專(zhuān)利名稱(chēng)：免疫隔離化細(xì)胞藥物,其制備方法和其在殺傷腫瘤中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新穎的免疫隔離化細(xì)胞藥物，其制備方法和其在殺傷和/或抑制腫瘤中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
目前采用三大手段(手術(shù)切除、化療、放療)治療惡性腫瘤的治愈率很低。手術(shù)只能切除肉眼所辨別的腫瘤組織；放療或化療僅能殺滅部分的腫瘤細(xì)胞，殘存瘤細(xì)胞成為腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的根源；同時(shí)，放療和化療存在毒副作用大、全身使用的藥物進(jìn)入腫瘤區(qū)甚少及易產(chǎn)生耐藥等缺點(diǎn)。惡性腫瘤的治療仍是一世界性難題。
一些蛋白質(zhì)因子可抑制腫瘤組織的生長(zhǎng)，但臨床難以應(yīng)用。
研究已顯示一些蛋白質(zhì)等因子可殺死腫瘤細(xì)胞和/或抑制腫瘤組織生長(zhǎng)，如腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)、血管抑素(Angiostatin，AST)、內(nèi)皮抑素(Endostatin，EST)等。
由于腫瘤組織的快速生長(zhǎng)是與腫瘤血管的快速生長(zhǎng)相關(guān)，阻斷新血管的生成就可有效地抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。實(shí)驗(yàn)證明在腫瘤局部注射大劑量的TNF，證明能直接殺死多種腫瘤細(xì)胞或抑制腫瘤增殖，無(wú)嚴(yán)重的毒副作用。將AST、EST等因子注射于腫瘤內(nèi)部或連續(xù)靜脈注射，可選擇性地抑制腫瘤組織內(nèi)毛細(xì)血管的生長(zhǎng)，從而可減少腫瘤細(xì)胞的血液及營(yíng)養(yǎng)物的供應(yīng)，而對(duì)正常血管和細(xì)胞無(wú)抑制作用，具有明確的抑制動(dòng)物實(shí)體瘤生長(zhǎng)的作用，如肝癌、肺癌、腦膠質(zhì)瘤等。該類(lèi)因子的抗癌效果具有廣譜性、低毒性及不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn)。這些腫瘤抑制因子(TIF)和裸DNA半衰期短、易在體內(nèi)降解，必須反復(fù)多次地大量的注射入腫瘤局部，臨床使用困難，特別是對(duì)深部腫瘤。而全身使用TIF的毒副作用很大，如低血壓等；同時(shí)，全身用藥在腫瘤局部的藥物濃度很低，治療效果差；并且全身使用TIF的價(jià)格極昂貴。使得TIF難以在臨床中應(yīng)用于治療腫瘤。
將分泌抑瘤和/或殺瘤因子的細(xì)胞植入瘤體內(nèi)，具有較好的治療腫瘤效果，但存在免疫反應(yīng)和過(guò)度生長(zhǎng)成瘤的難題。
雖然有研究將TNF或EST基因直接導(dǎo)入腫瘤動(dòng)物體內(nèi)或瘤細(xì)胞中，產(chǎn)生了一定的抑瘤效應(yīng)。然而，這種基因治療方法除了存在注射后易于引起炎癥和免疫反應(yīng)的問(wèn)題，還存在著目的基因表達(dá)不穩(wěn)定、轉(zhuǎn)染效率低、病毒載體具有潛在地危險(xiǎn)性等目前難以解決的問(wèn)題。
國(guó)外有研究嘗試將單一種類(lèi)的EST或者AST基因轉(zhuǎn)染入具有高增殖活性的載體細(xì)胞內(nèi)，并將分泌EST或者AST的基因工程細(xì)胞植入模型動(dòng)物的瘤體內(nèi)，可觀(guān)察到腫瘤區(qū)血管生成減少，產(chǎn)生了一定地抑制腫瘤生長(zhǎng)的效果。但這種抑制腫瘤生長(zhǎng)的效果并不理想，尚達(dá)不到殺死腫瘤細(xì)胞及治療腫瘤的目的。分析其原因可能為(1)由于異基因的載體細(xì)胞植入不可避免地會(huì)引起宿主體產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)，導(dǎo)致載體細(xì)胞死亡；(2)高增殖活性的基因載體細(xì)胞會(huì)在宿主體內(nèi)過(guò)度的生長(zhǎng)，存在載體細(xì)胞產(chǎn)生新的腫瘤的危險(xiǎn)；(3)植入的基因工程細(xì)胞僅能分泌單一種類(lèi)的抑瘤或殺瘤因子，不足以殺死腫瘤細(xì)胞。
免疫隔離膜包裹細(xì)胞可防止移植免疫排斥反應(yīng)近年發(fā)展起來(lái)的免疫隔離技術(shù)是用能截割＞16萬(wàn)道爾頓分子的半透膜包裹細(xì)胞，植入宿主體內(nèi)后，該膜在允許小分子的營(yíng)養(yǎng)物和分泌物自由擴(kuò)散的情況下，能截割＞16萬(wàn)道爾頓的免疫活性物質(zhì)(免疫球蛋白、免疫活性細(xì)胞等)，從而發(fā)揮防止免疫排斥反應(yīng)和維持膜內(nèi)細(xì)胞生存的效應(yīng)。目前的免疫隔離膜可由多種材料構(gòu)成，并有多種形式，如中空纖維管、大包囊、微囊、灌流小室等。國(guó)內(nèi)、外均有研究已證明采用免疫隔離膜包裹異基因細(xì)胞，植入體內(nèi)后可有效地防止免疫排斥反應(yīng)的發(fā)生，同時(shí)可維持囊內(nèi)細(xì)胞的生存和分泌。實(shí)驗(yàn)顯示出海藻酸鈣-聚賴(lài)氨酸-海藻酸鈣構(gòu)成的球型半透膜(APA微囊)具有較好的生物相容性，在小、大動(dòng)物體內(nèi)可較長(zhǎng)時(shí)間(約4年)完好存在。在胰島、肝細(xì)胞、甲狀旁腺、腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞和基因重組人生長(zhǎng)激素分泌細(xì)胞移植治療疾病模型動(dòng)物的研究中，已證明具有保護(hù)異種移植物免受宿主免疫系統(tǒng)破壞的作用。但是，迄今為止，國(guó)內(nèi)外尚未發(fā)現(xiàn)采用APA微囊包裹兩種以上抑瘤和/或殺瘤因子分泌細(xì)胞植入瘤體內(nèi)用于治療腫瘤的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一類(lèi)新的用于殺傷和/或抑制腫瘤的免疫隔離化細(xì)胞藥物，其包括可分泌抑制腫瘤生長(zhǎng)因子和/或腫瘤殺傷因子的活細(xì)胞和免疫隔離膜的包裹，尤其是APA微囊化抑瘤和/或殺瘤細(xì)胞。
本發(fā)明另一目的是提供殺傷和/或抑制腫瘤的方法，其包括將免疫隔離化抑瘤和/或殺瘤因子分泌細(xì)胞直接植入腫瘤組織內(nèi)或手術(shù)切除后殘余的腫瘤組織內(nèi)。
本發(fā)明進(jìn)一步目的是提供用于殺傷和/或抑制腫瘤的免疫隔離化細(xì)胞藥物的制備方法，其步驟如下(1)將抑瘤細(xì)胞和/或殺瘤細(xì)胞與一種濃度為10-20g/L的藻酸鈉溶液混合，制成懸浮液，使每升懸浮液中含0.01-1×1010個(gè)細(xì)胞；(2)利用噴霧裝置將步驟(1)獲得的懸浮液以100-1000μm直徑的微滴狀態(tài)分散于一種濃度為80-120mmol/L的氯化鈣或乳酸鈣溶液中，放置5-20分鐘，待沉淀完全后，除去上清液，獲得含抑瘤和/或殺瘤細(xì)胞的藻酸鈣微珠沉淀；(3)將步驟(2)獲得的沉淀物加入到一種濃度為0.1-1.0g/L的聚賴(lài)氨酸溶液中，混合均勻，放置5-20分鐘，待沉淀完全后除去上清液，獲得沉淀物；(4)將步驟(3)獲得的沉淀物加入到一種濃度為1.0-2.0g/L的藻酸鈉溶液中，混合均勻，放置3-15分鐘，待沉淀完全后除去上清液，獲得沉淀物；(5)將步驟(4)獲得的沉淀物加入到一種濃度為10-100mmol/L的檸檬酸鈉溶液中，混合均勻，放置5-20分鐘，待沉淀完全后除去上清液，獲得APA微囊化抑和/或殺瘤細(xì)胞沉淀物；(6)將步驟(5)獲得的沉淀物加入到一種濃度為9g/L的氯化鈉溶液清洗，最后將沉淀物轉(zhuǎn)移入細(xì)胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)并作為治療腫瘤的APA微囊化抑瘤和/或殺瘤細(xì)胞(APA-TIF細(xì)胞微囊)藥物保存。
本發(fā)明另一目的是提供可分泌抑制腫瘤生長(zhǎng)因子和/或腫瘤殺傷因子的活細(xì)胞和免疫隔離膜的包裹在制備用于殺傷和/或抑制腫瘤的免疫隔離化細(xì)胞藥物中用途。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明所述抑制腫瘤生長(zhǎng)因子和/或腫瘤殺傷因子分泌細(xì)胞至少使用兩種。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明所述腫瘤包括實(shí)體瘤或非實(shí)體瘤、良性或惡性腫瘤。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明中抑瘤細(xì)胞或殺瘤細(xì)胞可來(lái)自基因工程細(xì)胞或哺乳動(dòng)物如人、猴、牛、羊、豬或鼠的分泌細(xì)胞，優(yōu)選基因工程細(xì)胞。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明中抑瘤細(xì)胞或殺瘤細(xì)胞為可分泌抑瘤和/或殺瘤因子的基因工程細(xì)胞。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的抑瘤細(xì)胞和/或殺瘤細(xì)胞是以免疫隔離化形式使用的，優(yōu)選APA微囊化的抑瘤細(xì)胞和/或殺瘤細(xì)胞。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的APA微囊(免疫隔離膜)可截割大于15萬(wàn)道爾頓分子、允許小于10萬(wàn)道爾頓分子通過(guò)，并符合體內(nèi)植入要求的強(qiáng)度和生物相容度等性質(zhì)。
根據(jù)本發(fā)明的APA-TIF細(xì)胞微囊藥物，在其步驟(2)中優(yōu)選是將步驟(1)獲得的懸浮液以100-500μm直徑的微滴狀態(tài)分散。
在使用時(shí)，只要將本發(fā)明APA-TIF細(xì)胞微囊注入患者的腫瘤組織內(nèi)或腫瘤切除后的腔內(nèi)，即可在24小時(shí)內(nèi)開(kāi)始產(chǎn)生抑制或殺傷腫瘤細(xì)胞的作用，而且一次注射可以維持治療作用6個(gè)月以上。
進(jìn)一步講，在本發(fā)明中所述的TI F細(xì)胞是指在載體細(xì)胞中轉(zhuǎn)染了分泌抑制和/或殺傷腫瘤因子基因的工程細(xì)胞，它可分泌抑制和/或殺傷腫瘤的因子(包括腫瘤壞死因子、腫瘤血管生長(zhǎng)抑制因子等)物質(zhì)。
TIF細(xì)胞的獲得可用本領(lǐng)域已知的基因轉(zhuǎn)染方法進(jìn)行。例如，可以使用腺病毒等將目的基因轉(zhuǎn)染入載體細(xì)胞，使其可持續(xù)地分泌TIF。將TIF細(xì)胞在體外培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)增殖。
載體細(xì)胞可為各種具有增殖活性的細(xì)胞，優(yōu)選人胚胎細(xì)胞系。
在本發(fā)明的APA-TIF細(xì)胞微囊藥物的制備中，步驟(1)所獲得的懸浮液中每升含有0.01-1×1010個(gè)細(xì)胞，也可以根據(jù)載體細(xì)胞的生長(zhǎng)特性來(lái)掌握。例如，高增殖活性的載體細(xì)胞可降低細(xì)胞密度，而低增殖活性的載體細(xì)胞可升高細(xì)胞密度。余此類(lèi)推。
在步驟(2)中形成藻酸鈣微珠呈密網(wǎng)格狀，其中含有許多TIF細(xì)胞。步驟(3)的作用是為了在藻酸鈣微珠表面形成能截割大分子的半透膜。步驟(4)的作用是為了步驟(3)產(chǎn)物表面形成生物相容的膜，獲得含TIF細(xì)胞的APA微球。在步驟(5)中，檸檬酸鈉的鈉離子將藻酸鈣微珠中的鈣離子置換之后，便使APA微球中芯液化，形成了中芯為稀網(wǎng)格狀孔隙的APA微囊，其中含有許多TIF細(xì)胞。
對(duì)藻酸鈣微珠的形成方法沒(méi)有特殊限定，只要是能將含有TIF細(xì)胞的藻酸鈉懸浮液以足夠微小的液滴分散于鈣溶液中既可。該藻酸鈉懸浮液微滴的直徑通常應(yīng)在100-1000μm的范圍內(nèi)，優(yōu)選在180-500μm的范圍內(nèi)。如果微滴直徑在1000μm以上，則最后獲得的微囊過(guò)大，在注射入人或動(dòng)物的機(jī)體時(shí)容易引起破裂，因此不好。通常使用的液滴分散方法有針頭注射法、噴霧法等，優(yōu)選是靜電微囊發(fā)生器之噴霧法。
上面對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行了較詳細(xì)的解釋?zhuān)绢I(lǐng)域的技術(shù)人員在閱讀了上文及下文所附的實(shí)施例之后將能很容易地理解本發(fā)明。
與本領(lǐng)域的現(xiàn)有同類(lèi)技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的積極效果通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，使用本發(fā)明的APA-TIF細(xì)胞微囊可以持續(xù)地分泌抑制和/或殺傷腫瘤的因子(TIF)，作用于患者的腫瘤組織細(xì)胞。植入的TIF細(xì)胞發(fā)揮“微型生物泵”的持續(xù)、小量分泌效應(yīng)，在一段較長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)，通過(guò)其分泌的TIF，達(dá)到抑制和/或殺傷腫瘤組織細(xì)胞的作用，從而達(dá)到治療腫瘤的目的。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有下列特點(diǎn)1、靜脈等方法全身使用TIF，腫瘤組織內(nèi)藥物濃度低，治療效果差；同時(shí)，藥物對(duì)全身的毒副作用大。而本發(fā)明將TIF細(xì)胞植入腫瘤組織內(nèi)，其分泌的腫瘤抑制和/或殺傷因子主要濃集并作用于腫瘤組織局部，治療效果好、對(duì)全身的毒副作用??；
2、直接使用TIF蛋白因子，必須反復(fù)多次地長(zhǎng)時(shí)間地注射于腫瘤組織內(nèi)，才能達(dá)到治療腫瘤的目的。本發(fā)明采用分泌腫瘤抑制和/或殺傷因子的基因工程細(xì)胞系(TIF細(xì)胞)植入腫瘤組織，通過(guò)其持續(xù)分泌TIF的微型生物泵作用，發(fā)揮抑制腫瘤組織生長(zhǎng)的效應(yīng)。它可解決臨床難以實(shí)施向腫瘤組織內(nèi)反復(fù)注射TIF蛋白因子的問(wèn)題；3、本發(fā)明采用同時(shí)植入多種分泌腫瘤抑制和/或殺傷因子的基因工程細(xì)胞的方法，所分泌的多種TIF，可通過(guò)殺傷腫瘤細(xì)胞、抑制腫瘤血管組織生長(zhǎng)等多種機(jī)制，更好地發(fā)揮治療腫瘤的作用；4、本發(fā)明以APA微囊包裹TIF細(xì)胞，一方面可防止免疫反應(yīng)發(fā)生，另一方面可限制高增殖活性載體細(xì)胞的過(guò)度生長(zhǎng)。大量實(shí)驗(yàn)已證實(shí)，本發(fā)明的APA微囊具有很好的免疫保護(hù)作用；5、按本發(fā)明制作的APA微囊體積小(直徑100-500um)，因而至少具有4個(gè)優(yōu)點(diǎn)，即(1)利于營(yíng)養(yǎng)物和代謝物的擴(kuò)散，使囊內(nèi)細(xì)胞易于較長(zhǎng)期的存活；(2)微囊的機(jī)械強(qiáng)度高；(3)僅需以簡(jiǎn)單的注射方法即可將微囊注入腫瘤組織內(nèi)，不需特殊的手術(shù)操作植入；(4)微囊對(duì)腫瘤周?chē)M織的損傷壓迫作用?。?、按本發(fā)明制作的APA微囊強(qiáng)度高、囊球形度高、表面光潔度高，因而其組織相容性好，更適合于體內(nèi)植入的要求，不易在宿主體內(nèi)破裂，不易被宿主的炎性細(xì)胞包裹而堵塞微囊膜孔；7、與其它材料的免疫隔離膜相比，APA微囊具有良好的生物相容性；8、APA-TIF細(xì)胞微囊在宿主腫瘤組織內(nèi)可持續(xù)地(6個(gè)月以上)分泌腫瘤抑制和/或殺傷因子，產(chǎn)生持續(xù)的抑制和/或殺傷腫瘤組織細(xì)胞的治療作用。為解決腫瘤復(fù)發(fā)等難題提供新的方法；
9、與采用人體自然殺傷細(xì)胞或因子相比，TIF基因工程細(xì)胞可大批量獲得；10、可采用低溫技術(shù)保存APA-TIF細(xì)胞微囊，便于長(zhǎng)距離運(yùn)輸和批量供應(yīng)。
具體實(shí)施例方式
下面舉出實(shí)施例和實(shí)驗(yàn)例來(lái)進(jìn)一步解釋本發(fā)明，但本發(fā)明不受這些具體例的限定。
實(shí)施例1rEST/293基因工程細(xì)胞系的建立1、將人血管內(nèi)皮抑素(rEST)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入人胚胎腎293細(xì)胞，以獲得穩(wěn)定分泌人血管內(nèi)皮抑素的工程細(xì)胞(rEST/293)2、用臺(tái)盤(pán)蘭染色法檢測(cè)rEST/293細(xì)胞的存活率；3、用RT-PCR擴(kuò)增法從mRNA水平檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)皮抑素的表達(dá)；4、從蛋白水平檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)皮抑素的表達(dá)用SDS-PAGD檢測(cè)rEST的特異性；用Western Blot法證實(shí)rEST/293細(xì)胞表達(dá)分泌型蛋白中含有重組rEST，并具有抗原活性；5、用ELISA法檢測(cè)細(xì)胞分泌的rEST量。
6、轉(zhuǎn)染細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)物內(nèi)皮抑素的體外生物學(xué)活性鑒定通過(guò)血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制實(shí)驗(yàn)、雞胚絨毛膜尿囊膜實(shí)驗(yàn)，證實(shí)rEST/293細(xì)胞可抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞再生。
實(shí)施例2TNF/293基因工程細(xì)胞系的建立1、將腫瘤壞死因子α(TNFα)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入人胚胎腎293細(xì)胞，以獲得穩(wěn)定分泌人血管內(nèi)皮抑素的工程細(xì)胞(TNFα/293)；2、用臺(tái)盤(pán)蘭染色法檢測(cè)TNFα/293細(xì)胞的存活率；3、用RT-PCR擴(kuò)增法從mRNA水平檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞TNFα的表達(dá)；4、用Western Blot法從蛋白水平檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞TNFα的表達(dá)；5、用ELISA法檢測(cè)細(xì)胞分泌的TNFα量。
6、用MTT比色法測(cè)定TNFα對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷活性。
應(yīng)予說(shuō)明，實(shí)施例1、2的方法屬于常規(guī)技術(shù)，它對(duì)本發(fā)明不起任何限定作用。
實(shí)施例3APA-TIF細(xì)胞微囊藥物的制備1、使用按實(shí)施例1、2的方法獲得的TIF細(xì)胞(rEST/293細(xì)胞、TNFα/293細(xì)胞混合物)沉淀物，用生理鹽水洗滌。
2、向其中加入1ml濃度為15g/L的海藻酸鈉溶液，其制成懸浮液。
3、用靜電微囊發(fā)生器(electrostatic droplet generator)將懸浮液噴入到100ml濃度為100mmol/L的氯化鈣溶液中，獲得一種直徑在100-500μm范圍內(nèi)的含細(xì)胞的藻酸鈣珠沉淀，待沉淀完全后除去上清液。
4、將海藻酸鈣珠加入到50ml濃度為0.5g/L的聚賴(lài)氨酸溶液中，混合均勻，在室溫下放置5-10分鐘，待沉淀完全后除去上清液。
5、將步驟4獲得的沉淀物加入到60ml濃度為1.5g/L的藻酸鈉溶液中，混合均勻，在室溫下放置5-10分鐘，待沉淀完全后除去上清液。
6、將步驟5獲得的沉淀物加入到60ml濃度為55mmol/L的檸檬酸鈉溶液中，在室溫下放置5-10分鐘，待沉淀完全后除去上清液，獲得APA-TIF細(xì)胞微囊沉淀物。
7、用濃度為9g/L的氯化鈉溶液洗滌沉淀物，然后將此沉淀物轉(zhuǎn)移入DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)，作為注射用APA-TIF細(xì)胞微囊藥物待用。
實(shí)驗(yàn)例1APA-TIF細(xì)胞微囊對(duì)C6腦膠質(zhì)瘤大鼠的治療作用實(shí)驗(yàn)材料與方法1、在裸鼠上建立C6腦膠質(zhì)瘤鼠模型；2、將APA-rEST-TNFα/293細(xì)胞微囊植入C6腦膠質(zhì)瘤模型鼠的瘤體內(nèi)；3、21天后將小鼠處死，行組織病理學(xué)檢查。與對(duì)照組C6腦膠質(zhì)瘤模型鼠比較，APA-rEST-TNFα/293細(xì)胞微囊植入組C6腦膠質(zhì)瘤體內(nèi)新生血管數(shù)量明顯減少、死亡細(xì)胞數(shù)量明顯增多。
組別 血管分?jǐn)?shù)凋亡指數(shù)(％)APA-rEST-TNFα/293細(xì)胞微囊組 6.33±5.20* 11.2±0.5*空囊對(duì)照組 38.21±5.91 3.8±2.5實(shí)驗(yàn)例2APA-TIF細(xì)胞微囊對(duì)雞胚尿囊膜血管生成的抑制作用雞胚尿囊膜血管生成實(shí)驗(yàn)顯示APA-rEST-TNFα/293微囊培養(yǎng)上清液可明顯減少新生血管的數(shù)量，其血管抑制率(78％)明顯高于空微囊組、APA-rEST/293微囊組(66％)及APA-TNFα/293微囊組(9％)。
實(shí)驗(yàn)例的結(jié)果表明與對(duì)照組C6腦膠質(zhì)瘤模型大鼠相比，APA-rEST-TNFα/293微囊植入C6腦膠質(zhì)瘤鼠的瘤體內(nèi)(APA-TIF細(xì)胞微囊組)，可使腫瘤體積減小、瘤內(nèi)微血管密度降低、死亡細(xì)胞數(shù)量明顯增多、荷瘤鼠存活率增高、生存時(shí)間延長(zhǎng)(P＜0.01)。并且，APA-rEST-TNFα/293微囊的作用強(qiáng)于單一的APA-rEST/293微囊或APA-TNFα/293微囊。
權(quán)利要求
1.用于殺傷和/或抑制腫瘤的免疫隔離化細(xì)胞藥物，其包括可分泌抑制腫瘤生長(zhǎng)因子和/或腫瘤殺傷因子的活細(xì)胞和免疫隔離膜的包裹。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述藥物，該可分泌抑制腫瘤生長(zhǎng)因子或腫瘤殺傷因子的活細(xì)胞和免疫隔離膜的包裹為APA微囊化抑瘤和/或殺瘤細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述藥物，該APA微囊包裹至少兩種可分泌抑制腫瘤生長(zhǎng)因子和/或腫瘤殺傷因子的活細(xì)胞。
4.權(quán)利要求1所述藥物的制備方法，其步驟如下(1)將抑瘤細(xì)胞和/或殺瘤細(xì)胞與一種濃度為10-20g/L的藻酸鈉溶液混合，制成懸浮液。(2)利用噴霧裝置將步驟(1)獲得的懸浮液以100-1000μm直徑的微滴狀態(tài)分散于一種濃度為80-120mmol/L的氯化鈣或乳酸鈣溶液中，放置5-20分鐘，待沉淀完全后，除去上清液，獲得含抑瘤和/或殺瘤細(xì)胞的藻酸鈣微珠沉淀。(3)將步驟(2)獲得的沉淀物加入到一種濃度為0.1-1.0g/L的聚賴(lài)氨酸溶液中，混合均勻，放置5-20分鐘，待沉淀完全后除去上清液，獲得沉淀物。(4)將步驟(3)獲得的沉淀物加入到一種濃度為1.0-2.0g/L的藻酸鈉溶液中，混合均勻，放置3-15分鐘，待沉淀完全后除去上清液，獲得沉淀物。(5)將步驟(4)獲得的沉淀物加入到一種濃度為10-100mmol/L的檸檬酸鈉溶液中，混合均勻，放置5-20分鐘，待沉淀完全后除去上清液，獲得APA微囊化抑瘤和/或殺瘤細(xì)胞沉淀物。(6)將步驟(5)獲得的沉淀物加入到一種濃度為9g/L的氯化鈉溶液清洗，最后將沉淀物轉(zhuǎn)移入細(xì)胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)并作為治療腫瘤的APA微囊化抑瘤和/或殺瘤細(xì)胞藥物保存。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中步驟(1)中至少使用兩種可分泌抑制腫瘤生長(zhǎng)因子和/或腫瘤殺傷因子的活細(xì)胞。
6.可分泌抑制腫瘤生長(zhǎng)因子和/或腫瘤殺傷因子的活細(xì)胞和免疫隔離膜的包裹在制備用于治療和/或抑制腫瘤的免疫隔離化藥物中用途。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的用途，其中抑瘤細(xì)胞和/或腫瘤殺傷細(xì)胞至少使用兩種可分泌抑制腫瘤生長(zhǎng)因子和/或腫瘤殺傷因子的活細(xì)胞。
8.根據(jù)權(quán)利要求6的用途，所述腫瘤包括實(shí)體瘤或非實(shí)體瘤、良性或惡性腫瘤。
9.根據(jù)權(quán)利要求6的用途，其中抑瘤細(xì)胞和/或腫瘤殺傷細(xì)胞來(lái)自基因工程細(xì)胞或哺乳動(dòng)物。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的用途，其中基因工程細(xì)胞為分泌抑瘤和/或殺瘤因子的基因工程細(xì)胞。
11.根據(jù)權(quán)利要求9的用途，所述哺乳動(dòng)物為人、猴、牛、羊、豬或鼠。
12.根據(jù)權(quán)利要求6的用途，其中抑瘤和/或殺瘤細(xì)胞是APA微囊化的抑瘤和/或殺瘤細(xì)胞。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的用途，其中APA微囊可截割大于15萬(wàn)道爾頓分子、允許小于10萬(wàn)道爾頓分子通過(guò)，并符合體內(nèi)植入要求的強(qiáng)度和生物相容度。
14.根據(jù)權(quán)利要求6的用途，其中抑瘤和/或殺瘤細(xì)胞是以免疫隔離化形式使用的。
全文摘要
本發(fā)明涉及免疫隔離化細(xì)胞藥物，其制備方法和其在殺傷和/或抑制腫瘤中的應(yīng)用。用于治療腫瘤的免疫隔離化細(xì)胞產(chǎn)品，其組成和用法是1.可截割免疫活性物質(zhì)的半透膜——免疫隔離膜包裹活細(xì)胞；2.該活細(xì)胞可分泌抑制腫瘤生長(zhǎng)和/或殺死腫瘤細(xì)胞的因子；為兩種以上活細(xì)胞共包裹；3.將該藥物注入腫瘤組織或手術(shù)切除后的殘余腫瘤組織內(nèi)，用于殺死腫瘤細(xì)胞和/或抑制腫瘤組織的生長(zhǎng)。一次性注入后，該細(xì)胞藥物能在腫瘤組織內(nèi)長(zhǎng)時(shí)間地分泌抑瘤和/或殺瘤的因子，發(fā)揮治療腫瘤的作用。
文檔編號(hào)A61P35/00GK1730099SQ20051008893
公開(kāi)日2006年2月8日 申請(qǐng)日期2005年8月3日 優(yōu)先權(quán)日2005年8月3日
發(fā)明者崔和厚 申請(qǐng)人:崔和厚