecular Biology，Vol.33In Situ Hybridization Protocols，Choo，ed.，Humana Press，Totowa，NJ(1994)，等。在特定的優(yōu)選實(shí)施方案中，使用Pinkel等人(1998)Nature Genetics 20207-211或Kallioniemi(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 895321-5325的雜交方案。優(yōu)化雜交條件的方法是公知的(參見例如，Tijssen(1993)Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology，Vol.24Hybridization With Nucleic Acid Probes，Elsevier，NY)。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過在雜交過程中使用去污劑(例如，C-TAB)或封閉劑(例如，精子DNA、cot-1 DNA等)來減少非特異性結(jié)合而降低背景信號。優(yōu)選地，在存在大約0.1至大約0.5mg/ml DNA(例如，cot-1 DNA)時進(jìn)行雜交。
可通過本領(lǐng)域已知的任何方法制備探針，包括合成或在生物宿主中生長。合成方法包括寡核苷酸合成、核糖探針和PCR。
可通過本領(lǐng)域已知的任何方法用可檢測的標(biāo)記物標(biāo)記探針。標(biāo)記探針的方法包括隨機(jī)引發(fā)、末端標(biāo)記、PCR和缺口翻譯。在存在核酸聚合酶、三種未標(biāo)記的核苷酸、和被直接標(biāo)記的包含用于結(jié)合標(biāo)記的接頭臂、或與半抗原結(jié)合的或與標(biāo)記的結(jié)合分子的其他分子結(jié)合的第四種核苷酸時進(jìn)行酶促標(biāo)記。合適的直接標(biāo)記包括放射性標(biāo)記例如，32P、3H和35S，以及非放射性的標(biāo)記例如熒光標(biāo)記，例如熒光素、德克薩斯紅、AMCA藍(lán)、熒光黃、羅丹明等；使用可見光可檢測的花青苷染料；酶等。也可通過亞硫酸氫鹽介導(dǎo)的轉(zhuǎn)氨作用或在寡核苷酸合成中直接將標(biāo)記化學(xué)摻入到DNA探針中。
可使熒光標(biāo)記容易地結(jié)合至具有摻入探針中的活化接頭臂的核苷酸?？赏ㄟ^上述公開的方法，通過摻入共價連接的半抗原或其他分子，例如生物素或地高辛的核酸而間接地標(biāo)記探針，并用指向半抗原或其他分子的標(biāo)記抗體，或在生物素的情況下，用結(jié)合可檢測標(biāo)記的抗生物素蛋白進(jìn)行夾層雜交?？贵w和抗生物素蛋白可結(jié)合熒光標(biāo)記，或結(jié)合酶促標(biāo)記，例如堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶以使得其可被檢測。結(jié)合的抗生物蛋白和抗體是可從公司，例如Vector Laboratories(Burlingame，CA)和Boehringer Mannheim(Indianapolis，IN)商業(yè)購買的。
可通過提供酶的底物進(jìn)行生色反應(yīng)而檢測酶。當(dāng)存在多種底物時，通過反應(yīng)產(chǎn)生不同的顏色，可目測這些顏色而分別檢測多個探針?？墒褂帽绢I(lǐng)域已知的任何底物。堿性磷酸酶的優(yōu)選底物包括5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸鹽(BCIP)和硝基藍(lán)四氮唑(NBT)。辣根過氧化物酶的優(yōu)選底物是二氨基苯甲酸鹽(DAB)。
適合用于本發(fā)明的原位雜交法的熒光標(biāo)記探針優(yōu)選長度為150-500個核苷酸。探針可以是DNA或RNA，優(yōu)選DNA。
可檢測探針與細(xì)胞的雜交在探針濃度為0.1-500ng/μl，優(yōu)選5-250ng/μl下進(jìn)行。雜交混合物優(yōu)選包含變性劑，例如甲酰胺。通常，在25℃-45℃，更優(yōu)選在32℃-40℃，以及最優(yōu)選在37℃-38℃下進(jìn)行雜交。雜交所需要的時間是大約0.25-96小時，更優(yōu)選為1-72小時，以及最優(yōu)選為4-24小時。雜交時間可根據(jù)探針濃度和可能包含加速劑，例如hnRNP結(jié)合蛋白、三烷基銨鹽、內(nèi)酰胺等的雜交溶液的含量而變化。然后用包含變性劑，例如甲酰胺和遞減濃度的氯化鈉的溶液，或在任何除去了未結(jié)合和錯配探針的溶液中洗滌載片。
溫度和鹽濃度將根據(jù)所需要的雜交嚴(yán)謹(jǐn)度而不同。例如，可在42℃-68℃進(jìn)行高嚴(yán)謹(jǐn)度洗滌，而中嚴(yán)謹(jǐn)度洗滌是在37℃-55℃進(jìn)行，低嚴(yán)謹(jǐn)度洗滌是在30℃-37℃進(jìn)行。高嚴(yán)謹(jǐn)度洗滌的鹽濃度是0.5-1倍的SSC(0.15M NaCl，0.015M檸檬酸鈉)，而中嚴(yán)謹(jǐn)度洗滌是1-4倍，低嚴(yán)謹(jǐn)度洗滌是2-6倍的SSC。
如果需要檢測孵育步驟，優(yōu)選在保濕盒中于23℃-42℃進(jìn)行，更優(yōu)選在25℃-38℃，以及最優(yōu)選在37-38℃進(jìn)行。標(biāo)記的試劑優(yōu)選是在含有封閉劑，例如BSA、脫脂奶粉等的溶液中稀釋的。稀釋度可以是在1∶10-1∶10,000的范圍，更優(yōu)選為1∶50-1∶5,000，以及最優(yōu)選為1∶100-1∶1,000。每個孵育步驟之間應(yīng)該洗滌載片或其他固體支持物以除去多余的試劑。
然后固定載片，在可視的可檢測標(biāo)記的情況下，通過顯微鏡進(jìn)行分析；或在放射性標(biāo)記的情況下通過曝光于放射自顯影膠片而進(jìn)行分析。在熒光標(biāo)記的情況下，優(yōu)選使載片在含有抗褪色試劑的溶液中固定，并利用熒光顯微鏡進(jìn)行分析?？蓹z查多個細(xì)胞核來提高檢測的準(zhǔn)確性。
此外，LBC癌基因表達(dá)產(chǎn)物的測定也可用于確定是否已經(jīng)發(fā)生了LBC癌基因的突變。最優(yōu)選地，這種測定是免疫測定。免疫測定，就其最簡單和直接的意義來說，是結(jié)合測定。某些優(yōu)選的免疫測定是本領(lǐng)域已知的各種類型的酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)和放射免疫測定(RIA)。利用組織切片的IHC檢測也是特別有用的。
在例證性的ELISA中，將抗-癌的LBC蛋白質(zhì)-特異的抗體固定到顯示蛋白質(zhì)親合力的選擇的表面，例如聚苯乙烯微滴定平板中的孔上。然后，將含有所需要抗原的測試組合物，例如臨床樣品加入孔中。結(jié)合并洗滌除去非特異性結(jié)合的免疫復(fù)合物后，可檢測結(jié)合的抗原。一般通過加入特異于所需要抗原、與可檢測標(biāo)記連接的另一種抗體而實(shí)現(xiàn)檢測。這種類型的ELISA是簡單的“夾層ELISA”。也可通過加入特異于所需要抗原的第二抗體，然后加入具有針對第二抗體的結(jié)合親合力、與可檢測標(biāo)記連接的第三抗體而實(shí)現(xiàn)檢測。
ELISA技術(shù)的改變是本領(lǐng)域公知的。在一種變化中，將含有所需要抗原的樣品固定到孔的表面上，然后與本發(fā)明的抗體接觸。在結(jié)合和適當(dāng)?shù)南礈熘?，檢測結(jié)合的免疫復(fù)合物。當(dāng)最初的抗原特異性抗體與可檢測的標(biāo)記連接時，可直接檢測免疫復(fù)合物。也可利用對第一抗原特異的抗體具有結(jié)合親合力、并與可檢測標(biāo)記連接的第二抗體來檢測免疫復(fù)合物。
競爭性的ELISA也是可能的，其中測試樣品競爭結(jié)合已知數(shù)量的標(biāo)記抗原或抗體。通過在與涂層的孔一起孵育之前或期間，將樣品與已知的標(biāo)記組分混合來確定未知樣品中活性組分的數(shù)量。樣品中存在活性組分將起減少可利用的標(biāo)記組分結(jié)合孔的數(shù)量的作用，并因此減少最終的信號。
抗原或抗體也可連接固體的支持物，例如平板、珠子、量尺、膜或柱狀材料，并將待分析的樣品加入固定的抗原或抗體中。在用抗原或抗體涂覆平板中，一般使平板的孔與抗原或抗體的溶液一起孵育過夜或特定的時間。然后洗滌平板的孔以除去不完全吸附的物質(zhì)。然后孔的任何剩余的可利用表面被“涂覆”了非特異的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)對于測試抗血清來說在抗原性上是中性的。這些包括BSA、酪蛋白和奶粉溶液。該涂層容許封閉固定表面上的非特異性吸附位點(diǎn)，因此降低由抗血清非特異地結(jié)合到表面上所造成的背景。
在ELISAs中，通常使用次級或三級檢測方式而非直接的方法。因此，在抗原或抗體結(jié)合孔后，用非反應(yīng)的材料涂覆以降低背景，洗滌除去未結(jié)合的材料，使固定的表面在提供有效免疫復(fù)合物(抗原/抗體)的條件下與待測試的臨床或生物樣品接觸。這可包括用溶液，例如BSA、牛γ球蛋白(BGG)和PBS/Tween稀釋抗原和抗體。這些試劑也趨向于幫助降低非特異性的背景。然后對免疫復(fù)合物的檢測需要標(biāo)記的次級結(jié)合配體或抗體，或與標(biāo)記的三級抗體或第三結(jié)合配體結(jié)合的次級結(jié)合配體或抗體。
在ELISA中的所有孵育步驟后，洗滌接觸的表面以除去非復(fù)合的物質(zhì)。洗滌經(jīng)常包括用PBS/Tween的溶液或硼酸鹽緩沖液洗滌。在測試樣品和起始結(jié)合的物質(zhì)之間形成特異的免疫復(fù)合物后，隨后進(jìn)行洗滌，甚至可以檢測出存在微小數(shù)量的免疫復(fù)合物。
為了提供檢測方式，第二或第三抗體將具有締合標(biāo)記以容許檢測。優(yōu)選地，這是當(dāng)與適合的生色底物孵育時發(fā)生顯色的酶。因此例如，使第一或第二免疫復(fù)合物與結(jié)合脲酶、葡萄糖氧化酶、堿性磷酸酶或過氧化氫酶的抗體接觸一段時間，并且是在有助于進(jìn)一步的免疫復(fù)合物形成發(fā)展的條件下，例如在含有PBS的溶液，例如PBS-Tween中于室溫孵育2小時。
在與標(biāo)記的抗體一起孵育后，隨后洗滌除去未結(jié)合的物質(zhì)，通過例如，與生色底物，例如在以過氧化物酶作為酶標(biāo)記的情況下，與尿素和溴甲酚紫和H2O2孵育來定量標(biāo)記的數(shù)量。然后通過測量顏色生成的程度，例如，利用可見光譜分光光度計來實(shí)現(xiàn)定量。備選地，標(biāo)記可以是化學(xué)發(fā)光的標(biāo)記。這種標(biāo)記的使用在美國專利5,310,687、5,238,808和5,221,605中有描述。
在本發(fā)明的實(shí)施方案中，其中為了確定對FTI的應(yīng)答而檢測基因表達(dá)，使用基因表達(dá)組合是最優(yōu)選的?；虻慕M合是分為一組的基因群，使得所獲得的關(guān)于它們的表達(dá)信息為作出臨床上的相關(guān)判斷，例如診斷、預(yù)后或治療選擇而提供基礎(chǔ)。在此情況下，基因表達(dá)組合可以是模式化的，以幫助作出關(guān)于在癌癥患者中使用FTI的治療性決策。
最優(yōu)選的是檢測作為伴隨一個或多個其它基因的基因表達(dá)圖譜一部分的LBC癌基因的表達(dá)，其中所述的一個或多個其它基因的差異表達(dá)表明了應(yīng)答FTI治療的可能性。也可使用下列的一個或多個基因，最優(yōu)選地，將其與LBC癌基因組合AHR、MINA53、IDS、OPN3、GPR105、TEM6、TNFSF13、SVII、IL3RA、C6orf56、FRAG1、GOSR1、KIAA1036、BTG3、MAPK8IP3、LILRB3、ARHH、NPTX2(SEQ ID NOs1、3-18和29)。OPN3和IL3RA與一個或多個其它基因組合使用，并且優(yōu)選地，圖譜包括2個或多個任何的基因。最優(yōu)選的基因表達(dá)圖譜檢測LBC癌基因和AHR的差異表達(dá)。一組3個基因的優(yōu)選組是LBC、MHR和MINA53。上述基因的變體，例如拼接變體在這種應(yīng)用中也是有用的。
建立基因表達(dá)圖譜(包括用于達(dá)到解釋相關(guān)生物途徑的基因)的優(yōu)選方法包括確定由可編碼蛋白質(zhì)或肽或轉(zhuǎn)錄RNA的基因所產(chǎn)生的RNA的數(shù)量。這最好通過逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)、競爭性RT-PCR、實(shí)時RT-PCR、差異顯示RT-PCR、RNA印跡分析和其他相關(guān)測試而實(shí)現(xiàn)。當(dāng)可能利用個別的PCR反應(yīng)進(jìn)行這些技術(shù)時，經(jīng)常需要擴(kuò)增從mRNA產(chǎn)生的拷貝DNA(cDNA)或拷貝RNA(cRNA)，并通過微陣列進(jìn)行分析。對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說許多不同陣列的構(gòu)型和生產(chǎn)方法是已知的，其在下列美國專利中有描述，例如5,445,934、5,532,128、5,556,752、5,242,974、5,384,261、5,405,783、5,412,087、5,424,186、5,429,807、5,436,327、5,472,672、5,527,681、5,529,756、5,545,531、5,554,501、5,561,071、5,571,639、5,593,839、5,599,695、5,624,711、5,658,734、和5,700,637；其公開的內(nèi)容在此引入作為參考。
微陣列技術(shù)容許同時測量成千個基因的穩(wěn)態(tài)mRNA水平，由此提供鑒定FTI對細(xì)胞生物學(xué)的效果和基于對這種效果的分析的可能的治療效果的有力工具。目前廣泛使用2種微陣列技術(shù)。第一種是cDNA陣列，第二種是寡核苷酸陣列。盡管在這些芯片的構(gòu)成方面存在差異，但是基本上所有的下游數(shù)據(jù)分析和輸出是相同的。這些分析的產(chǎn)物典型地是從用于檢測來自樣品的cDNA序列標(biāo)記探針接受到的信號強(qiáng)度的測量值，其中該樣品與微陣列上已知位置的核酸序列雜交。典型地，信號強(qiáng)度與cDNA的數(shù)量和樣品細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的mRNA成比例。大量的這種技術(shù)是可利用的并且是有用的?？稍贚insley等人的美國專利6,271,002、Friend等人的6,218,122、Peck等人的6,218,114、和Wang等人的6,004,755中發(fā)現(xiàn)優(yōu)選的方法，其每個公開的內(nèi)容在此引入作為參考。
通過比較這種強(qiáng)度進(jìn)行表達(dá)水平的分析。這最好通過生成測試樣品對對照樣品中基因表達(dá)強(qiáng)度的比率矩陣而進(jìn)行。例如，可將來自已經(jīng)用藥物處理的組織的基因表達(dá)強(qiáng)度與產(chǎn)生自未用藥物處理的相同組織的表達(dá)強(qiáng)度比較。這些表達(dá)強(qiáng)度的比率表明在測試樣品和對照樣品之間基因表達(dá)的成倍變化。
也可以以多種方式顯示基因表達(dá)圖譜。通常的方法是將比率矩陣排列成為圖示的樹形圖，其中列表示測試樣品，而行表示基因。排列基因以使得具有相似表達(dá)圖譜的基因相互靠近。每個基因的表達(dá)比率以顏色直觀化。例如，小于1的比率(表示下調(diào))可以以藍(lán)色部分的光譜出現(xiàn)，而大于1的比率(表示上調(diào))可以以紅色部分的光譜出現(xiàn)?？衫蒙虡I(yè)購買的計算機(jī)軟件程序來顯示這種數(shù)據(jù)，包括來自SiliconGenetics，Inc.的“GENESPRINT”和來自Partek，Inc.的“DISCOVERY”和“INFER”軟件。
通過上述基因表達(dá)評估的推導(dǎo)，在FTI處理后的疾病細(xì)胞中，或在治療前的應(yīng)答者對非應(yīng)答者中，差異表達(dá)的基因是上調(diào)或下調(diào)的。上調(diào)或下調(diào)是相對的術(shù)語，是指在相對于一些基線的基因表達(dá)的數(shù)量中發(fā)現(xiàn)可檢測的差異(超過用于測量的系統(tǒng)中的噪音分布)。在這種情況下，基線是測量的未處理的疾病細(xì)胞的基因表達(dá)。然后利用相同的測量方法，在處理的疾病細(xì)胞中目的基因相對于基線水平是上調(diào)或下調(diào)的。優(yōu)選地，根據(jù)雜交微陣列探針的強(qiáng)度測量值的倍數(shù)變化區(qū)分上調(diào)或下調(diào)的水平。1.5倍的差異是優(yōu)選產(chǎn)生這種區(qū)分的。即，在認(rèn)為一個基因在處理的對未處理的疾病細(xì)胞中差異表達(dá)之前，發(fā)現(xiàn)處理的細(xì)胞比未處理的細(xì)胞產(chǎn)生至少1.5倍以上，或1.5倍以下的強(qiáng)度。在基因表達(dá)測量中1.7倍的差異是更優(yōu)選的，而2倍以上的差異是最優(yōu)選的。
本發(fā)明的一個方法包括比較多種基因的基因表達(dá)圖譜來確定個體是否可能對使用的治療劑作出應(yīng)答。已經(jīng)建立了區(qū)分應(yīng)答者和非應(yīng)答者的基因表達(dá)圖譜，將每個基因表達(dá)圖譜固定在介質(zhì)，例如下述的計算機(jī)可讀介質(zhì)中。獲得患者的樣品，然后獲得該樣品包含的疾病細(xì)胞(在AML的情況下為例如血液胚細(xì)胞)。最優(yōu)選地，在用藥物治療患者前，樣品是骨髓樣品，以及根據(jù)常規(guī)方法從患者的胸骨或髂脊提取樣品。優(yōu)選地利用常規(guī)方法處理骨髓抽吸物以富集白血病胚細(xì)胞。然后獲得樣品RNA并從疾病患者的細(xì)胞擴(kuò)增RNA，優(yōu)選地(在大量基因組合的情況下)通過微陣列獲得適當(dāng)基因組合的基因表達(dá)圖譜。然后將樣品的表達(dá)圖譜與預(yù)先確定的應(yīng)答者和非應(yīng)答者的比較。如果樣品表達(dá)模式與FTI非應(yīng)答者表達(dá)模式相一致，則不表明用FTI治療。當(dāng)在組合中使用小數(shù)目的基因，例如使用單個基因，LBC癌基因時，簡單的核酸擴(kuò)增和檢測方案是最優(yōu)選的測量基因調(diào)節(jié)的方法。在這種情況下，本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的PCR、滾動循環(huán)、LCR、和其它擴(kuò)增方案可與PCR一起成為最優(yōu)選的。其中組合包括大量的基因或需要測量多個其它基因的表達(dá)，優(yōu)選根據(jù)上述的微陣列強(qiáng)度測量值來評估表達(dá)模式。
在相似的模式中，可進(jìn)行基因表達(dá)圖譜分析以檢測治療應(yīng)答。在本方法的一個方面，對用FTI治療的患者在整個治療過程的不同時間段進(jìn)行上述的基因表達(dá)分析。如果基因表達(dá)模式與應(yīng)答者相一致，則繼續(xù)對患者治療。如果不一致則用另外的治療劑，例如酪氨酸蛋白激酶抑制劑改變患者的治療，或改變劑量，或取消FTI治療。這種分析在可檢測的臨床標(biāo)記之前或面對不明確的臨床標(biāo)記時，允許介入或調(diào)整治療。
考慮到本發(fā)明的分子標(biāo)記，為了診斷的用途可采用許多其它的格式和途徑?；蚪M區(qū)域的甲基化可影響基因表達(dá)的水平。例如，基因啟動子區(qū)域的超甲基化可結(jié)構(gòu)性地下調(diào)基因表達(dá)，而超甲基化可導(dǎo)致穩(wěn)態(tài)mRNA水平的增加。因此，對與預(yù)示藥物應(yīng)答的基因相關(guān)的甲基化區(qū)域的檢測可用于診斷基因表達(dá)水平的備選方法。這種方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。備選地，存在于啟動子區(qū)域中的單核苷酸多態(tài)性(SNPs)也可影響基因的轉(zhuǎn)錄活性。因此，通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法檢測這些SNPs也可用于檢測在應(yīng)答者和非應(yīng)答者之間差異表達(dá)的基因的診斷手段。
也可通過附加分析治療前存在的骨髓白血病胚細(xì)胞的比例和/或細(xì)胞表面抗原，例如CD33和/或CD34的存在，而有利地區(qū)分應(yīng)答者和非應(yīng)答者。CD33和CD34表面抗原的低表達(dá)表明應(yīng)答FTI治療的可能性增加。對于具有大約60％或以下的這種表達(dá)CD33的細(xì)胞和大約15％或以下的表達(dá)CD34的細(xì)胞的應(yīng)答者，這可最方便地測量成樣品中表達(dá)這種抗原的細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。表達(dá)CD33的這種細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)超過60％或表達(dá)CD34抗原的超過15％，則表明該患者可能是FTI治療的非應(yīng)答者。此外，上述采集的樣品中作為細(xì)胞的胚細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)小于大約60％則可能應(yīng)答FTI治療，而胚細(xì)胞計數(shù)超過這個百分?jǐn)?shù)的則不可能應(yīng)答。根據(jù)任何眾所周知的方法測定CD33+、CD34+和胚細(xì)胞計數(shù)的百分?jǐn)?shù)，而利用在大多數(shù)臨床試驗室中進(jìn)行的標(biāo)準(zhǔn)的病理學(xué)測試和制劑來測定百分?jǐn)?shù)是最有效的。
本發(fā)明的制品是用于治療、診斷、預(yù)后、分級和評估疾病的基因表達(dá)圖譜的表示物。優(yōu)選地使其簡化為可自動化閱讀的介質(zhì)，例如計算機(jī)可閱讀的介質(zhì)(磁性的、光學(xué)的等)。制品也可包括用于在這種介質(zhì)中評估基因表達(dá)圖譜的用法說明。例如，制品可包括具有用于比較上述基因組合的基因表達(dá)圖譜的計算機(jī)指令的CD ROM。制品也可具有數(shù)字化記錄在其中的基因表達(dá)圖譜，以使得其可與來自患者樣品的基因表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。備選地，可以以不同的表示格式記錄圖譜。例如整合在來自上述的Partek，Inc.“DISCOVERY”和“INFER”軟件中的集群算法可最佳地輔助這種數(shù)據(jù)的直觀化。
根據(jù)本發(fā)明的附加制品是用于進(jìn)行上述測定的試劑盒。每個這種試劑盒優(yōu)選包括人或機(jī)器可閱讀形式的用法說明以及用于上述類型測定的常用試劑。這些包括例如，核酸陣列(例如，cDNA或寡核苷酸陣列)，如上所述，對其進(jìn)行組合以鑒別本發(fā)明的基因表達(dá)圖譜。它們也可包含用于進(jìn)行核酸擴(kuò)增和檢測的試劑，包括例如，逆轉(zhuǎn)錄酶、逆轉(zhuǎn)錄酶引物、相應(yīng)的PCR引物組、熱穩(wěn)定的DNA聚合酶、例如Taq聚合酶，以及合適的檢測試劑，例如但不限于，蝎子探針、用于熒光探針測定的探針、分子信標(biāo)探針、單個染料引物或特異于雙鏈DNA的熒光染料，例如溴化乙錠。用于檢測表面抗原的試劑盒包括染色物質(zhì)或是以抗體為基礎(chǔ)的，包括成分，例如緩沖液、抗-抗原的抗體、檢測酶和底物，例如辣根過氧化物酶或以生物素-抗生物素蛋白為基礎(chǔ)的試劑。用于檢測胚細(xì)胞的試劑盒成分一般包括用于進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)、胚細(xì)胞粘附測定、和其它普遍實(shí)行的胚細(xì)胞測定的試劑。
如在本發(fā)明人于2002年10月30日提交的、題目為“用于評估和治療白血病的方法”的未決申請(系列號10/283,975)中所描述的，除了優(yōu)選的FTI以外，本發(fā)明的優(yōu)選藥物是調(diào)節(jié)MAPK/ERK信號通路、TGFβ、WNT或凋亡途徑的藥物。這些包括但不限于酪氨酸激酶抑制劑、MEK激酶抑制劑、PI3K激酶抑制劑、MAP激酶抑制劑、凋亡調(diào)節(jié)劑及其組合。這些藥物中最優(yōu)選的例證性藥物是Novartis的“GLEEVEC”酪氨酸激酶抑制劑、U-0126 MAP激酶抑制劑、PD-098059 MAP激酶抑制劑、SB-203580 MAP激酶抑制劑、和反義物、核糖酶，和DNA酶、Bcl-XL、以及抗-凋亡劑。其他有用藥物的實(shí)例包括但不限于，美國專利6,306,897的長春胺乙交酯、美國專利6,284,764的取代二環(huán)、美國專利6,133,305的二氫吲哚、和美國專利6,271,210的反義寡核苷酸。
FTI也可與其它傳統(tǒng)的抗癌劑組合使用，所述抗癌劑例如選自，鉑配位的化合物，例如順鉑或卡鉑，紫杉烷化合物，例如紫杉醇、多面紫杉醇，喜樹堿化合物例如，依立替康或托泊替康，抗腫瘤的長春花生物堿例如，長春堿、長春新堿、長春瑞濱，抗腫瘤的核酸衍生物例如，5-氟尿嘧啶、吉西他濱或卡培他濱氮芥或亞硝基脲烷基化試劑，例如環(huán)磷酰胺、苯丁酸氮芥、亞硝脲氮芥或環(huán)己亞硝脲、抗腫瘤的蒽環(huán)類抗生物素衍生物，例如柔紅霉素、阿霉素或伊達(dá)比星；HER2抗體例如trastzumab；以及抗腫瘤的鬼臼毒素衍生物例如依托泊苷、替尼泊苷；和雌激素對抗劑包括雌激素受體拮抗劑或選擇性的雌激素受體調(diào)節(jié)劑優(yōu)選他莫昔芬、或備選地托瑞米芬、屈洛昔芬、faslodex和雷洛昔芬、或芳香酶抑制劑，例如依西美坦、阿那曲唑、來曲唑和伏氯唑。
可將FTI如上所述與放射結(jié)合而施用于患者；當(dāng)FTI可發(fā)揮放射激敏物的作用時，這種治療可能是特別有效的，例如在WO00/01411中所描述的，增強(qiáng)這種放射的療效。放射是指電離輻射，特別是γ輻射，其特別地通過線性加速器或通過目前普遍使用的放射性核素發(fā)射。經(jīng)放射性核素的腫瘤照射可以是外部的或內(nèi)部的。
優(yōu)選地，在腫瘤照射之前一個月，特別是10天或1周開始FTI給藥。此外，在第一和最后的照射期間的間隔中將腫瘤照射分級和維持FTI給藥是有利的。FTI的數(shù)量、照射的劑量和照射劑量的周期性將取決于一系列的參數(shù)，例如腫瘤的類型、其部位、患者對化療或放療的反應(yīng)，并且在每個個體的情況中最終由醫(yī)師和放射學(xué)家來決定。因此，根據(jù)本發(fā)明方法的癌癥治療也包括，對于停泊了腫瘤的宿主，在對所述宿主的靠近腫瘤處施用放射之前、期間或之后施用本發(fā)明所述的放射致敏有效量的FTI。
如指出的，本發(fā)明的藥物可以是指導(dǎo)基因治療或反義治療或RNA干擾的治療劑。可將含有互補(bǔ)于mRNA序列的序列寡核苷酸導(dǎo)入細(xì)胞以阻斷mRNA的翻譯，由此阻斷編碼mRNA的基因的功能。例如，在Strachan和Read，Human Molecular Genetics，1996中描述了寡核苷酸阻斷基因表達(dá)的用途，其在此引入作為參考。
這些反義分子可以是DNA、DNA的穩(wěn)定衍生物，例如硫代磷酸酯或甲基瞵酸酯、RNA、RNA的穩(wěn)定衍生物，例如2’-O-烷基RNA，或其他反義寡核苷酸模擬物?？赏ㄟ^微注射、脂質(zhì)體包封或通過從停泊有反義序列的載體表達(dá)而將反義分子導(dǎo)入細(xì)胞。
在基因治療的情況下，可通過感染受體宿主細(xì)胞將目標(biāo)基因與介導(dǎo)治療性DNA轉(zhuǎn)移的病毒載體連接。合適的病毒載體包括反向病毒、腺病毒、腺伴隨病毒、皰疹病毒、牛痘病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒等。備選地，可通過非病毒技術(shù)，包括利用配體-DNA共軛物或腺病毒-配體-DNA-共軛物、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染膜融合或直接微注射的受體介導(dǎo)的靶向DNA轉(zhuǎn)移使治療性DNA轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中而用于基因治療。這些方法及其變化適合于體外的以及體內(nèi)的基因治療。適合與基因一起使用的基因治療分子方法學(xué)的方案在Gene Therapy Protocols，Paul D.Robbins編輯，Human press，Totowa NJ，1996中有描述。
FTI可用于治療各種類型的癌癥，包括肺癌(例如腺癌以及包括非小細(xì)胞肺癌)、胰腺癌(例如胰腺腫瘤，例如外分泌的胰腺癌)、結(jié)腸癌(例如結(jié)腸直腸癌、例如結(jié)腸腺癌和結(jié)腸腺瘤)、前列腺癌，包括先期疾病，淋巴系統(tǒng)的造血腫瘤(例如，急性淋巴細(xì)胞白血病、B-細(xì)胞淋巴瘤、Burkitt’s淋巴瘤)、骨髓性白血病(例如AML)、甲狀腺濾泡癌、骨髓增生異常綜合癥(MDS)、間充質(zhì)起源的腫瘤(例如，纖維肉瘤和橫紋肌肉瘤)、黑素瘤、畸胎瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、皮膚的良性腫瘤(例如，角化棘皮瘤)、乳腺癌(例如，先期乳腺癌)、腎癌、卵巢癌、膀胱癌和表皮癌。
可根據(jù)已知的方法，例如通過混合藥物學(xué)上可接受的載體來配制包括本發(fā)明藥物的藥用組合物?？稍赗emington’s PharmaceuticalSciences中發(fā)現(xiàn)這種載體和配制方法的實(shí)例。為了形成適于有效給藥的藥物學(xué)上可接受的組合物，這種組合物將包含有效量的藥物。藥物的有效量可根據(jù)多種因素而變化，例如個體的狀況、重量、性別和年齡。其他因素包括給藥的方式?？赏ㄟ^多種途徑，例如皮下的、局部的、口服的和肌內(nèi)的途徑將藥物組合物提供給個體。
本發(fā)明的藥物包括藥物骨架分子的化學(xué)衍生物。即，它們可以包含通常不是骨架分子部分的附加化學(xué)部分。這種部分可以提高骨架分子的溶解度、半衰期、吸收性等。備選地，該部分可以減弱不需要的骨架分子的副作用，或減少骨架分子的毒性。這種部分的實(shí)例在教科書，例如Remington’s Pharmaceutical Sciences中有描述。
根據(jù)在此公開的本方法鑒定的化合物可以通過常規(guī)測試所確定的適當(dāng)劑量單獨(dú)使用以獲得最佳的抑制或活性，同時使任何潛在的毒性最小化。此外，可能需要其它試劑的共給藥或按序給藥。
本發(fā)明的藥物可在用于給藥的傳統(tǒng)媒介物中以廣泛的治療劑量形式給藥。例如，該藥物可以以口服劑量形式，例如片劑、膠囊劑(每個包括定時釋放和持續(xù)釋放的制劑)、丸劑、粉劑、顆粒劑、酏劑、酊劑、溶液、懸浮液、糖漿和乳劑，或通過注射的形式給藥。同樣，它們也可以靜脈內(nèi)(丸劑和輸液)、腹膜內(nèi)、皮下、堵塞或不堵塞的局部、或肌內(nèi)的形式給藥，所有的都使用藥物學(xué)領(lǐng)域中普通技術(shù)人員已知的形式?？墒褂盟枰衔锏挠行У嵌拘缘牧孔鳛檎{(diào)節(jié)劑。
產(chǎn)品的每日劑量可在每天每位患者0.01至1,000mg的范圍內(nèi)變化。對于口服給藥，優(yōu)選提供的組合物的形式是記錄或未記錄的含有用于癥狀調(diào)節(jié)待治療患者的劑量的0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、15.0、25.0、和50.0毫克活性成分的片劑。通常提供的藥物有效量是每天大約0.0001mg/kg至大約100mg/kg體重的劑量水平。更特別的范圍是每天大約0.001mg/kg至10mg/kg體重。當(dāng)組合獲得所需要的效果時，可調(diào)節(jié)劑量。另一方面，可獨(dú)立地優(yōu)化這些各種試劑的劑量，并組合獲得協(xié)同作用，其中比單獨(dú)使用該試劑減少更多的病理學(xué)癥狀。
有利的是，本發(fā)明中所使用的化合物或調(diào)節(jié)劑可以以單獨(dú)的每日劑量形式給藥，或每日可將總的日劑量分為2、3或4次的劑量給藥。此外，本發(fā)明的化合物或調(diào)節(jié)劑可以以本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的、借助局部使用合適的鼻內(nèi)載體的鼻內(nèi)形式，或借助于利用透過皮膚塊的透過皮膚起作用的形式給藥。當(dāng)然在透過皮膚的遞送系統(tǒng)形式的給藥中，在整個劑量方案中劑量給藥是連續(xù)的而不是間斷的。
對于與一種以上的活性試劑組合的治療，當(dāng)活性試劑是分開劑量的制劑時，可同時施用活性試劑，或可在分開的時間段分別給藥。
根據(jù)多種因素，包括患者的類型、種屬、年齡、重量、性別和醫(yī)療條件、待治療病癥的嚴(yán)重度、給藥途徑、患者的肝腎功能、和所使用的特定藥物來選擇利用本發(fā)明化合物或調(diào)節(jié)劑的劑量方案。普通的醫(yī)師或獸醫(yī)能夠容易地確定預(yù)防、逆轉(zhuǎn)或阻止病癥進(jìn)展所需要藥物的有效量并開出處方。在產(chǎn)生效果而不具有毒性的范圍內(nèi)獲得藥物濃度的最佳精確度需要以藥物的靶向位點(diǎn)利用度的動力學(xué)為基礎(chǔ)的方案。這涉及考慮藥物的分布、平衡和消除。
本發(fā)明的藥物可形成活性成分，一般與合適的藥物稀釋劑、賦形劑或載體混合給藥(在此集中稱為“載體”物質(zhì))，考慮到給藥形式，其合適地選自口服片劑、膠囊劑、酏劑、糖漿等，并且符合傳統(tǒng)的藥學(xué)實(shí)踐。
例如，對于片劑或膠囊劑形式的口服給藥，活性藥物成分可與口服的、非毒性的藥物學(xué)上可接受的惰性載體，例如乙醇、甘油、水等組合。此外，當(dāng)需要或必要時，也可在混合物中摻入合適的粘合劑、潤滑劑、崩解劑和著色劑。合適的粘合劑包括但不限于，淀粉、明膠、天然糖、例如葡萄糖、或β-乳糖、玉米甜味劑、天然和合成的膠，例如阿拉伯膠、黃芪膠、海藻酸鈉、羧甲基纖維素、聚乙二醇、蠟等。在這些劑量形式中所使用的潤滑劑包括但不限于，油酸鈉、硬脂酸鈉、硬脂酸鎂、苯甲酸鈉、醋酸鈉、氯化鈉等。崩解劑包括但不限于，淀粉、甲基化纖維素、瓊脂、高嶺土、黃原膠等。
對于液體形式，活性藥物成分可與適合調(diào)味的懸浮劑或分散劑組合，例如合成的和天然的膠，例如黃芪膠、阿拉伯膠、甲基化纖維素等。其他可使用的分散劑包括甘油等。對于非胃腸道給藥，需要無菌的懸浮劑和溶液。但需要靜脈內(nèi)給藥時，可使用一般包含合適防腐劑的等滲制劑。
本發(fā)明中的藥物也可以以脂質(zhì)體遞送系統(tǒng)，例如小的單層囊泡、大的單層囊泡和多層囊泡的形式給藥?？梢詮亩喾N磷脂、例如膽固醇、十八胺、磷脂酰膽堿形成脂質(zhì)體。
也可通過使用單克隆抗體作為偶聯(lián)化合物的個別載體來遞送本發(fā)明的藥物。藥物也可與作為靶向藥物載體的可溶性聚合物偶聯(lián)。這種聚合物可包括聚乙烯-吡咯烷酮、吡喃共聚物、聚羥丙基異丁烯酰胺苯酚、聚羥基-乙基天冬酰胺苯酚或用棕櫚腺殘基取代的聚乙烯-氧化聚賴氨酸。此外，本發(fā)明的藥物可與用于實(shí)現(xiàn)藥物的控制釋放的可生物降解的聚合物種類偶聯(lián)，例如聚乳酸、聚ε己內(nèi)酯、聚羥基丁酸、聚原酸酯、聚縮醛、聚二氫-吡喃、聚氰基丙烯酸酯和交聯(lián)或兩親的水凝膠嵌段共聚物。
對于口服給藥，可以以膠囊、片劑或丸劑的形式施用藥物，或備選地其可與飼料混合。膠囊、片劑和丸劑由與適當(dāng)?shù)妮d體媒介物，例如淀粉、滑石粉、硬脂酸鎂、或磷酸二鈣組合的活性成分組成。通過將活性成分與合適的精細(xì)粉碎的惰性成分，包括稀釋劑、填充劑、崩解劑和/或粘合劑緊密混合以獲得均勻的混合物來制備這些單位劑量形式。惰性成分是不與藥物起反應(yīng)的成分，并且對于待治療的動物是非毒性的。合適的惰性成分包括淀粉、乳糖、滑石粉、硬脂酸鎂、植物膠和油等。根據(jù)多種因素，這些制劑可包含廣泛的不同數(shù)量的活性和非活性成分，這些因素包括待治療的動物種屬的大小和類型以及感染的類型和嚴(yán)重度。也可通過將化合物與飼料簡單地混合，或通過將化合物加到飼料的表面來施用活性成分。
備選地，可借助于注射由溶解于惰性液體載體中的活性成分組成的制劑而非腸胃道地施用化合物或調(diào)節(jié)劑。注射可以是肌內(nèi)的、管腔內(nèi)的、氣管內(nèi)的、或皮下的?？勺⑸涞闹苿┯膳c適當(dāng)?shù)亩栊砸后w載體混合的活性成分組成?？山邮艿囊后w載體包括植物油，例如花生油、棉籽油、芝麻油等，以及有機(jī)溶劑，例如胂酸、甘油類等。備選地，也可使用含水的非腸胃道制劑。植物油是優(yōu)選的液體載體。通過將活性成分溶解或懸浮在液體載體中而制備制劑，使得最終的制劑包含0.005至10％重量的活性成分。
通過下列非限制性的實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明。
實(shí)施例在非預(yù)測性的實(shí)施例中，對AML患者施用600mg的(R)-6-[氨基(4-氯苯基)(1-甲基-1H-咪唑-5-基)甲基]-4-(3-氯苯基)l-甲基-2(1H)-喹啉酮)(稱為ZarnestraTM)，在AML中每28天循環(huán)的第一個21天，起始口服劑量為600mg b.i.d.。將受試個體編為兩組，復(fù)發(fā)的AML和難愈的AML?？偣仓委?57個患者(135個復(fù)發(fā)的和117個難愈的)。
將對Zarnestra治療作出應(yīng)答定義為如表2所示患者具有目的性應(yīng)答(CR、CRp或PR)，或通過中心觀察或臨床部位確定而證實(shí)患者有穩(wěn)定的疾病和抗-白血病活性(減少＞50％的白血病胚細(xì)胞)。將抗-白血病活性定義為任何的骨髓胚細(xì)胞計數(shù)小于5％或骨髓胚細(xì)胞至少減半。
表2
實(shí)施例1微陣列分析從同意用以PBS稀釋和以Ficoll-3，5-雙(乙酰氨基)-2，4，6-三碘苯甲酸(1.077g/ml)離心的ZarnestraTMFTI(活性成分，(R)-6-[氨基(4-氯苯基)(1-甲基-1H-咪唑-5-基)甲基]-4-(3-氯苯基)1-甲基-2(1H)-喹啉酮)治療的患者，在治療前后收集骨髓樣品。用PBS洗滌白細(xì)胞2次，重懸于含有10％DMSO的FBS中，并立即在-80℃冷凍。于37℃融化樣品，在5分鐘的時間內(nèi)逐滴加入10×體積的含20％FBS的RPMI。在500g離心細(xì)胞10分鐘，重懸于含有2mM EDTA和0.5％BSA的10ml PBS中。然后使樣品通過70μM的濾器(BectonDickinson Labware，F(xiàn)ranklin lakes，NJ)以除去任何細(xì)胞塊。通過臺盼藍(lán)染料排斥試驗確定細(xì)胞的存活力。融化時骨髓樣品的平均存活力是35％(范圍0-96％)。由于存在的存活細(xì)胞的數(shù)目相對較低，就不進(jìn)一步富集樣品的骨髓細(xì)胞。用CD33-FITC和CD34-PE抗體(BectonDickinson Biosciences Pharmingen，San Biego，CA)雙標(biāo)記大約2×105個細(xì)胞并進(jìn)行FACS分析。
利用Rneasy試劑盒(Qiagen，Santa Clarita，CA)從細(xì)胞樣品提取總RNA。根據(jù)Affymetrix(Santa Clara，CA)的方案進(jìn)行cDNA和cRNA的合成。由于幾個樣品的RNA產(chǎn)量小于1μg，因此進(jìn)行2輪先行擴(kuò)增。為了雜交，通過在40mM Tris-乙酸鹽、pH8.1，100mM乙酸鉀和30mM乙酸鎂中于94℃孵育35分鐘，使11μg的cRNA隨機(jī)片段化。將片段化的cRNA與U133A陣列于45℃在設(shè)置為60rpm的電轉(zhuǎn)烤爐中雜交16hr。雜交后洗滌陣列(使用含有Triton X-100(0.005％)的6×SSPE和0.5×SSPE)，然后用鏈霉抗生物素蛋白-藻紅蛋白(SAPE；Molecular Probes，Eugene，OR)染色。利用Agilent G2500AGeneArray掃描儀(Agilent Technologies，Palo Alto，CA)進(jìn)行結(jié)合的標(biāo)記探針的定量。
將每個陣列的總熒光強(qiáng)度換算為600的均一值。通過計算信噪比(原始平均的信號/噪音)定量芯片的性能。如果芯片的信噪比小于5則從進(jìn)一步的分析中除去該芯片。只有當(dāng)基因被稱為“存在于”至少10％的芯片上時，該基因才被包括在進(jìn)一步的分析內(nèi)。在這種截留后保留了大約12,000個Affymetrix探針組。進(jìn)一步通過根據(jù)主要成分分析鑒定溢出值和分析基因強(qiáng)度的正常分布來控制基因表達(dá)數(shù)據(jù)的質(zhì)量。
使用Chi-squared檢驗和Student’s t-檢驗來鑒定患者應(yīng)答和患者共變量、突變狀態(tài)、CD33和CD34抗原表達(dá)、白血病胚細(xì)胞計數(shù)以及基因表達(dá)之間的相關(guān)性。為了鑒定可預(yù)測以高靈敏度應(yīng)答的基因，使用按百分比排列的分析。例如，鑒定出與至少40％的非應(yīng)答者相比在所有的應(yīng)答者中上調(diào)或下調(diào)的基因。除去根據(jù)雙尾Student’s t-檢驗(不等方差)不顯示顯著p-值(P＜0.05)的基因。通過排一交互檢驗法分析頂端基因的預(yù)測值。在此，從數(shù)據(jù)組除去一個樣品，并且從12,000個基因中再選擇標(biāo)記。然后利用線性判別式分析在排除的樣品上測試該基因的預(yù)測值。將真陽性的數(shù)目除以真陽性加假陰性的總和來計算靈敏度。將真陰性的數(shù)目除以真陰性加假陽性的總和來計算特異性。將真陽性的數(shù)目除以真陽性加假陽性的總和來計算陽性預(yù)測值。將真陰性的數(shù)目除以假陰性加真陰性的總和來計算陰性預(yù)測值。
使用單變量cox比例風(fēng)險模型來評估具有患者存活結(jié)果的每個參數(shù)的相關(guān)性(基因或胚細(xì)胞計數(shù))。對來自cox模型的每個參數(shù)的系數(shù)評估衡量了這種相關(guān)性的強(qiáng)度。當(dāng)使用多于一個的基因時，使用多變量風(fēng)險模型。區(qū)別應(yīng)答者和非應(yīng)答者的分類物被定義為b1*x1+b2*x2+b3*x3+其中b1、b2、b3是來自cox模型的系數(shù)評估，而x2、x2、x3是標(biāo)準(zhǔn)化的參數(shù)值(胚細(xì)胞計數(shù)或基因表達(dá)值的log10)。
使用受體操縱子曲線(ROC)選擇每個分類物的適當(dāng)閾值，需要的靈敏度為至少90％。ROC診斷計算對于每個參數(shù)的靈敏度和特異性。此外，首先利用29個隨機(jī)選擇的樣品的訓(xùn)練組針對基因標(biāo)記使好的結(jié)果和差的結(jié)果分層的能力而給基因標(biāo)記分出等級。然后對剩余的29個樣品測試每個基因的預(yù)測值。這就容許鑒定具有最強(qiáng)預(yù)測值的基因。
實(shí)施例2白血病細(xì)胞抗原表達(dá)已知白血病胚細(xì)胞表達(dá)表面抗原CD33和CD34。分別有95％和55％的患者骨髓白血病細(xì)胞是CD33和CD34陽性的。每個樣品中表達(dá)抗原的細(xì)胞的平均百分?jǐn)?shù)對于CD34為13％，對于CD33為43％。進(jìn)行Chi-squared分析以研究抗原表達(dá)水平和患者結(jié)果之間的相關(guān)性。對于CD34和CD33水平分別選擇15％和60％的截止值。CD33和CD34的低表達(dá)(小于大約15％的CD34細(xì)胞群陽性和小于大約60％的CD33細(xì)胞群陽性)與患者應(yīng)答ZarnestraTM相關(guān)(分別為p＝0.137，p＝0.052)。兩種抗原的高表達(dá)(大于大約15％的CD34細(xì)胞群陽性和小于大約60％的CD33細(xì)胞群陽性)也與高的胚細(xì)胞計數(shù)正相關(guān)。Kaplan Meier分析也表明高的CD33表達(dá)與差的整體存活力相關(guān)(圖1)。
實(shí)施例3白血病胚細(xì)胞計數(shù)分析CD33和CD34抗原表達(dá)的分析提示白血病胚細(xì)胞與患者應(yīng)答相關(guān)。計算位點(diǎn)的平均值和DCL胚細(xì)胞計數(shù)測量，并進(jìn)行Student’s t-檢驗以研究胚細(xì)胞計數(shù)是否與AML患者中的患者應(yīng)答相關(guān)。在總共199個評估的患者中，24個具有CR、CRp、PR或SD，胚細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)與患者的輸出顯著相關(guān)(p＝0.0006)。應(yīng)答者比進(jìn)行性疾病患者(平均51％)具有更低數(shù)目的胚細(xì)胞(平均34％)?？偣?4個應(yīng)答者中只有一個(定義為具有SD)具有高于60％的胚細(xì)胞計數(shù)。對所有可評估患者的Chi-平方分析也發(fā)現(xiàn)在高胚細(xì)胞計數(shù)和治療抗性之間的顯著相關(guān)性(X2＝9.53)。
Kaplan-Meier分析發(fā)現(xiàn)具有低水平胚細(xì)胞計數(shù)(＜60％)的患者比具有高水平胚細(xì)胞計數(shù)的患者具有顯著更好的總體存活力(圖2)。這些分析表明具有高于大約60％的胚細(xì)胞計數(shù)的患者不可能對ZarnestraTM作出應(yīng)答。
實(shí)施例4鑒定在應(yīng)答者和非應(yīng)答者之間差異表達(dá)的基因在藥物治療前從80個患者獲得骨髓樣品用于基因表達(dá)分析。在80個基線樣品中，從分析中除去14個，因為它們來自非可評估的患者。富集樣品的骨髓細(xì)胞，加工獲得信使RNA(編碼基因特異性蛋白質(zhì)的分子)，并與Affymetrix U133A基因芯片雜交。與U133A芯片雜交后，使66個樣品中的55個通過附加的質(zhì)量控制措施。將基因表達(dá)數(shù)據(jù)與臨床信息整合，進(jìn)行回顧性分析以鑒定可以高水平的靈敏度劃分應(yīng)答者和非應(yīng)答者的基因。鑒定若干個基因標(biāo)記來用于預(yù)測對ZarnestraTM(表3)的應(yīng)答。就LBC癌基因(致癌LBC)來說，利用排一交互檢驗法對數(shù)據(jù)組計算該基因的預(yù)測值(表3)。致癌LBC基因表達(dá)水平能夠捕獲所有臨床上鑒定的應(yīng)答者，同時除去超過一半的非應(yīng)答者。
表3在應(yīng)答者對非-應(yīng)答者中差異表達(dá)的基因
*比率表明應(yīng)答者與非應(yīng)答者相比較的倍數(shù)變化表4利用致癌LBC作為應(yīng)達(dá)標(biāo)記的排一交互檢驗法。
檢驗靈敏度＝100％特異性＝55％陽性預(yù)測值＝41％陰性預(yù)測值＝100％存活分析顯示根據(jù)致癌LBC表達(dá)(圖3A，p＝0.00841)將患者分類為應(yīng)答者的患者顯著優(yōu)越于利用臨床數(shù)據(jù)(圖3B，p＝0.0827)的患者分類。這是因為癌LBC標(biāo)記鑒定了整體存活力增加的非應(yīng)答者子集。根據(jù)Cox風(fēng)險模型，組合致癌LBC和第二基因標(biāo)記芳烴類受體(AHR)使特異性和陽性預(yù)測值分別增加至75％和56％(圖3C)。這些結(jié)果表明單獨(dú)利用致癌LBC，或與AHR基因組合提供了用于預(yù)測應(yīng)答zarnestraTM治療的有效陣列。
也進(jìn)行了利用致癌LBC和AHR作為標(biāo)記的排一交互檢驗。當(dāng)利用截留值來鑒定最高的靈敏度和最佳的特異性時，PPV和靈敏度保持相同。對其他基因組合的排一交互檢驗結(jié)果如表5所示。這表明標(biāo)記的組合可以提高該方法的預(yù)測值。
表5
此外，利用LBC和AHR分類物對患者分類顯示與利用致癌LBC基因或臨床反應(yīng)定義比較的兩個患者群體之間在中值存活時間方面的相似差異(圖4C)。這些結(jié)果表明單獨(dú)利用致癌LBC，或與AHR基因組合可在目前的數(shù)據(jù)組中用作預(yù)測應(yīng)答ZARNESTRA的有效生物標(biāo)記。
使用Cox風(fēng)險模型分析在劃分弱的存活者和好的存活者中其他的標(biāo)記組合(表6)。在此，使用來自51個患者的數(shù)據(jù)，因為只有這個數(shù)目的患者樣品具有測量的CD33和CD34抗原水平。使用大于90％的靈敏度來確定標(biāo)記的適當(dāng)截留值。使用多個標(biāo)記可提高2個存活組的中值存活時間的差異。
表6
實(shí)施例5鑒定在應(yīng)答者和非應(yīng)答者之間差異表達(dá)的基因(重復(fù)分析)我們利用基因表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行監(jiān)控分析以鑒定在所有應(yīng)答者和至少40％的非應(yīng)答者之間差異表達(dá)的附加基因。選擇這些標(biāo)準(zhǔn)以鑒定可預(yù)測以可能的最高靈敏度水平應(yīng)答Tipifarnib的基因?？偣茶b定了可劃分應(yīng)答者和非應(yīng)答者的19個基因(表7和8)，并在t-檢驗中給出顯著性p-值(p＜0.05)。令人感興趣地，基因包括涉及信號傳導(dǎo)、凋亡、細(xì)胞增殖、腫瘤發(fā)生、和潛在地，F(xiàn)TI生物學(xué)(ARHH、LBC和IL3RA)的基因。
表7可預(yù)測應(yīng)答Tipifarnib的頂端19個基因的列表
表8.表7中基因的特性
實(shí)施例6鑒定由3個基因標(biāo)記組成的最小組為了鑒定與單獨(dú)的LBC相比可以以提高的準(zhǔn)確度預(yù)測應(yīng)答tipifarnib的基因標(biāo)記的候選組，我們使用LOOCV來確定基因的最佳數(shù)目。我們根據(jù)t-檢驗p-值建立了具有增加的基因數(shù)目的分類物，并利用LOOCV計算這些分類物的誤差率，同時保持預(yù)測應(yīng)答的靈敏度為100％(圖4A)。發(fā)現(xiàn)3-基因分類物(包括LBC、AHR、和MINA53)可以以最低的誤差率預(yù)測應(yīng)答(圖4A)。當(dāng)進(jìn)行排一交互檢驗時，這也可觀察到。當(dāng)加入更多的基因時，誤差率增加，表明附加的基因向分類物導(dǎo)入了噪音。對于3-基因分類物，LOOCV證實(shí)靈敏度為86％，特異性為70％，整體的診斷準(zhǔn)確率為74％(圖4B)。在每個患者中3個基因的組合表達(dá)值如圖4C所示。
Kaplan-Meier分析再次顯示在預(yù)測的應(yīng)答者組和非應(yīng)答者組之間存活力有顯著的差異(圖4D)。此外，如果我們將不正確分類的非應(yīng)答者與正確分類的非應(yīng)答者相比，則錯誤分類的非應(yīng)答者顯示了更好的總存活力(圖5)。這表明該基因標(biāo)記可預(yù)測不能通過臨床標(biāo)準(zhǔn)觀察到的應(yīng)答治療的水平。備選地，這可容許基因標(biāo)記預(yù)測對FTI治療的應(yīng)答，由此提供預(yù)后值。在未治療的患者中進(jìn)行的進(jìn)一步分析可用于確定基因表達(dá)標(biāo)記和預(yù)后之間的關(guān)系。
實(shí)施例7抗體(預(yù)測性的)合成LBC癌基因衍生的肽，偶連于匙孔血藍(lán)蛋白，并用于免疫家兔來生產(chǎn)多克隆抗體。用ELISA測試血清針對相應(yīng)肽的反應(yīng)性，并親合純化陽性的批次。純化的抗體特異性地在組織切片中檢測具有表位的肽。這通過如果與抗體同時加入相應(yīng)的肽則信號完全消除而加以驗證。除了這種在IHC中作用良好的多克隆抗體外，也產(chǎn)生能夠檢測天然折疊狀態(tài)的蛋白質(zhì)的單克隆抗體。為了產(chǎn)生單克隆抗體，產(chǎn)生在哺乳動物細(xì)胞中生產(chǎn)的純化抗原以確保天然折疊和翻譯后的修飾。在小鼠骨髓細(xì)胞中表達(dá)抗原LBC癌蛋白-IgG恒定部分融合蛋白，并利用Fc部分作為餌來純化蛋白質(zhì)。在Western印跡中通過C-末端多克隆抗體識別該純化的抗原。通過選擇出產(chǎn)生與LBC肽而非IgG恒定部分發(fā)生作用的抗體的陽性克隆，可使用該抗原來產(chǎn)生針對LBC肽的小鼠單克隆抗體。
使用這些抗體和相似的抗體可容易地形成用于臨床鑒定LBC癌基因的試劑盒。這種試劑盒包括直接針對LBC肽鑒定(在此，LBC癌基因)的抗體、合適的指示試劑(例如，酶、標(biāo)記等)以及(任選地)這種試劑盒用于臨床應(yīng)用的其他試劑，例如稀釋緩沖液、穩(wěn)定劑和一般用于這種測定的其他材料。
實(shí)施例8原位雜交(預(yù)測性的)將福爾馬林固定的石蠟包埋的組織樣品切成5-7μm厚的切片，固定在涂有硅烷的玻璃載片上，在37℃孵育過夜，并于65℃孵育30分鐘，然后在二甲苯中脫蠟兩次。此后，使樣品通過梯度系列的乙醇溶液(100至70％)而再水合，在PBS pH7.0中漂洗5分鐘2次，用含0.1mol/L甘氨酸的PBS處理5分鐘2次，用含0.3％ Triton X-100的PBS浸透15分鐘。用蛋白酶K(Finnzymes，赫爾辛基，芬蘭)(在TE緩沖液中，μg/ml；100mmol/L Tris-HCl，50mmol/L EDTA，pH8.0)于37℃處理切片30分鐘，在含3％多聚甲醛的PBS中于4℃后固定5分鐘，并在PBS中漂洗2次。通過將載片在0.25％(v/v)乙酸酐、100mmol/L三乙醇胺，pH8.0中浸泡5分鐘2次而封閉正電荷。使載片在4×SSC，50％(v/v)去離子的甲酰胺中于37℃平衡10分鐘。
利用TA克隆試劑盒(Invitrogen，San Diego CA)，通過將PCR擴(kuò)增的0.4kb LBC癌基因cDNA連接插入pCR-II載體來制備探針。通過使適當(dāng)?shù)妮d體構(gòu)建體線性化而產(chǎn)生LBC癌基因反義或有義RNA探針的模板(分別為3’至5’的方向或5’至3’的方向)。使用RNA標(biāo)記試劑盒(Boehringer-Mannheim)通過體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生地高辛標(biāo)記的RNA探針。利用含有1×Denhardt’s溶液(0.2g/L Ficoll 400型，Pharmacia)、0.2g/L聚乙烯吡咯烷酮、0.2g/L BSA(級分V；Sigma)、40％甲酰胺、10％硫酸葡聚糖、4×SSC、10mmol/L二硫蘇糖醇、1mg/mL酵母tRNA、1mg/mL鯡魚精DNA和300ng/mL地高辛標(biāo)記的RNA探針的雜交混合物于45℃雜交過夜。雜交后，在2×SSC中于37℃洗滌組織切片5分鐘2次，在60％甲酰胺、0.2×SSC中洗滌15分鐘1次，然后在2×SSC中于室溫漂洗5分鐘2次，在100mmol/L Tris-HCl，pH8.0，150mmol/L NaCl中洗滌10分鐘2次。利用1∶250的堿性磷酸酶-軛合的羊抗地高辛Fab片段(Boehringer Mannheim)進(jìn)行信號檢測。通過將切片與NBT/BCIP儲液(Boehringer Mannheim)孵育1.5小時來使觀察信號可視化。
在癌癥患者的腫瘤發(fā)生細(xì)胞中觀察到LBC癌基因-陽性細(xì)胞，表明不可能應(yīng)答FTI。
實(shí)施例9免疫組織化學(xué)(預(yù)測性的)使用針對LBC癌基因的C-末端肽親合純化的多克隆抗體用于IHC檢測和LBC癌基因的定位。將來自福爾馬林固定的4μm切片和石蠟包埋的正常和腫瘤組織固定到涂有3-氨基丙基-三乙氧基硅烷(APES，Sigma，St.Louis，MO)的載片上。使切片脫蠟并且在梯度濃度的乙醇中再水合，用甲醇化的過氧化物(含0.5％過氧化氫的無水甲醇)于室溫處理30分鐘以封閉內(nèi)源的過氧化物酶活性。在微波爐中挽救抗原5分鐘2次(650W)。
使用Elite ABC試劑盒(Vectastain，Vector Laboratories，Burlingame，CA)用于免疫過氧化物酶染色。以1∶2000的最佳稀釋度使用LBC肽的抗體。將生物素?；牡诙贵w和過氧化物酶標(biāo)記的抗生物素蛋白-生物素復(fù)合物在切片上孵育30分鐘。在PBS(pH7.2)中制備稀釋物，所有的孵育都于室溫在保濕皿中進(jìn)行。在不同的染色步驟之間，用PBS漂洗載片3次。用3-氨基-9-乙基咔唑(Sigma)溶液(0.2mg/ml，在含0.03％過氧化氫的0.05M乙酸緩沖液中，pH5.0)于室溫染色15分鐘而使過氧化物酶染色可視化。最后，用Mayer’s蘇木精略微復(fù)染切片，并用含水的固定介質(zhì)(Aquamount，BDH)固定。在對照實(shí)驗中，用正常家兔血清的IgG部分替換初級抗體或用LBC肽預(yù)先吸附初級抗體。這些染色表明在細(xì)胞的子集中存在LBC癌基因。
實(shí)施例10酶免疫測定(預(yù)測性的)針對LBC蛋白質(zhì)或與LBC癌基因相關(guān)的特征性肽準(zhǔn)備免疫測定。使用包括結(jié)腸腫瘤活組織樣本的消化物的抗原標(biāo)準(zhǔn)(通過免疫過氧化物酶染色顯示包含抗原)。人白細(xì)胞來自AML患者。收集活組織樣本并于4℃在含有0.2％(w/v)脫氧膽酸鈉的10體積的10mM Tris緩沖液，pH7.4中勻漿化。將勻漿迅速帶至37℃，加入下列試劑(終濃度)同時攪拌1mm半胱氨酸(Sigma)、1mM EDTA(Sigma)和木瓜蛋白酶(0.8單位/ml)(Boehringer-Mannheim，Indianapolis，IN)。5分鐘后，加入5mM碘乙酰胺(Sigma)終止消化。使勻漿于4℃在100,000×g離心1小時，然后對含有分別為10mM的苯甲基磺酰氟和氨基己酸的10mM Tris/0.9％NaCl溶液緩沖液，pH7.4充分透析。將勻漿以0.5mg蛋白質(zhì)/ml的濃度按小等分冷凍。
對于測量LBC蛋白質(zhì)或肽的免疫測定方法所產(chǎn)生的劑量應(yīng)答曲線證實(shí)了在100ng至100μg/ml的抗原輸入之間的線性。對于血清分析，范圍是1ng至1000ng/ml，因為這些樣品在測定前是10倍稀釋的。
上述實(shí)施例中所述抗體的固相制品是利用CNBr-活化的Sepharose(Pharmacia)制備的。用50mM碳酸鹽-碳酸氫鹽緩沖液，pH9.6中的抗體(200μl/孔)于4℃涂覆微滴定平板(Nunc IImmunoplates；Grand Island Biological Co.，Grand Island，NY)18小時。除去抗體溶液后，通過加入200μl的測定緩沖液[含有1％(v/v)兔血清和1％(w/v)牛白蛋白的PBS]而封閉塑料制品上的剩余蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)。在室溫下孵育1小時后，將涂覆的平板立即用于測定步驟。
為了進(jìn)行測定，在37℃應(yīng)用在測定緩沖液中稀釋的200μl樣品1-5小時。用測定緩沖液洗滌3次后，于37℃將共價軛合到辣根過氧化物酶(Sigma，類型VI)上的200μl抗體加入每個孔1.5小時。將共軛物稀釋至濃度為每ml含有10％(v/v)鼠血清的PBS有0.5μg免疫球蛋白。如上述的洗滌步驟之后，于室溫下向每孔加入200μl底物0.5小時。底物溶液在每ml pH5.0的檸檬酸鹽緩沖液中包含0.4mg的鄰-苯二胺和0.003％過氧化氫。加入50μl的2N硫酸終止反應(yīng)，利用酶測定平板閱讀儀(Fisher Scientific Co.，Pittsburgh，PA)在488nM處監(jiān)測吸光度。
通過下列公式計算結(jié)合酶共軛物的百分比(B-B0)(Bt-B0)(100)其中B＝樣品的吸光度，Bt＝最大吸光度，以及B0＝空白的吸光度。利用標(biāo)準(zhǔn)的消化和在測定緩沖液中稀釋的26倍稀釋的血清樣品對每個測定進(jìn)行三次重復(fù)。通過替換固相的多種抗體試劑來檢驗免疫測定的特異性，包括針對不相關(guān)的蛋白質(zhì)和非免疫的兔血清的抗體。在固相抗體中只有根據(jù)上述實(shí)施例制備的抗體結(jié)合高稀釋度的抗原。
檢測正常的對照受試個體、良性和惡性血液病癥患者的血清LBC蛋白質(zhì)的水平。
從明顯健康的個體獲得的血清顯示沒有LBC蛋白質(zhì)。只有5％的樣品在檢測的極限或其上表達(dá)血清抗原，并且選擇這個值作為評估血清水平的截斷值。在截斷值以下的癌癥患者可能對FTI治療作出應(yīng)答。
序列表<110>Ortho-Clinical DiagnosticsRAPONI，MITCHRAPONI，MITCH<120>用于評估和治療癌癥的方法<130>ADS-5001 CIP<150>10/611,446<151>2003-07-03<160>29<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>5496<212>DNA<213>人<400>1attcagccgg tgcgcgcggc ggcgggaggc agtggctggg gagtcccgtc gacgctctgt 60tccgagagcg tgccccggac cgccagctca gaacaggggc agccgtgtag ccgaacggaa120gctgggagca gccgggactg gtggcccgcg cccgagctcc gcaggcggga agcaccctgg180atttgggaag tcccgggagc agcgcggcgg cacctccctc acccaagggg ccgcggcgac240ggtcacgggg cgcggcgcca ccgtgagcga cccaggccag gattctaaat agacggccca300ggctcctcct ccgcccgggc cgcctcacct gcgggcattg ccgcgccgcc tccgccggtg360tagacggcac ctgcgccgcc ttgctcgcgg gtctccgccc ctcgcccacc ctcactgcgc420caggcccagg cagctcacct gtactggcgc gggctgcgga agcctgcgtg agccgaggcg480ttgaggcgcg gcgcccacgc cactgtcccg agaggacgca ggtggagcgg gcgcggcttc540gcggaacccg gcgccggccg ccgcagtggt cccagcctac accgggttcc ggggacccgg600ccgccagtgc ccggggagta gccgccgccg tcggctgggc accatgaaca gcagcagcgc660
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195 200 205Met Ser Ser Ser Val Val Arg Arg Leu Gly Ile Pro Glu Cys Ile Leu210 215 220Leu Val Thr Gln Arg Ile Thr Lys Tyr Pro Val Leu Phe Gln Arg Ile225 230 235 240Leu Gln Cys Thr Lys Asp Asn Glu Val Glu Gln Glu Asp Leu Ala Gln245 250 255Ser Leu Ser Leu Val Lys Asp Val Ile Gly Ala Val Asp Ser Lys Val260 265 270Ala Ser Tyr Glu Lys Lys Val Arg Leu Asn Glu Ile Tyr Thr Lys Thr275 280 285Asp Ser Lys Ser Ile Met Arg Met Lys Ser Gly Gln Met Phe Ala Lys290 295 300Glu Asp Leu Lys Arg Lys Lys Leu Val Arg Asp Gly Ser Val Phe Leu305 310 315 320Lys Asn Ala Ala Gly Arg Leu Lys Glu Val Gl nAla Val Leu Leu Thr325 330 335Asp Ile Leu Val Phe Leu Gln Glu Lys Asp Gln Lys Tyr Ile Phe Ala340 345 350Ser Leu Asp Gln Lys Ser Thr Val Ile Ser Leu Lys Lys Leu Ile Val355 360 365Arg Glu Val Ala His Glu Glu Lys Gly Leu Phe Leu Ile Ser Met Gly
370 375 380Met Thr Asp Pro Glu Met Val Glu Val His Ala Ser Ser Lys Glu Glu385 390 395 400Arg Asn Ser Trp Ile Gln Ile Ile Gln Asp Thr Ile Asn Thr Leu Ser405 410 415Gly Asn Gly Trp Arg Cys Phe Asn420<210>29<211>2170<212>DNA<213>人<400>29ctgagggctc atccctctgc agagcgcggg gtcaccggga ggagacgcca tgacgcccgc 60cctcacagcc ctgctctgcc ttgggctgag tctgggcccc aggacccgcg tgcaggcagg120gcccttcccc aaacccaccc tctgggctga gccaggctct gtgatcagct gggggagccc180cgtgaccatc tggtgtcagg ggagcctgga ggcccaggag taccgactgg ataaagaggg240aagcccagag cccttggaca gaaataaccc actggaaccc aagaacaagg ccagattctc300catcccatcc atgacagagc accatgcggg gagataccgc tgccactatt acagctctgc360aggctggtca gagcccagcg accccctgga gctggtgatg acaggattct acaacaaacc420caccctctca gccctgccca gccctgtggt ggcctcaggg gggaatatga ccctccgatg480tggctcacag aagggatatc accattttgt tctgatgaag gaaggagaac accagctccc540ccggaccctg gactcacagc agctccacag tggggggttc caggccctgt tccctgtggg600ccccgtgaac cccagccaca ggtggaggtt cacatgctat tactattata tgaacacccc660ccaggtgtgg tcccacccca gtgaccccct ggagattctg ccctcaggcg tgtctaggaa720
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權(quán)利要求
1.一種通過分析LBC癌基因(SEQ ID NO2)的存在或表達(dá)，來確定患者是否對使用法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑(FTI)的治療作出應(yīng)答的方法。
2.權(quán)利要求1的方法，其進(jìn)一步包括分析在存在FTI時受到差異調(diào)節(jié)的基因的表達(dá)。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述的分析是對除了LBC癌基因之外的一個以上基因的表達(dá)的分析。
4.權(quán)利要求2的方法，其中所述的基因選自SEQ ID NO1、3-18和29。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述的基因是SEQ ID NO1和/或3。
6.權(quán)利要求1的方法，其中用FTI治療被確定為缺乏或不表達(dá)LBC癌基因的患者。
7.權(quán)利要求1的方法，其中用除FTI之外的試劑治療被確定為存在或表達(dá)LBC癌基因的患者。
8.權(quán)利要求1的方法，其進(jìn)一步包括確定用于檢測對FTI作出應(yīng)答的患者樣品中是否包括選自CD33和CD44的細(xì)胞表面抗原的步驟。
9.權(quán)利要求8的方法，其中存在具有所述表面抗原的細(xì)胞是對FTI治療作出應(yīng)答的預(yù)后癥狀。
10.權(quán)利要求1的方法，其進(jìn)一步包括確定用于測定對FTI作出應(yīng)答的患者樣品中包括胚細(xì)胞的細(xì)胞百分比的步驟。
11.權(quán)利要求10的方法，其中在所述的樣品中存在小于60％的胚細(xì)胞是對FTI作出應(yīng)答的預(yù)后癥狀。
12.一種通過分析LBC癌基因(SEQ ID NO2)的存在或表達(dá)，來監(jiān)測正在用法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑(FTI)治療的患者的治療效力的方法。
13.權(quán)利要求12的方法，其進(jìn)一步包括分析在存在FTI時受到差異調(diào)節(jié)的基因的表達(dá)。
14.權(quán)利要求12的方法，其中所述的分析是對除了LBC癌基因之外的一個以上基因的表達(dá)。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述的基因選自SEQ ID NO1、3-18和29。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述的基因是SEQ ID NO1和/或3。
17.權(quán)利要求12的方法，其中被確定為缺乏或不表達(dá)LBC癌基因的患者作為應(yīng)答FTI的患者而接受治療。
18.權(quán)利要求12的方法，其進(jìn)一步包括確定用于測定對FTI作出應(yīng)答的患者樣品中是否包括選自CD33和CD44的細(xì)胞表面抗原的步驟。
19.權(quán)利要求18的方法，其中具有所述表面抗原的細(xì)胞的存在量在CD33的情況中占15％以下，或在CD34的情況中占60％以下是對FTI作出應(yīng)答的指示。
20.權(quán)利要求18的方法，其中缺乏具有所述表面抗原的細(xì)胞是對FTI作出應(yīng)答的指示。
21.權(quán)利要求12的方法，其進(jìn)一步包括確定用于測定對FTI作出應(yīng)答的包括胚細(xì)胞的患者樣品中細(xì)胞的百分比的步驟。
22.權(quán)利要求21的方法，其中在所述的樣品中存在少于或等于60％的胚細(xì)胞時，則表示對FTI作出應(yīng)答。
23.權(quán)利要求22的方法，其中在所述的樣品中存在多于60％的胚細(xì)胞時，則表示對FTI是非應(yīng)答的。
24.權(quán)利要求12的方法，其中被確定為存在或表達(dá)數(shù)量不減少的LBC癌基因的患者作為非應(yīng)答FTI的患者而接受治療。
25.權(quán)利要求12的方法，其中所述的FTI是(R)-6-[氨基(4-氯苯基)(1-甲基-1H-咪唑-5-基)甲基]-4-(3-氯苯基)1-甲基-2(1H)-喹啉酮)。
26.權(quán)利要求12的方法，其中所述的FTI是(R)-6-[氨基(4-氯苯基)(1-甲基-1H-咪唑-5-基)甲基]-4-(3-氯苯基)1-甲基-2(1H)-喹啉酮)。
27.一種治療患者的方法，包括a)分析所述患者中的基因表達(dá)圖譜或LBC癌基因(SEQ ID NO2)的存在，以確定該患者是否對使用法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑(FTI)的治療作出應(yīng)答，以及b)如果分析表明該患者有應(yīng)答，則用FTI治療該患者。
28.權(quán)利要求27的方法，其中所述的分析是對一個以上基因表達(dá)的分析。
29.權(quán)利要求27的方法，F(xiàn)TI選自喹啉或喹啉衍生物。
30.權(quán)利要求29的方法，其中FTI選自7-(3-氯苯基)-9-[(4-氯苯基)-1H-咪唑-1-基]甲基]-2，3-二氫-1H，5H-苯并[ij]喹嗪-5-酮、7-(3-氯苯基)-9-[(4-氯苯基)-1H-咪唑-1-基]甲基]-1，2-二氫-4H-吡咯并[3，2，1-ij]喹啉-4-酮、8-[氨基(4-氯苯基)(1-甲基-1H-咪唑-5-基)，甲基]-6-(3-氯苯基)-1，2-二氫-4H-吡咯并[3，2，1-ij]喹啉-4-酮、8-[氨基(4-氯苯基)(1-甲基-1H-咪唑-5-基)，甲基]-6-(3-氯苯基)-2，3-二氫-1H，5H-苯并[ij]喹嗪-5-酮、和(R)-6-[氨基(4-氯苯基)(1-甲基-1H-咪唑-5-基)甲基]-4-(3-氯苯基)1-甲基-2(1H)-喹啉酮)。
31.權(quán)利要求30的方法，其中所述的FTI是6-[氨基(4-氯苯基)(1-甲基-1H-咪唑-5-基)甲基]-4-(3-氯苯基)1-甲基-2(1H)-喹啉酮)。
32.權(quán)利要求28的方法，其中所述的基因與具有SEQ ID NO1-18和29的一個或多個核酸序列相關(guān)聯(lián)。
33.權(quán)利要求32的方法，其中所述的基因是SEQ ID NO1和/或3。
34.權(quán)利要求27的方法，其中所述的治療包括施用FTI和另一種治療組合物。
35.權(quán)利要求34的方法，其中所述的另一種治療組合物調(diào)節(jié)MAPK/ERK信號通路、TGFβ、WNT、Rho或細(xì)胞凋亡途徑。
36.權(quán)利要求34的方法，其中所述的另一種組合物選自酪氨酸激酶抑制劑、MEK激酶抑制劑、PI3激酶抑制劑、MAP激酶抑制劑、凋亡調(diào)節(jié)劑及其組合。
37.用于評估使用法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑(FTI)治療患者的效能的制品，包括用于確定指示FTI應(yīng)答的患者的基因表達(dá)圖譜的介質(zhì)。
38.權(quán)利要求37的制品，其中基因表達(dá)圖譜是從與SEQ ID No1-18和29中的一個以上核酸序列相關(guān)聯(lián)的基因組獲得的。
39.權(quán)利要求37的方法，其中所述的基因是SEQ ID NO1和/或2和和/或3。
40.權(quán)利要求37的制品，包括固定于介質(zhì)上的基因表達(dá)圖譜的顯示物。
41.包括用于確定對使用法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑(FTI)的治療作出應(yīng)答的試劑的試劑盒。
42.權(quán)利要求41的試劑盒，其中所述的試劑用于檢測LBC癌基因(SEQ ID NO2)的存在或表達(dá)。
43.權(quán)利要求42的試劑盒，其中所述的試劑用于檢測選自SEQ IDNO1、3-18和29及其變體的基因的表達(dá)。
44.權(quán)利要求43的方法，其中所述的基因是SEQ ID NO1和/或3。
45.權(quán)利要求41的試劑盒，其進(jìn)一步包括用于檢測選自CD33和CD34的細(xì)胞表面抗原的試劑。
46.權(quán)利要求41的試劑盒，其進(jìn)一步包括用于檢測胚細(xì)胞的試劑。
47.權(quán)利要求41的試劑盒，其中所述的試劑包括PCR引物。
48.權(quán)利要求47的試劑盒，其進(jìn)一步包括探針。
49.法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑(FTI)在制備用于治療其中LBC癌基因(SEQ ID NO2)已經(jīng)或隨后被確定為缺乏或不表達(dá)的患者的藥物中的用途。
50.法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑(FTI)在制備用于治療的患者的藥物中的用途，隨后該患者被監(jiān)測LBC癌基因(SEQ ID NO2)存在或表達(dá)。
51.一種診斷試劑盒，其用于分析來自患者的樣品，由此確定LBC癌基因(SEQ ID NO2)的存在或表達(dá)。
52.一種用于治療患者的組合，包括用于確定所述患者中基因表達(dá)圖譜或LBC癌基因(SEQ ID NO2)的存在以確定該患者是否對法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑(FTI)治療作出應(yīng)答的手段；以及如果所述分析表明該患者有應(yīng)答，則使用FTI來制備用于治療所述患者的藥物組合物。
全文摘要
用于治療癌癥，以及優(yōu)選治療血液惡性腫瘤患者的方法，包括分析患者的基因表達(dá)圖譜和/或分子標(biāo)記以確定該患者是否對使用法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑(FTIs)的治療和任選的其他治療作出應(yīng)答。該方法也可用于監(jiān)測患者的治療和用于選擇療程。提供了在應(yīng)答FTI治療中受到調(diào)節(jié)的基因并用于形成圖譜。
文檔編號A61P35/00GK1721553SQ20051008221
公開日2006年1月18日 申請日期2005年7月1日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月1日
發(fā)明者M·拉波尼 申請人:維里德克斯有限責(zé)任公司