專利名稱：含漢防己甲素的用于防治角膜混濁的眼用藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及漢防己甲素在制備用于預防或治療角膜混濁(Haze)的藥物方面的用途，以及一種用于預防或治療角膜混濁的含漢防己甲素的藥物組合物。
背景技術(shù)：
屈光手術(shù)是矯正屈光不正的常用方法，在眾多的手術(shù)方式中，準分子激光角膜切削術(shù)(photorefractive keratectomy，PRK)的出現(xiàn)是屈光手術(shù)的一項重大突破，喚起越來越多的人對角膜屈光手術(shù)的興趣，并且多年來大量臨床資料證實，其準確性、預測性好，是一種安全有效的手術(shù)方法。然而，該手術(shù)仍存在一些難以克服的問題，其中最主要的是術(shù)后出現(xiàn)角膜混濁[1]，影響手術(shù)療效，從而限制了該手術(shù)的運用。
到目前為止，角膜混濁的發(fā)生主要報道有如下機制。
炎癥反應(yīng)準分子激光的光切削作用引起由炎癥反應(yīng)介導的細胞和組織損傷。只有當創(chuàng)傷發(fā)生時，創(chuàng)傷的刺激使細胞膜紊亂，磷脂酶A2活化，在磷脂酶A2的作用下，花生四烯酸即從細胞膜磷脂中釋放出來?；ㄉ南┧嵩诃h(huán)氧酶的催化下形成環(huán)內(nèi)過氧化物，再通過異構(gòu)酶的作用轉(zhuǎn)化成前列腺素、前列環(huán)素和血栓素A2。研究發(fā)現(xiàn)，PRK術(shù)后角膜基質(zhì)淺層多形核白細胞增多，炎癥介質(zhì)PGE2、組織胺等含量增高[2]；O′Brien[3]等以大鼠PRK為模型也觀察了術(shù)后早期階段的角膜炎癥反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)角膜緣處僅有少量巨噬細胞和Langerhans細胞，而在術(shù)后36h這種炎癥細胞增加了2倍，說明炎癥反應(yīng)也參與切削區(qū)基質(zhì)的愈合過程，可能與PRK術(shù)后角膜混濁的形成有密切關(guān)系。
細胞凋亡許多實驗發(fā)現(xiàn)，在鼠、家兔和靈長類動物眼模型上，角膜上皮的機械性損傷可引起角膜表層基質(zhì)細胞的消失，其機制就是角膜表層基質(zhì)細胞凋亡。由于角膜基質(zhì)細胞凋亡是繼上皮損傷后所觀察到的基質(zhì)中的最早變化，Wilson提出[4]基質(zhì)細胞凋亡是角膜損傷修復反應(yīng)的啟動因素，即前基質(zhì)細胞凋亡可激活末凋亡基質(zhì)細胞的增生，啟動損傷修復機制。Helena[5]通過TUNEL、電鏡及電泳技術(shù)發(fā)現(xiàn)，在兔角膜上皮擦傷后即刻觀察到前基質(zhì)細胞發(fā)生具有凋亡特征的改變，4h左右達到高峰，凋亡的基質(zhì)細胞可在幾天內(nèi)由后層及周圍的基質(zhì)細胞通過增生和遷移來代償.活化的基質(zhì)細胞產(chǎn)生大量排列紊亂的膠原和其他細胞外基質(zhì)成分，同時表達大量肝細胞生長因子及其他生長因子，后者刺激角膜上皮增殖并抑制其分化，導致上皮過度增生。
晚期修復角膜上皮細胞損傷后，由鄰近上皮增殖和移行來修復。有文獻報道[6，7]PRK后淚液中的EGF、TGF-α、TGF-β、HGF、VEGF等生長因子含量增高，活化的基質(zhì)細胞也分泌HGF、KGF致上皮增生，并且保持不分化狀態(tài)，導致過度增生。同時合成和分泌細胞外基質(zhì)成分，使新生的基質(zhì)纖維排列紊亂。PRK術(shù)后，角膜中多種細胞因子參與角膜傷口的愈合，這些細胞因子在角膜增生修復中發(fā)揮著重要的作用，調(diào)節(jié)術(shù)后角膜混濁的形成和發(fā)展，其表達增加的程度和角膜混濁形成的強弱相關(guān)，如轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)[8]、血小板源性生長因子(PDGF)等[9]。
簡而言之，PRK術(shù)后早期的炎癥反應(yīng)和角膜前基質(zhì)細胞的調(diào)亡，使鄰近或后面的基質(zhì)細胞激活、增生，被激活的基質(zhì)細胞產(chǎn)生大量的細胞外基質(zhì)，使形成的基質(zhì)纖維排列紊亂而形成角膜混濁，同時角膜中的各種細胞因子也參與了角膜傷口的愈合，并在其中發(fā)揮了重要作用。也就是說，角膜混濁形成的實質(zhì)為角膜基質(zhì)細胞的增生、活化和基質(zhì)纖維重新構(gòu)建的愈合過程，與其它組織的纖維化過程基本相似。
目前，對屈光術(shù)后角膜混濁的防治，主要有兩種方式，即手術(shù)方式的改進和藥物治療。準分子激光原位角膜磨鑲術(shù)(excimer laser in keratomileusis，LASIK)是自動板層角膜成形術(shù)(automated lameller keratoplasty，ALK)和準分子激光角膜切削術(shù)的結(jié)合[10]。LSAIK雖然可以避免角膜混濁的發(fā)生，但首先LASIK需要制作角膜瓣，故而存在與角膜瓣相關(guān)的角膜瓣破損、游離、丟失及角膜上皮瓣下植入等嚴重并發(fā)癥，手術(shù)難度和手術(shù)風險相對較大；其次，LASIK除去角膜瓣后，在安全范圍內(nèi)可供切削的基質(zhì)厚度減少，從而使其矯正范圍受限。
近年來國內(nèi)眼屈光學者提出未來準分子激光手術(shù)發(fā)展的方向之一就是回歸激光表層切削，包括PRK、準分子激光角膜上皮磨鑲術(shù)(Laser subepithelial keratomileusis，簡稱LASEK)[11]以及Epi-LASIK。LASEK和Epi-LASIK雖可減少角膜混濁，但卻不能象LASIK手術(shù)一樣完全避免角膜混濁的發(fā)生，這可能是因為這兩種角膜屈光手術(shù)同樣破壞了前彈力層，使角膜上皮和角膜基質(zhì)細胞直接接觸，二者之間的細胞因子網(wǎng)絡(luò)促使角膜混濁的形成。
因此，有利的是使用安全有效的藥物來防治角膜混濁。皮質(zhì)類固醇激素是目前防治角膜混濁的主要用藥，效果顯著。但長期應(yīng)用，可引起激素性高眼壓、激素性青光眼及白內(nèi)障等并發(fā)癥的發(fā)生。有文獻報道非甾體抗炎藥、抗代謝藥、鋅制劑、caspase(半胱氨酰天冬氨酸特異性蛋白酶)抑制劑等也用于防治PRK術(shù)后角膜混濁的形成[12]，但到目前為止尚無一種藥物能完全取代皮質(zhì)類固醇激素而大量應(yīng)用于臨床。因此，尋找一種皮質(zhì)類固醇激素的替代藥，并結(jié)合PRK、LASEK、Epi-LASIK等安全、有效的準分子激光表面切削手術(shù)方式，必將使角膜屈光手術(shù)發(fā)生一次新的飛躍。
漢防己甲素(tetrandrine，Tet)是從中藥漢防己的根塊中提取的一種雙芐基異喹啉類生物堿，其分子式為C38H42O6N2，相對分子質(zhì)量為622.73。整個分子中由2個二苯醚鍵組成十八元大環(huán)，含有多個烷氧基，脂溶性較高。分子中含有兩個甲氧異喹啉環(huán)，并具有含活潑弧電子對的氮原子和氧原子，使該藥容易通過生物膜且排泄速度較慢，可在作用部位達到一定含量。漢防己甲素曾作為一種鈣通道阻滯劑用于治療高血壓、心絞痛等[13]。目前因它還具有抗炎作用而將其歸入非甾體消炎藥[14]。
肖繼皋等[15]報道，Tet 50mg·kg-1腹腔注射(ip)能顯著抑制晶狀體蛋白引起的家兔前葡萄膜炎的發(fā)生，其作用機制可能是降低細胞內(nèi)鈣水平，抑制炎癥介質(zhì)的生成，抑制體液和細胞免疫反應(yīng)，并且它不會產(chǎn)生如地塞米松撤藥后的反跳現(xiàn)象。
晶狀體后囊膜混濁(PCO)是影響白內(nèi)障術(shù)后復明效果的原因之一，其發(fā)生是因為白內(nèi)障術(shù)后殘留的晶狀體上皮細胞增生、移行和分泌膠原蛋白，導致晶狀體后囊膜纖維化和混濁。郭琳潔[16]等報道Tet可減少白內(nèi)障術(shù)后房水中蛋白質(zhì)和丙二醛的含量，抑制晶狀體上皮細胞增生，從而抑制PCO的形成。
本發(fā)明人所了解的現(xiàn)有技術(shù)中尚沒有將漢防己甲素制備成眼用藥物來治療角膜混濁。

發(fā)明內(nèi)容
為了尋找一種能代替皮質(zhì)類固醇激素治療角膜混濁的藥物，本發(fā)明人進行了大量的實驗研究，發(fā)現(xiàn)漢防己甲素有望開發(fā)為代替皮質(zhì)類固醇激素來治療角膜混濁的藥物。
因此，本發(fā)明的一個目的是提供漢防己甲素在制備用于預防或治療角膜混濁的眼用藥物方面的用途。
在一個實施方案中，所述的角膜混濁是屈光術(shù)后的角膜混濁。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種用于預防或治療角膜混濁的眼用藥物組合物，其包含作為有效成分的0.05％-0.2％漢防己甲素，和可選的藥學上可接受的載體。
在一個實施方案中，所述的角膜混濁是屈光術(shù)后的角膜混濁。
在另一個實施方案中，所述的眼用藥物組合物可以配制成眼液或眼膏劑型。
在一個優(yōu)選的實施方案中，漢防己甲素眼液包含0.05％～0.2％漢防己甲素；0.1％亞硫酸氫鈉；0.8％氯化鈉；0.03％依地酸二鈉；0.03％羥苯乙酯；磷酸緩沖液配制，再用氫氧化鈉將pH調(diào)至5.5～6.5。
在另一個優(yōu)選的實施方案中，漢防己甲素眼膏包含0.05％～0.2％漢防己甲素；0.1％亞硫酸氫鈉0.8％氯化鈉；0.03％依地酸二鈉；0.03％羥苯乙酯；磷酸緩沖液配制，氫氧化鈉將pH調(diào)至5.5～6.5，再用適量玻璃酸鈉調(diào)至合適濃度。所述的合適濃度是本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠根據(jù)經(jīng)驗確定的，是患者易于接受的濃度。


圖1顯示NS組術(shù)后1月角膜上皮增厚，基底膜不連續(xù)，基質(zhì)淺層成纖維細胞數(shù)量明顯增多，角膜上皮和基質(zhì)層存在局限性散在裂隙，膠原排列紊亂(HE×400)；圖2顯示FML組術(shù)后1月角膜上皮增厚，基底細胞水腫；基底膜增厚；基質(zhì)淺層成纖維細胞數(shù)量增多；膠原纖維排列紊亂(HE×400)；圖3顯示Tet術(shù)后1月角膜上皮變薄；基底膜變薄；基質(zhì)淺層成纖維細胞數(shù)量明顯減少，形態(tài)和排列基本規(guī)則；膠原纖維排列基本規(guī)則(HE×400)；圖4顯示NS組術(shù)后2月角膜上皮增厚；基底膜明顯增厚；基質(zhì)淺層成纖維細胞數(shù)量增多；膠原纖維排列紊亂(HE×400)；圖5顯示FML加藥組術(shù)后2月角膜變薄；基底膜增厚；基質(zhì)層成纖維細胞數(shù)量減少；膠原纖維排列稍紊亂(HE×400)；圖6顯示Tet加藥組術(shù)后2月角膜角膜上皮變??；基底膜變薄，厚薄均勻；基質(zhì)淺層成纖維細胞數(shù)量明顯減少；膠原纖維排列基本規(guī)則(HE×400)；圖7顯示正常角膜成纖維細胞少含細胞器，膠原纖維排列整齊(×23800)圖8顯示NS組術(shù)后1月成纖維細胞數(shù)量增多，富含細胞器，膠原纖維排列紊亂(×4930)；圖9顯示Tet組術(shù)后1月成纖維細胞數(shù)量減少，線粒體腫脹(×7140)；圖10顯示FML組術(shù)后1月成纖維細胞數(shù)量增多，線粒體腫脹(×11900)；圖11顯示正常角膜纖維連接接蛋白(FN)陰性表達(SP×400)；圖12顯示NS組術(shù)后1月胞漿FN呈棕褐色強陽性表達(SP×400)；圖13顯示Tet組術(shù)后1月胞漿FN呈棕黃色弱陽性表達(SP×400)；圖14顯示FML組術(shù)后1月胞漿FN呈棕褐色陽性表達(SP×400)；圖15顯示正常角膜III型膠原陰性表達(SP×400)；圖16顯示NS組術(shù)后1月胞漿III型膠原呈棕褐色強陽性表達(SP×400)；圖17顯示Tet組術(shù)后1月胞漿III型膠原呈棕黃色弱陽性表達(SP×400)；圖18顯示FML組術(shù)后1月胞漿III型膠原呈棕褐色陽性表達(SP×400)；圖19說明不同濃度Tet、FML對FN表達的抑制作用；圖20說明不同濃度Tet、FML對III型膠原表達的抑制作用；圖21所示為TGF-β1的標準曲線；圖22說明Tet、FML對兔房水TGF-β1表達的抑制作用。
具體實施例方式
下面通過優(yōu)選的實施例并結(jié)合附圖來說明本發(fā)明的藥物組合物及其治療效果。除非特別指明，實施例中所用實驗方法和試劑都是本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的常規(guī)方法和試劑。這些實施例只是對本發(fā)明的各個方面和特征加以說明，并不限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明的實質(zhì)和范圍僅由權(quán)利要求書來限定。因此，在不背離本發(fā)明實質(zhì)和范圍的情況下，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以對本發(fā)明的實施方案進行各種改動，這些改動內(nèi)容也屬于本發(fā)明的保護范圍。
實施例1漢防己甲素眼液的配制漢防己甲素眼液配制如下漢防己甲素(購自西安山川生物有限公司，純度98.6％)(0.05％、0.1％、0.2％)；亞硫酸氫鈉(0.1％)；氯化鈉(0.8％)；依地酸二鈉(0.03％)；0.03％羥苯乙酯；磷酸緩沖液配制，再用氫氧化鈉將pH調(diào)至5.5～6.5。
實施例2漢防己甲素眼液對PRK術(shù)后角膜混濁形成的治療效果PRK模型的制作健康新西蘭大耳白兔60只(重慶醫(yī)科大學試驗動物中心提供)，雌雄不限，體重1.8-2.5kg，裂隙燈顯微鏡下眼部檢查無異常。隨機編號后分組，分籠喂養(yǎng)。
術(shù)前3天潔霉素眼液(湖北潛江制藥有限股份公司)點眼，每天3次。手術(shù)當天用潔霉素眼液沖洗結(jié)膜囊，用速眠新II注射液(購自長春軍需大學獸醫(yī)研究所)0.1ml/kg肌肉注射。開瞼器開瞼，于VISX20/20型準分子激光儀下行PRK術(shù)。激光參數(shù)能量設(shè)置205mJ，Cal Facter 1.01，光區(qū)5.5mm，Sphere-10.0D，激光去上皮55μm，pluse 686(激光去上皮226，激光切削460)。術(shù)畢結(jié)膜囊滴諾氟沙星眼液(來自武漢五景藥業(yè)有限公司)及迪可羅眼膏(來自沈陽市興齊有限責任公司)。
漢防己甲素對角膜混濁分級的影響術(shù)后1周點潔霉素眼液，每天三次；迪可羅眼膏，每天二次。待角膜上皮愈合后，按試驗分組，分別用0.05％Tet、0.1％Tet、0.2％Tet、0.1％艾氟龍眼液(FML，來自美國眼力健公司)和生理鹽水(0.9％氯化鈉，來自重慶天圣制藥有限公司)點眼，每天四次；1月后減為每天三次。除0.2％Tet點眼2月組一眼在點眼一個半月時出現(xiàn)輕度結(jié)膜充血并伴少量分泌物外，其余各實驗兔均未出現(xiàn)結(jié)膜充血、畏光、流淚等眼部刺激癥狀。
裂隙燈顯微鏡觀察結(jié)膜有無充血，有無分泌物，角膜上皮愈合情況并按Fantes[17]等的角膜混濁分級標準，進行分級并記錄0級角膜完全透明；0.5級角膜輕微混濁，僅使用裂隙燈間接照明法可見；1級角膜低密度混濁，使用裂隙燈直接照明法或彌散光照法可見；2級角膜輕度混濁致視力受影響，使用裂隙燈直接聚焦法可見；3級角膜中度混濁，遮擋部分虹膜結(jié)構(gòu)；4級角膜嚴重混濁，遮擋眼內(nèi)組織結(jié)構(gòu)。
角膜混濁分級結(jié)果見表1，結(jié)果表明各Tet處理組在術(shù)后各時間點使角膜混濁形成明顯減輕，與對照相比差異有顯著性意義(P＜0.01)。
表1各組術(shù)后不同時間角膜混濁分級情況

注與對照比較，*P＜0.01形態(tài)學觀察空氣栓塞法處死試驗兔，用6mm角膜環(huán)鉆取角膜組織，一式兩半，一半用4％戊二醛固定兔角膜組織2h，繼用1％四氧化鋨固定，脫水，包埋，切片，染色按常規(guī)處理。然后采用透射電子顯微鏡觀察，拍照。另一半用4％多聚甲醛固定，脫水，包埋，切成5μm連續(xù)切片，貼附于多聚賴氨酸處理的載玻片上，放至烤箱60℃烤6小時，如下所述進行HE染色。
石蠟切片用二甲苯透明(I、II)各20min。然后，梯度酒精脫水，100％、95％、85％、70％各3min。蒸餾水沖洗2次，各3min。蘇木素染液中浸泡5min。流水洗去浮色，在1％鹽酸乙醇溶液中分色30秒。流水沖洗3min。5％伊紅染色2-5min，流水沖去浮色。梯度酒精脫水，70％、80％、95％(I、II)、100％(I、II)各2min。二甲苯透明(III)3min。中性樹膠立即封片。光鏡下觀察組織形態(tài)，拍照。
光鏡觀察角膜組織形態(tài)學改變術(shù)后1周至1月生理鹽水陰性對照組角膜上皮明顯增厚，角膜上皮基底細胞形態(tài)各異，可見細胞水腫和空泡樣改變；基底膜增厚，厚薄不均，且不連續(xù)；角膜上皮層和基質(zhì)層存在局限性裂隙，基質(zhì)淺層成纖維細胞數(shù)量明顯增多，細胞形態(tài)和排列不規(guī)則；膠原纖維排列紊亂(圖1)。FML加藥組角膜上皮增厚，角膜上皮基底細胞水腫，呈高柱狀改變；基底膜增厚，呈不同程度的波浪狀彎曲；基質(zhì)淺層成纖維細胞數(shù)量增多，細胞形態(tài)和排列不規(guī)則；膠原纖維排列紊亂(圖2)。Tet加藥組角膜上皮增厚；基底膜增厚，呈不同程度的波浪狀彎曲；基質(zhì)淺層成纖維細胞數(shù)量少；膠原纖維排列較前兩組整齊(圖3)。
術(shù)后2月生理鹽水陰性對照組角膜上皮增厚，角膜上皮基底細胞形態(tài)各異；基底膜明顯增厚，且厚薄不均；基質(zhì)淺層成纖維細胞數(shù)量增多，細胞形態(tài)和排列不規(guī)則；膠原纖維排列紊亂(圖4)。FML加藥組角膜上皮基底細胞呈高柱狀；基底膜增厚，呈波浪狀彎曲；基質(zhì)層成纖維細胞數(shù)量減少；膠原纖維排列稍紊亂(圖5)。Tet加藥組角膜上皮細胞排列基本規(guī)則，角膜上皮變??；基底膜變薄，厚薄均勻；基質(zhì)淺層成纖維細胞數(shù)量明顯減少，形態(tài)和排列基本規(guī)則；膠原纖維排列基本規(guī)則(圖6)電鏡觀察角膜組織超微結(jié)構(gòu)的改變術(shù)后1月生理鹽水陰性對照組角膜上皮基底細胞的半橋粒稀疏，基底膜薄且不連續(xù)；基質(zhì)淺層可見大量成纖維細胞，細胞胞漿內(nèi)富含細胞器，以線粒體和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)為主，線粒體水腫，呈空泡樣改變；膠原纖維排列紊亂，膠原纖維直徑及膠原纖維之間的間隔不規(guī)則(圖8)。Tet加藥組角膜上皮基底細胞的半橋粒增多，基底膜不連續(xù)；基質(zhì)淺層成纖維細胞數(shù)量明顯減少，細胞胞漿內(nèi)細胞器減少，線粒體腫脹明顯減輕；膠原排列稍紊亂(圖9)。FML加藥組角膜上皮基底細胞的半橋粒稀疏，基底膜薄且不連續(xù)；基質(zhì)淺層成纖維細胞數(shù)量增多，細胞胞漿內(nèi)富含細胞器，線粒體腫脹，呈空泡樣改變；膠原纖維排列紊亂(圖10)。
鏈霉素親和素—生物素—過氧化物酶復合物法檢測FN、III型膠原的表達如前所述，PRK術(shù)后角膜混濁形成的實質(zhì)是基質(zhì)細胞激活、增生，被激活的基質(zhì)細胞產(chǎn)生大量的細胞外基質(zhì)(如FN、III型膠原等)堆積在細胞間，并使形成的基質(zhì)纖維排列紊亂而形成角膜混濁。由此在該實驗中我們檢測了漢防己甲素對FN、III型膠原表達的影響。
石蠟切片，二甲苯透明(I、II)各20min。梯度酒精脫水，100％、95％、85％、75％酒精各3min。蒸餾水沖洗3min。3％H2O2去離子水室溫孵育10min。蒸餾水沖洗，PBS液浸泡5min。浸入枸櫞酸鹽溶液，微波加熱至冒泡，開啟，間隔5min后再次加熱，共3次。取出容器，室溫冷卻30min。加正常山羊血清封閉，37℃孵育15min。加FN和III型膠原一抗(Rabbit Anti-collagen type III，F(xiàn)N，均為濃縮液，工作濃度為1∶50，均購自武漢博士德生物工程有限公司)，以PBS代替一抗作陰性對照，4℃過夜，PBS沖洗3min×3次。加生物素二抗，37℃孵育15min，PBS沖洗3min×3次。辣根酶標記鏈霉素，37℃孵育15min，PBS洗3min×3次。DAB顯色，蒸餾水沖洗，自來水浸泡3min。復染蘇木素染色2min，分色1s，用流水沖洗3min，烤箱內(nèi)烘干，二甲苯III浸泡3min，中性樹膠立即封片，光鏡下觀察，拍照。
取1月時間點的實驗組與對照組各取10張免疫組化切片，每張切片隨機挑選10個視野(×200)，測定一定面積的陽性積分光密度及測定面積，按公式AIOD＝陽性積分光密度/測定面積來計算面積積分光密度(AIOD)。采用統(tǒng)計軟件包SPSS 12.0FOR WINDOWS統(tǒng)計軟件對計量資料進行方差分析，用Least-significant-difference(LSD)法進行兩兩比較。計數(shù)資料用秩和檢驗?；貧w方程的建立采用直線回歸法及線性相關(guān)分析。
結(jié)果顯示正常兔角膜基質(zhì)FN(圖11)、III型膠原(圖15)均為陰性表達；生理鹽水陽性對照組角膜基質(zhì)細胞胞漿呈棕褐色，F(xiàn)N(圖12)及III型膠原(圖16)均呈強陽性表達；Tet各濃度組角膜基質(zhì)細胞胞漿呈棕黃色，F(xiàn)N(圖13)及III型膠原(圖17)均呈弱陽性表達；FML組角膜基質(zhì)細胞胞漿呈棕褐色，F(xiàn)N(圖14)及III型膠原(圖18)均呈陽性表達。
用圖像分析系統(tǒng)對免疫組織化學結(jié)果進行分析(表2、圖19、圖20)，結(jié)果表明Tet各濃度組與FML組、生理鹽水組比較，P＜0.01，差異有顯著性意義；表明Tet可能通過直接抑制PRK術(shù)后細胞外基質(zhì)(ECM)的合成，減少細胞外基質(zhì)在角膜基質(zhì)細胞間的堆積來抑制術(shù)后角膜混濁的形成；Tet各組隨著濃度的增加，F(xiàn)N、III型膠原的表達均下降，有明顯的劑量依賴關(guān)系。FML組與生理鹽水組比較，P＞0.05，差異無顯著性意義。
表2不同濃度Tet、FML抑制FN、III型膠原表達的比較


注與對照比較，*P＜0.01漢防己甲素對兔PRK術(shù)后房水TGF-β1的影響鑒于TGF-β1與角膜混濁的形成密切相關(guān)[18]，在本實驗中我們用TGF-β1ELISA試劑盒(購自深圳晶美生物有限公司)檢測了漢防己甲素對兔房水中TGF-β1含量的影響。
用1ml注射器自角鞏膜緣后1mm處刺穿前房，抽取前房水0.3ml，放置于1.5mlEppendorf管內(nèi)，-20℃冷凍保存?zhèn)溆?。?00μl標準品/標本稀釋液加入200μl標本。加20μl 1N HCL蓋緊，上下混勻，4℃放置60分鐘。加15μl 1N NaOH，蓋緊，上下混勻即用。從已平衡室溫的密封袋中取出所需板條。除空白孔外，分別將標本和不同濃度標準品(100μl/孔)加入相應(yīng)孔中，用封板膠條封住反應(yīng)孔，37℃孵箱育90min。甩盡孔內(nèi)液體，每孔加洗滌液350μl，靜止30秒后甩盡液體，在原吸水紙上拍干，洗板4次。除空白孔外，加入生物素化抗體工作液(100μl/孔)用封板膠紙封住反應(yīng)孔，37℃孵育箱孵育60分鐘。洗板4次。除空白孔外，加入酶結(jié)合工作液(100μl/孔)，封住板孔，37℃孵育箱30min。洗板4次。加入顯色劑(100μl/孔)，避光37℃，顯色20分鐘。加入終止液(100μl/孔)，混勻后即刻測量OD450值。
以標準品濃度作橫坐標，OD值作縱坐標，用CurveExpert 1.3軟件繪制標準曲線(見圖21)，并進行回歸分析。根據(jù)下列回歸方程Y＝ab+cxd/b+xd(其中a＝0.0073902283，b＝1819.0906，c＝3.04840，d＝0.8838035)，計算TGF-β1的濃度(pg/ml)。采用統(tǒng)計軟件包SPSS 12.0 FOR WINDOWS統(tǒng)計軟件對計量資料進行方差分析，用Least-significant-difference(LSD)法進行兩兩比較。計數(shù)資料用秩和檢驗?；貧w方程的建立采用直線回歸法及線性相關(guān)分析。
結(jié)果如表3和圖22所示。生理鹽水陽性對照組PRK術(shù)后1w兔房水中TGF-β1含量逐漸增加，于術(shù)后2m仍處于較高水平；PRK術(shù)后1w，Tet各濃度組及FML組TGF-β1含量明顯低于生理鹽水陽性對照組，P＜0.01，差異有顯著性意義，但Tet各濃度組及FML組TGF-β1含量比較，差異無顯著性意義；PRK術(shù)后2w至2m，Tet各濃度組、FML組均可下調(diào)兔房水中的TGF-β1含量，與生理鹽水組比較，P＜0.01，差異有顯著性意義；Tet各濃度組與FML組比較，P＜0.01，差異也有顯著性意義，且隨著Tet濃度的增加，兔房水中的TGF-β1含量減少，表現(xiàn)出明顯的劑量依賴性。
表3不同濃度Tet、FML下調(diào)兔房水TGF-β1表達的比較

注與對照比較，*P＜0.01，ΔP＜0.05從上述結(jié)果可以看出，本發(fā)明的藥物組合物對兔PRK術(shù)后角膜混濁有明顯的抑制作用，并且藥理學實驗結(jié)果表明其可能是通過減少細胞外基質(zhì)如FN、III型膠原的生成和下調(diào)PRK術(shù)后TGF-β1的表達而發(fā)揮其抑制作用；另外，本發(fā)明的藥物組合物還可能對PRK術(shù)后角膜基質(zhì)成纖維細胞的增殖具有一定的抑制作用，從而減少了細胞外基質(zhì)(ECM)的分泌；與臨床所用眼液一致的濃度(0.1％)的比較中，漢防己甲素強于傳統(tǒng)防治角膜混濁的皮質(zhì)類固醇藥物(FML)。這些結(jié)果說明本發(fā)明的藥物組合物對角膜渾濁具有強于皮質(zhì)類固醇藥物的治療效果。
參考文獻[1]杜之渝，鄭晴，張大勇等.角膜Bowman’s層功能的研究.中國實用眼科雜志，2002，20(10)754-757[2]Phillips AF，Szerenyi K，Campos M，et al.Arachidonic acid metabolites after excimerlaser comeal surgery.Arch Ophthalmol，1993，1111273[3]O′Brien TP，Li Q，Ashraf MF，et al.Inflammatory response in the early stages of woundhealing after excimer laser keratectomy.Arch Ophthalmol，1998，116(11)1470～4 Wilson SE.Role ofapoptosis in wound healing in the cornea.Cornea.2000，19(3)S7-12[5]Helena MC，Baerveldt F，Kim WJ，et al.Keratocyte apoptosis after cornealsurgery.Invest Ophthalmol Vis Sci.1998Feb；39(2)276-83[6]Wilson SE，Liang Q，Kim WJ.Lacrimal gland HGF，KGF，and EGF mRNA levelsincrease after corneal epithelial wounding.Invest Ophthalmol Vis Sci.1999Sep；40(10)2185-90[7]Wilson SE，Liu JJ，Mohan RR，et al.Stromal-epithelial interactions in the comea.ProgRetin Eye Res.1999 May；18(3)293-309[8]許惠卓，劉雙珍等.PRK術(shù)后轉(zhuǎn)化生長因子β1mRNA表達的實驗研究湖南醫(yī)科大學學報.2002.02.28；27(1)23-25[9]鐘一聲，程楓.兔準分子激光角膜切削術(shù)后角膜血小板源性生長因子mRNA表達的變化.眼科研究.2000.06.15；18(3)204-206[10]李鏡海，肖瑛等.近視手術(shù)治療學.北京人民衛(wèi)生出版社，2001，64[11]Camellin M.LASEK may ofter the advantages of both Lasik and PRK.Ocu Surg NInt，1999，10(3)14-15[12]賈麗.準分子激光屈光性角膜切削術(shù)后角膜混濁與藥物治療研究.國外醫(yī)學，1997，21(4)201-206[13]Leung YM，Kwan CY，Current perspectives in the pharmacological studies ofstore-operated Ca+2entry blockers.Jpn J pharmacol.1999；81253-258[14]陳祖基主編.眼科臨床藥理學.北京化學工業(yè)出版社.2002，208[15]肖繼皋，吳樹楊，李晶閣等.實驗動物和動物實驗.漢防己甲素對家兔實驗性前葡萄膜炎的抑制作用.1994.6(1)15-18[16]郭琳潔.中華眼科雜志.漢防己甲素抑制兔晶狀體后囊膜混濁2002(38).4235-238[17]Fantes FE，Hanna KD，Waring GO，et al.Wound healing after excimer laserkeratomileusis(photorefractive keratectomy)in monkeys.Arch Ophthalmol.1990 May；108(5)665-75[18]周穎明，鐘一聲，廉井財?shù)?PRK術(shù)后房水中TGF-β1含量與haze的相關(guān)性.上海第二醫(yī)科大學學報2002，22(1)1-4。
權(quán)利要求
1.漢防己甲素在制備用于預防或治療角膜混濁的眼用藥物方面的用途。
2.權(quán)利要求1所述的用途，其中所述的角膜混濁是屈光術(shù)后的角膜混濁。
3.一種用于預防或治療角膜混濁的眼用藥物組合物，其包含作為有效成分的0.05％-0.2％漢防己甲素，和任選的藥學上可接受的載體。
4.權(quán)利要求3所述的眼用藥物組合物，其中所述的角膜混濁是屈光術(shù)后的角膜混濁。
5.權(quán)利要求3或4所述的眼用藥物組合物，其可以配制成眼液或眼膏劑型。
6.權(quán)利要求5所述的眼用藥物組合物，其中所述的眼液包含0.05％～0.2％漢防己甲素、0.1％亞硫酸氫鈉、0.8％氯化鈉、0.03％依地酸二鈉和0.03％羥苯乙酯。
7.權(quán)利要求5所述的眼用藥物組合物，其中所述的眼膏包含0.05％～0.2％漢防己甲素、0.1％亞硫酸氫鈉、0.8％氯化鈉、0.03％依地酸二鈉、0.03％羥苯乙酯和適量的玻璃酸鈉。
全文摘要
本發(fā)明涉及漢防己甲素在制備用于預防或治療角膜混濁的眼用藥物方面的用途，具體地說，所述的角膜混濁是屈光術(shù)后的角膜混濁。本發(fā)明還涉及一種用于預防或治療角膜混濁的眼用藥物組合物，其包含作為有效成分的0.05％－ 0.2％漢防己甲素，和任選的藥學上可接受的載體。該組合物可以配制成眼液或眼膏劑型。
文檔編號A61P27/00GK1729981SQ200510089120
公開日2006年2月8日 申請日期2005年8月2日 優(yōu)先權(quán)日2005年8月2日
發(fā)明者杜之渝 申請人:杜之渝