專利名稱：穩(wěn)定的液體干擾素制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及穩(wěn)定人β-干擾素的方法和穩(wěn)定的β-干擾素液體制劑。
背景技術(shù)：
干擾素是具有多種生物活性的蛋白質(zhì)，其中某些具有抗病毒、免疫調(diào)節(jié)和抗增生作用。它們是相對(duì)較小的、種特異性的單鏈多肽，在多種誘因作用下由哺乳動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生，例如病毒、多肽、促細(xì)胞分裂劑等等。干擾素保護(hù)動(dòng)物組織和細(xì)胞不受病毒攻擊，是一種重要的宿主防御機(jī)制。在大多數(shù)情況下，與其他類型的組織和細(xì)胞相比，干擾素對(duì)產(chǎn)生它們的組織和細(xì)胞種類提供更好的保護(hù)作用，這說(shuō)明來(lái)源于人的干擾素在治療人的疾病時(shí)應(yīng)當(dāng)比來(lái)自其他物種的干擾素更為有效。
人干擾素有幾種不同類型，一般分為白細(xì)胞(α-干擾素)、成纖維細(xì)胞(β-干擾素)和免疫細(xì)胞(γ-干擾素)，以及它們的大量變體。在各種教科書和?？锌梢哉业接嘘P(guān)干擾素的一般性討論，包括《干擾素系統(tǒng))》(W.E.Stewart，II，Springer-Verlag，N.Y.1979)；和《干擾素療法)》(世界衛(wèi)生組織技術(shù)報(bào)告叢書676，世界衛(wèi)生組織，日內(nèi)瓦1982)，結(jié)合在此作為參考。
干擾素的給藥方法是這種重要治療劑的臨床應(yīng)用中的一個(gè)重要因素。通過(guò)靜脈內(nèi)、肌內(nèi)或皮下注射而進(jìn)行的全身性干擾素給藥使用最為頻繁，在一些疾患的治療中取得了一定成功，例如多毛細(xì)胞白血病、獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)和相關(guān)的卡波濟(jì)氏肉瘤。不過(guò)已知這類蛋白質(zhì)的純凈形式尤其對(duì)降解敏感。對(duì)β-干擾素來(lái)說(shuō)，溶液中干擾素降解的主要機(jī)制是聚集作用和脫酰胺作用。干擾素溶液及其他產(chǎn)品在穩(wěn)定性上的缺陷因此就限制了它的應(yīng)用。
臨床用的藥物干擾素組合物通常含有干擾素的凍干(即冷凍干燥)制劑以及復(fù)合有機(jī)賦形劑和穩(wěn)定劑，例如非離子型表面活性試劑(即表面活性劑)、各種糖類、有機(jī)多元醇和/或人血清白蛋白。凍干制劑具有需要復(fù)合包裝的缺點(diǎn)，這是由于需要單獨(dú)提供無(wú)菌的注射用水的緣故。而且，凍干制劑在使用前還需要若干操作，這就增加了在注射劑制備過(guò)程中被針刺傷和滴落成分的可能性。這些操作對(duì)肌肉無(wú)力和協(xié)調(diào)作用差的患者人群來(lái)說(shuō)尤其是成問(wèn)題的，例如患多發(fā)性硬化(MS)的人。MS患者可以將干擾素自我給藥，以使比目前的凍干產(chǎn)品更易于給藥的劑型給患者人群目標(biāo)帶來(lái)重要的可利用價(jià)值。為了避免在使用凍干制劑時(shí)所必需的再制備操作，迫切需要干擾素的簡(jiǎn)單液體制劑。
含有干擾素的液體非凍干型制劑也可以含有復(fù)合載體，例如人血清白蛋白、多元醇、糖類和陰離子型表面活性穩(wěn)定劑。例如參見(jiàn)WO89/10756(Hara等，含有多元醇和對(duì)羥基苯甲酸酯)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明已經(jīng)解決了上述問(wèn)題，因?yàn)榘l(fā)現(xiàn)，人β-干擾素在置于pH約為4和7.2之間的緩沖溶液中時(shí)是可以被穩(wěn)定的，該溶液含有氨基酸作為穩(wěn)定劑，在某些情況下還含有鹽(如果該氨基酸不含有一條帶電側(cè)鏈)。β-干擾素不是凍干的，而是一旦利用普通技術(shù)人員已知的方法從來(lái)源中制得，就直接包括在本發(fā)明的制劑中。
因此，本發(fā)明的一個(gè)方面是一種液體組合物，該組合物含有干擾素和約0.3至5重量％的穩(wěn)定劑，該穩(wěn)定劑是氨基酸，選自由酸性氨基酸、精氨酸和甘氨酸組成的組。液體組合物預(yù)先不經(jīng)過(guò)凍干。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述液體組合物是被冷凍的。而且，優(yōu)選將該液體組合物包含在一種容器中，例如注射器，其中在該容器與液體接觸的表面涂一層對(duì)干擾素呈惰性的材料，例如硅氧烷或聚四氟乙烯。優(yōu)選的組合物包括在pH約為4.0至7.2的緩沖液中的β-干擾素或重組生成的干擾素，優(yōu)選緩沖液pH為4.8-5.2。本發(fā)明其他的制劑包括
(1)pH 5.0的20mM乙酸鹽緩沖液，該緩沖液預(yù)先不經(jīng)過(guò)凍干，其中該緩沖液包括β-干擾素加選自下列的成分(a)150mM精氨酸-HCl；(b)100mM氯化鈉和70mM甘氨酸；(c)150mM精氨酸-HCl和15mg/ml人血清白蛋白；(d)150mM精氨酸-HCl和0.1％普流羅尼(Pluronic)F-68；(e)140mM氯化鈉；(f)140mM氯化鈉和15mg/ml人血清白蛋白；和(g)140mM氯化鈉和0.1％Pluronic F-68；(2)pH 5.0的液體，該液體包括β-干擾素、170mM L-谷氨酸和150mM氫氧化鈉，該液體預(yù)先不經(jīng)過(guò)凍干；(3)pH 7.2的20mM磷酸鹽緩沖液，該緩沖液預(yù)先不經(jīng)過(guò)凍干，其中該緩沖液包括β-干擾素加選自下列的成分(a)140mM精氨酸-HCl；和(b)100mM氯化鈉和70mM甘氨酸。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式是用于液體干擾素制劑胃腸外給藥的試劑盒。該試劑盒包含一個(gè)含有pH為4至6的液體制劑的容器，該液體含有預(yù)先不經(jīng)過(guò)凍干的藥學(xué)有效量的β-干擾素，和大約或少于5重量％的氨基酸穩(wěn)定劑；和使用說(shuō)明書。
本發(fā)明還有一種實(shí)施方式是適用于對(duì)哺乳動(dòng)物胃腸外給藥的液體藥物組合物，該組合物基本上由預(yù)先不經(jīng)過(guò)凍干的有效量的β-干擾素和一種具有適當(dāng)離子強(qiáng)度的氨基酸穩(wěn)定劑組成，所述β-干擾素存在于pH保持在4.0至6.0范圍內(nèi)的緩沖液中。將該組合物包含在一種貯存容器中，例如注射器。優(yōu)選地，該貯存容器沒(méi)有含氧/液體界面(也就是說(shuō)，干擾素溶液在制備和貯存過(guò)程中不受含氧氣體影響)。β-干擾素在約2攝氏度至約25攝氏度之間的溫度下貯存至少3個(gè)月的過(guò)程中，基本上保持了它的抗病毒活性。
在液體藥物組合物中穩(wěn)定β-干擾素的本發(fā)明方法使干擾素在約2攝氏度至約25攝氏度之間的溫度下貯存至少3個(gè)月的過(guò)程中基本上保持了它的物質(zhì)穩(wěn)定性，該方法包括將a)有效量的β-干擾素；b)保持pH在4.0至7.2范圍內(nèi)和適當(dāng)離子強(qiáng)度的緩沖液，優(yōu)選緩沖液pH為4.8-5.2；和c)一種氨基酸穩(wěn)定劑混合，其中該液體預(yù)先不經(jīng)過(guò)凍干，并且在制備和貯存過(guò)程中不受含氧氣體的影響。
本發(fā)明的液體制劑比凍干制劑具有很多優(yōu)點(diǎn)。這些優(yōu)點(diǎn)包括(i)液體制劑所需的較小注射體積比大體積引起較少不適；(ii)用簡(jiǎn)單的氨基酸類代替復(fù)雜的賦形劑，使更密切地監(jiān)測(cè)最終產(chǎn)品質(zhì)量成為可能；(iii)由于不需要單獨(dú)提供注射用水(WFI)和單獨(dú)的注射器與小瓶，包裝大大簡(jiǎn)化；(iv)由于幾乎沒(méi)有液體轉(zhuǎn)移，劑量精度得以提高；和(v)提高了產(chǎn)品的安全性，因?yàn)楦鼮楹?jiǎn)便的給藥方式減少了在注射劑的制備過(guò)程中被針刺傷和滴落成分的機(jī)會(huì)。
因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種具有生物學(xué)活性的穩(wěn)定的β-干擾素液體制劑，用于注射的用途。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種制劑，該制劑不需要預(yù)先對(duì)β-干擾素組合物進(jìn)行凍干。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是防止β-干擾素液體制劑的穩(wěn)定性降低，是通過(guò)a)在液體組合物的制備過(guò)程中避免空化作用和/或液上空間的形成，或b)用所述液上空間保存液體制劑，該液上空間由一種惰性氣體組成，例如氬或氮。
本發(fā)明還有另一個(gè)目的是提供一種可以以液體狀態(tài)長(zhǎng)時(shí)間貯存的液體制劑，有利于給藥前的貯存和運(yùn)輸。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種易于制備和給藥的液體制劑，并且不需要凍干和再制備步驟。
本發(fā)明進(jìn)一步的目的是利用簡(jiǎn)單的氨基酸類代替常用的血清白蛋白作為穩(wěn)定劑，使監(jiān)測(cè)產(chǎn)品質(zhì)量更為容易。
本發(fā)明還有另一個(gè)目的是提供一種含有非凍干β-干擾素的藥物組合物，該組合物的生產(chǎn)成本低廉。
本發(fā)明的其他優(yōu)點(diǎn)一部分闡述在下面的說(shuō)明中，另一部分將通過(guò)該說(shuō)明書而顯而易見(jiàn)，或者可以通過(guò)實(shí)施本發(fā)明而獲知。結(jié)合在本說(shuō)明書中的附圖構(gòu)成了本說(shuō)明書的一部分，用來(lái)舉例說(shuō)明，和本說(shuō)明書一起起到解釋本發(fā)明原理的作用。
附圖的簡(jiǎn)要說(shuō)明

圖1表示保留在散裝加工液體中的β-干擾素單體百分比，它是該液體中溶解氧的百分比的函數(shù)。
圖2表示液體制劑BG9589-1以原料為標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化處理后的蛋白質(zhì)濃度對(duì)時(shí)間的百分比。標(biāo)為“4℃”的樣本(實(shí)心正方形)在2-8℃下恒溫。其他樣本在25℃(實(shí)心圓)、33℃(實(shí)心三角形)和40℃(實(shí)心菱形)下恒溫。
圖3表示液體制劑BG9589-3以原料為標(biāo)準(zhǔn)經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化處理后的蛋白質(zhì)濃度對(duì)時(shí)間的百分比。標(biāo)為“4℃”的樣本在2-8℃下恒溫。其他樣本在25℃(實(shí)心圓)、33℃(實(shí)心三角形)和40℃(實(shí)心菱形)下恒溫。
發(fā)明的詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明克服了目前策略和設(shè)計(jì)中的問(wèn)題和不足，提供了一種穩(wěn)定干擾素的簡(jiǎn)單方法和一種提高了貯存穩(wěn)定性的簡(jiǎn)單干擾素制劑。本發(fā)明是部分地基于我們的發(fā)現(xiàn)而作出的，即a)β-干擾素特別不穩(wěn)定，在與氧接觸時(shí)發(fā)生聚集作用，氧既可以是活躍地通入液體中的氣泡，也可以靜止地存在于液上空間中與之接觸；b)缺少載體、如人血清白蛋白的β-干擾素液體制劑對(duì)玻璃表面的吸收(即化學(xué)反應(yīng)或物理結(jié)合)特別敏感；和c)β-干擾素以較低的離子強(qiáng)度聚集，需要一個(gè)為含水狀態(tài)提供穩(wěn)定性的離子環(huán)境。
本發(fā)明因此涉及穩(wěn)定人β-干擾素的方法，避免了這些不利因素，還涉及所得被穩(wěn)定了的β-干擾素的液體制劑。
A、定義“緩沖液”一詞指一種弱酸及含有該酸陰離子的鹽的溶液，或一種弱堿及其鹽的溶液。特別是本說(shuō)明書所用的“乙酸鹽”一詞(又見(jiàn)下表I)指一種優(yōu)選含有乙酸鈉和乙酸的緩沖系統(tǒng)，“磷酸鹽”一詞指優(yōu)選分別含有磷酸氫二鈉與磷酸二氫鈉的七與一水合物的緩沖系統(tǒng)。而且，表II(見(jiàn)下)中那些含有酸性氨基酸以及氫氧化鈉的溶液盡管作為本領(lǐng)域已知的術(shù)語(yǔ)在習(xí)慣上是不被認(rèn)為是緩沖液的，然而也包括在此處的定義中。
“賦形劑”一詞指在加工和/或貯存過(guò)程中向液體制劑中加入的任意化合物，其作用是改變體積性質(zhì)、提高穩(wěn)定性和/或調(diào)節(jié)重量摩爾滲透壓濃度。
“穩(wěn)定劑”一詞指一種提高或者增強(qiáng)穩(wěn)定性的賦形劑。
“穩(wěn)定性”一詞必然具有功能定義，指干擾素活性、如抗病毒活性和/或干擾素結(jié)構(gòu)的相對(duì)暫時(shí)恒定性。
“空化的”一詞指由于壓力改變或物理攪拌作用，至少在制備和貯存過(guò)程中與含氧氣泡(例如空氣)接觸了的任意液體干擾素制劑。“空化作用”一詞也指在液體干擾素制劑的制備、貯存和使用過(guò)程中某時(shí)間點(diǎn)形成含氧氣體/液體界面?！翱栈摹币辉~也指在至少在制備和貯存過(guò)程中一般會(huì)遇到的溫度下，液體干擾素制劑中的溶氧水平超過(guò)大氣壓平衡值大約10％。
此處所用的“胃腸外”一詞包括皮下、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、胸骨內(nèi)、腹膜內(nèi)、眼或脊柱內(nèi)注射或輸液技術(shù)。
“藥學(xué)上可接受的鹽”這一表達(dá)方式指任何有機(jī)或無(wú)機(jī)加成鹽，該加成鹽在發(fā)揮出有效活性的濃度下對(duì)患者是相對(duì)無(wú)毒和無(wú)害的，以使可歸因于該鹽的副作用不會(huì)損害干擾素的治療作用。
化合物的“有效量”是能夠?qū)λ委煹木唧w疾病產(chǎn)生結(jié)果或發(fā)揮影響的量?！坝行Я俊币仓冈诳共《净钚缘腃PE試驗(yàn)中產(chǎn)生陽(yáng)性結(jié)果(即發(fā)揮抗病毒作用)的量。
此處所用的干擾素的“藥學(xué)上的有效量”指醫(yī)學(xué)和藥學(xué)領(lǐng)域中已知的、安全有效治療具體疾病的藥劑百分濃度。
“與血液等滲”(可互換使用“等滲性”)指具有足夠成分濃度的液體干擾素組合物，以使它的滲透行為基本上等同于血液，也就是說(shuō)，與制劑接觸的細(xì)胞基本上將保持其形狀，并且基本上不會(huì)由于滲透壓的作用而發(fā)生水的凈轉(zhuǎn)運(yùn)。
“聚離子種類”(可互換使用“聚合電解質(zhì)種類”)指一種高分子量的物質(zhì)，它是一種電解質(zhì)，當(dāng)被用于本發(fā)明制劑中時(shí)，對(duì)給定的重量摩爾滲透壓濃度來(lái)說(shuō)，產(chǎn)生最大化的離子強(qiáng)度。該定義是基于我們的發(fā)現(xiàn)而作出的，我們發(fā)現(xiàn)，高離子強(qiáng)度使β-干擾素穩(wěn)定，但是溶液與血液等滲的必要性限制了總離子強(qiáng)度(見(jiàn)實(shí)施例7)。對(duì)給定的重量摩爾滲透壓濃度來(lái)說(shuō)，一種優(yōu)選的最大化離子強(qiáng)度的方法是使用一種聚離子種類的賦形劑。
“對(duì)干擾素呈惰性”的物質(zhì)指該物質(zhì)至少具有與干擾素不發(fā)生物理和/或化學(xué)反應(yīng)的性質(zhì)。
B、制備干擾素一般來(lái)說(shuō)，本發(fā)明適用于所有類型的干擾素，包括天然干擾素、由重組DNA技術(shù)生產(chǎn)的干擾素和由化學(xué)合成或改性生產(chǎn)的干擾素。本發(fā)明也可以用在來(lái)自人或任意其他物種的成纖維細(xì)胞、白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞或任意其他含干擾素或產(chǎn)生干擾素的組織的粗品、半精制和精制干擾素。本發(fā)明最優(yōu)選適用于人成纖維細(xì)胞干擾素(β-干擾素)。
最優(yōu)選的β-干擾素是重組體形式，用于生成包括各種干擾素在內(nèi)的蛋白質(zhì)的重組DNA方法是已知的，無(wú)論如何不是用來(lái)限制本發(fā)明的。例如參見(jiàn)美國(guó)專利4399216、5149636、5179017(Axel等)；4470461(Kaufman等)。β-干擾素的重組形式已經(jīng)被制備出來(lái)了。例如參見(jiàn)歐洲專利041313(Fiers-β-干擾素的表達(dá))；美國(guó)專利4966843(McMormick等—干擾素在CHO細(xì)胞中的表達(dá))；美國(guó)專利5326859(Sugano等-DNA編碼的β-干擾素)。也可以利用重組方法或化學(xué)方法對(duì)β-干擾素進(jìn)行改性，并且可以在含血清或不含血清的介質(zhì)中生成。β-干擾素的形式可以包括變體，例如排除了半胱氨酸的突變體(美國(guó)專利4588585和4737462Mark等)和排除了甲硫氨酸的突變體(EP 260350-Wang等)。用糖部分進(jìn)行衍生作用(糖基化作用)或其他附加分子可以增大蛋白質(zhì)的基本氨基酸序列。通過(guò)宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)譯后處理系統(tǒng)，可以進(jìn)行其他改性處理。鏈中個(gè)別氨基酸殘基可以進(jìn)一步通過(guò)氧化、還原或其他衍生作用進(jìn)行改性，蛋白質(zhì)也可以被裂解得到活性片段。因此，具體重組β-干擾素的確切化學(xué)結(jié)構(gòu)取決于若干因素，也不是用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。所有這些包含在本文所述制劑中的β-干擾素蛋白質(zhì)當(dāng)被置于適當(dāng)?shù)沫h(huán)境條件下時(shí)，將保持它們的生物活性。
一種重組β-干擾素的制備方法是培養(yǎng)用人β-干擾素基因轉(zhuǎn)染的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞。在含有牛胎血清的混懸液培養(yǎng)基中成批生長(zhǎng)起來(lái)的CHO細(xì)胞分泌出重組β-干擾素。細(xì)胞可以在旋轉(zhuǎn)燒瓶中生長(zhǎng)，旋轉(zhuǎn)燒瓶(spinner flask)置于約35攝氏度(以下稱為“℃”)下的CO2恒溫箱中(5％CO2)。如果需要按比例擴(kuò)大培養(yǎng)的話，可以匯集多個(gè)旋轉(zhuǎn)燒瓶，并將正在增加的面積接種在發(fā)酵器中。在給定的發(fā)酵器中生長(zhǎng)大約六天，此間活性β-干擾素產(chǎn)物積聚在培養(yǎng)基中。然后可以收獲培養(yǎng)物，并通過(guò)諸如正切流動(dòng)式過(guò)濾等方法從含有產(chǎn)物的培養(yǎng)基上除去細(xì)胞。
C、精制干擾素干擾素的精制流程有詳細(xì)描述，對(duì)本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)也是可以獲知的。這些方法包括涉及各種色譜分離步驟的一步或多步程序。例如參見(jiàn)美國(guó)專利5015730(Friesen等—親合色譜法和HPLC)；4541952(Hosoi等—螯合色譜法)。
一種例舉性的方法涉及利用β-干擾素分子非同尋常的疏水性和相對(duì)堿性，以及它與金屬離子結(jié)合的強(qiáng)烈的親合性。例如參見(jiàn)Knight和Fahey，“人成纖維細(xì)胞干擾素—一種改進(jìn)的精制方法”，《生物化學(xué)雜志》2563609-3611(1981)，和Edy等，“鋅螯合色譜法精制人成纖維細(xì)胞干擾素”，《生物化學(xué)雜志》2325934-5935(1981)，二者均結(jié)合在此作為參考。
簡(jiǎn)單地說(shuō)，收集和精制步驟涉及將β-干擾素與一系列瓊脂糖Sepharose柱(由Pharmacia Biotech制造)結(jié)合，用鹽和多元醇洗脫。一旦將最終的瓊脂糖洗脫液稀釋并調(diào)低pH，其中的β-干擾素將與SPSepharose(Pharmacia Biotech)結(jié)合。大多數(shù)剩余的柱中所載帶的蛋白質(zhì)堿性強(qiáng)于單體β-干擾素，比干擾素更緊密地與柱結(jié)合。在該柱上DNA和病毒與β-干擾素分離開(kāi)來(lái)。然后用一系列含有氯化鈉的緩沖液洗滌柱子。
現(xiàn)在，干擾素產(chǎn)物已經(jīng)結(jié)合在預(yù)先裝載有鋅的螯合瓊脂糖Sepharose(Pharmacia Biotech)柱子上了。參見(jiàn)Edy等，出處同上。該柱子在無(wú)氧氣氛下操作，以保護(hù)分子中的自由巰基，所有后續(xù)步驟也是如此。將精制了的干擾素酸化，并保持在低pH下，使任何殘留的病毒失活。中和后，利用交叉流過(guò)濾法濃縮干擾素，然后換一種中性緩沖溶液進(jìn)行緩沖。緩沖液交換的過(guò)程降低了鋅和有機(jī)化合物的濃度。隨后，散裝干擾素在配制步驟前可以貯存在-70℃下。
D、配制干擾素在上述例舉性的精制方法中的第一次緩沖液交換過(guò)程之后，用一種pH在4與7.2之間的緩沖溶液代替中性緩沖溶液，進(jìn)行第二次緩沖液交換的過(guò)程，這種緩沖液含有一種穩(wěn)定劑，下文將有詳細(xì)描述。所得含干擾素制劑被稱為“加工中間體”，可以冷凍貯存。另見(jiàn)實(shí)施例7。
如果以冷凍狀態(tài)貯存(在一種惰性氣體的氣氛下，例如氬或氮)，然后可以將其解凍，并通過(guò)0.22微米濾器泵入稱重容器中，優(yōu)選為不銹鋼制，加工中間體在此與預(yù)先經(jīng)過(guò)濾器除菌的稀釋液混合，直至達(dá)到所需的終產(chǎn)物重量。稀釋液由第二次緩沖液交換過(guò)程所用相同的緩沖液組成。然后在無(wú)菌程序下利用諸如連續(xù)的兩個(gè)0.22微米濾器對(duì)液體終產(chǎn)物進(jìn)行除菌過(guò)濾，灌入優(yōu)選為不銹鋼制的密封容器中，該容器含有一個(gè)惰性氣體入口、一個(gè)脫氣閥/濾器聯(lián)合、和一個(gè)流入/流出浸漬管。終產(chǎn)物通過(guò)浸管泵入密封容器中。利用惰性氣體、如氮，將終產(chǎn)物壓力轉(zhuǎn)移至能夠無(wú)菌灌裝滅菌注射器的裝置的泵壓頭。
有若干無(wú)菌灌裝滅菌注射器的方法是可以獲知的，所用的具體方法不是用來(lái)限制本發(fā)明范圍的。一種例舉性的方法涉及使用HYPAK可進(jìn)行高壓滅菌的注射濾器(Becton Dickinson PharmaceuticalSystems，F(xiàn)ranklin Lakes，NJ)。注射器在適當(dāng)位置蓋上頂蓋后進(jìn)行高壓滅菌。一般來(lái)說(shuō)，這種類型的裝置具有一個(gè)真空室，它將裝有干擾素制劑的注射器包含其中。真空室被置于無(wú)菌環(huán)境。每支注射器均垂直排列在真空室中，使其開(kāi)口端與活塞相對(duì)，活塞能夠插入注射管的開(kāi)口端?；钊辉O(shè)計(jì)成是可以插入注射管堵住液體的塞子。插入后在注射器內(nèi)留有一小部分液上空間。將真空室抽空，用一種惰性的無(wú)氧氣體(例如氬、氮)反沖若干次，在達(dá)到最終的真空狀態(tài)時(shí)，利用機(jī)械作用將活塞推進(jìn)開(kāi)口的注射管內(nèi)一小段距離，塞子自動(dòng)地插入各自的注射器。然后對(duì)真空室內(nèi)通入過(guò)濾空氣，使真空室內(nèi)壓力恢復(fù)到大氣壓水平。真空度決定了含有惰性氣體的液上空間大小。
在我們所用的具體系統(tǒng)中，注射器是垂直取向的，并被旋轉(zhuǎn)盤上的鏈輪固定在適當(dāng)位置。注射器首先被定位在一支針頭下方，針頭插入注射器。用一種惰性氣體(例如氬、氮)通過(guò)針頭沖洗注射器內(nèi)部。針頭然后從注射器中收回。然后將注射器定位在第二支針頭下方，針頭插入注射器。該針頭連接在泵上，將產(chǎn)物分裝在注射器中。第二支針頭然后從注射器中收回。然后將注射器定位在第三支針頭下方，針頭插入注射器。用一種惰性的無(wú)氧氣體(例如氮、氬)將活塞(預(yù)先經(jīng)過(guò)高壓滅菌)吹入注射器，然后針頭從注射器中收回。固定活塞，使液體上表面和活塞底面之間留有惰性氣體的液上空間。
1、賦形劑賦形劑優(yōu)選為聚離子種類的，對(duì)給定的重量摩爾滲透壓濃度可以產(chǎn)生最大離子強(qiáng)度，例如一種聚合電解質(zhì)，可以包括肝素或其他聚合物。正如實(shí)施例4中的討論，高離子強(qiáng)度可穩(wěn)定β-干擾素，不過(guò)溶液與血液等滲的必要性限制了總離子強(qiáng)度。因此對(duì)給定的重量摩爾滲透壓濃度產(chǎn)生最大離子強(qiáng)度的一種優(yōu)選方法是使用聚離子種類的賦形劑。本發(fā)明的β-干擾素溶液對(duì)血液是等滲的(約290毫滲摩爾/千克)。
本發(fā)明最優(yōu)選的穩(wěn)定劑是一種氨基酸，可以包括下列之一任意的酸性氨基酸(例如谷氨酸、天門冬氨酸)或一種選自精氨酸和甘氨酸的氨基酸。最優(yōu)選地，氨基酸穩(wěn)定劑是以其在pH 5.0溶液中的酸性形式加入的精氨酸(精氨酸-HCL)。一種優(yōu)選的酸性氨基酸是L-谷氨酸。希望不受任何理論的局限，聚離子賦形劑是優(yōu)選的這一事實(shí)很可能是為什么精氨酸與賴氨酸(具有3個(gè)帶電荷基團(tuán))穩(wěn)定干擾素的效果好于甘氨酸(具有2個(gè)帶電荷基團(tuán))的原因，同樣其穩(wěn)定效果也好于任何不帶電荷的供試物。
如果賦形劑是精氨酸-HCl，其濃度將在0.5％(w/v)至5％的范圍內(nèi)，最優(yōu)選為3.13％(相當(dāng)于150mM精氨酸-HCl)。如果賦形劑是甘氨酸，其濃度將在0.50％(w/v)至2.0％的范圍內(nèi)，最優(yōu)選為0.52％(相當(dāng)于66.7mM至266.4mM，最優(yōu)選為70mM)。如果賦形劑是谷氨酸，其濃度將在100mM至200mM的范圍內(nèi)，最優(yōu)選為170mM(相當(dāng)于1.47％至2.94％的w/v百分比范圍，最優(yōu)選為2.5％)。
我們使用50mM乙酸鈉與冰醋酸以及100mM氯化鈉的pH 5.0緩沖系統(tǒng)分析了用作β-干擾素液體制劑穩(wěn)定劑的不同賦形劑。液體干擾素樣本或者在37℃下恒溫1至3周進(jìn)行熱壓處理，或者置于旋轉(zhuǎn)裝置上1至3天進(jìn)行機(jī)械壓力處理。利用實(shí)施例1所述的方法評(píng)價(jià)經(jīng)過(guò)處理后的樣本的β-干擾素穩(wěn)定性。正如實(shí)施例7中更為詳細(xì)的描述，用含有一種氨基酸賦形劑(可選還含有氯化鈉)的乙酸鈉以pH 5.0緩沖的制劑顯示出最好的穩(wěn)定性。
2、干擾素優(yōu)選的干擾素是成纖維細(xì)胞β-干擾素，最優(yōu)選為由哺乳動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生的重組人β-干擾素。重組人β-干擾素可以含有一個(gè)游離的巰基和至少一條二硫鍵。一種特別優(yōu)選的分子是每分子在17位含有一個(gè)游離的巰基，并在31位與141位之間含有一條二硫鍵。正如在天然人β-IFN的情況下所已知的那樣，在Asn-80預(yù)期發(fā)生N-糖基化作用。本發(fā)明液體制劑的濃度范圍為約30μg/ml至約250μg/ml。一個(gè)優(yōu)選的濃度范圍是48μg/ml至78μg/ml，最優(yōu)選的濃度是約60μg/ml。根據(jù)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)值，已用WHO有關(guān)干擾素的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)Natural#Gb-23-902-531對(duì)生源性內(nèi)標(biāo)進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)化處理，因此濃度范圍以IU表示(對(duì)0.5ml注射體積來(lái)說(shuō))為大約6IMU至50IMU，最優(yōu)選的濃度是12IMU。
3、緩沖液用在本發(fā)明中的有機(jī)酸與磷酸鹽緩沖液保持了pH在約4.0至7.2的范圍內(nèi)，優(yōu)選為約4.5至約5.5，最優(yōu)選為5.0，該緩沖液可以是常規(guī)的有機(jī)酸及其鹽的緩沖液，例如檸檬酸鹽緩沖液(例如檸檬酸一鈉-檸檬酸二鈉混合物、檸檬酸-檸檬酸三鈉混合物、檸檬酸-檸檬酸一鈉混合物等)、琥珀酸鹽緩沖液(例如琥珀酸-琥珀酸一鈉混合物、琥珀酸-氫氧化鈉混合物、琥珀酸-琥珀酸二鈉混合物等)、酒石酸鹽緩沖液(例如酒石酸-酒石酸鈉混合物、酒石酸-酒石酸鉀混合物、酒石酸-氫氧化鈉混合物等)、富馬酸鹽緩沖液(富馬酸-富馬酸一鈉混合物、富馬酸-富馬酸二鈉混合物、富馬酸一鈉-富馬酸二鈉混合物等)、葡萄糖酸鹽緩沖液(例如葡萄糖酸-葡萄糖酸鈉混合物、葡萄糖酸-氫氧化鈉混合物、葡萄糖酸-葡萄糖酸鉀混合物等)、草酸鹽緩沖液(例如草酸-草酸鈉混合物、草酸-氫氧化鈉混合物、草酸-草酸鉀混合物等)、乳酸鹽緩沖液(例如乳酸-乳酸鈉混合物、乳酸-氫氧化鈉混合物、乳酸-乳酸鉀混合物等)、磷酸鹽緩沖液(磷酸二氫鈉/磷酸氫二鈉)和乙酸鹽緩沖液(例如乙酸-乙酸鈉混合物、乙酸-氫氧化鈉混合物等)。
在下述實(shí)施例中，我們使用磷酸鈉、檸檬酸鈉、琥珀酸鈉、碳酸鈉和乙酸鈉的不同緩沖濃度和不同pH，以鑒別出最適當(dāng)?shù)木彌_液。β-干擾素樣本或者在37℃下放置6天至2周，或者置于旋轉(zhuǎn)裝置上7至9小時(shí)，以加速降解過(guò)程。然后測(cè)定樣本的化學(xué)性質(zhì)。分析樣本的光密度、作肽圖、體積排阻HPLC、還原性與非還原性SDS-PAGE/蛋白質(zhì)印跡和等電聚焦/蛋白質(zhì)印跡(IEF)，全部?jī)?nèi)容描述在下列實(shí)施例1中。將全部試驗(yàn)用β-干擾素樣本與起始β-干擾素原料或置于2至8℃之間的β-干擾素樣本進(jìn)行比較。我們的數(shù)據(jù)說(shuō)明，pH是決定我們的β-干擾素樣本穩(wěn)定性的主要因素，在pH4.0與5.0之間的樣本比pH7.0或以上的樣本更穩(wěn)定。見(jiàn)實(shí)施例2。盡管如此，我們也能夠研制出若干在生理pH(pH 7.2)下的β-干擾素制劑。見(jiàn)實(shí)施例6。
4、空化作用在高pH條件(pH＞8.0)下，β-干擾素中最自由的巰基發(fā)生氧化反應(yīng)，在此pH下二硫鍵發(fā)生重排。通過(guò)體積排阻色譜法、非還原性SDS-PAGE和激光散射，我們?cè)谏⒀b中間體中已經(jīng)檢測(cè)到β-干擾素一定程度的聚集作用。隨后我們發(fā)現(xiàn)，聚集了的β-干擾素的形成可依賴于所溶解的氧的濃度。為了確保液體β-干擾素制劑不發(fā)生空化作用，我們研究出來(lái)的標(biāo)準(zhǔn)過(guò)程包括(a)如果可能的話，在制備和貯存過(guò)程中不應(yīng)當(dāng)存在含氧氣體/液體界面；和/或(b)在制備和貯存過(guò)程中不應(yīng)當(dāng)有氣泡生成；和/或(c)在制備和貯存溫度下，制劑中溶解的氧的濃度應(yīng)當(dāng)保持在大氣平衡的10％以下。見(jiàn)實(shí)施例3。
5、干擾素到表面的吸附作用我們也測(cè)定了干擾素將吸附到某些表面上，其在玻璃容器中的貯存需要至少一個(gè)與干擾素接觸的容器表面涂有或者覆蓋一種材料，該材料防止或基本上消除吸附作用。該表面對(duì)吸附作用可以是化學(xué)惰性或物理惰性的。用于該目的例舉性材料是本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所已知的，例如可以包括噴淋或烘焙的聚硅氧烷、聚丙烯或聚四氟乙烯(PTFE)。我們采用所優(yōu)選的60μg/ml液體制劑(BG9589-1、2、3和4總結(jié)在下表1中)，灌裝在1ml長(zhǎng)的I型玻璃注射器和0.75ml的I型玻璃小瓶中，該注射器涂有噴淋的聚硅氧烷(BeckonDickinson)。然后用反相HPLC(rpHPLC)對(duì)樣本進(jìn)行分析，以測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。數(shù)據(jù)表明，與涂有聚硅氧烷的預(yù)灌裝樣本的注射器相比，灌裝在玻璃小瓶中的樣本溶液中的蛋白質(zhì)量更少。見(jiàn)實(shí)施例5。
6、優(yōu)選的制劑我們利用四種液體制劑進(jìn)行了蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的動(dòng)力學(xué)分析，它們的最終濃度如下表1所示，每種制劑均含有60μg/ml β-干擾素。表2中給出的是供交替使用的制劑，其中一部分含有表面活性劑，例如Pluronic F68(由BASF制造)。
表1優(yōu)選的制劑pH系統(tǒng) 賦形劑 最終的pH

所有制劑的組分均為USP級(jí)原料。詳細(xì)組成為BG9589-1成分(以原料計(jì))量精氨酸-HCl，USP15.8mg冰醋酸，USP0.167mg乙酸鈉三水合物，USP0.972mgβ-干擾素 30ugm注射用水，USP 0.5mlBG9589-2成分(以原料計(jì))量甘氨酸，USP2.628mg冰醋酸，USP0.185mg乙酸鈉三水合物，USP0.932mgβ-1a干擾素30ugm注射用水，USP 0.5ml氯化鈉 2.922mgBG9589-3成分(以原料計(jì))量精氨酸-HCl，USP14.725mg磷酸氫二鈉-7H2O 2.332mg磷酸二氫鈉-1H2O 0.359β-1a干擾素30ug注射用水，USP 0.5mlBG9589-4成分(以原料計(jì))量磷酸氫二鈉-7H2O 1.984mg磷酸二氫鈉-1H2O 0.359mgβ-1a干擾素30ug甘氨酸 2.628mg氯化鈉 2.922mg注射用水，USP 0.5ml表2其它制劑pH系統(tǒng)賦形劑 最終的pH

其他原料也可以結(jié)合在本發(fā)明的制劑中。它們可以包括下列防腐劑，其中所有優(yōu)選的百分比均為w/v苯酚(約0.2％)；對(duì)羥基苯甲酸甲酯(0.08％)；對(duì)羥基苯甲酸丙酯(0.008％)；間甲酚(0.1％)；氯丁醇(0.25％)；苯甲醇(0.1％)；和硫柳汞(0.1％)。在對(duì)蛋白質(zhì)聚集作用和脫酰胺作用進(jìn)行測(cè)定分析的基礎(chǔ)上(數(shù)據(jù)沒(méi)有列出)，最優(yōu)選的防腐劑是氯丁醇和苯甲醇。
7、用于胃腸外給藥的試劑盒本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式包括用于本發(fā)明液體制劑胃腸外給藥的成套試劑盒。包裝內(nèi)可以包括預(yù)先灌裝有本發(fā)明液體制劑的注射器、若干乙醇拭子、至少一支針頭、一條或幾條膠粘繃帶和使用說(shuō)明書。不言而喻，本發(fā)明的液體制劑也可以用在常規(guī)的無(wú)針-注射系統(tǒng)。
E、使用干擾素本發(fā)明的干擾素制劑具有抗病毒活性。見(jiàn)實(shí)施例7。對(duì)臨床使用來(lái)說(shuō)，決定干擾素在任意具體情況下的給藥量以及給藥頻率的因素例如所用干擾素的類型、所治療的疾病和患者對(duì)干擾素治療的反應(yīng)。
本發(fā)明液體組合物的一種優(yōu)選用途是用于治療復(fù)發(fā)的多發(fā)性硬化。天然β-干擾素與重組β-干擾素的凍干(即制備)液體制劑已用于對(duì)患有復(fù)發(fā)的多發(fā)性硬化的患者給藥。見(jiàn)Jacobs等《神經(jīng)病學(xué)記事》39285-294(1996年三月)及其引用的參考文獻(xiàn)，Jacobs和Munschauer，“用干擾素治療多發(fā)性硬化”，載于《多發(fā)性硬化的治療試驗(yàn)設(shè)計(jì)、結(jié)果和未來(lái)展望》pp.223-250(R.A.Rudnick等編)，LondonSpringer，1992。使用本文所述的液體制劑治療多發(fā)性硬化，是按照上面Jacobs等人的文獻(xiàn)中所述相同的方案進(jìn)行的，并測(cè)量相同的主要結(jié)果變量。
一種評(píng)價(jià)本液體制劑用途的方法是進(jìn)行毒理學(xué)研究和進(jìn)行與液體制劑給藥有關(guān)的組織刺激反應(yīng)的評(píng)價(jià)。我們已經(jīng)進(jìn)行了本液體制劑在兔子體內(nèi)的毒理學(xué)研究。見(jiàn)實(shí)施例8。
具體實(shí)施例方式
提供下列實(shí)施例用以闡述本發(fā)明的實(shí)施方式，但是不應(yīng)視為對(duì)本發(fā)明范圍的限制。
實(shí)施例1試驗(yàn)方法使用若干被充分特征化描述的方法來(lái)測(cè)定我們的液體制劑中β-干擾素的物理化學(xué)性質(zhì)，這些方法還可用于檢測(cè)其它干擾素的性質(zhì)。
通過(guò)測(cè)量320nm下的吸光度和580nm下的透光度，來(lái)檢測(cè)不溶性聚集物的有/無(wú)。通過(guò)測(cè)量278-280nm下的吸光度(消光系數(shù)為1.5)，或者通過(guò)反相高效液相色譜法(HPLC)并使用制劑緩沖液中β-干擾素的已知峰濃度作為標(biāo)準(zhǔn)，來(lái)測(cè)定可溶性蛋白質(zhì)的濃度。試驗(yàn)前對(duì)液體制劑樣本進(jìn)行離心處理。通過(guò)在TSK-GelG2000SWXL柱(Toso Haas，Montgomeryville，PA)上進(jìn)行體積排阻色譜法，以從β-干擾素單體中分離聚集物，來(lái)測(cè)定可溶性聚集物的百分比。在280nm下檢測(cè)到的峰面積用來(lái)計(jì)算可溶性聚集物百分比。
通過(guò)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳法(SDS-PAGE)來(lái)確定肽主鏈的穩(wěn)定性。在十二烷基硫酸鈉的存在下，用巰基乙醇還原β-干擾素，然后在10-20％梯度凝膠(MiniPlus Sepragel，綜合分離系統(tǒng)，Natick，MA)上進(jìn)行電泳。然后利用電泳法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至硝基纖維素膜上，使用抗β-干擾素抗體和與辣根過(guò)氧化酶偶聯(lián)的山羊抗小鼠抗體進(jìn)行免疫檢測(cè)，使其顯色。例如參見(jiàn)《蛋白質(zhì)的凝膠電泳，一種實(shí)用的方法》第2版，B.D.Hames和D.RickWood，IRLPress。
通過(guò)在一種聚丙烯酰胺凝膠(IEF 3-10 MiniPlus Sepragel，綜合分離系統(tǒng))上進(jìn)行等電聚焦，來(lái)檢測(cè)由脫酰胺作用和其他化學(xué)變化引起的凈表面電荷的改變。見(jiàn)《蛋白質(zhì)的凝膠電泳，一種實(shí)用的方法》，著者同上。
通過(guò)作肽圖也可以檢測(cè)甲硫氨酸的氧化作用、天冬酰胺的脫酰胺作用和其他可能的化學(xué)變化。在二硫蘇糖醇的存在下，用內(nèi)蛋白酶Lys-C(Wako Pure Chemicals公司)消化β-干擾素，所得肽的片段通過(guò)反相HPLC分離。一般見(jiàn)Kalgahtgi，K.，& Horvath，C.“通過(guò)高效液相色譜法實(shí)現(xiàn)快速作肽圖”，《色譜學(xué)雜志》443，343-354(1988)。
使用Glyko，Inc.(Novato，CA)的熒光團(tuán)輔助碳水化合物電泳(FACE)系統(tǒng)測(cè)定N-連接的低聚糖簡(jiǎn)要分析。使用肽N-糖苷酶F，從糖蛋白中釋放天冬酰胺連接(N-連接)的低聚糖，然后通過(guò)還原性胺化作用在還原末端用熒光團(tuán)標(biāo)記，分離，然后在聚丙烯酰胺凝膠上定量。
有大量方法可測(cè)定干擾素的抗病毒活性，例如在W.E.StewartII《干擾素系統(tǒng)》Springer-Verlag(1981年第2版)中有更詳細(xì)的描述。細(xì)胞病變作用抑制分析法(CPE)特別適用于測(cè)定干擾素的抗病毒活性。我們所優(yōu)選的方法記載在WHO技術(shù)報(bào)告叢書725附錄1(1985)中，結(jié)合在此作為參考。簡(jiǎn)單地說(shuō)，該CPE方法是先制備標(biāo)準(zhǔn)β-干擾素的儲(chǔ)備溶液，并預(yù)先用WHO參考標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行校準(zhǔn)。該儲(chǔ)備溶液在D-MEM+培養(yǎng)基中制得，濃度為10000單位(U)每ml，培養(yǎng)基含有10％胎牛血清和4mM L-谷氨酰胺。在進(jìn)行分析當(dāng)天，標(biāo)準(zhǔn)、對(duì)照和樣本用三種單獨(dú)的稀釋系列稀釋在D-MEM+中a)以32U/ml開(kāi)始，隨后以2倍稀釋；b)以12U/ml開(kāi)始，隨后以1.5倍稀釋；和c)以6U/ml開(kāi)始，隨后以1.2倍稀釋。向96孔微量滴定盤的小孔中一列一列地加入五十微升稀釋液，每種稀釋系列加入一個(gè)盤中。下一步，向每個(gè)小孔中以5×105個(gè)細(xì)胞/ml、50微升每孔加入在D-MEM+中的A549細(xì)胞(ATCC目錄編號(hào)CCL-185，Rockville，MD)，對(duì)細(xì)胞和β-干擾素進(jìn)行兩倍稀釋。細(xì)胞和干擾素在37℃下、5％二氧化碳中培養(yǎng)15至20小時(shí)。振搖盤中內(nèi)容物，使其進(jìn)入漂洗桶中，向每孔中加入適當(dāng)稀釋在培養(yǎng)基中的100微升EMC(腦心肌炎病毒)。病毒和細(xì)胞在37℃下、5％二氧化碳中培養(yǎng)30小時(shí)。振搖盤中內(nèi)容物，使其進(jìn)入漂洗桶中，向盤中加入0.75％結(jié)晶紫染料。5至10分鐘后，盤用蒸餾水洗滌，并干燥。每只分析盤包括既不含干擾素也不含EMC的細(xì)胞生長(zhǎng)對(duì)照孔、含有EMC與細(xì)胞但不含干擾素的病毒對(duì)照孔和不同稀釋系列的標(biāo)準(zhǔn)干擾素。用肉眼觀察盤子，以確定每列的最后一孔中含有存活的細(xì)胞(＞25％融合的紫色染色)。檢出限決定為標(biāo)準(zhǔn)的最低濃度，該濃度防止了病毒的細(xì)胞毒作用。通過(guò)用于標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定的檢出限和在樣本中得到干擾素活性(MU/ml)的樣本稀釋因子，將最后一個(gè)陽(yáng)性孔中的樣本稀釋液復(fù)復(fù)幾次。將由每只盤得到的結(jié)果轉(zhuǎn)換為對(duì)數(shù)單位，用于測(cè)定幾何平均值和計(jì)算95％置信區(qū)間。
實(shí)施例2緩沖系統(tǒng)的選擇我們制備了三組緩沖液，每組含有九至十種不同的組分。第I組含有pH在4.0與7.2之間的一系列磷酸鈉和/或100mM氯化鈉溶液。第II組含有pH在4.0與7.0之間的另一系列檸檬酸鈉緩沖液。第III組含有琥珀酸鈉、乙酸鈉和碳酸鈉緩沖溶液，均結(jié)合有100mM氯化鈉，pH值范圍為4.0至7.2。另兩種溶液用50mM硫酸鈉代替氯化鈉，pH為4.0和7.2。
在2-8℃下，將解凍的散裝β-干擾素透析入不同的緩沖液中過(guò)夜，其間至少進(jìn)行兩次緩沖液交換，然后無(wú)菌過(guò)濾，備用。通過(guò)278nm下的吸光度測(cè)定蛋白質(zhì)濃度(消光系數(shù)為1.5mg-1ml.cm-1)，全部樣本含有140ug/ml或150ug/ml β-干擾素。樣本過(guò)濾，分成四組，部分地灌裝在2.2ml eppendorf試管中。一組置于2-8℃下；一組置于37℃下6天至兩周；另一組置于旋轉(zhuǎn)裝置上7至9小時(shí)；最后一組用作零時(shí)間對(duì)照。用在各種處理過(guò)程中的蛋白質(zhì)濃度損失除以起始濃度，計(jì)算由不溶性聚集物引起的蛋白質(zhì)損失的百分比。
結(jié)果用蛋白質(zhì)濃度的損失除以起始蛋白質(zhì)濃度，計(jì)算由不溶性聚集物引起的百分蛋白質(zhì)損失。所有數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析說(shuō)明，在pH4.0與5.0的緩沖液中的干擾素樣本由聚集作用引起的蛋白質(zhì)的百分損失低于高pH者。在37℃下恒溫、且pH為4.0和5.0的干擾素樣本因聚集作用損失了大約10％和15％。在pH值超過(guò)6.0的條件下，損失升高至40-50％。我們也測(cè)定了在pH值超過(guò)6.0的條件下，干擾素樣本具有更多的可溶性聚集物。而且，我們利用作肽圖測(cè)定了隨著pH從4.0升高至7.2，去酰胺化的干擾素的量基本上呈線性增加；在pH為7.0及更高的條件下，超過(guò)85％的干擾素在研究過(guò)程中發(fā)生去酰胺作用。我們用IEF/蛋白質(zhì)印跡法測(cè)量了樣本中蛋白質(zhì)種類的等電點(diǎn)(pI)(也就是蛋白質(zhì)在電場(chǎng)中不發(fā)生移動(dòng)和蛋白質(zhì)上的平均電荷為零時(shí)的pH)，該印跡顯示，檸檬酸鈉中的樣本具有額外的pI帶，琥珀酸鈉中的樣本帶強(qiáng)度發(fā)生移位。磷酸鹽在pH 5.0下沒(méi)有緩沖能力。乙酸鈉加氯化鈉在pH 5.0下對(duì)帶型或強(qiáng)度沒(méi)有改變。
實(shí)施例3空化作用在實(shí)施例2所述的pH篩選試驗(yàn)過(guò)程中，我們發(fā)現(xiàn)，貯存試管的液上空間對(duì)某些樣本的蛋白質(zhì)損失起到關(guān)鍵作用。在2.2ml體積試管中的1.5ml樣本沒(méi)有觀察到蛋白質(zhì)的損失。相反，1.2ml樣本出現(xiàn)聚集物顯著增加的情況。這與我們的觀察結(jié)果是一致的，因?yàn)槲覀冇^察到，在精制過(guò)程的病毒滅活步驟中，聚集的β-干擾素的形成取決于在該步驟中所溶解的氧的水平。
簡(jiǎn)單地說(shuō)，病毒滅活步驟涉及用15％磷酸將螫合瓊脂糖洗出液(見(jiàn)C部分)的pH從7.85+/-0.25調(diào)至2.5與3.5之間，保持酸化的洗出液120-135分鐘，然后用0.5N氫氧化鈉回調(diào)至pH6.7+/-0.7。所有步驟均在2-8℃下進(jìn)行。我們?cè)O(shè)計(jì)了一項(xiàng)研究，以測(cè)定在β-干擾素聚集物的形成與所溶解的氧的量之間是否存在某種關(guān)系。
材料和方法將來(lái)自螯合瓊脂糖柱的洗出液分成50ml或100ml的等分試樣，置于100ml旋轉(zhuǎn)燒瓶中。向每只燒瓶中加入1ml用氬氣吹洗過(guò)的(argon-sparged)15％磷酸。然后將燒瓶輕微攪拌約2分鐘，并在2-8℃下不攪拌地保持約2小時(shí)。在此階段之后，加入6.5ml用氬氣吹洗過(guò)的氫氧化鈉，在不同時(shí)間用體積排阻色譜法進(jìn)行樣本分析。在加入堿的同時(shí)，用氧探針(Orion，860型)連續(xù)測(cè)量液體內(nèi)溶解的氧并記錄。對(duì)于所溶解的氧的水平等于或小于10％的樣本來(lái)說(shuō)，氬氣在反應(yīng)容器的液上空間中被沖走了。
結(jié)果
數(shù)據(jù)列在表1中，這些數(shù)據(jù)揭示了在加入氫氧化鈉的同時(shí)所溶解的氧的量與在病毒滅活步驟中β-干擾素單體的產(chǎn)出之間存在一種明確的關(guān)系。所溶解的氧濃度小于或等于10％的所得產(chǎn)出值明顯不同于所有其他氧濃度下的產(chǎn)出值。我們也對(duì)聚集物進(jìn)行了特征化描述(數(shù)據(jù)在這里沒(méi)有列出)，并測(cè)定了其特異性活性比散裝中間體降低了30-40倍。我們還測(cè)定了在非還原性條件下，超過(guò)大約90％的聚集物具有抗SDS變性作用，提示了聚集物內(nèi)存在著共價(jià)交聯(lián)方式。在還原性條件下(2％β-巰基乙醇)，聚集物崩解為單體，提示了該交聯(lián)涉及二硫鍵。
實(shí)施例4賦形劑的選擇在優(yōu)選的pH 5.0緩沖液中制得含有不同賦形劑的一系列β-干擾素(60ug/ml)制劑，緩沖液中含有50mM乙酸鈉和100mM氯化鈉。賦形劑包括甘氨酸、精氨酸-HCl、賴氨酸-HCl、蔗糖、甘油、PEG3350、谷胱甘肽和Pluronic F-68。在pH5.0、2-8℃下，使β-干擾素散裝中間體透析進(jìn)入50mM乙酸鈉和100mM氯化鈉中過(guò)夜，其間至少進(jìn)行兩次緩沖液交換，然后過(guò)濾備用。減去背景，由278nm下的吸光度測(cè)定β-干擾素濃度。將所有樣本稀釋至最終干擾素濃度約為60ug/ml。所有制得的樣本過(guò)濾，取兩毫升轉(zhuǎn)移至4ml玻璃小瓶(未經(jīng)聚硅氧烷處理)中，用氬氣對(duì)液上空間吹洗，然后將小瓶密封。將幾組樣本置于2-8℃和37℃下兩周。其他樣本通過(guò)在室溫下旋轉(zhuǎn)3天，對(duì)其施以機(jī)械壓力。
按照實(shí)施例1的程序?qū)颖具M(jìn)行分析。另外，用Ciba-Corning248型血液氣體分析儀測(cè)量制劑中所溶解的氧的百分比。“試驗(yàn)”值是樣本的氧分壓(mmHg)減去氮吹洗過(guò)的緩沖液空白的氧分壓，“對(duì)照”值是在室溫下貯存的緩沖液空白中的氧分壓減去氮吹洗過(guò)的緩沖液空白的氧分壓。百分溶解氧(“試驗(yàn)”/“對(duì)照”)總是小于30％。
結(jié)果在37℃下恒溫了兩周的樣本的IEF/蛋白質(zhì)印跡和SDS-PAGE/蛋白質(zhì)印跡顯示，在含有PEG3350和谷胱甘肽的樣本中，譜帶發(fā)生漂移，強(qiáng)度降低，以及有干擾素多聚體存在。再在37℃下恒溫一周后，在我們的印跡中，甘油賦形劑顯示出額外的一條帶。蔗糖賦形劑表現(xiàn)為帶強(qiáng)度降低。該最初的篩選程序使我們考慮用精氨酸-HCl、甘氨酸、氯化鈉和甘露糖醇進(jìn)行進(jìn)一步研究。
實(shí)施例5干擾素的吸附在2-8℃下，將解凍的散裝β-干擾素透析至BG9589-1、2、3和4(見(jiàn)表1)過(guò)夜，其間至少進(jìn)行兩次緩沖液交換，然后過(guò)濾備用。通過(guò)280nm下的吸光度測(cè)定蛋白質(zhì)濃度(消光系數(shù)為1.5mg-1ml.cm-1)。所有樣本稀釋至最終濃度大約為60ug/ml。稀釋了的樣本過(guò)濾，在三支1.0ml長(zhǎng)的噴有聚硅氧烷的BD注射器(I型玻璃)中各灌裝0.5ml，液上空間用氮沖洗，或者在三支0.75ml的I型玻璃小瓶中各灌裝0.75ml，液上空間用氬沖洗。用反相HPLC測(cè)定蛋白質(zhì)濃度(實(shí)施例1)。
結(jié)果下表3列出了用反相HPLC測(cè)定的蛋白質(zhì)濃度。數(shù)據(jù)顯示，與涂有聚硅氧烷的預(yù)灌裝的注射器相比，灌裝在玻璃小瓶中的樣本含有較少的蛋白質(zhì)。因此，使用經(jīng)聚硅氧烷處理的注射器作為β-干擾素液體制劑的包裝。
表3

實(shí)施例6生理pH下的制劑離子強(qiáng)度/磷酸鹽。我們對(duì)具有各種緩沖組分濃度的磷酸鹽/氯化鈉的pH 7.2緩沖系統(tǒng)進(jìn)行了初步研究，其中磷酸鹽濃度為10、50和75mM不等，離子強(qiáng)度(由I＝∑cIzI2定義，其中cI和zI分別是離子種類I的摩爾濃度和價(jià)電荷)為0.2、0.4和0.6，這是通過(guò)加入氯化鈉來(lái)調(diào)節(jié)的。
我們對(duì)磷酸鹽濃度(10、50和75mM)和離子強(qiáng)度(I＝0.2、0.4和0.6)變量使用了完整的析因設(shè)計(jì)。使用經(jīng)過(guò)Ellis和Morrison改寫的棋盤式分布表計(jì)算磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉和氯化鈉(用以達(dá)到所需的離子強(qiáng)度)在緩沖液中的組成，見(jiàn)“用于研究pH依賴過(guò)程的恒定離子強(qiáng)度的緩沖液”，《酶學(xué)方法》87405-426(1982)。等式可以測(cè)定特定pH所需的每種緩沖組分量、磷酸鹽濃度和離子強(qiáng)度。使β-干擾素散裝中間體通過(guò)Pharmacia PD-10脫鹽柱進(jìn)行緩沖液交換，由此得到析因?qū)嶒?yàn)所用的九種溶液。所得溶液的pH均為7.20+/-0.15。通過(guò)280nm下的吸光度測(cè)定濃度，然后用適當(dāng)緩沖液稀釋至β-干擾素濃度為150ug/ml。所得溶液在氬環(huán)境下通過(guò)0.22微米濾器進(jìn)行無(wú)菌過(guò)濾，將每1.3ml等分試樣灌裝在5ml玻璃小瓶中，液上空間為氬。樣本在37℃下恒溫6天，并重復(fù)進(jìn)行三次。通過(guò)580nm下的百分透光度、百分蛋白質(zhì)回收率和IEF-PAGE/蛋白質(zhì)印跡，對(duì)樣本進(jìn)行分析。
結(jié)果不同離子強(qiáng)度下的百分透光度分析表明，隨著離子強(qiáng)度的增加，透光度也有增加的趨勢(shì)(也就是說(shuō)，不溶性蛋白質(zhì)聚集物的濃度降低了)。百分蛋白質(zhì)回收率數(shù)據(jù)也顯示具有與之相似的趨勢(shì)，不過(guò)IEF-PAGE/蛋白質(zhì)印跡顯示脫酰胺作用與不同離子強(qiáng)度之間沒(méi)有什么關(guān)系，以致全部樣本都被同樣地脫酰胺了。因此，在37℃下貯存六天后，隨著磷酸鹽濃度降低和離子強(qiáng)度增加，樣本發(fā)生聚集作用的趨勢(shì)減弱。百分透光度和作為不同磷酸鹽濃度(這里沒(méi)有列出)的一個(gè)函數(shù)的百分回收率的試驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著磷酸鹽濃度的增加，％透光度有微弱降低的趨勢(shì)，但是方差分析顯示不同磷酸鹽濃度的樣本之間沒(méi)有顯著差異。百分回收率數(shù)據(jù)顯示磷酸鹽濃度越低，蛋白質(zhì)回收率越高(94％置信水平下有顯著差異)。IEF-PAGE/蛋白質(zhì)印跡顯示，不同磷酸鹽濃度對(duì)脫酰胺作用沒(méi)有明顯影響。
賦形劑/鹽的比例。初步研究(沒(méi)有表示出來(lái))說(shuō)明，某些賦形劑可能需要鹽(例如氯化鈉)的幫助，才能保持較高離子強(qiáng)度和在pH 7.2下表現(xiàn)出穩(wěn)定作用。我們利用賦形劑(甘氨酸、賴氨酸、精氨酸、蔗糖和甘露糖醇)和對(duì)等滲性有貢獻(xiàn)的氯化鈉部分(f鹽＝0、0.25、0.75和1.0)設(shè)計(jì)了析因研究。該部分的計(jì)算方法為f鹽＝O鹽/(O鹽+O賦形劑)，其中O鹽和O賦形劑分別是溶液中氯化鈉和賦形劑的重量摩爾滲透壓濃度，以mOsm/kg表示。鹽部分提供了將鹽的作用與不同賦形劑進(jìn)行對(duì)比的方法。由于賦形劑鹽的比例(如f鹽所定義)不同，全部樣本都含有添加劑，使其為等滲。
制備每種賦形劑在20mM磷酸鹽中的、pH為7.2的10％(w/v)儲(chǔ)備溶液，脫氣，并用氬氣吹洗。制備250mM氯化鈉、20mM磷酸鹽、pH為7.2的儲(chǔ)備溶液，脫氣，并用氬氣吹洗。將散裝β-干擾素中間體對(duì)用氬氣吹洗過(guò)的、pH為7.2的20mM磷酸鹽緩沖液進(jìn)行透析。通過(guò)280nm下的吸光度測(cè)定所得溶液的β-干擾素濃度，用磷酸鹽緩沖液和各賦形劑和鹽的儲(chǔ)備溶液稀釋至β-干擾素濃度為60ug/ml，并達(dá)到所需最終的鹽和賦形劑條件。所得樣本無(wú)菌過(guò)濾(0.22微米)，灌裝在1.0ml Becton Dickinson聚硅氧烷噴涂的I型玻璃注射器中(灌裝體積為0.5ml)，液上空間為氮。樣本在40℃下貯存。
6天后，分別在通過(guò)0.22微米濾器過(guò)濾的前后測(cè)定320nm和280nm下的吸光度，對(duì)甘氨酸和蔗糖樣本進(jìn)行分析。2周后，對(duì)精氨酸、賴氨酸和甘露糖醇進(jìn)行類似分析，同時(shí)進(jìn)行IEF-PAGE、還原性SDS-PAGE和非還原性SDS-PAGE。對(duì)照樣本在2至8℃間貯存，也進(jìn)行類似分析。
結(jié)果隨著蔗糖和甘露糖醇的f鹽升高，β-1a干擾素的回收率(為對(duì)照的百分比)也升高了，在f鹽＝1(130mM氯化鈉)時(shí)回收率達(dá)到最大。對(duì)精氨酸和賴氨酸來(lái)說(shuō)，隨著f鹽升高，回收率降低。在大約f鹽＝0.75下，pH 7.2的甘氨酸制劑達(dá)到了最大回收率。
使用含有不同賦形劑、如甘氨酸、賴氨酸、精氨酸、甘露糖醇和蔗糖等的等滲pH 7.2磷酸鹽緩沖液進(jìn)行的賦形劑篩選研究顯示，所有不帶電荷的賦形劑的回收率都很低。例如，還原性和非還原性SDS/PAGE說(shuō)明全部制劑中的非糖基化類的β-干擾素都減少了，單獨(dú)的等滲氯化鈉和甘露糖醇的多聚體帶都加強(qiáng)了?？偟膩?lái)說(shuō)，在這些生理pH下的緩沖系統(tǒng)中，賦形劑的離子特征與其抗β-干擾素聚集的穩(wěn)定能力之間存在明顯的關(guān)系。蔗糖和甘露糖醇等非離子性添加劑似乎不提供保護(hù)作用，或者實(shí)際上可能在生理pH下加速蛋白質(zhì)的損失。每個(gè)可溶性種類(species)帶一個(gè)單電荷的氯化鈉的作用優(yōu)于甘露糖醇或蔗糖。在生理pH下，每分子氨基酸含有兩個(gè)電荷。如果是甘氨酸的話，分子本身的兩性離子性質(zhì)似乎不足以穩(wěn)定β-干擾素。每分子精氨酸和賴氨酸都含有三個(gè)電荷，對(duì)β-干擾素的穩(wěn)定作用要好于單用氯化鈉或甘氨酸/氯化鈉制劑。
實(shí)施例7穩(wěn)定性和動(dòng)力學(xué)研究在惰性氣氛下，將制劑無(wú)菌灌裝在注射器中，將注射器在一定溫度范圍內(nèi)恒溫不同的時(shí)間階段，對(duì)注射器內(nèi)容物進(jìn)行分析。簡(jiǎn)單地說(shuō)，在2-8℃下，將解凍的散裝β-干擾素透析至BG9589-1、-2、-3和-4過(guò)夜，其間至少進(jìn)行兩次緩沖液交換。通過(guò)280nm下的吸光度測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，消光系數(shù)為1.5ml/mg/cm。全部樣本稀釋至β-1a干擾素的最終濃度約為60ug/ml。將表1的四種β-1a干擾素制劑過(guò)濾，取0.5ml分配在1.0ml長(zhǎng)的Becton Dickinson(BD)注射器中，注射器的內(nèi)表面涂有烘焙的聚硅氧烷或噴霧的聚硅氧烷。利用0D、體積排阻HPLC(SEC)、等電聚焦凝膠電泳(IEF)/蛋白質(zhì)印跡、還原的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)/蛋白質(zhì)印跡、作肽圖、熒光團(tuán)輔助碳水化合物電泳(FACE)和CPE生物測(cè)定對(duì)樣本進(jìn)行分析。注射器的液上空間為氮?dú)狻Ｗ⑸淦髟?-8℃、25℃、33℃和40℃下恒溫達(dá)九十天。按照實(shí)施例1的方法分析樣本。
結(jié)果我們分析了樣本的蛋白質(zhì)濃度，并利用在不同溫度下恒溫九十天的原料樣本進(jìn)行過(guò)標(biāo)準(zhǔn)化處理。圖2說(shuō)明，在從2-8℃(平均4℃)至25℃的溫度范圍內(nèi)恒溫三個(gè)月后，BG9589-1顯示出完美的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性(沒(méi)有蛋白質(zhì)損失)。在接近體溫的溫度(33℃)下貯存，有大約18％的蛋白質(zhì)降解。在超過(guò)體溫的溫度(40℃)下貯存，3個(gè)月后有大約百分之三十的蛋白質(zhì)降解。BG9589-2基本上也得到相同的結(jié)果(沒(méi)有顯示)。圖3說(shuō)明對(duì)BG9589-3進(jìn)行2個(gè)月貯存試驗(yàn)的結(jié)果。蛋白質(zhì)在4至25℃下的降解作用最小，但在較高溫度下快速降解。BG9589-4的結(jié)果基本上與圖2和圖3相同。這些數(shù)據(jù)使用還原的SDS-PAGE/蛋白質(zhì)印跡得到了證實(shí)。
在“烘焙”的注射器中，在本研究的時(shí)間階段內(nèi)，沒(méi)有檢測(cè)到可溶性聚集物的存在。蛋白質(zhì)濃度、CPE測(cè)定、百分氧化的AP6和碳水化合物簡(jiǎn)要分析中沒(méi)有觀察到明顯改變。還原性SDS-PAGE/蛋白質(zhì)印跡和IEF/蛋白質(zhì)印跡可以看到，樣本中沒(méi)有可觀察到的改變。與起始時(shí)間點(diǎn)相比，百分脫酰胺作用有一定提高。不過(guò)，用于灌裝這些注射器的散裝中間體具有37％的脫酰胺作用，高于灌裝入注射器后的33.8％。后者這一低值可能是由測(cè)定變異性引起的。在“噴霧”的注射器中，在本研究的時(shí)間階段內(nèi)，也沒(méi)有檢測(cè)到可溶性聚集物的存在。蛋白質(zhì)濃度、CPE測(cè)定、百分脫酰胺作用、百分氧化的AP6和碳水化合物簡(jiǎn)要分析中沒(méi)有觀察到明顯改變。還原性SDS-PAGE/蛋白質(zhì)印跡和IEF/蛋白質(zhì)印跡可以看到，樣本中沒(méi)有可觀察到的改變。簡(jiǎn)言之，迄今為止的結(jié)果已經(jīng)顯示，終產(chǎn)物BG9589-1在“烘焙聚硅氧烷”注射器中、在2-8℃下3個(gè)月是穩(wěn)定的，在“噴霧聚硅氧烷”注射器中、在2-8℃下6個(gè)月是穩(wěn)定的。
在注射器進(jìn)行無(wú)菌灌裝后，我們對(duì)BG9589-1和BG9589-2制劑進(jìn)行了抗病毒CPE測(cè)定(見(jiàn)表1)。所報(bào)告的BG9589-1和BG9589-2的活性值均為12.0MU/ml。樣本在2-8℃下貯存3個(gè)月后，重復(fù)抗病毒CPE測(cè)定。所報(bào)告的BG9589-1的活性值為11.6MU/ml(n＝8)，10.2-13.3MU/ml的置信區(qū)間為95％。
我們也測(cè)量了BG9589-1的散裝中間體原料在2-8℃下5個(gè)月和-70℃下6個(gè)月的穩(wěn)定性。用實(shí)施例1的方法分析小規(guī)模滲濾研究后得到的BG9589-1樣本。迄今為止的結(jié)果已經(jīng)顯示，BG9589-1的半成品原料在2-8℃下5個(gè)月、和在-70℃下6個(gè)月是穩(wěn)定的。
在這項(xiàng)特別研究的時(shí)間階段內(nèi)，沒(méi)有檢測(cè)到可溶性聚集物的存在。百分脫酰胺作用和碳水化合物簡(jiǎn)要分析沒(méi)有觀察到明顯改變(百分脫酰胺作用中的差異是在測(cè)定變異性范圍內(nèi))。還原性SDS-PAGE/蛋白質(zhì)印跡和IEF/蛋白質(zhì)印跡可以看到，樣本中沒(méi)有可觀察到的改變。蛋白質(zhì)濃度有輕微降低。-70℃下蛋白質(zhì)濃度的降低可能是由樣本經(jīng)過(guò)一次冷凍/解凍周期所引起的。蛋白質(zhì)濃度的降低仍然在最初濃度的15％內(nèi)。
實(shí)施例8臨床前研究進(jìn)行兔的單次肌內(nèi)(IM)劑量局部耐受性研究，來(lái)評(píng)價(jià)以幾種新制劑給藥的干擾素的局部毒性。由本發(fā)明液體制劑或凍干并再制備干擾素制劑給藥所引起的注射部位的反應(yīng)可與生理鹽水給藥后所引起的現(xiàn)象比較。
1、四種β-干擾素制劑的單劑量IM給藥后的兔刺激反應(yīng)/生物利用度研究二十只雄性新西蘭白兔每只均接受單次30ug β-1a干擾素的五種制劑之一的肌內(nèi)(IM)注射BG9589-1(pH 5.0，乙酸鹽緩沖液，精氨酸穩(wěn)定劑，0.5ml/劑)；BG9589-2(pH 5.0，乙酸鹽緩沖液，甘氨酸/氯化鈉穩(wěn)定劑，0.5ml/劑)；BG9589-3(pH 7.2，磷酸鹽緩沖液，精氨酸穩(wěn)定劑，0.5ml/劑)；BG9589-4(pH 7.2，磷酸鹽緩沖液，甘氨酸/氯化鈉穩(wěn)定劑，0.5ml/劑)；和一種pH 7.2的凍干β-干擾素制劑，含有1.5％HSA，1.0ml/劑(見(jiàn)Jacobs等，出處同上)。
每四只動(dòng)物接受一種治療。接受BG9589-1或凍干制劑的動(dòng)物還接受等體積生理鹽水的對(duì)側(cè)部位注射，作為陰性對(duì)照。給藥后72小時(shí)內(nèi)采集血樣，進(jìn)行血清β-干擾素活性分析。在給藥后6、12、24、48和72小時(shí)用肉眼觀察皮膚，以評(píng)價(jià)紅斑、瘢痕形成和水腫情況。72小時(shí)給藥后血液采集之后，將動(dòng)物處死，用肉眼檢查注射部位的組織損傷表現(xiàn)，然后固定在10％中性緩沖的福爾馬林中。用顯微鏡檢查肌肉樣本(三份/注射部位)的炎癥、壞死、出血和損害。
結(jié)果用基本刺激反應(yīng)指數(shù)分(EPA皮膚分類系統(tǒng))評(píng)分后發(fā)現(xiàn)，上述液體制劑經(jīng)測(cè)定對(duì)皮膚的刺激反應(yīng)均沒(méi)有超過(guò)輕微程度。有一只動(dòng)物的BG9589-4注射部位用肉眼檢查發(fā)現(xiàn)有輕微的刺激反應(yīng)(出血)；不過(guò)顯微檢查發(fā)現(xiàn)沒(méi)有出血表現(xiàn)，肉眼觀察結(jié)果經(jīng)確定是人為現(xiàn)象。簡(jiǎn)言之，顯微檢查揭示了液體制劑試樣注射部位反應(yīng)恒為最小程度，反應(yīng)的嚴(yán)重性均沒(méi)有超過(guò)由凍干制劑或生理鹽水給藥所誘發(fā)的刺激反應(yīng)。
另外，利用多組兔子可以容易地試驗(yàn)液體制劑反復(fù)IM給藥后的兔皮膚刺激反應(yīng)，動(dòng)物將每隔一天接受液體制劑或生理鹽水的肌內(nèi)注射，持續(xù)八天(共給藥五次)。給藥部位選定為每只動(dòng)物背部，以使暴露在試樣下的局部面積最大。每治療組在每次給藥后4-6小時(shí)和最后一次給藥后24小時(shí)，用肉眼進(jìn)行皮膚評(píng)價(jià)。在每次皮膚評(píng)價(jià)時(shí)進(jìn)行每日的大體觀察。給藥后肉眼檢查的24小時(shí)之后，將動(dòng)物處死，檢查注射部位的組織損傷表現(xiàn)，然后將組織固定在10％中性緩沖的福爾馬林中。用顯微鏡檢查防腐組織的炎癥、壞死、出血和損害。還在最初的試樣給藥之前和處死時(shí)立即采集血樣，進(jìn)行血液學(xué)和血清化學(xué)評(píng)價(jià)。
實(shí)施例9臨床研究本發(fā)明的液體制劑與以前的干擾素制劑有顯著區(qū)別。對(duì)任何臨床適應(yīng)征來(lái)說(shuō)，在對(duì)人給藥后，干擾素的藥動(dòng)學(xué)和藥效學(xué)特性有可能發(fā)生改變。不幸的是，β-干擾素活性是高度種特異性的，最相關(guān)的藥理學(xué)信息來(lái)自對(duì)培養(yǎng)的人細(xì)胞、對(duì)人、以及在較小程度上對(duì)恒河猴的研究結(jié)果。如果有藥理學(xué)改變的話，試驗(yàn)其改變的優(yōu)選方法是進(jìn)行人生物等價(jià)試驗(yàn)。
使用細(xì)胞病理學(xué)作用(CPE)生物測(cè)定法可以定量分析血清中β-干擾素的抗病毒水平，方法例如實(shí)施例1所述。用任意數(shù)量的液體與凍干干擾素制劑可以進(jìn)行人生物等價(jià)研究。通過(guò)對(duì)血清、曲線下面積(AUC)和CMAX活性參數(shù)的分析，普通技術(shù)人員能夠確定凍干制劑和液體制劑是否是生物等價(jià)的。作為唯一的生物等價(jià)研究方案例子，我們簡(jiǎn)要地描述了一種雙盲的、單劑量的、交叉研究，用以證明在健康志愿者身上，本發(fā)明的液體制劑和凍干的β-干擾素產(chǎn)品是生物等價(jià)的。
方案在雙盲、兩階段的交叉試驗(yàn)中，每位受試者接受相同劑量(例如60ug/12MU)的β-干擾素制劑(表4)。受試者年齡在18至45歲之間，對(duì)不同的身高和體格來(lái)說(shuō)，體重都在相應(yīng)的正常體重范圍的15％內(nèi)，包括15％。在每次給藥前和在各次給藥時(shí)間后立即抽取血樣，用于血液學(xué)、化學(xué)、血清β-干擾素活性和藥效學(xué)簡(jiǎn)要分析，直至給藥后144小時(shí)。還進(jìn)行了注射疼痛和注射部位反應(yīng)的評(píng)估。
研究指導(dǎo)為了預(yù)防與干擾素有關(guān)的流感并發(fā)癥，全部受試者將在給藥階段前立即接受對(duì)乙酰氨基酚，在整個(gè)給藥階段中也是如此。
藥動(dòng)學(xué)血清β-干擾素測(cè)定。用(CPE)測(cè)定法測(cè)量血清水平，作為抗病毒活性的單位。分析血清抗病毒水平的AUC、Cmax和Tmax。AUC值將從給藥時(shí)間計(jì)算到最后可檢測(cè)水平的時(shí)間(AUC0-T)，并一直到給藥后144小時(shí)(AUC0-144)。使用SAS(6.08版，SAS Institute，Cary，NorthCarolina)進(jìn)行治療數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)描述分析。
表5示范研究的給藥方案給藥組途徑劑量(MU)治療階段1 治療階段21 IM 12 凍干(60mcg)液體(60mcg)2 IM 12 液體(60mcg)凍干(60mcg)藥效學(xué)對(duì)生物標(biāo)記物新蝶呤進(jìn)行了特征化描述，這是一種干擾素誘導(dǎo)的GTP環(huán)水解酶產(chǎn)物，它反映巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞的活化作用(C.Huber等《實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》1984；160310-314；1996年9月20日；D.Fuchs等《今日免疫學(xué)》9150-155，1988)。在重組人β-干擾素的非臨床研究和臨床研究中，新蝶呤的誘導(dǎo)產(chǎn)生與各種重組人β-干擾素給藥治療后的血清活性水平有相互關(guān)系。
通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室程序測(cè)量新蝶呤。通過(guò)三個(gè)血清新蝶呤參數(shù)的計(jì)算，以定量方式描述了β-干擾素的藥效學(xué)概況。第一個(gè)參數(shù)EAUC是新蝶呤-時(shí)間曲線下面積，曲線用基線水平作過(guò)規(guī)范化。第二個(gè)參數(shù)是EMAX；該參數(shù)是所觀察到的峰新蝶呤水平與基線新蝶呤水平之間的差異。第三個(gè)參數(shù)是誘導(dǎo)比IR；該參數(shù)是用峰新蝶呤水平除以基線新蝶呤水平計(jì)算得到的。
統(tǒng)計(jì)學(xué)對(duì)AUC使用Wilcoxon-Mann-Whitney雙、單側(cè)試驗(yàn)程序，以測(cè)定等價(jià)性。為了估計(jì)液體制劑中的干擾素相對(duì)于凍干制劑中的干擾素的相對(duì)生物利用度及其90％置信限，將AUC進(jìn)行對(duì)數(shù)變換后再進(jìn)行方差分析(ANOVA)。通過(guò)“個(gè)體間差異”將順序和性別分離開(kāi)來(lái)。通過(guò)“個(gè)體內(nèi)差異”將不同階段和治療的組成部分分離開(kāi)來(lái)。
等價(jià)形式通過(guò)考慮說(shuō)明書和實(shí)施這里所公開(kāi)的發(fā)明，本發(fā)明的其他實(shí)施方式和用途對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)將是顯而易見(jiàn)的。說(shuō)明書和實(shí)施例應(yīng)被理解為僅供舉例說(shuō)明之用，而權(quán)利要求書才指出了本發(fā)明的真實(shí)范圍和精神。
權(quán)利要求
1.一種液體組合物，所述組合物包含干擾素和穩(wěn)定干擾素并使溶液與血液等滲的試劑，并含有維持pH在約4.0至約7.2范圍內(nèi)的緩沖劑；其中所述液體組合物不被進(jìn)一步冷凍干燥。
2.一種液體藥物組合物，所述組合物包含(a)干擾素，(b)緩沖劑，和(c)穩(wěn)定干擾素并使溶液與血液等滲的試劑；其中所述組合物的pH在約4.0至約6.0范圍內(nèi)；所述組合物不含有血清白蛋白，并且所述液體組合物不被進(jìn)一步冷凍干燥。
3.一種制備穩(wěn)定的液體藥物組合物的方法，所述方法包括混合下列組分(a)干擾素，(b)維持pH在約4.0至約7.0范圍內(nèi)的酸或緩沖劑，和(c)穩(wěn)定干擾素并使溶液與血液等滲的試劑；其中所述液體組合物不被進(jìn)一步冷凍干燥。
全文摘要
描述了pH在4.0與7.2之間的液體干擾素組合物。該組合物包含β－干擾素和約0.3至5重量％的一種穩(wěn)定劑，該穩(wěn)定劑是氨基酸，其選自酸性氨基酸、精氨酸和甘氨酸。如果需要的話，加入鹽以提供足夠的離子強(qiáng)度。該液體組合物預(yù)先不經(jīng)過(guò)凍干，預(yù)先也不被空化。該液體優(yōu)選包含在一個(gè)容器中，該容器具有至少一個(gè)與該液體接觸的表面，該表面涂有一種對(duì)β－干擾素的吸附作用顯惰性的材料。也描述了一種用于液體干擾素制劑胃腸外給藥的試劑盒和一種用于穩(wěn)定液體干擾素組合物的方法。
文檔編號(hào)A61K47/18GK1733296SQ20051009151
公開(kāi)日2006年2月15日 申請(qǐng)日期1997年12月23日 優(yōu)先權(quán)日1996年12月24日
發(fā)明者M·D·迪比西, M·斯泰普斯, 李文莉, E·沙林 申請(qǐng)人:拜奧根Idec馬薩諸塞公司