專利名稱：自組裝復合納米顆粒腫瘤疫苗及其制備方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及一種新型治療性腫瘤疫苗，具體地說涉及一種自組裝復合納米顆粒腫瘤疫苗及其制備方法。
背景技術(shù)：
腫瘤疫苗是腫瘤生物治療中的重要手段，它通過激發(fā)機體免疫系統(tǒng)，在體內(nèi)產(chǎn)生針對腫瘤細胞的特異性的識別和殺傷。在預防腫瘤的復發(fā)和轉(zhuǎn)移方面，腫瘤疫苗具有手術(shù)、化療、放療三大傳統(tǒng)治療手段無法比擬的獨特優(yōu)勢[Mocellin S，et al Cancer vaccine developmenton the way to break immunetolerance to malignant cells.Exp Cell Res.2004；299(2)267-78]。
腫瘤疫苗，目前已經(jīng)研究和開發(fā)的有以下多種形式(1)以腫瘤全細胞為基礎的疫苗腫瘤裂解物，基因轉(zhuǎn)染的腫瘤細胞，腫瘤細胞RNA疫苗等；(2)腫瘤抗原疫苗以明確的腫瘤抗原為基礎，包括肽疫苗，DNA疫苗，自身RNA疫苗等；(3)DC為基礎的疫苗包括腫瘤-DC融合細胞疫苗，腫瘤裂解物、RNA和抗原肽沖擊DC疫苗等。其它還有熱休克蛋白融合肽疫苗，RNA疫苗、外小體(exosomes)疫苗等。但上述疫苗，尚沒有達到理想的免疫治療效果[Yannelli JR，etal On the road to a tumor cell vaccine20 years ofcellular immunotherapy.Vaccine.2004；23(1)97-113]。腫瘤疫苗的制備涉及到腫瘤抗原、免疫遞呈、免疫共刺激及免疫微環(huán)境等多方面的問題，只有將多種免疫學機制和多種疫苗形式有機地融合到一起，才有可能使多種作用機制，協(xié)同性發(fā)揮作用，最大程度地增強腫瘤疫苗的免疫保護效果。目前的腫瘤疫苗制備技術(shù)，尚不能達到上述目的，本發(fā)明將發(fā)展自組裝復合納米顆粒疫苗技術(shù)，實現(xiàn)多種免疫學機制和多種疫苗形式的有機融合，大幅度提高腫瘤疫苗的免疫保護效果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一類融合多種作用機制的自組裝復合納米顆粒腫瘤疫苗，還提供了自組裝復合納米顆粒腫瘤疫苗的制備方法。
本發(fā)明公開的自組裝復合納米顆粒腫瘤疫苗，為一種由腫瘤細胞膜脂質(zhì)、蛋白質(zhì)分子元件、DNA質(zhì)粒三種成分自組裝形成的納米顆粒，如

圖1所示。它是將腫瘤抗原分子、免疫佐劑分子等各種分子元件構(gòu)建到真核表達載體上，分別錨定表達在腫瘤細胞表面，然后將表達有關(guān)分子元件的細胞進行混合，提取收獲細胞膜，將細胞膜裂解成含有錨定形式蛋白質(zhì)分子元件的膜脂質(zhì)成分，與含有腫瘤抗原分子、免疫調(diào)節(jié)分子的DNA質(zhì)?；旌?，在一定的緩沖條件下自組裝形成納米顆粒腫瘤疫苗。電鏡結(jié)果顯示，自組裝納米顆粒復合腫瘤疫苗顆粒直徑為100-300nm，有利于單核巨噬系統(tǒng)吞噬。
組成腫瘤疫苗的蛋白質(zhì)形式或基因形式的分子元件，含有腫瘤抗原分子、免疫佐劑分子等的一種或幾種；腫瘤抗原分子包括特異性腫瘤抗原和抗轉(zhuǎn)移和血管靶點的抗原；免疫佐劑分子包括GM-CSF、IL-2、B7、4-1BBL、SLC、CD40L、FL等。
組成腫瘤疫苗的蛋白質(zhì)分子元件，融合有來源于人免疫球蛋白的IgGFc蛋白片段，通過GPI與細胞膜脂質(zhì)成分連接，并融合有來源于魚精蛋白的陽離子蛋白片段，可與含陰離子電荷的核酸結(jié)合，結(jié)合一種或幾種含有腫瘤抗原分子、免疫調(diào)節(jié)分子DNA質(zhì)粒。
本發(fā)明提供的自組裝復合納米顆粒腫瘤疫苗，含有以下具體的技術(shù)特征1、復合抗原靶點本發(fā)明除了利用腫瘤細胞本身提供腫瘤抗原，還選擇已知的特異性腫瘤抗原、血管靶點和轉(zhuǎn)移靶點，從多種層面上解決靶抗原的選擇問題，對抗原進行進一步強化，使激發(fā)的免疫反應，不但能夠攻擊腫瘤細胞本身，而且對腫瘤新生血管生成及腫瘤轉(zhuǎn)移，都能夠發(fā)揮強力的抑制作用，從而實現(xiàn)對腫瘤細胞的立體化攻擊和抑制，比目前其它腫瘤疫苗選擇單向靶點(主要是腫瘤抗原)有較大優(yōu)勢[Liu JY，et al Immunotherapy of tumorswith vaccine based on quail homologous vascular endothelial growth factorreceptor-2.Blood.2003；102(5)1815-23]。
2、佐劑分子配伍目前有多種免疫佐劑分子和DC遞呈細胞等曾用于疫苗的研究，我們對這些免疫分子及細胞的協(xié)同作用做了細致深入的配伍研究，找到了最佳的分子配伍方案，發(fā)現(xiàn)GM-CSF、IL-2、B7可以作為基本配伍方案、4-1BBL、SLC、CD40L、FL等對上述基本配伍方案具有強化作用，可作為基本配伍方案的拓展和補充。由此設計的疫苗佐劑系統(tǒng)，能夠動員多種作用機制，協(xié)同性發(fā)揮作用，使疫苗在結(jié)構(gòu)和功能上都得到了較好的優(yōu)化，是目前其它模式疫苗難以媲美的[Van Tendeloo VF，et al.Gene-based cancervaccinesan ex vivo approach.Leukemia.2001；15(4)545-58]。
3、細胞表面錨定糖基化磷脂酰肌醇(GPI)，是對蛋白質(zhì)進行翻譯后修飾的一種脂性結(jié)構(gòu)，蛋白質(zhì)可通過GPI結(jié)構(gòu)錨定于細胞膜表面，而不跨越其磷脂膜雙層結(jié)構(gòu)[Cimino AM，et al Cancer vaccine developmentproteintransfer of membrane-anchored cytokines and immunostimulatory molecules.Immunol Res.2004；29(1-3)231-40]。本項目用GPI修飾各種分子元件，以GPI錨定蛋白的形式表達于細胞膜表面，有利于在細胞膜自組裝形成脂質(zhì)體時，自發(fā)的整合到脂質(zhì)體中，使所得到的脂質(zhì)體，含有所需要的所有分子元件，從而發(fā)揮分子的免疫協(xié)同作用。表面錨定技術(shù)和自組裝嵌合膜脂質(zhì)體技術(shù)的聯(lián)合應用，巧妙地解決了將多種功能分子元件進行有機整合的問題，是疫苗設計上的一個重要突破。
4、基因錨定DNA疫苗被稱為疫苗史上的第三次革命，是將含有目的基因的真核質(zhì)粒直接注入機體。它以能產(chǎn)生蛋白疫苗不能產(chǎn)生的細胞免疫反應而倍受關(guān)注。魚精蛋白是一段含有28個氨基酸的小肽，魚精蛋白含有豐富的正電荷，可與DNA質(zhì)粒高親和力結(jié)合?？梢酝ㄟ^魚精蛋白基因的表達，將含抗原和各種免疫分子的DNA質(zhì)粒，負載到在膜表達的功能蛋白上(融合有陽離子魚精蛋白片段)，在陽離子蛋白上形成“簇狀”的分布形式，我們稱之為“基因簇錨定技術(shù)”，通過上述策略，可將核酸疫苗與蛋白質(zhì)疫苗有機融合，更好地激發(fā)機體的高效免疫應答[Li S，et al Characterization of cationiclipid-protamine-DNA(LPD)complexes for intravenous gene delivery Gene Ther.1998；5(7)930-7.]。
5、自組裝膜脂質(zhì)納米顆粒近年來，脂質(zhì)體作為藥物載體的研究愈來愈受到重視，進展迅速。脂質(zhì)體是網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)最好的藥物載體，用于疫苗類藥物具有獨特的優(yōu)勢。目前，將脂質(zhì)體用作疫苗佐劑已有很多報道，大部分都取得了良好效果。常規(guī)脂質(zhì)體都是用磷脂、膽固醇等脂性材料進行人工合成，而細胞膜本身就含有豐富的磷脂和膽固醇等脂性材料，在一定的緩沖條件下能夠自組裝形成脂質(zhì)體納米粒，并使多種機制融于一體，協(xié)同發(fā)揮作用[Westerman LE，Jensen PE.Liposomes composed of reconstituted membranes forinduction of tumor-specific immunity.Methods Enzymol.2003；373118-27]。
納米粒疫苗有效解決了腫瘤疫苗整合多種免疫機制的技術(shù)難題，將多種機制有效地融于一體，使多種分子元件能夠有效地組裝到一個簡單的開放性系統(tǒng)，為腫瘤抗原提供了良好的負載、支撐、遞呈和佐劑功能，有利于融合多種作用機制，協(xié)同性發(fā)揮作用，達到更好地激發(fā)機體免疫系統(tǒng)的目的。
與單獨的蛋白質(zhì)疫苗或DNA疫苗相比，同時含有多種蛋白質(zhì)或基因形式分子元件的自組裝復合納米顆粒腫瘤疫苗在免疫效應功能上更具優(yōu)勢，能夠融合多種作用機制，協(xié)同性發(fā)揮作用。首先由GM-CSF等免疫調(diào)節(jié)分子趨化和誘導DC細胞，加工遞呈蛋白質(zhì)抗原，實現(xiàn)初次免疫。納米顆粒疫苗中其它免疫分子可以動員局部的免疫細胞，形成活躍的免疫微環(huán)境。接著含有腫瘤抗原成分和各種免疫分子的基因在DC中進行表達，再次形成免疫沖擊。由于首次免疫已經(jīng)形成了活躍的免疫學微環(huán)境(包括刺激產(chǎn)生的各種趨化因子、細胞因子和抗體等)，第二次免疫沖擊時將可能獲得更好的效果。而且第一次免疫沖擊是由蛋白質(zhì)抗原完成的，容易激發(fā)體液免疫應答，第二次免疫沖擊則主要是由DNA疫苗形式的抗原完成的，有利于激發(fā)細胞免疫應答。因此，自組裝復合納米顆粒腫瘤疫苗一次免疫注射，至少能夠形成兩次免疫沖擊，免疫應答的效果也呈遞進式上升。既能夠有效地激發(fā)體液免疫應答，也能夠有效地激發(fā)細胞免疫應答。在上述自組裝復合納米顆粒腫瘤疫苗的結(jié)構(gòu)中，融合了腫瘤靶向分子及相關(guān)攻擊元件，通過腫瘤靶向分子，捕獲體內(nèi)的腫瘤細胞，在對殘留的腫瘤細胞實施打擊的同時，也在體內(nèi)對其進行免疫學標記和修飾，使之成為具有個體特異性的活疫苗。
本發(fā)明涉及的自組裝復合納米顆粒腫瘤疫苗可以通過以下方法制備1、構(gòu)建通用腫瘤疫苗真核表達載體pCI-Pr-GPI
如圖2所示，pCI-pr-GPI是在真核表達質(zhì)粒pCI-neo原多克隆位點NheI和NotI之間插入通用序列構(gòu)建而成的。通用序列的基因順序為5’-魚精蛋白片段基因-人IgGFc-GPI-3’。外源免疫分子基因可以方便的插入NheI和EcoRV位點中進行克隆表達。除pCI載體多克隆位點NheI和NotI之間插入的相關(guān)基因元件外，pCI-pr-GPI含有pCI載體的整個骨架結(jié)構(gòu)，如CMV早期啟動子、嵌合內(nèi)含子、Neo篩選標記、SV40增強子、氨芐抗性基因Ampr等。
2、獲得多種穩(wěn)定表達各種分子元件的腫瘤細胞株綜合考慮免疫系統(tǒng)的激活條件，獲得相關(guān)腫瘤復合靶抗原、免疫調(diào)節(jié)分子的基因，插入上述通用載體上，分別轉(zhuǎn)染腫瘤細胞，篩選獲得多種穩(wěn)定表達相關(guān)分子元件的腫瘤細胞株。表達的分子元件為融合蛋白，其羧基端連有IgG Fc和魚精蛋白，最后通過GPI結(jié)構(gòu)錨定于腫瘤細胞膜上。IgG Fc除了可用于表達后的熒光檢測，本身還有吸引巨噬細胞、刺激免疫應答的功能。魚精蛋白含有豐富的正電荷，可與DNA質(zhì)粒高親和力結(jié)合。
3、自組裝納米顆粒疫苗將表達不同分子元件的腫瘤細胞混合，通過低滲方式去除細胞內(nèi)成分，離心獲得細胞膜，用細胞裂解液裂解，獲得膜脂質(zhì)，富含GPI錨定表達的多種分子元件，包括腫瘤抗原和免疫調(diào)節(jié)分子；在一定的緩沖條件下，與表達不同分子元件的真核表達質(zhì)粒孵育，通過魚精蛋白結(jié)合核酸，有由膜脂質(zhì)、蛋白分子與核酸共同作用，形成自組裝復合納米粒疫苗。
本發(fā)明的特點及優(yōu)點如下突破了整合多種分子元件于一體的技術(shù)瓶頸，將蛋白質(zhì)疫苗和DNA疫苗有機地融為一體，使多種功能分子元件及蛋白質(zhì)、核酸等多種物質(zhì)形態(tài)，能夠有機融合到一個開放性的免疫增效系統(tǒng)，為靶抗原提供了良好的負載、支撐、遞呈和佐劑功能，有利于使多種作用機制，協(xié)同性發(fā)揮作用。同時，本發(fā)明在工藝上巧妙避開了常規(guī)生物技術(shù)藥物所不可避免的蛋白質(zhì)純化等復雜昂貴的工藝，有利于進行產(chǎn)業(yè)化開發(fā)和應用。
附圖簡要說明圖1為自組裝復合納米顆粒腫瘤疫苗結(jié)構(gòu)示意2為通用腫瘤疫苗表達載體pCI-pr-GPI示意3為pCI-pr-GPI-GM-CSF酶切鑒定圖1、DL-2000marker2、pCI-GPI-GM-CSF酶切后結(jié)果3、pCI-GPI-GM-CSF PCR結(jié)果圖4為pCI-pr-GPI-GM-CSF錨定表達示意5為自組裝復合納米顆粒腫瘤疫苗的透射電鏡照片(顆粒大小為100-300nm)具體實施方式
本發(fā)明更詳細的實施方法可參見實施例，本實施例是用于解釋、而不是以任何方式限制本發(fā)明。
實施例一、通用腫瘤疫苗表達載體pCI-pr-GPI的構(gòu)建和鑒定1、確定通用序列按照技術(shù)方案，通用序列的順序為5’-NheI-EcoRV-G-G-G-魚精蛋白基因-IgG Fc-GPI-Not-3’。免疫調(diào)節(jié)分子基因插入NheI-EcoRV酶切位點之間，由3個G組成的連接臂使表達的分子具有一定的空間自由度，易于保持其天然活性。整個通用序列的基因共有1472bp，序列如下GCGGCTAGC(NheI)GATATC(EcoRV)GGAGGGGGA CGCTCCCAGTCCCGGAGCAGATACTACAGGCAGCGCCAGAGAAGCCGGAGGCGCAGAAGAAGGTCC GTTGGTGAGAGCTCAGCGCTCCTGCCTGGACGCATCCCGGCTATGCAGCCCCAGTCCAGGGCAGCAAGGCAGGCCCCGTCTGCCTCTTCACCCGGAGGCCTCTGCCCGCCCCACTCATGCTCAGGGAGAGGGTCTTCTGGCTTTTTCCCCAGGCTCTGGGCAGGCACAGGCTAGGTGCCCCTAACCCAGGCCCTGCACACAAAGGGGCAGGTGCTGGGCTCAGACCTGCCAAGAGCCATATCCGGGAGGACCCTGCCCCTGACCTAAGCCCACCCCAAAGGCCAAACTCTCCACTCCCTCAGCTCGGACACCTTCTCTCCTCCCAGATTCCAGTAACTCCCAATCTTCTCTCTCCAGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGGTAAGCCAGCCCAGGCCTCGCCCTCCAGCTCAAGGCGGGACAGGTGCCCTAGGGTAGCCTGCATCCAGGGACAGGCCCCAGCCGGGTGCTGACACGTCCACCTCCATCTCTTCCTCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGTGGGACCCGTGGGGTGCGAGGGCCACATGGACAGAGGCCGGCTCGGCCCACCCTCTGCCCTGAGAGTGACCGCTGTACCAACCTCTGTCCCTACAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCTTAAGTCCGGGAAAA GGCAGCGGCACCACCAGCGGCACCACCCGCCTCCTGAGCGGCATGACCTGCTTCACCCTGACCGGCCTGCTGGGCACCCTGGTGACCATGGGCCTGCTGACCTAAGCGGCCGC(NotI)GCG通用基因序列設計后，委托上海生工生物工程有限公司進行全序列合成。
2、通用序列插入pCI載體雙酶切上述通用基因片段和用堿變性法提取的質(zhì)粒pCI-neo(構(gòu)自Invitrogen公司)，分別用NheI和NotI雙酶切。酶切體系還有10×緩沖液(H)4μl，10u/μl的NotI 2μl，10u/μl的NheI 2μl加水至總體積40μl，37℃水浴8小時。酶切后產(chǎn)物割膠回收目的片段，具體方法參見華舜試劑盒說明書。
插入連接取1.5ml滅菌Eppendorf管加入雙酶切后質(zhì)粒pCI和通用基因片段各1μl，10×T4DNA連接緩沖液1μl，T4DNA連接酶(12u/μl)1μl，加滅菌雙蒸水至15μl，16℃過夜。
3、轉(zhuǎn)化和表達無菌取100μl感受態(tài)細胞(HB101菌株按《分子克隆》—科學出版社，第二版的CaCl2方法制備)，至于冰浴中，加入連接產(chǎn)物8μl，輕輕旋轉(zhuǎn)以混勻內(nèi)容物，在冰浴中放置30分鐘，立即轉(zhuǎn)移到42℃水浴中靜置2分鐘，然后每管加入0.5ml不加抗生素的LB培養(yǎng)基，37℃水浴15分鐘后，30℃搖床輕搖45分鐘；取200μl轉(zhuǎn)化菌體，均勻涂布于含有100mg/ml氨芐的瓊脂平板培養(yǎng)基上，在超凈工作臺吹干約10分鐘，37℃倒置培養(yǎng)過夜。
從平板中挑取菌落約10個，分別接種于含100mg/ml氨芐LB培養(yǎng)基中(5ml/管)，32℃搖床培養(yǎng)過夜。次日4、載體的鑒定取1μl過夜培養(yǎng)菌采用PCR法進行初步鑒定，引物選用pCI載體中的sp6和t7一對測序引物。PCR進行PCR擴增，擴增體系為10×Buffer 5μl，R1、F1各1μl，4dNTPs(2.5mM)4μl，Taq DNA聚合酶(5U/μl)0.5μl，加水至50μl。(Taq DNA聚合酶、Buffer、dNTPs均購自于Tacara生物技術(shù)有限公司)。PCR擴增反應94℃1分鐘，55℃1分鐘，72℃1分，共30個循環(huán)。
根據(jù)1.5％瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果選取陽性克隆，并進一步用酶切鑒定后，進行序列測定。測序結(jié)果證明通用基因序列已正確無誤地插入了pCI載體中，即通用腫瘤疫苗表達載體pCI-pr-GPI構(gòu)建成功。
實施例二、獲得錨定表達相關(guān)分子元件的腫瘤細胞株(以GM-CSF/Renca為例)1、GM-CSF基因的獲得根據(jù)gene bank上GM-CSF基因序列設計引物，委托上海生工生物工程有限公司合成F1GCGCTAGCAGCCTCTCAGCACCCACCCGCTCACC，R1GC GATATCTTTTTGGACTGGTTTTTTGC。
提取小鼠PBMC細胞用5ug/ml的ConA誘導4hr，提取總RNA進行RT-PCR，具體方法參見Introgene Trozol試劑盒說明書。PCR擴增后在分子量為400bp處有條帶出現(xiàn)，測序為GM-CSF基因。
2、pCI-pr-GPI/GM-CSF重組質(zhì)粒的獲得PCR擴增后產(chǎn)物純化后和質(zhì)粒pCI-pr-GPI分別用NheI、EcoRV雙酶切，然后使酶切后的基因和質(zhì)粒連接、轉(zhuǎn)化后用PCR法和雙酶切法進行鑒定，獲得pCI-pr-GPI/GM-CSF重組質(zhì)粒。具體操作均同實施例一所述3、重組質(zhì)粒pCI-pr-GPI/GM-CSF轉(zhuǎn)染Renca細胞Renca細胞為本研究室保存的Balb/c小鼠來源的腎癌細胞系。Renca細胞轉(zhuǎn)染前傳代，接種于六孔板上，使次日細胞能鋪滿孔底面地70％，轉(zhuǎn)染步驟按Invitrogen公司的Lipofectamine2000 Reagent說明書進行。分別取1μg質(zhì)粒，用無雙抗DMEM培養(yǎng)基稀釋到250μl，為A液；另取7μl Lipofectamine2000用無雙抗DMEM培養(yǎng)基稀釋到250μl，為B液，將B液室溫放置5分鐘后，立即將A液B液輕輕混勻，為C液，室溫放置20分鐘。取出六孔板用新鮮培養(yǎng)基洗一次后，每孔加入2.5ml新鮮培養(yǎng)基。將C液分別加入到各孔中，混勻，置CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染48小時后，至細胞密度達到50-70％融合時，棄培養(yǎng)液，換用含有G-418(400μg/ml)培養(yǎng)基進行抗性篩選，同時用未轉(zhuǎn)染的細胞作對照。當對照細胞幾乎全部死亡時，G-418的濃度降至200μg/ml以維持篩選作用。待2wk左右出現(xiàn)陽性細胞克隆時，擴大培養(yǎng)進行后續(xù)實驗。
收集pCI-pr-GPI/GM-CSF和空載體pCI-pr-GPI/GM-CSF轉(zhuǎn)染的Renca細胞，用4℃預冷的PBS(含20ml/L小牛血清)洗滌3次，加入熒光標記的羊抗鼠GM-CSF(1∶1000稀釋)，于冰浴中震蕩孵育45min，再用PBS洗3次。加5g/L多聚甲醛固定后，于熒光顯微鏡下觀察并照相，結(jié)果證明pCI-pr-GPI載體能夠很好地將GM-CSF表達在宿主細胞膜上(圖4)。
實施例三、自組裝復合納米顆粒疫苗1、獲得多種相關(guān)分子元件錨定表達的細胞膜收集多種相關(guān)分子元件修飾的Renca細胞共108個，用含有蛋白酶抑制劑的低滲buffer(25mmol/L Tris-HCl.PH7.4)裂解細胞，用27號針頭(4.5號)抽吸3次以上，混勻2,300rpm(2,000g)離心10min，取上清(含有膜成分)。25,400rpm(22,000g)離心30min，取沉淀。
2、復合納米粒疫苗的形成用溶液I(0.15mol/L NaCl，10mmol/L Tris，pH8.0)洗兩次，用溶液II(0.14mol/L NaCl，25mmol/L Tris-HCl，pH7.4，其中含有2％1-S-Octyl Beta-D-thioglucopyranoside)溶解，達到濃度相當108個/mL，4℃震蕩30min。離心取上清，取質(zhì)粒DNA100μg，加入上述含膜脂質(zhì)及錨定表達的陽離子融合蛋白質(zhì)的溶液中，用透析液(0.14mol/L NaCl，25mmol/LTris-HCl，pH7.4)透吸過夜，更換三次透析液，收集形成的復合納米顆粒疫苗。電鏡觀察顆粒大小。
權(quán)利要求
1.一種自組裝復合納米顆粒腫瘤疫苗，其特征在于由腫瘤細胞膜脂質(zhì)、蛋白質(zhì)分子元件、DNA質(zhì)粒三種成分自組裝形成的納米顆粒。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述，組成腫瘤疫苗的蛋白質(zhì)分子元件，含有腫瘤抗原分子、免疫佐劑分子的一種或幾種，通過GPI與細胞膜脂質(zhì)成分連接。
3.根據(jù)根據(jù)權(quán)利要求1所述，組成腫瘤疫苗的DNA質(zhì)粒成分中，含有腫瘤抗原分子、免疫佐劑分子的一種或幾種。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述，在組成腫瘤疫苗的蛋白質(zhì)分子元件中，融合有來源于魚精蛋白的陽離子蛋白片段，可與含陰離子電荷的核酸結(jié)合，結(jié)合一種或幾種含有腫瘤抗原分子、免疫調(diào)節(jié)分子DNA質(zhì)粒。
5.根據(jù)權(quán)利要求2，組成腫瘤疫苗的蛋白質(zhì)分子元件，融合有來源于人免疫球蛋白的IgGFc蛋白片段。
6.根據(jù)權(quán)利要求2，蛋白質(zhì)形式的腫瘤抗原分子、免疫佐劑分子的一種或幾種，通過GPI與細胞膜脂質(zhì)成分連接。
7.根據(jù)權(quán)利要求2和3，腫瘤抗原分子包括特異性腫瘤抗原和抗轉(zhuǎn)移和血管靶點的抗原；免疫佐劑分子包括GM-CSF、IL-2、B7、4-1BBL、SLC、CD40L、FL等。
8.根據(jù)根據(jù)權(quán)利要求1所述，自組裝靶向復合納米顆粒腫瘤疫苗的制備方法，包括以下步驟1)通用錨定真核表達載體的構(gòu)建；2)構(gòu)建含有不同分子元件基因的錨定表達載體；3)含有不同分子元件基因的錨定表達載體，轉(zhuǎn)染相應的腫瘤細胞株，并鑒定分子在細胞膜表面的錨定表達情況；4)收獲上述細胞的細胞膜成分；5)細胞膜裂解成含有錨定形式蛋白質(zhì)分子元件的膜脂質(zhì)成分，與含有腫瘤抗原分子、免疫調(diào)節(jié)分子的DNA質(zhì)?；旌?，在一定的緩沖條件下自組裝形成納米顆粒腫瘤疫苗。
9.根據(jù)權(quán)利要求8，通用表達載體為pCI-pr+-GPI，含有來源于魚精蛋白的陽離子蛋白片段基因序列、來源于人免疫球蛋白的IgGFc蛋白片段基因序列和GPI信號肽基因序列。并保留pCI-neo載體的骨架結(jié)構(gòu)，如CMV早期啟動子、嵌合內(nèi)含子、Neo篩選標記、SV40增強子、氨芐抗性基因Ampr等。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種自組裝復合納米顆粒腫瘤疫苗及其制備方法。本發(fā)明公開的自組裝復合納米顆粒腫瘤疫苗是由腫瘤細胞膜脂質(zhì)、蛋白質(zhì)分子元件、DNA質(zhì)粒三種成分組成的。它是將腫瘤抗原分子、免疫佐劑分子等各種分子元件構(gòu)建到真核表達載體上，分別錨定表達在腫瘤細胞表面，然后將表達有關(guān)分子元件的細胞進行混合，提取收獲細胞膜，將細胞膜裂解成含有錨定形式蛋白質(zhì)分子元件的膜脂質(zhì)成分，與含有腫瘤抗原分子、免疫調(diào)節(jié)分子的DNA質(zhì)?；旌希谝欢ǖ木彌_條件下自組裝形成納米顆粒腫瘤疫苗。本發(fā)明所提供的制備自組裝復合納米顆粒腫瘤疫苗的技術(shù)和方法，可用于設計和制備多種惡性腫瘤的治療性疫苗，也可用于各類傳染病及非傳染病疫苗的制備。
文檔編號A61K39/395GK1927401SQ20051009588
公開日2007年3月14日 申請日期2005年9月7日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月7日
發(fā)明者于繼云, 修冰水, 閻瑾琦, 劉荷中, 陳興, 劉穎, 黃悅, 胡巍 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所