專利名稱：雜交酵母禽流感疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是一種治療和/或預(yù)防傳染性疾病禽流感的方法及其組成成份。該發(fā)明由至少兩個(gè)基因表達(dá)單位經(jīng)雜交形成一個(gè)基因表達(dá)載體；其中一個(gè)基因表達(dá)單位表達(dá)細(xì)胞因子和/或淋巴因子，另一個(gè)基因表達(dá)單位表達(dá)單個(gè)、融合和/或多個(gè)禽流感抗原基因；該發(fā)明主要是應(yīng)用這個(gè)基因表達(dá)單位形成雜交載體疫苗治療和預(yù)防禽流感。
背景技術(shù)：
在疾病防治歷史上，疫苗一直是最有效、價(jià)廉和實(shí)用的方法。沒有任何一種措施包括抗生素在內(nèi)曾經(jīng)如此有效地降低人口的死亡率，疫苗對(duì)人類健康的影響之大是難以用語言做評(píng)價(jià)的。疫苗曾在世界上許多國家成功地控制了以下九種疾病天花、白喉、破傷風(fēng)、猩紅熱、百日咳、脊髓灰質(zhì)炎、麻疹、腮腺炎和風(fēng)疹。天花是在世界范圍內(nèi)得到最有效控制的疾病。一個(gè)疫苗的有效性是取決于它能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性免疫反應(yīng)的能力。
脊椎動(dòng)物尤其是鳥類和哺乳動(dòng)物戰(zhàn)勝微生物感染的機(jī)制是一個(gè)復(fù)雜的過程。病原體侵入宿主后會(huì)激活機(jī)體多系統(tǒng)多種保護(hù)性反應(yīng)，如果病原體或其毒素成功地攻破機(jī)體的外層防線而進(jìn)入血循環(huán)，淋巴器官如脾、肝和骨髓將會(huì)分解和清除進(jìn)入血循環(huán)中的病原體或其毒素。淋巴組織是由一系列相互交織的細(xì)胞和纖維組成，這些細(xì)胞包括白細(xì)胞即淋巴細(xì)胞和處于不同分化階段的其它細(xì)胞，如漿細(xì)胞、淋巴纖維細(xì)胞、單核-巨噬細(xì)胞、嗜酸細(xì)胞和肥大細(xì)胞。淋巴細(xì)胞主要分為T和B淋巴細(xì)胞，它們?cè)跈C(jī)體的抗原特異性免疫反應(yīng)中起不同作用但又互補(bǔ)。
免疫系統(tǒng)通過識(shí)別外源性病原體而成為保持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要防線。機(jī)體對(duì)外源性病原體的初步反應(yīng)稱為“先天性免疫”，先天性免疫的特征是自然殺傷細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和其它白細(xì)胞首先對(duì)病原體產(chǎn)生應(yīng)答，這些細(xì)胞通過吞噬、消化、裂解或分泌淋巴因子在短時(shí)間內(nèi)消滅病原體。先天性免疫是抗原非特異性的，它是機(jī)體產(chǎn)生“獲得性免疫”應(yīng)答之前的第一道抵御病原體的防線。T和B淋巴細(xì)胞是參于獲得性免疫反應(yīng)的主要細(xì)胞，獲得性免疫反應(yīng)的特征是B細(xì)胞識(shí)別抗原后被激活從而分泌抗原特異性抗體、T細(xì)胞的激活和抗原提呈。
B細(xì)胞識(shí)別抗原是指抗原與B細(xì)胞表面的免疫球蛋白受體結(jié)合，這些抗原包括細(xì)菌細(xì)胞壁、細(xì)菌毒素或病毒表面糖蛋白，該結(jié)合促使信號(hào)傳導(dǎo)到B細(xì)胞內(nèi)，此過程稱為“第一信號(hào)”，在某些情況下，僅需要一個(gè)信號(hào)就能激活B細(xì)胞，這些無需輔助性T細(xì)胞就能激活B細(xì)胞的抗原稱為“不依賴T細(xì)胞抗原”(或不依賴胸腺抗原)；某些情況下，B細(xì)胞的激活需要“第二信號(hào)”，第二信號(hào)通常由輔助性T細(xì)胞提供，這類細(xì)胞抗原稱為“T細(xì)胞依賴性抗原”(或胸腺依賴性抗原)；結(jié)合到B細(xì)胞表面的抗原通過內(nèi)吞進(jìn)入B細(xì)胞并被消化為小片段，這些片段又與B細(xì)胞表面的MHCII分子結(jié)合形成“抗原多肽-MHCII分子復(fù)合物”，該復(fù)合物提供T細(xì)胞依賴性抗原激活B細(xì)胞所需的第二信號(hào)。激活B細(xì)胞的另一種方式是B細(xì)胞與淋巴結(jié)和脾臟生發(fā)中心的樹突狀細(xì)胞(DentriticCells，DC)結(jié)合。
獲得性免疫的一個(gè)重要機(jī)制是T細(xì)胞的激活，激活T細(xì)胞需要抗原提呈細(xì)胞如巨噬細(xì)胞和DC細(xì)胞與T細(xì)胞結(jié)合，巨噬細(xì)胞表面有多個(gè)識(shí)別病原體抗原的受體，如甘露糖和清道夫受體，巨噬細(xì)胞吞噬這些病原體后在內(nèi)體和溶酶體的作用下將其消化裂解為多肽片段，這些多肽片段與巨噬細(xì)胞表面的MHCII分子結(jié)合形成“抗原多肽-MHCII分子復(fù)合物”，當(dāng)T細(xì)胞與該復(fù)合物結(jié)合后被激活。DC細(xì)胞是既能形成“抗原多肽-MHCII分子復(fù)合物”又能形成“抗原多肽-MHCI分子復(fù)合物”的抗原提呈細(xì)胞。
當(dāng)B細(xì)胞與抗原結(jié)合后通過“同型轉(zhuǎn)換”使分泌普通IgM抗體的B細(xì)胞轉(zhuǎn)化為分泌特異性的IgG抗體，這些細(xì)胞分為兩類一類不斷分裂稱為克隆擴(kuò)增，這類細(xì)胞成熟后每秒鐘可釋放2000個(gè)同樣的抗體，約2-3天后死亡；另一類細(xì)胞此時(shí)不分泌抗體而成為記憶細(xì)胞，這些記憶細(xì)胞可存活數(shù)月到數(shù)年，當(dāng)再次遇到同樣抗原時(shí)這類記憶細(xì)胞會(huì)迅速產(chǎn)生大量抗體，這種免疫反應(yīng)稱為次級(jí)免疫反應(yīng)。研發(fā)疫苗的目標(biāo)就是要誘導(dǎo)這種較初級(jí)免疫反應(yīng)更快更強(qiáng)的次級(jí)免疫反應(yīng)。
經(jīng)典的主動(dòng)疫苗分為亞單位和完整病原體疫苗，亞單位疫苗是完整病原體的一部分，其目的是避免應(yīng)用有致病性的完整病原體或避免應(yīng)用完整病原體的有毒組份。B型副流感病毒的脂多糖做為腦膜炎疫苗就是應(yīng)用抗原組份的一個(gè)亞單位疫苗例子；完整病原體疫苗通常是滅活或減毒的病原體，如滅活的百日咳疫苗。由于滅活或減毒過程有時(shí)會(huì)損害一些誘導(dǎo)免疫反應(yīng)所必需的抗原決定基，因此這類疫苗常需添加免疫增強(qiáng)劑。
傳統(tǒng)的預(yù)防性疫苗是通過接種疫苗后使機(jī)體在再次遇到相同病原體時(shí)能產(chǎn)生保護(hù)性免疫反應(yīng)，這種理論適用于病毒或細(xì)菌傳染性疾病，因病毒或細(xì)菌僅有有限數(shù)量的抗原；但抗癌疫苗并非如此，抗癌疫苗是必須能夠根除已經(jīng)存在的癌細(xì)胞，這樣就使我們必須更好地明白腫瘤抗原和宿主免疫的作用機(jī)制，當(dāng)代的疫苗理論是要誘導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng)。
因禽流感的變異快、血清型眾多，容易發(fā)生突變且有動(dòng)物儲(chǔ)存源，此類動(dòng)物與人類的接觸密切，致使迄今沒有成功的禽流感疫苗，還沒有疫苗能夠誘導(dǎo)足夠強(qiáng)的細(xì)胞免疫反應(yīng)來消滅已被病毒感染的細(xì)胞和不斷釋放新病毒顆粒的被感染細(xì)胞。禽流感的迅速蔓延，使疫苗免疫接種成為必然的選擇。
本發(fā)明是一種雜交酵母禽流感疫苗，它能誘導(dǎo)與MHCI和II分子偶聯(lián)的強(qiáng)效、持久的保護(hù)性CTL免疫反應(yīng)和產(chǎn)生禽流感病毒特異性抗體的體液免疫，也就是說是能達(dá)到理想免疫效果的疫苗。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明第一部分是一個(gè)基因載體系統(tǒng)。該載體由兩個(gè)DNA質(zhì)粒組成，一個(gè)編碼協(xié)同刺激信號(hào)，由啟動(dòng)子操作的T細(xì)胞生長因子；另一個(gè)DNA質(zhì)粒編碼由啟動(dòng)子操作的至少一個(gè)或多個(gè)禽流感保護(hù)性抗原基因。
本發(fā)明第二部分是一種誘導(dǎo)禽流感特異性的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞免疫反應(yīng)(CTL)和產(chǎn)生禽流感特異性抗體的體液免疫對(duì)抗禽流感病毒及其它病原微生物的方法。
本發(fā)明第三部分是一種基因表達(dá)系統(tǒng)，該系統(tǒng)由獨(dú)立啟動(dòng)子分別表達(dá)細(xì)胞生長因子如IL-2和禽流感的保護(hù)性抗原基因。
本發(fā)明第四部分是一種誘導(dǎo)脊椎動(dòng)物免疫反應(yīng)的方法，所需免疫反應(yīng)通過該禽流感疫苗載體及疫苗載體所攜帶的保護(hù)性抗原基因或細(xì)胞生長因子來體現(xiàn)。


以下

是對(duì)本發(fā)明以圖表示時(shí)的一些部分的具體描述，同時(shí)也是對(duì)本發(fā)明原理的輔助性解釋。
圖1.本發(fā)明操作原理的圖解。
圖2.本發(fā)明疫苗載體系統(tǒng)圖解。
圖3.應(yīng)用本發(fā)明所表達(dá)的IL-2水平的線圖示。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明的禽流感疫苗載體系統(tǒng)是一種誘導(dǎo)強(qiáng)效、持久的CTL免疫反應(yīng)的方法，它通過激活依賴MHCI和II的途徑來產(chǎn)生保護(hù)性免疫反應(yīng)。圖1是對(duì)本發(fā)明操作原理的圖解，圖中的酵母質(zhì)粒α和a分別表達(dá)抗原基因和一個(gè)協(xié)同刺激信號(hào)，該協(xié)同刺激信號(hào)通常是促使抗原基因刺激最有效免疫反應(yīng)的相應(yīng)細(xì)胞生長因子，而且很可能若沒有同時(shí)將此細(xì)胞因子導(dǎo)入，其免疫反應(yīng)將不能達(dá)到其最佳狀態(tài)。這些抗原分子有如下所列但并不限于這些，如病毒、細(xì)菌、寄生蟲和腫瘤細(xì)胞組份、百喉毒素C片斷、霍亂毒素B亞單位、B型肝炎病毒表面抗原、HIV抗原、志賀氏桿菌脂多糖(LPS)等以及單個(gè)、多個(gè)或不同排列組合的抗原。另一些抗原可以是真菌、原蟲、蛔蟲和癌細(xì)胞抗原；禽流感的病毒蛋白抗原有如下所列但并不限于這些，如HA、NA、NP、M1、M2、PB1、PB2和PA等；細(xì)胞因子有如下所列但并不限于這些，IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、TNF-β和IFN-γ等。
本發(fā)明的疫苗載體系統(tǒng)首先是由兩個(gè)分離的質(zhì)粒通過真核生物基因交配的方法形成。該真核生物包括如下所列但并不限于這些，Saccharomyces，Schizosaccharomyces，Yarrowia，candida，hansenula。另外，這個(gè)載體系統(tǒng)也可由原核細(xì)胞組成，如大腸桿菌和病毒質(zhì)粒等但并不限于這些。因此，無論是真核或原核細(xì)胞所形成的最后產(chǎn)品是由一個(gè)啟動(dòng)子控制表達(dá)細(xì)胞因子，另一個(gè)多克隆位點(diǎn)供插入各種各樣的抗原基因，另有復(fù)制子、轉(zhuǎn)錄、翻譯元件的DNA序列、篩選標(biāo)記等通過連接子將其連成完整質(zhì)粒，真核細(xì)胞表達(dá)載體的篩選標(biāo)記有neo、leu2、ura3、trp1、ade1、his3等，該疫苗載體被用于需要治療的機(jī)體。
本發(fā)明疫苗載體的結(jié)構(gòu)原理如圖1所示，首先，構(gòu)建二個(gè)功能性的多核苷酸序列組成的DNA表達(dá)質(zhì)粒；這兩個(gè)質(zhì)粒的具體應(yīng)用本發(fā)明疫苗如圖2所示。其中的啟動(dòng)子是真核生物啟動(dòng)子但并不限于此，如酵母Sccharomyces cerevisine和Candida albicans。啟動(dòng)子可以是誘導(dǎo)性的或組成性的，誘導(dǎo)性啟動(dòng)子可以被調(diào)介，如營養(yǎng)成份(carbonsouces，nitrogen souces和其它)、藥物(抗藥性等)、與感染過程有關(guān)的特殊試劑(血清等)和溫度(熱休克和冷休克等)。將所得到的兩個(gè)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化為真核微生物如單倍體酵母，轉(zhuǎn)化DNA的方法可以是多種多樣的，包括鈣磷沉淀法、顯微注射法、脂質(zhì)體法、電穿孔法和病毒載體法等，這里也包括各種各樣的含有載體的宿主細(xì)胞。
本發(fā)明用酵母作為宿主微生物，酵母質(zhì)粒被成功地轉(zhuǎn)化為酵母時(shí)，可用氨基酸缺陷培養(yǎng)基篩選轉(zhuǎn)化子，然后通過單倍體酵母基因交配而形成雙倍體雜交酵母，此時(shí)再用雙氨基酸缺陷培養(yǎng)基篩選雙倍體雜交轉(zhuǎn)化子[Guthrie Fink，Guide to Yeast Genetics &Molecular Biology，Methods in Enzymology，1943-231(1999)]，在這個(gè)過程中，非轉(zhuǎn)化子被自然淘汰。
本發(fā)明中的DNA質(zhì)粒的啟動(dòng)子可以是原核細(xì)胞啟動(dòng)子，在這種情況下，宿主可以是原核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒，其目的也是誘導(dǎo)所需的免疫反應(yīng)，可用多種方法將此原核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化為真核微生物，如轉(zhuǎn)導(dǎo)、偶聯(lián)、轉(zhuǎn)化、電穿孔法和轉(zhuǎn)染等。
本發(fā)明禽流感疫苗載體用于禽流感的治療和預(yù)防。
應(yīng)用該疫苗的另一個(gè)方法是從禽流感患病機(jī)體分離巨噬細(xì)胞或DC細(xì)胞，然后將該禽流感疫苗導(dǎo)入被分離出的巨噬細(xì)胞或DC細(xì)胞，在體外培養(yǎng)這種細(xì)胞并加入一些淋巴因子，然后將該細(xì)胞輸回入患者。
為構(gòu)建禽流感疫苗，將細(xì)胞生長因子IL-2、IL-4、IL-6等克隆到在組成性酵母啟動(dòng)子控制下的酵母質(zhì)粒α上，將禽流感保護(hù)性病毒抗原HA、NA、NP、M1、M2、PB1、PB2和PA等克隆到酵母質(zhì)粒a，將所得到的兩個(gè)單倍體酵母質(zhì)粒α和a分別轉(zhuǎn)化到宿主酵母W303α和a上，將所得到的轉(zhuǎn)化子交配形成雙倍體，通過leu2/ura3氨基酸缺陷培養(yǎng)基篩選終末疫苗產(chǎn)品。
本發(fā)明中的疫苗通常通過注射，如皮下、皮內(nèi)、肌內(nèi)、腹腔使用，也可通過胃腸道使用等；也可通過鼻腔滴入、噴霧吸入和口服；本發(fā)明也包括該禽流感的其它配方，如栓劑或應(yīng)用納米技術(shù)；使用疫苗的途經(jīng)可根據(jù)個(gè)體情況選擇以達(dá)到最佳臨床效果；本疫苗可通過計(jì)算活性單位來定量，可以是無菌胃腸道型和非胃腸道型的，也可以是普通胃腸道型和非胃腸道型的；可以是油水或水油乳劑；使用該疫苗的療程可以是2-3周內(nèi)2次或視具體情況決定。
以下舉例說明本發(fā)明的具體實(shí)施例，當(dāng)然本發(fā)明的應(yīng)用并不局限于此，另外，用同樣方式同樣性質(zhì)組分但又作些修改仍顯而易見屬于本發(fā)明之范疇。
例1.構(gòu)建酵母表達(dá)質(zhì)粒表達(dá)IL-2和構(gòu)建表達(dá)禽流感保護(hù)性抗原基因的廣譜質(zhì)粒載體圖2中的質(zhì)粒pcDNA3.IL-2，將該質(zhì)粒中的IL-2用限制性內(nèi)切酶smalI/NotI消化后克隆到pYES3/CT(Invitrogen)的多克隆位點(diǎn)區(qū)(MCS)smalI/NotI，將質(zhì)粒pYEX-BX(Clontech)的MCS區(qū)域修飾即增加多個(gè)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)使其容易克隆，由此構(gòu)建成表達(dá)抗原基因的廣譜質(zhì)粒載體pYEX.UIG。所得到的質(zhì)粒pYEX.UIG可用于克隆表達(dá)禽流感保護(hù)性抗原基因，在此實(shí)施例中為血凝素基因(HA基因)，由中國AIDS協(xié)會(huì)何敏博士贈(zèng)送)，用EcoRI/XhoI內(nèi)切酶將其抗原基因克隆到pYEX.UIG載體。
例2.雜交酵母禽流感疫苗載體的構(gòu)建如圖2所示，將例1中所得質(zhì)粒pYES3/CT.IL-2用TE/LiOAc方法轉(zhuǎn)化為酵母W303-1Aα(ATCC)，用Leu營養(yǎng)缺陷瓊脂培養(yǎng)基平板篩選轉(zhuǎn)化子；將例1中所得質(zhì)粒pYEX.UIG HA用TE/LiOAc方法轉(zhuǎn)化為酵母W303-1Aa(ATCC)，用Ura3營養(yǎng)缺陷瓊脂培養(yǎng)基平板篩選轉(zhuǎn)化子；將所得兩個(gè)轉(zhuǎn)化子IGV.IL-2(α)和IGV.HA通過基因配型雜交生成終末疫苗產(chǎn)品，該疫苗具有表達(dá)細(xì)胞生長因子IL-2和血凝素蛋白(HA)的能力。
例3.IL-2的測(cè)定向5周齡的無免疫SPF雞和Balh/c小鼠，24小時(shí)后用無血清的PBS液清洗出腹腔滲出液，收集滲出液中的巨噬細(xì)胞，將1-6×106個(gè)巨噬細(xì)胞分為二組并分別與IGV.IL-2和IGV.gp41.36共同孵育，在不同時(shí)間時(shí)，取出200μl培養(yǎng)上清液儲(chǔ)存于-70℃待作IL-2定量測(cè)定，用IL-2測(cè)定試劑盒(DuoSet Kit)(Genzyme Diagnostics，Cambridge，MA)定量測(cè)定IL-2。如圖3所示，接種表達(dá)IL-2和HA基因的疫苗比接種有HA基因但無IL-2的疫苗的IL-2水平明顯提高，該結(jié)果表明用本發(fā)明所生產(chǎn)的疫苗能有效地激活機(jī)體APC細(xì)胞分泌足夠量的淋巴因子，它有利于進(jìn)一步激活CTL免疫反應(yīng)。
例4.疫苗誘導(dǎo)的CTL活性的測(cè)定將4-6周齡Balh/c小鼠分為4組，每組10只，向小鼠皮下注射1×106穩(wěn)定轉(zhuǎn)染禽流HA基因的疫苗產(chǎn)品(IGV.Factor)和對(duì)照疫苗IGV.HA，接種劑量為2mg/200μl/次，對(duì)照組注射200μl PBS，30天時(shí)用CO2安樂死法殺死小鼠，取出脾臟，以51Cr標(biāo)記的B16.gag細(xì)胞為靶細(xì)胞，以取出的脾臟細(xì)胞為功能性T細(xì)胞，按照40∶1的E∶T比例測(cè)定CTL活性，百分裂解率(lysis％)實(shí)驗(yàn)CPM減去自發(fā)CPM的百分比。實(shí)驗(yàn)正在進(jìn)行中。
例5.疫苗誘導(dǎo)的禽流感特異性HI抗體的檢測(cè)試驗(yàn)通過間接ELISA方法測(cè)定雜交酵母禽流感疫苗免疫無免疫的SPF雞后HI特異性抗體的出現(xiàn)時(shí)間和HA特異性抗體的滴度。試驗(yàn)在雞群進(jìn)行相應(yīng)免疫后一周開始監(jiān)測(cè)相應(yīng)抗體，以間隔一周的時(shí)間進(jìn)行一次連續(xù)監(jiān)測(cè)8次，定量雞群禽流感特異性HA的抗體水平，評(píng)價(jià)雜交酵母禽流感疫苗的抗原性和誘導(dǎo)的體液免疫反應(yīng)的能力，該實(shí)驗(yàn)正在進(jìn)行。
例6.禽流感疫苗保護(hù)性免疫反應(yīng)通過中和試驗(yàn)和攻擊試驗(yàn)進(jìn)行保護(hù)性免疫反應(yīng)作用的研究。試驗(yàn)用活病毒進(jìn)行細(xì)胞中和試驗(yàn)、雞胚試驗(yàn)和Balb/c小鼠的中和試驗(yàn)，評(píng)價(jià)禽流感疫苗的免疫保護(hù)作用；分別使用同型病株和不同年代的同型病株的活病毒進(jìn)行Balb/c小鼠和雞胚的攻擊試驗(yàn)，觀察禽流感疫苗誘導(dǎo)的保護(hù)性的免疫作用，并通過不同年代的同型病株攻擊試驗(yàn)進(jìn)行交互免疫作用的研究，此類實(shí)驗(yàn)正在進(jìn)行中。
新一代的禽流感重組蛋白疫苗和DNA疫苗直接將編碼保護(hù)性抗原基因置于適當(dāng)?shù)恼婧思?xì)胞啟動(dòng)子下，直接導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞體內(nèi)使其表達(dá)，通過MHC-I和MHC-II直接遞呈給機(jī)體的免疫系統(tǒng)，可誘導(dǎo)強(qiáng)效、持久的體液和細(xì)胞雙重保護(hù)性免疫反應(yīng)，安全性好且比傳統(tǒng)的疫苗免疫原性弱。禽流感血清型眾多和變異速度快，傳統(tǒng)的疫苗不能誘導(dǎo)患病機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng)且免疫反應(yīng)維持時(shí)間短，急需具有可維持持久免疫佐劑作用的禽流感疫苗和疫苗載體系統(tǒng)，當(dāng)今以誘導(dǎo)細(xì)胞免疫為主的疫苗通常缺乏有效的導(dǎo)入刺激T細(xì)胞活性的協(xié)同刺激淋巴因子的方法，本發(fā)明為最有效地刺激機(jī)體的免疫反應(yīng)提供了一個(gè)理想的方法，該理論可延伸到基因治療的所有領(lǐng)域，因?yàn)樽钣行У卮碳C(jī)體的免疫反應(yīng)常需要合適的協(xié)同因子的配合。
本發(fā)明是一個(gè)創(chuàng)新性的疫苗平臺(tái)技術(shù)，不僅僅可用于禽流感的治療和預(yù)防，可用于研發(fā)多種以誘導(dǎo)細(xì)胞免疫為主的治療性和預(yù)防性疫苗。
權(quán)利要求
1.刺激機(jī)體產(chǎn)生禽流感特異性CTL細(xì)胞免疫反應(yīng)和特異性抗體免疫反應(yīng)的疫苗，該疫苗由一個(gè)DNA酵母質(zhì)粒通過啟動(dòng)子控制表達(dá)細(xì)胞生長因子和第二個(gè)DNA酵母質(zhì)粒通過啟動(dòng)子控制表達(dá)多個(gè)禽流感病毒抗原基因組成，這兩個(gè)質(zhì)粒都由一個(gè)宿主微生物作為載體來攜帶。
2.1中所說的CTL細(xì)胞免疫反應(yīng)是CD8+殺傷性T細(xì)胞免疫反應(yīng)。
3.1中所說的禽流感特異性抗體是指禽流感病毒血凝抑制(HA)抗體但不限于此。
4.1中所說的細(xì)胞因子包括如下IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-9、IL-10和細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子IFN-γ和TNF-β等。
5.1中所說的禽流感病毒抗原來源于禽流感病毒蛋白。
6.1中所說的患病機(jī)體是指禽流感病毒感染個(gè)體。
7.1中所說的宿主微生物載體是指真核細(xì)胞。
8.6中所說的真核細(xì)胞是酵母細(xì)胞。
9.將1中所說的疫苗配以賦形劑或與其它藥物聯(lián)合應(yīng)用。
10.3中所說的禽流感病毒抗原是指HA、NA、NP、M1、M2、PB1、PB2和PA等禽流感相關(guān)抗原。
全文摘要
雜交酵母禽流感疫苗由基因重組雜交酵母組成。禽流感疫苗組成為兩個(gè)分別表達(dá)不同目的基因的酵母質(zhì)粒，其中一個(gè)質(zhì)粒表達(dá)細(xì)胞因子，另一個(gè)質(zhì)粒表達(dá)禽流感抗原基因；經(jīng)這兩個(gè)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化為單倍體酵母，通過酵母雜交技術(shù)將這兩個(gè)單倍體酵母轉(zhuǎn)化為含有分別表達(dá)不同目的基因的雜交酵母，由此產(chǎn)生的重組雜交酵母禽流感疫苗是一種具有治療和預(yù)防禽流感作用的疫苗。
文檔編號(hào)A61P31/00GK1923289SQ20051009779
公開日2007年3月7日 申請(qǐng)日期2005年8月30日 優(yōu)先權(quán)日2005年8月30日
發(fā)明者孫娟 申請(qǐng)人:孫娟