專利名稱：炭疽毒素受體ATR－Fc融合蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種炭疽毒素受體ATR-Fc融合蛋白，屬于醫(yī)學(xué)生物工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
炭疽熱是嚴(yán)重威脅人類健康的傳染性疾病，美國疾病控制與預(yù)防中心(CDC)將炭疽、鼠疫、天花等列為等級最高的傳染性疾病，這類傳染性疾病具有傳播速度快、死亡率高、易引發(fā)公眾恐慌和社會混亂等特點(diǎn)，需要特別對待和嚴(yán)密監(jiān)測。炭疽桿菌有以下特點(diǎn)(1)繁殖速度快，炭疽孢子存活時間長，在自然條件下可以存活36年；(2)傳染性強(qiáng)，室外施放含炭疽菌的氣溶膠，即便在室內(nèi)也有感染炭疽熱的可能；(3)吸入性炭疽熱死亡率極高，至今仍沒有有效的方法治療。(4)作為生物武器具有很強(qiáng)的殺傷能力。1993年美國國會技術(shù)評估部門(OTA)估計，在美國首都華盛頓的上風(fēng)口施放100kg的氣溶膠化的炭疽孢子，將會造成13萬～300萬人死亡，其致死性殺傷效果相當(dāng)于甚至超過1顆氫彈的威力。由于炭疽桿菌的這些特點(diǎn)，80年前有的國家就開始了以炭疽作為生物武器的研究，“911”事件后美國又出現(xiàn)炭疽菌襲擊，研究抵御生物恐怖襲擊的新方法已成為美國政府優(yōu)先資助的項目，并且引起各國政府的高度重視。
人體感染炭疽桿菌后，炭疽桿菌能在人體內(nèi)增殖并產(chǎn)生致命的毒素。大多數(shù)的炭疽熱致死病例是由炭疽毒素不可逆的毒性作用導(dǎo)致的。炭疽毒素包括(1)保護(hù)抗原(PA)，它可與哺乳動物細(xì)胞膜上的炭疽毒素受體(ATR)結(jié)合，并介導(dǎo)致死毒素(LeTx)和水腫因子(EF)進(jìn)入宿主細(xì)胞內(nèi)；(2)水腫因子(EF)，它是一種腺苷酸環(huán)化酶，通過提高感染部位細(xì)胞內(nèi)的環(huán)腺苷酸(cAMP)濃度而引起水腫，并可抑制噬菌作用；(3)致死因子(LF)，它是一種高度特異性的鋅依賴性蛋白酶，可改變巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子并誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞裂解。保護(hù)抗原是炭疽毒素的核心成分，它能在細(xì)胞水平上促進(jìn)炭疽感染進(jìn)展。在沒有保護(hù)抗原的情況下，炭疽桿菌產(chǎn)生的水腫因子和致死因子對人體是無害的，只有保護(hù)抗原與細(xì)胞表面的炭疽毒素受體結(jié)合形成保護(hù)抗原-受體(PA-ATR)復(fù)合物，炭疽致死毒素和水腫因子在PA-ATR復(fù)合物的介導(dǎo)下才能進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)內(nèi)并產(chǎn)生毒性。因此，保護(hù)抗原在炭疽感染中起著舉足輕重的作用，保護(hù)抗原自然而然成為研制預(yù)防和治療炭疽熱新藥的有效靶標(biāo)。
抗體類藥物的研究、開發(fā)和生產(chǎn)已成為生物制藥行業(yè)中最重要和最為活躍的領(lǐng)域。
抗炭疽毒素抗體是預(yù)防和治療炭疽感染最直接和最有效的手段之一，有許多抗保護(hù)抗原抗體(anti-PA antibodies)在細(xì)胞保護(hù)實(shí)驗(yàn)和動物實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出明顯的保護(hù)作用，并且在治療中有明顯療效，由于具有Fc段，抗體不僅能結(jié)合炭疽毒素PA，并且可以由抗體Fc介導(dǎo)的生物學(xué)效應(yīng)如抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒效應(yīng)(ADCC)、補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒效應(yīng)(CDC)或免疫調(diào)理作用而殺死炭疽孢子，起到治療的作用。但是，不是所有的anti-PA抗體都有細(xì)胞保護(hù)作用，相反，如果anti-PA抗體不是封閉PA與其受體ATR結(jié)合部位，不僅不能保護(hù)細(xì)胞，反而能強(qiáng)化致死毒素對巨噬細(xì)胞的殺傷作用。PA的可溶性受體ATR能夠結(jié)合PA并阻止致死毒素對細(xì)胞產(chǎn)生殺傷作用，但是，由于可溶性受體半衰期短，而且沒有抗體分子的Fc段介導(dǎo)的對病原體產(chǎn)生殺傷作用的功能。
目前國內(nèi)外還沒有研制ATR-Fc融合蛋白的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的主要目的在于提供一種安全、有效的炭疽毒素受體ATR-Fc融合蛋白。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案一種炭疽毒素受體ATR-Fc融合蛋白，是炭疽毒素PA的受體(ATR)與人Fc的二聚體融合蛋白，單鏈ATR-Fc分子具有序列表SEQ ID No.1所示的氨基酸序列，共459個氨基酸殘基；其中前27個氨基酸為ATR的信號肽。所以成熟的單鏈ATR-Fc有432aa，二聚體為864aa。
編碼炭疽毒素受體ATR-Fc融合蛋白單鏈的基因，具有序列表SEQ ID No.2所示的堿基序列。
我們采用人工合成的方法，成功地得到了與設(shè)計相符的編碼炭疽毒素受體ATR胞外區(qū)1-227aa的基因。cDNA人工合成具有許多優(yōu)點(diǎn)，如基因的來源不受材料限制；可以從基因水平上進(jìn)行優(yōu)化以提高表達(dá)水平；可以對幾個基因進(jìn)行剪裁或組合等。但是，在利用重疊延伸PCR法組裝基因過程中，由于寡核苷酸片段的反復(fù)退火與連接，可能引入錯誤。因此，盡量減少PCR的次數(shù)，或者合成的基因長度較短如400bp以下，會有利于寡核苷酸片段的正確組裝。本文合成的加上酶切位點(diǎn)和剪切供體序列的ATR基因長度大于700bp，如果從第一個寡核苷酸片段順序組裝到第18個片段，PCR次數(shù)過多，容易出現(xiàn)錯誤。我們采取的策略是先組裝成兩個長度在300-400bp的大片段，再通過兩個大片段的互補(bǔ)堿基的重疊延伸，得到全長基因，PCR次數(shù)減少了1倍，減少了堿基錯配或缺失的幾率。
合成的寡核苷酸片段的長度對全基因的正確組裝也有很大影響。一方面，長度太短，
會增加寡核苷酸片段的數(shù)目和PCR的次數(shù)，導(dǎo)致發(fā)生錯誤的幾率增加；另一方面，長度太長又會使合成中出現(xiàn)錯誤的幾率增加，合成成本和難度極大增加。因此，合成的寡核苷酸片段的長度要綜合考慮合成和組裝過程中的各種因素，國外報道50-70個核苷酸長度比較適宜，合成時我們選擇了50-60個寡核苷酸的長度，即可保證組裝基因的質(zhì)量，又大大降低了寡核苷酸合成的成本。此外，采用高保真的Taq酶，可以極大限度地減少PCR重疊延伸過程中的錯誤，是獲得正確的全基因的關(guān)鍵。我們在PCR過程中，采用了TaKaRa公司的最新產(chǎn)品PyrobestTMDNA Polymerase，該酶與TaKaRa TaqTM相比，保真性能提高了10倍。
將全長為681bp的編碼炭疽毒素受體(ATR)N端1-227氨基酸的基因分成長約50-60堿基的18個寡核苷酸片段，相鄰片段重疊部分為20-22個堿基，利用重疊延伸PCR和引物PCR法，將合成的片段組裝與擴(kuò)增，得到了含有ATR1-227的全部編碼區(qū)和Hind III、BamH I位點(diǎn)在內(nèi)的DNA片段。回收的基因片段經(jīng)BamH I/Hind III雙酶切連接到pUC19質(zhì)粒中，挑選陽性克隆進(jìn)行酶切鑒定和雙向序列測定，獲得了全序列正確的克隆。BamHI/Hind III雙酶切質(zhì)粒pUC19/ATR和pcDNA3.1/CD40-Fc，用ATR基因替換CD40基因得到表達(dá)ATR-Fc融合蛋白的真核表達(dá)載體pcDNA3.1/ATR-Fc。
將編碼炭疽毒素受體(ATR)N端1-227氨基酸的基因和編碼Fc段的基因連接，插入到pcDNA3.1的Hind III和Not I位點(diǎn)得到表達(dá)ATR-Fc融合蛋白的真核表達(dá)載體pcDNA3.1/ATR-Fc，并用脂質(zhì)體方法將該載體轉(zhuǎn)染至CHO-K1細(xì)胞中，用G418篩選并獲得ATR-Fc表達(dá)水平為10-15μg/(106cells·d)的基因工程CHO細(xì)胞系A(chǔ)TR-Fc-1D5。采用蛋白A純化重組蛋白，并用ELISA法鑒定ATR-Fc與PA的親和性，表明ATR-Fc可與PA特異性結(jié)合。
本發(fā)明還獲得了表達(dá)水平較高的表達(dá)ATR-Fc的基因工程CHO細(xì)胞系A(chǔ)TR-Fc-1D5(已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保存，登記入冊編號為CGMCCNo.1399，保存的細(xì)胞株名稱為ATR-Fc融合蛋白CHO工程細(xì)胞株，地址北京市海淀區(qū)中關(guān)村北一條13號，中國科學(xué)院微生物研究所，100080；電話010-62542758；傳真010-62537796；電子郵件cgmcc@sun.im.ac.cn)，該細(xì)胞系的表達(dá)水平約10-15μg/(106cells.d)，并且連續(xù)傳代培養(yǎng)1年，表達(dá)水平?jīng)]有變化。
本發(fā)明的炭疽毒素受體ATR-Fc融合蛋白用于制備治療炭疽感染的藥物的應(yīng)用。
ELISA證實(shí)ATR-Fc可既能夠與PA高親和力結(jié)合，又能特異性封閉PA與其細(xì)胞受體結(jié)合區(qū)域，并且在細(xì)胞保護(hù)實(shí)驗(yàn)中顯示，ATR-Fc可明顯抑制炭疽毒素對細(xì)胞的殺傷作用，該融合蛋白值得進(jìn)一步研究并開發(fā)成防治炭疽感染的抗體類藥物。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是這種融合蛋白可與抗原高親和力結(jié)合，相當(dāng)于抗體的Fab片段，而Fc段又提供了抗體的生物學(xué)活性，它有以下特點(diǎn)(1)無抗原性，兩段蛋白均來自人體；(2)親和力高，一般配體和受體的親和力都較高(Kd～10-10M)；(3)不用擔(dān)心病毒或菌株等抗原的突變，抗體只是針對抗原的一個表位，一旦該抗原的表位突變，抗體可能失去與抗原的親和力，而如果抗原突變導(dǎo)致抗原與受體不結(jié)合，則這種抗原(即病原體)便失去了致病能力，如果抗原的突變不會影響其與受體的結(jié)合，則受體-Fc融合蛋白同樣可以將抗原捕獲并清除；(4)也具有抗體的ADDC效應(yīng)和CDC效應(yīng)；(5)半衰期長，與人源抗體相近(10～20天左右)。
下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式
對本發(fā)明做進(jìn)一步說明，不以任何方式限制本發(fā)明的實(shí)施。凡是依照本發(fā)明公開的內(nèi)容進(jìn)行的任何本領(lǐng)域的等同替換，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。


圖1為18段寡核苷酸連接組裝成完整ATR基因的過程示意圖。
圖2為ATR基因的PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳分析圖。
圖3為ATR-Fc融合蛋白真核表達(dá)載體pcDNA3.1/ATR-Fc。
圖4為重組質(zhì)粒pcDNA3.1/ATR-Fc酶切鑒定圖譜。條帶1為Hind III/Not I雙酶切結(jié)果，條帶2為DNAMarker，條帶3為Hind III/BamH I雙酶切結(jié)果。
圖5為將編碼ATR-Fc融合蛋白的基因用Hind III和Not I雙酶切插入pcDNA3.1真核表達(dá)載體中全基因測序結(jié)果。
圖6單鏈ATR-Fc融合蛋白的基因序列和蛋白質(zhì)序列。
圖7為表達(dá)ATR-Fc融合蛋白的基因重組CHO細(xì)胞克隆ATR-Fe-1D5。
圖8為直接ELISA篩選表達(dá)ATR-Fc融合蛋白的陽性重組CHO細(xì)胞克隆。
圖9為表達(dá)產(chǎn)物ATR-Fc的SDS-PAGE分析。條帶1非還原SDS-PAGE；條帶2蛋白質(zhì)marker；條帶3，4還原SDS-PAGE。
圖10為ELISA定性檢測ATR-Fc與炭疽毒素保護(hù)抗原的親和性。(1)PA+mouseanti-PA MAb+HRP-labeled goat anti-mouse IgG Fc；(2)PA+ATR-Fc+HRP-labeled goatanti-human IgG Fc；(3)PA+Enbrel+HRP-labeled goat anti-human IgG Fc；(4)CHO-K1supernatant+HRP-labeled goat anti-human IgG Fc；(5)mouse anti-PA MAb+HRP-labeledgoat anti-mouse IgG Fc。
圖11為ATR-Fc保護(hù)小鼠巨噬細(xì)胞J774A.1細(xì)胞不受炭疽致死毒素的攻擊具體實(shí)施方式
以下實(shí)施例按照參照分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊進(jìn)行；涉及的材料及其來源如下大腸桿菌DH5α(道普公司)、pUC19質(zhì)粒(本室保存)、pcDNA3.1真核表達(dá)載體(Invitrogen公司)、源自基因組(含有內(nèi)含子)的編碼人免疫球蛋白IgG1 Fc段(鉸鏈區(qū)、CH2區(qū)和CH3區(qū))的基因(美國R&D Systems公司，載體名為pIG1，產(chǎn)品編號為pIg vectors，MBV-002-10)。
限制性內(nèi)切酶Nhe I、BamH I、Not I、Hind III等購自NEB公司，T4 DNA連接酶及高保真Taq酶Pyrobest購自寶生物工程有限公司。質(zhì)粒提取、PCR產(chǎn)物回收及酶切產(chǎn)物回收試劑盒均購自Promega公司。DNA Marker購白天為時代公司。
實(shí)施例1.ATR基因合成的設(shè)計Bradley等2001年發(fā)現(xiàn)的炭疽毒素受體ATR，實(shí)質(zhì)就是人腫瘤內(nèi)皮標(biāo)志物蛋白(tumor endothelial marker 8，TEM8)的胞外區(qū)(1-315氨基酸)，其中1-27位氨基酸為信號肽，而實(shí)驗(yàn)表明可溶性受體ATR41-227具有明顯的中和炭疽毒素PA的作用，因而本文合成的基因?yàn)榫幋aATR1-227的序列，將全長681bp ATR1-227基因分成18個片段，每個片段長約50-60堿基，相鄰片段重疊部分為20-22個堿基，具體的設(shè)計見表1。寡核苷酸片段的合成和基因序列的測定由上海博亞生物技術(shù)公司完成。
表1

實(shí)施例2.寡核苷酸片段的連接和組裝采用重疊延伸PCR技術(shù)，按如下方法將寡核苷酸片段連接成一完整ATR基因(見圖1)①將ATR基因片段1→2、3→4、5→6、7→8、9→10、11→12、13→14、15→16、17→18重疊延伸形成核苷酸片段(1-2)、(3-4)、(5-6)、(7-8)、(9-10)、(11-12)、(13-14)、(15-16)和(17-18)，PCR反應(yīng)體系為2μL dNTP(2.5mmol/L)、0.125μL Pyrobest聚合酶、2.5μL 10×Buffer、寡核苷酸片段2×5μL(5μmol/L)、純凈水10.375μL，總反應(yīng)體系為25μL。PCR反應(yīng)條件94℃，預(yù)變性2min→[94℃，30s→57℃，30s→72℃，50s]×20循環(huán)→72℃，5min→4℃，5min；②將步驟①得到的PCR產(chǎn)物按(1-2)→(3-4)、(5-6)→(7-8)、(11-12)→(13-14)、(15-16)→(17-18)連接，反應(yīng)體系為12.5μL(1-2)PCR產(chǎn)物+12.5μL(3-4)PCR產(chǎn)物，補(bǔ)加0.125μL Pyrobest聚合酶，余此類推，PCR反應(yīng)條件同步驟①；③將步驟②得到的PCR產(chǎn)物按(1-4)→(5-8)、(11-14)→(15-18)連接，反應(yīng)體系為12.5μL(1-4)PCR產(chǎn)物+12.5μL(5-8)PCR產(chǎn)物，補(bǔ)加0.125μL Pyrobest聚合酶，余此類推，PCR反應(yīng)條件同步驟①；④將步驟③得到的PCR產(chǎn)物(1-8)與(9-10)連接，反應(yīng)體系為12.5/μL(1-8)PCR產(chǎn)物+12.5μL(9-10)PCR產(chǎn)物，補(bǔ)加0.125μL Pyrobest聚合酶，PCR反應(yīng)條件同步驟①；⑤將步驟④得到的PCR產(chǎn)物(1-10)與(11-18)連接，反應(yīng)體系為12.5μL(1-10)PCR產(chǎn)物+12.5μL(11-18)PCR產(chǎn)物，補(bǔ)加0.125μL Pyrobest聚合酶，PCR反應(yīng)條件同步驟①。
得到ATR的全基因。用1.5％的瓊脂糖凝膠電泳分析最終的PCR產(chǎn)物，證實(shí)獲得的基因大小約700bp(圖2)，與預(yù)計的ATR基因大小一致。
實(shí)施例3.ATR cDNA的克隆用ATR上游引物(5’端)和下游引物(3’端)PCR擴(kuò)增1.4中得到的ATR全基因，PCR反應(yīng)體系為8μL dNTP(2.5mmol/L)、0.5μL Pyrobest聚合酶、10μL ATR(1-18)模板、10μL 10×Buffer、2μL ATR上游引物(10μmol/L)、2μL ATR下游引物(10μmol/L)、67.5μL水，總反應(yīng)體系為100μL，PCR反應(yīng)條件94℃，2min(預(yù)變性)→[94℃，30s→58℃，30s→72℃，1min]×25循環(huán)→72℃，5min→4℃，5min。用0.8％-1％低熔點(diǎn)瓊脂糖膠回收PCR產(chǎn)物(Promega，Agarose LMP)。
ATR上游引物5’-CTAAAGCTT ATGGCCACGGCGGAGCGGAG-3’，下劃線為Hind III酶切位點(diǎn)，方框中為Kozak序列；
ATR下游引物5’-CGCGGATCC TCAGCTGCTAGAATTTCGATGCAG-3’，下劃線為BamH I酶切位點(diǎn)，陰影斜體字為Fc段鉸鏈區(qū)前的剪切供體序列。
將回收的PCR擴(kuò)增的ATR基因經(jīng)Hind III和BamH I酶切后，用T4連接酶與用同樣限制性內(nèi)切酶酶切過的pUC19質(zhì)粒連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，涂布于含有X-gal和氨芐青霉素的平板上，培養(yǎng)過夜，挑取白色菌落接種培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，酶切鑒定，由上海博亞生物技術(shù)公司進(jìn)行序列測定，得到的序列與設(shè)計的基因序列完全一致。
實(shí)施例4.ATR-Fc融合蛋白真核表達(dá)載體pcDNA3.1/ATR-Fc的構(gòu)建將pIG1(R&D Systems公司，產(chǎn)品編號為MBV-002-10)載體和pcDNA3.1載體(美國Invitrogen公司)分別用BamH I和Not I雙酶切，經(jīng)低熔點(diǎn)膠電泳回收pIG1中大小約1500bp的Fc基因片段，在T4連接酶作用下將Fc和pcDNA3.1兩段DNA連接成pcDNA3.1/Fc載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑出的克隆經(jīng)搖瓶培養(yǎng)，提取質(zhì)粒行BamH I+Xho I雙酶切鑒定。將插入了Fc片段的含pcDNA3.1/Fc質(zhì)粒的菌株搖瓶培養(yǎng)提質(zhì)粒。
將測序正確的pUC19/ATR質(zhì)粒(含ATR1-227基因)用Hind III和BamH I雙酶切，經(jīng)低熔點(diǎn)膠電泳回收，同時將pcDNA3.1/Fc質(zhì)粒用Hind III和Bam H雙酶切經(jīng)試劑盒回收，在T4連接酶作用下將上述兩段DNA連接成pcDNA3.1/ATR-Fc表達(dá)載體(圖3)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑出的克隆經(jīng)搖瓶培養(yǎng)，提取質(zhì)粒行Hind III+BamH I和Hind III+Not I雙酶切鑒定。并進(jìn)行ATR-Fc基因全序列測定。測序正確的重組質(zhì)粒命名為pcDNA3.1/ATR-Fc。
結(jié)果表明(圖4)，用Hind III和BamH I雙酶切時，可見大小為700bp和包含F(xiàn)c段1500bp的pcDNA3.1載體(約6.9kb)的片段，分別與ATR基因和載體+Fc基因大小一致，而用Hind III+Not I雙酶切，可見大小為2.2kb和5.4kb的條帶，分別與ATR-Fc基因和pcDNA3.1載體的大小一致，表明目的基因ATR-Fc正確插入了pcDNA3.1真核表達(dá)載體中。
實(shí)施例5.ATR-Fc基因的全序列測定。
由于ATR-Fc基因長2.2kb，測定結(jié)果表明，插入pcDNA3.1載體Hind III和Not I位點(diǎn)之間的ATR-Fc基因與預(yù)期的完全一致(圖5)。在圖5中，第11-692堿基為編碼ATR1-227的基因片段，而第693-2193為編碼人免疫球蛋白IgG1的Fc段(Hinge區(qū)+CH2區(qū)+CH3區(qū))的基因。由于單鏈Fc為232個氨基酸殘基，編碼該段蛋白的基因大小應(yīng)為696bp，而在pcDNA3.1/ATR-Fc載體中，F(xiàn)c基因來自基因組，含有四個內(nèi)含子(陰影部分)，因此基因長度約為1500bp。連接ATR和Fc的酶切位點(diǎn)BamH I位于第一個內(nèi)含子內(nèi)部，會通過RNA的拼接作用而去除，不影響蛋白質(zhì)的翻譯。在BamH I前面有一段剪切供體序列“ ”，有利于在轉(zhuǎn)錄時ATR基因和Fc段基因在mRNA水平的正確拼接。
編碼完整的ATR-Fc融合蛋白單鏈分子的基因序列及單鏈ATR-Fc氨基酸序列如圖6所示。圖6中1-227aa(陰影部分)為ATR段，其中1-27aa為ATR的信號肽，228-459aa為Fc段，成熟的單鏈ATR-Fc(不含信號肽)分子應(yīng)由432個氨基酸殘基組成。根據(jù)N-糖基化位點(diǎn)氨基酸序列特征Asn-X-Ser/Thr，推測該蛋白ATR部分存在兩個可能的糖基化位點(diǎn)(見圖6)，而Fc部分在CH2區(qū)有一個糖基化位點(diǎn)，因此推測用CHO細(xì)胞表達(dá)的ATR-Fc融合蛋白，其單鏈的分子量應(yīng)在60-65kDa，而完整的ATR-Fc分子的分子量約120-130kDa。我們將構(gòu)建的pcDNA3.1/ATR-Fc表達(dá)載體轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞后，得到的目的蛋白與預(yù)測的一致。
實(shí)施例6.重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO-K1細(xì)胞及篩選陽性克隆轉(zhuǎn)染采用Invitrogen公司生產(chǎn)的LipofectamineTM2000陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒，按照試劑盒說明書操作。轉(zhuǎn)染的CHO-K1細(xì)胞培養(yǎng)于5％CO2、37℃溫箱。轉(zhuǎn)染12h后，換含10％加強(qiáng)型小牛血清(Hyclone)的DMEM/F12培養(yǎng)基(Hyclone)。48h后，采用750μg/mL G418(Sigma)篩選培養(yǎng)基加壓篩選，每2-3d換液一次，加壓約12d后，將抗性細(xì)胞克隆用0.25％的胰酶消化，用有限稀釋法在96孔微孔細(xì)胞培養(yǎng)板(NUNC公司)中進(jìn)行單克隆化培養(yǎng)，即用含10％小牛血清和300μg/mL G418的DMEM/F12培養(yǎng)基將細(xì)胞稀釋至10個/mL，在每個微孔中接種200μL培養(yǎng)基(平均每個孔中含有約2個細(xì)胞)，2周后出現(xiàn)細(xì)胞克隆。換無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)3d，收集培養(yǎng)上清以直接競爭ELISA挑選陽性克隆，即將無血清培養(yǎng)上清直接包被NUNCTM酶聯(lián)板4℃過夜，3％BSA封閉后加入HRP標(biāo)記山羊抗人IgG(H+L)，孵育后加入TMB試劑顯色，450nm測OD值。以無血清培養(yǎng)基為陰性對照。
真核表達(dá)載體pcDNA3.1/ATR-Fc用LipofectamineTM2000陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染CHO-K1細(xì)胞后，經(jīng)過12d G418的加壓篩選，出現(xiàn)分散的細(xì)胞抗性克隆。將抗性克隆消化下，培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞接種到96孔微孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，接種密度為2個細(xì)胞/孔，進(jìn)行單克隆培養(yǎng)。培養(yǎng)2周后出現(xiàn)由一個細(xì)胞擴(kuò)增形成的細(xì)胞集落(圖7)，一般一個微孔中形成單個細(xì)胞克隆的幾率為30％-50％。將單個細(xì)胞克隆的微孔換成無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)3d后，收集培養(yǎng)上清用直接ELISA篩選陽性克隆，表達(dá)水平較高的細(xì)胞克隆出現(xiàn)的幾率約為20％-30％(圖8)。
實(shí)施例7.rCHO工程細(xì)胞的擴(kuò)大培養(yǎng)選擇表達(dá)水平最高的基因重組CHO工程細(xì)胞系A(chǔ)TR-Fc-1D5于1000mL轉(zhuǎn)瓶中用含2％小牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)，待細(xì)胞長滿瓶壁時，換為無血清培養(yǎng)基，隔天收液，可連續(xù)收液3-4次。
選擇表達(dá)水平較高的單克隆細(xì)胞系A(chǔ)TR-Fc-1D5用1000mL轉(zhuǎn)瓶擴(kuò)大培養(yǎng)，每2d收集無血清培養(yǎng)上清。收集的上清用蛋白A親和層析柱(Pharmacia)分離純化，用pH2.5的甘氨酸-HCl緩沖液洗脫，有一明顯的洗脫峰，收集做SDS-PAGE和ELISA分析。1000mL的上清經(jīng)純化后可以得到蛋白濃度約0.9mg/mL的收集液30mL，即該細(xì)胞在轉(zhuǎn)瓶中的表達(dá)水平約27mg/L，細(xì)胞的表達(dá)水平約10-15μg/(106cells·d)。
實(shí)施例8.表達(dá)蛋白的純化及SDS-PAGE分析利用蛋白A對IgG的特異性吸附作用，采用nProtein A Sepharose 4 Fast Flow分離介質(zhì)(Amersham Biosciences)進(jìn)行親和層析，純化表達(dá)蛋白。操作方法參見產(chǎn)品說明。結(jié)合的蛋白用pH2.5、0.1mol/L甘氨酸-HCl緩沖液洗脫，并用2mol/L的Tris-HCl緩沖液將洗脫液pH調(diào)至7。純化后，以紫外分光光度計測定A260和A280吸光度推算蛋白濃度，蛋白定量公式為蛋白含量(mg/mL)＝1.45×A260-0.74×A280。以SDS-PAGE測定蛋白的純度、分子量。
如果ATR-Fc融合蛋白能夠在CHO細(xì)胞中正確表達(dá)，表達(dá)的蛋白預(yù)計應(yīng)是同源二聚體抗體樣分子，即ATR-Fc單鏈在Hinge區(qū)通過鏈間二硫鍵連接成二聚體。單鏈ATR-Fc分子共有227aa+232aa＝459個氨基酸殘基，其中前27個氨基酸為ATR的信號肽，胞外分泌到細(xì)胞培養(yǎng)上清中時被切除，所以實(shí)際的單鏈ATR-Fc有432aa，二聚體為864aa。由于ATR和Fc段都有糖基化位點(diǎn)，因此單鏈ATR-Fc的分子量預(yù)期在60-65kD。親和層析純化得到的ATR-Fc融合蛋白，分別在還原和非還原條件下進(jìn)行SDS-PAGE分析，考馬斯亮藍(lán)染色。在非還原條件下，在120-130kD處有一條蛋白帶，而在還原條件下，在60-65kD處有一條明顯的蛋白帶，并且沒有其他的蛋白帶(圖9)。由于還原條件下所有二硫鍵包括鏈間二硫鍵都被打斷，測得的分子量為單鏈ATR-Fc分子，而非還原條件下不同肽鏈仍通過二硫鍵連接，在非還原條件下的分子量正好是還原條件下分子量的兩倍，表明我們獲得的ATR-Fc融合蛋白為同源二聚體抗體樣分子，與預(yù)期的結(jié)果相符。
實(shí)施例9.ELISA定性檢測產(chǎn)物與炭疽毒素保護(hù)抗原(PA)的特異性結(jié)合以基因重組PA(自制)包被NUNCTM酶聯(lián)板，3％BSA封閉后加入ATR-Fc融合蛋白，孵育后充分洗滌，再加入HRP標(biāo)記山羊抗人IgG(H+L)酶標(biāo)多抗，孵育后加入TMB試劑顯色，450nm測OD值。以anti-PA鼠源單克隆抗體(自制)為陽性對照，HRP酶標(biāo)二抗為山羊抗小鼠IgG Fc多抗，以基因重組腫瘤壞死因子受體(TNFαR)-Fc和人IgG1的Fc段連接而成的TNFαR-Fc融合蛋白(Enbrel，自制，文章待發(fā)表)作為對照。在未包被PA的微孔中直接包被未轉(zhuǎn)染的CHO-K1細(xì)胞培養(yǎng)上清為陰性對照，同時，還直接包被anti-PA鼠源單克隆抗體為陽性對照。
用ELISA方法初步確定了表達(dá)的ATR-Fc與炭疽毒素保護(hù)抗原PA具有特異性結(jié)合的能力(圖10)。該蛋白與PA的結(jié)合能力，與anti-PA單克隆抗體相似，表明與人IgG Fc融合后，不僅不影響ATR與其配體PA的結(jié)合，甚至ATR-Fc與PA結(jié)合的親和力比可溶性受體sATR與PA的親和力還高1個數(shù)量級，這個結(jié)果與其他受體-Fc融合蛋白相似，例如TNFαR-Fc融合蛋白(Enbrel)與TNFc的親和力比sTNFαR高50-1000倍，更高的親和力更有利于結(jié)合和中和炭疽毒素。非常有趣和令人意外的是，本來作為陰性對照的重組TNFαR-Fc融合蛋白，ELISA結(jié)果卻表明該融合蛋白與PA有中等強(qiáng)度的結(jié)合能力(圖10)。我們正在測定Enbrel與PA的親和力，以及驗(yàn)正Enbrel在炭疽毒素PA+LF細(xì)胞致死實(shí)驗(yàn)中能否起到中和毒素和保護(hù)細(xì)胞的作用。如果證明TNFαR-Fc融合蛋白可與PA結(jié)合，那么可以斷定TNFαR是炭疽毒素PA的第三種細(xì)胞受體，并且Enbrel可能在防治炭疽感染中有一定的作用。
實(shí)施例10.ATR-Fc融合蛋白在炭疽致死毒素殺傷小鼠巨噬細(xì)胞J774A.1實(shí)驗(yàn)中保護(hù)細(xì)胞的作用在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(NUNC公司)中預(yù)先用100μl含10％胎牛血清(Hyclone公司)的MEM培養(yǎng)基(Hyelone公司)培養(yǎng)J774A.11小鼠巨噬細(xì)胞(ATCC No.TIB-67)，細(xì)胞密度為1×105cells/孔，基因重組炭疽毒素保護(hù)抗原(PA)100ng/ml(來源軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所，參見文獻(xiàn)Xu J(許俊杰)，Dong D(董單)，Chen W(陳薇)，et al.Expression，purification and characterization of the recombinant anthrax protectiveantigen.Chin.J.Biotechnol.2004，20(5)，652-655)和基因重組炭疽毒素致死因子(LF)100ng/ml(來源軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所，參見文獻(xiàn)Guo Q，Xu J，Dong D，F(xiàn)u L，Chen W.Expression and characterization of the recombinant anthrax lethal factor.Acta.Microbiol.Sinica.2004，44(6)，749-751)與溶解于含10％胎牛血清(Hyclone公司)MEM培養(yǎng)基(Hyclone公司)中不同濃度的基因重組ATR-Fc融合蛋白在37℃條件下孵育30分鐘，取100μl上述溶液加到有J774A.11小鼠巨噬細(xì)胞生長的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，在37℃條件下孵育3小時，棄去培養(yǎng)上清，每孔加入100μl含0.5mg/ml MTT(Sigma公司)的pH7.0的磷酸緩沖液，在37℃條件下孵育30分鐘，之后棄去上清，每孔加入100μl酸化異丙醇溶液(0.5％SDS(w/v)，25mM HCl溶于90％的異丙醇中)。在振蕩器上振蕩搖勻，用酶聯(lián)儀(BioRad公司)在570nm波長下測定OD值。觀察每個孔中活細(xì)胞比率。實(shí)驗(yàn)表明(圖11)ATR-Fc濃度在37.5μg/ml的濃度下便可以充分保護(hù)J774A.1細(xì)胞免受炭疽致死毒素的致命攻擊，說明ATR-Fc可以用于預(yù)防和治療炭疽感染。
序列表<110>中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所<120>炭疽毒素受體ATR-Fc融合蛋白<130>
<160>2<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>459<212>PRT<213>人工合成<400>1Met Ala Thr Ala Glu Arg Arg Ala Leu Gly Ile Gly Phe Gln Trp Leu1 5 10 15Ser Leu Ala Thr Leu Val Leu Ile Cys Ala Gly Gln Gly Gly Arg Arg20 25 30Glu Asp Gly Gly Pro Ala Cys Tyr Gly Gly Phe Asp Leu Tyr Phe Ile
35 40 45Leu Asp Lys Ser Gly Ser Val Leu His His Trp Asn Glu Ile Tyr Tyr50 55 60Phe Val Glu Gln Leu Ala His Lys Phe Ile Ser Pro Gln Leu Arg Met65 70 75 80Ser Phe Ile Val Phe Ser Thr Arg Gly Thr Thr Leu Met Lys Leu Thr85 90 95Glu Asp Arg Glu Gln Ile Arg Gln Gly Leu Glu Glu Leu Gln Lys Val100 105 110Leu Pro Gly Gly Asp Thr Tyr Met His Glu Gly Phe Glu Arg Ala Ser115 120 125Glu Gln Ile Tyr Tyr Glu Asn Arg Gln Gly Tyr Arg Thr Ala Ser Val130 135 140Ile Ile Ala Leu Thr Asp Gly Glu Leu His Glu Asp Leu Phe Phe Tyr145 150 155 160Ser Glu Arg Glu Ala Asn Arg Ser Arg Asp Leu Gly Ala Ile Val Tyr165 170 175Cys Val Gly Val Lys Asp Phe Asn Glu Thr Gln Leu Ala Arg Ile Ala180 185 190Asp Ser Lys Asp His Val Phe Pro Val Asn Asp Gly Phe Gln Ala Leu195 200 205
Gln Gly Ile Ile His Ser Ile Leu Lys Lys Ser Cys Ile Glu Ile Leu210 215 220Ala Ala Glu Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro225 230 235 240Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro245 250 255Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr260 265 270Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn275 280 285Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg290 295 300Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val305 310 315 320Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser325 330 335Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys340 345 350Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp355 360 365
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe370 375 380Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu385 390 395 400Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe405 410 415Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly420 425 430Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr435 440 445Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys450 455<210>2<211>1380<212>DNA<213>人工合成<400>2atggccacgg cggagcggag agccctcggc atcggcttcc agtggctctc tttggccact 60ctggtgctca tctgcgccgg gcaaggggga cgcagggagg atgggggtcc agcctgctac120ggcggatttg acctgtactt cattttggac aaatcaggaa gtgtgctgca ccactggaat180
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權(quán)利要求
1.一種炭疽毒素受體ATR-Fc融合蛋白，是炭疽毒素PA的受體(ATR)與人Fc的二聚體融合蛋白，單鏈ATR-Fc分子具有序列表SEQ ID No.1所示的氨基酸序列，共459個氨基酸殘基；其中前27個氨基酸為ATR的信號肽；成熟的單鏈ATR-Fc有432個氨基酸殘基，二聚體為864個氨基酸殘基。
2.編碼炭疽毒素受體ATR-Fc融合蛋白單鏈的基因，具有序列表SEQ ID No.2所示的堿基序列。
3.權(quán)利要求1所述的炭疽毒素受體ATR-Fc融合蛋白用于制備治療炭疽病毒感染的藥物的應(yīng)用。
4.含有權(quán)利要求2所述的編碼炭疽毒素受體ATR-Fc融合蛋白的基因的表達(dá)載體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的表達(dá)載體，其特征在于該載體為真核表達(dá)載體。
6.含有權(quán)利要求4或5所述的表達(dá)載體的細(xì)胞系。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的細(xì)胞系，其特征在于，所述細(xì)胞為CHO細(xì)胞。
8.權(quán)利要求7所述的細(xì)胞系用于制備治療炭疽病毒感染的藥物的應(yīng)用。
9.表達(dá)ATR-Fc融合蛋白的基因工程CHO細(xì)胞株ATR-Fc-1D5，編號為CGMCCNo.1399。
10.權(quán)利要求9所述的表達(dá)ATR-Fc融合蛋白的基因工程CHO細(xì)胞株用于制備治療炭疽病毒感染的藥物的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種炭疽毒素受體ATR－Fc融合蛋白，是炭疽毒素PA的受體(ATR)與人Fc的二聚體融合蛋白，單鏈ATR－Fc分子具有序列表SEQ ID No.1所示的氨基酸序列，共459個氨基酸殘基；其中前27個氨基酸為ATR的信號肽。ATR－Fc融合蛋白可用于制備治療炭疽病毒感染的藥物。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于這種融合蛋白可與抗原高親和力結(jié)合，相當(dāng)于抗體的Fab片段，而Fc段又提供了抗體的生物學(xué)活性，它有以下特點(diǎn)(1)無抗原性，兩段蛋白均來自人體；(2)親和力高；(3)不用擔(dān)心病毒或菌株等抗原的突變；(4)也具有抗體的ADDC效應(yīng)和CDC效應(yīng)；(5)半衰期長，與人源抗體相近(10～20天左右)。
文檔編號A61K39/395GK1724570SQ20051008423
公開日2006年1月25日 申請日期2005年7月18日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月18日
發(fā)明者胡顯文, 高麗華, 陳惠鵬, 師明磊, 陳薇, 許俊杰 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所