專(zhuān)利名稱(chēng)：表達(dá)禽流感病毒H5亞型HA蛋白的重組新城疫LaSota弱毒疫苗株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及重組病毒疫苗領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及一種表達(dá)編碼野生型或突變型禽流感病毒H5亞型血凝素(HA)蛋白的基因的重組新城疫LaSota弱毒疫苗株，更具體地，重組新城疫LaSota弱毒疫苗株是rLasota-H5wtHA和rLasota-H5mutHA。本發(fā)明還公開(kāi)了制備所述重組新城疫LaSota弱毒疫苗株的方法和該重組新城疫LaSota弱毒疫苗株在制備預(yù)防禽流感的疫苗中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)為不分節(jié)段單股負(fù)鏈RNA病毒，作為副粘病毒科的重要成員和模型病毒，得到深入研究。重組NDV作為活病毒疫苗載體具有非凡的優(yōu)點(diǎn)包括LaSota株在內(nèi)的NDV弱毒疫苗長(zhǎng)期以來(lái)一直用于家禽防疫，其安全有效性已被充分證明；NDV遺傳相對(duì)穩(wěn)定，僅有一個(gè)血清型，毒株間發(fā)生重組及毒力返強(qiáng)可能性極??；復(fù)制過(guò)程在細(xì)胞漿內(nèi)完成，從RNA到RNA，不存在DNA階段及細(xì)胞基因組整合的可能；NDV弱毒疫苗可同時(shí)誘導(dǎo)全身性體液免疫、局部粘膜免疫及細(xì)胞免疫的形成，形成更加全面、確實(shí)的免疫保護(hù)；可通過(guò)飲水、噴霧、滴鼻、點(diǎn)眼或注射多種方式給苗，使用極為方便；NDV具有高滴度的雞胚生長(zhǎng)特性，生產(chǎn)成本極為低廉(1，7，8，11，12，13)。NDV為高度傳染性和高度致死性的家禽疫病原，我國(guó)每年用于新城疫防制的弱毒疫苗至少在百億羽份以上。NDV作為活病毒疫苗載體應(yīng)用的經(jīng)濟(jì)意義十分巨大。
負(fù)鏈RNA病毒的反向遺傳操作(Reverse genetic)是通過(guò)操作病毒基因組cDNA制造新病毒的過(guò)程，其基本過(guò)程是①組裝完整的病毒基因組(或重組型基因組)cDNA克隆，5’末端精確地綴于T7啟動(dòng)子后，3’末端精確綴于自我剪切的核酸酶序列和T7轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)之前，構(gòu)成基因組cDNA轉(zhuǎn)錄模板；②以基因組cDNA轉(zhuǎn)錄模板與啟動(dòng)病毒復(fù)制必須的轉(zhuǎn)錄相關(guān)功能結(jié)構(gòu)蛋白如核蛋白(NP)、磷酸蛋白(P)和聚合酶蛋白(L)的表達(dá)質(zhì)粒(T7啟動(dòng)子)一起，共轉(zhuǎn)染整合表達(dá)T7聚合酶的病毒復(fù)制許可細(xì)胞；③24-72小時(shí)后收獲培養(yǎng)上清，過(guò)濾后繼續(xù)敏感細(xì)胞傳代或接種雞胚尿囊腔救獲(rescue)病毒。對(duì)基因組cDNA進(jìn)行突變、缺失或外源基因插入修飾后，通過(guò)反向遺傳操作系統(tǒng)(reverse genetic system，RGS系統(tǒng))可獲得相應(yīng)的突變或重組的負(fù)鏈RNA病毒(1，2，3，4，5，6)。
NDV基因組全長(zhǎng)15186核苷酸，與其它副粘病毒一樣，包括核蛋白(NP)，磷蛋白(P)，基質(zhì)蛋白(M)，融合蛋白(F)，凝集素神經(jīng)氨酸酶蛋白(HN)，和大聚合酶蛋白(L)六個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)錄編碼單元(圖1A)。本研究將IBDV VP2蛋白克隆到P和M之間，來(lái)研究外源蛋白在NDV中的表達(dá)適當(dāng)位置。NDV和其它負(fù)鏈RNA病毒一樣，其最小感染單位是核糖核蛋白復(fù)合物，無(wú)蛋白包裹的RNA本身并無(wú)感染性。NDV的基因組RNA通過(guò)與NP、P、L蛋白一起組成核蛋白復(fù)合體，啟動(dòng)RNA的首輪轉(zhuǎn)錄及病毒蛋白的翻譯合成、產(chǎn)生感染性子代病毒(7，10)。根據(jù)這一原理，1999年歐洲學(xué)者率先建立了第一個(gè)高致病性NDV的反向遺傳操作系統(tǒng)(reverse genetic system，RGS系統(tǒng))(2)。目前在歐、美至少有4個(gè)實(shí)驗(yàn)室利用NDV的RGS技術(shù)在基礎(chǔ)與應(yīng)用研究方面開(kāi)展激烈的競(jìng)爭(zhēng)性研究。
禽流感是危害世界養(yǎng)禽業(yè)發(fā)展的重要疾病，高致病力禽流感可導(dǎo)致感染禽群100％的死亡，被國(guó)際獸疫局列為A類(lèi)烈性傳染病。H5亞型歷史上引起高致病力禽流感暴發(fā)。2003年末至2004年初，韓國(guó)、日本、越南、泰國(guó)、印尼、柬埔寨、老撾以及中國(guó)大陸等亞洲國(guó)家相繼暴發(fā)H5亞型高致病力禽流感，現(xiàn)有禽流感滅活疫苗和禽痘活載體疫苗具安全、免疫保護(hù)效果好的優(yōu)點(diǎn)，但仍存在著制造成本高、使用相對(duì)不便的不足。研制高效安全、成本低廉、使用方便的新一代疫苗具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。
禽流感(Avian Influenza，AI)是由禽流感病毒(Avian Influenza Virus，AIV)引起的禽類(lèi)感染和/或疾病綜合征，AIV在分類(lèi)學(xué)上屬于病毒界(Vira)----正粘病毒科(Orthomyxoviridae)----流感病毒屬(Influenza VirusA and B)----禽流感病毒(Avian Influenza Virus)。禽流感病毒屬于正粘病毒科流感病毒屬的A型流感病毒，基因組由8個(gè)單股負(fù)鏈RNA片段組成。其表面結(jié)構(gòu)蛋白血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)抗原性不同，被劃分為不同亞型。血凝素(HA)是禽流感病毒主要的免疫原蛋白，它可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗體介導(dǎo)的特異性體液免疫應(yīng)答，抗HA的抗體可以通過(guò)干擾病毒與唾液酸受體的結(jié)合或者病毒囊膜與內(nèi)吞體膜的融合過(guò)程從而中和病毒的感染。AIV的致病力與其表面結(jié)構(gòu)蛋白HA裂解位點(diǎn)的氨基酸序列密切相關(guān)。低致病力AIV的HA裂解位點(diǎn)只有一個(gè)堿性氨基酸精氨酸(R)，這一結(jié)構(gòu)決定了這些病毒感染動(dòng)物后只能在呼吸系統(tǒng)內(nèi)繁殖，因?yàn)橹挥泻粑郎掀ぜ?xì)胞內(nèi)含有一種精氨酸特異的類(lèi)似胰酶的蛋白酶，可將裂解位點(diǎn)含單一堿性氨基酸精氨酸的HA0裂解為有活性的HA1和HA2，啟動(dòng)病毒的吸附和復(fù)制周期。高致病力H5和H7亞型AIV HA裂解位點(diǎn)含有連續(xù)的多個(gè)堿性氨基酸殘基-RKKR-，可被體內(nèi)多種細(xì)胞內(nèi)廣泛存在的蛋白酶識(shí)別和裂解，因此具有廣泛的組織嗜性，一旦感染便會(huì)造成全身性擴(kuò)散并導(dǎo)致迅速死亡。與可感染人的H1、H2、H3及H9等亞型流感病毒相比，高致病性的H5和H7亞型AIV對(duì)人類(lèi)的潛在危害更為巨大，因?yàn)橐坏└腥救撕蠹纯赡苋硇詳U(kuò)散和迅速致死。
2001-2002年，Palese.P.等相繼構(gòu)建表達(dá)H1亞型流感病毒HA免疫原基因的重組NDV B1株和表達(dá)H7亞型流感病毒HA免疫原基因的重組NDVB1株，免疫試驗(yàn)表明這兩種NDV活載體疫苗可分別在小鼠和禽類(lèi)誘導(dǎo)保護(hù)性免疫反應(yīng)。但是由于B1本身高度致弱，在免疫接種雞體內(nèi)的復(fù)制能力較差，因而誘導(dǎo)免疫雞形成有效免疫保護(hù)的能力也相對(duì)較弱，試驗(yàn)表明，表達(dá)H7亞型HA基因的NDV B1株對(duì)NDV及H7亞型高致病力禽流感致死性攻擊的存活保護(hù)分別僅為60％和40％，且不能阻止病毒在體內(nèi)的復(fù)制和排放(12)。研究表明，NDV基因組在不同位點(diǎn)插入外源報(bào)告基因或免疫原基因，經(jīng)細(xì)胞或雞胚連續(xù)高代次傳代仍保持高度的遺傳和表達(dá)穩(wěn)定性(11，12，13)。但由于上述表達(dá)系統(tǒng)、活病毒載體本身的不足與缺陷以及使用成本等原因，均未實(shí)現(xiàn)在生產(chǎn)實(shí)際的廣泛應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)上述研究背景，本發(fā)明人為進(jìn)一步提高禽流感病毒表達(dá)抗原的免疫原性，構(gòu)建表達(dá)野生型和突變型禽流感病毒HA免疫原蛋白的重組NDV活載體二聯(lián)弱毒疫苗rLasota-H5wtHA和rLasota-H5mutHA，以增強(qiáng)并延長(zhǎng)重組病毒對(duì)禽流感的有效免疫保護(hù)，用于雛雞新城疫與禽流感預(yù)防免疫的免疫防制。
因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種表達(dá)編碼野生型或突變型禽流感病毒H5亞型血凝素(HA)蛋白的基因的重組新城疫LaSota弱毒疫苗株。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述編碼野生型HA蛋白的基因具有SEQ ID No 1所示的核苷酸序列。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述編碼突變型HA蛋白的基因具有SEQ ID No2所示的核苷酸序列。
優(yōu)選所述新城疫LaSota弱毒疫苗株是AV1615，更優(yōu)選所述重組新城疫LaSota弱毒疫苗株是rLasota-H5wtHA和rLasota-H5mutHA。
本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供一種生產(chǎn)上述重組新城疫LaSota弱毒疫苗株的方法，該方法包括(1)構(gòu)建轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒，該轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒包括其中插入編碼野生型或突變型禽流感病毒H5亞型HA蛋白的基因(野生型或突變型HA基因)的所述新城疫LaSota弱毒疫苗株的基因組cDNA序列；(2)構(gòu)建一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)錄輔助質(zhì)粒，該輔助質(zhì)粒包括編碼所述新城疫LaSota弱毒疫苗株的核蛋白(NP)的cDNA序列、編碼所述新城疫LaSota弱毒疫苗株的磷酸蛋白(P)的cDNA序列、和編碼所述新城疫LaSota弱毒疫苗株的大聚合酶蛋白(L)的cDNA序列；(3)將所述轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒和轉(zhuǎn)錄輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染所述病毒復(fù)制許可的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)轉(zhuǎn)染后的宿主細(xì)胞；(4)收獲上清液，過(guò)濾后繼續(xù)敏感細(xì)胞傳代或接種雞胚尿囊腔救獲重組病毒株。
在上述生產(chǎn)方法的一個(gè)實(shí)施方案中，將編碼野生型或突變型禽流感病毒H5亞型HA蛋白的基因插入到新城疫LaSota弱毒疫苗株的基因組P，M之間人工引入的PmeI位點(diǎn)。優(yōu)選所述LaSota弱毒疫苗株是AV1615。
在上述生產(chǎn)方法的另一個(gè)實(shí)施方案中，包括在所述轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒中的基因組cDNA序列位于T7啟動(dòng)子之后，而在編碼自我剪切的核酸酶的序列和T7轉(zhuǎn)錄終止子之前，構(gòu)成基因組cDNA轉(zhuǎn)錄模板。優(yōu)選所述自我剪切的核酸酶是丁肝病毒核酶(Rib)。
在上述生產(chǎn)方法的另一個(gè)實(shí)施方案中，包括在所述轉(zhuǎn)錄輔助質(zhì)粒中的編碼所述新城疫LaSota弱毒疫苗株的核蛋白(NP)的cDNA序列、編碼所述新城疫LaSota弱毒疫苗株的磷酸蛋白(P)的cDNA序列、和編碼所述新城疫LaSota弱毒疫苗株的大聚合酶蛋白(L)的cDNA序列都位于T7啟動(dòng)子之后。優(yōu)選所述轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒是pBRN-FL-H5wtHA(也稱(chēng)為pBRN-FL-H5HAwt)或pBRN-FL-H5mutHA(也稱(chēng)為pBRN-FL-H5HAmut)，所述轉(zhuǎn)錄輔助質(zhì)粒是質(zhì)粒pBSNP，pBSP和pBSL。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞是BHK-21。
本發(fā)明還提供了上述重組新城疫LaSota弱毒疫苗株(特別是rLasota-H5wtHA和rLasota-H5mutHA)在制備預(yù)防禽流感的疫苗中的應(yīng)用。
本發(fā)明通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增了NDV疫苗株LaSota 10個(gè)cDNA片段，利用片段之間互相重疊的部分進(jìn)行拼接，裝配成全長(zhǎng)cDNA克隆。序列測(cè)定結(jié)果已經(jīng)登錄GenBank，登錄號(hào)為AY845400。接著分別將禽流感病毒(Avian influenza virus)H5亞型A/Goose/Guangdong/96/1/H5N1分離株野生型(保留HA蛋白酶裂解位點(diǎn))和突變型(蛋白酶裂解位點(diǎn)缺失)HA基因分別重組到NDV疫苗株LaSota的P和M之間。將其與核蛋白(NP)、磷蛋白(P)和大聚合酶蛋白(L)輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染表達(dá)T7聚合酶的痘病毒感染的細(xì)胞內(nèi)，從而合成反基因組RNA。此RNA在NP、P和L蛋白的作用下，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和復(fù)制。將轉(zhuǎn)染上清接種SPF胚，得到來(lái)自cDNA的具有感染性的病毒。通過(guò)堿基突變，產(chǎn)生了帶有遺傳標(biāo)簽的Lasota的派生株rLasota-H5wtHA和rLasota-H5mutHA，救獲的病毒在雞胚上增殖特征與野毒相近，血凝價(jià)高達(dá)212，以上結(jié)果顯示，兩種類(lèi)型的HA均得到表達(dá)，再一次證實(shí)NDV具有作為疫苗活載體的潛力，為研制新型禽流感疫苗奠定基礎(chǔ)。以上重組NDV不僅可以作為預(yù)防H5亞型高致病力禽流感和新城疫和禽流感的二聯(lián)弱毒疫苗雙價(jià)弱毒疫苗，也可作為二聯(lián)滅活疫苗種毒株，并且完全不干擾目前普遍應(yīng)用的常規(guī)禽流感流行病學(xué)血清學(xué)監(jiān)測(cè)。
HA蛋白裂解位點(diǎn)連續(xù)多個(gè)堿性氨基酸是決定H5亞型高致病力禽流感必須的分子基礎(chǔ)。HA作為RNA病毒囊膜蛋白病表達(dá)后有可能嵌合到重組NDV的病毒囊膜表面，有可能發(fā)揮其細(xì)胞膜受體結(jié)合與融合等細(xì)胞侵入相關(guān)功能的。通過(guò)人工突變刪除HA裂解位點(diǎn)連續(xù)多個(gè)堿性氨基酸，使其轉(zhuǎn)變?yōu)榈椭虏×η萘鞲胁《綡A蛋白的基因形式，將完全避免潛在的生物安全隱患。為此，本發(fā)明通過(guò)PCR方法，人工刪除了裂解位點(diǎn)連續(xù)4個(gè)堿性氨基酸(-RKKR-)，并突變了另外一個(gè)氨基酸，形成突變的低致病力形式H5亞型HA基因(mutHA基因，SEQ ID No 2)，用于構(gòu)建表達(dá)H5亞型禽流感病毒HA抗原的重組新城疫LaSota雙價(jià)疫苗株。


圖1.從高保真RT-PCR產(chǎn)生的亞基因組重疊cDNA片段裝配全長(zhǎng)NDV cDNA。將cDNA片段在共有的限制位點(diǎn)連接，并且在轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒pBR322中裝配，在轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒pBR322中將RBZ和T7終止子序列預(yù)先克隆在EcoRI和salI位點(diǎn)之間(詳見(jiàn)說(shuō)明書(shū))。(A)顯示親代NDV的整個(gè)全長(zhǎng)基因組的第一個(gè)和最后一個(gè)核苷酸。(B)在頂部顯示含有GFP基因的NDV的cDNA克隆，在遺傳圖譜之下的水平線顯示單個(gè)cDNA的位置。
圖2.通過(guò)RT-PCR產(chǎn)生引入修飾酶位點(diǎn)的核苷酸變化，并通過(guò)使用PRISM試劑盒(Perkin-Elmer)和Applied Biosystems ABI310自動(dòng)測(cè)序儀測(cè)序。加框的是通過(guò)PCR誘變?cè)趐BRN1-10中引入的一個(gè)核苷酸替代(由A突變?yōu)镚)。
圖3.重組新城疫病毒rLasota-H5wtHA和rLasota-H5mutHA表達(dá)H5亞型HA抗原的免疫熒光分析。(圖3A和D)NDV-H5wtHA以MOI為1感染BHK-21細(xì)胞，(圖3B和E)和NDV-H5mutHA以MOI為1感染BHK-21細(xì)胞，(圖3C和F)NDV LaSota株對(duì)照以MOI為1感染BHK-21細(xì)胞，感染后20小時(shí)將感染的BHK細(xì)胞甲醇固定，分別以雞抗H5亞型禽流感病毒高免血清(圖3A、B和C)和雞抗新城疫病毒高免血清(圖3D、E和F)為一抗、FITC-偶聯(lián)的兔抗-雞IgG為二抗進(jìn)行間接免疫熒光檢測(cè)，Leica DMIRES2熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞。結(jié)果顯示野生型和突變型H5亞型HA抗原均可在重組新城疫LaSota弱毒疫苗病毒株獲得正確表達(dá)。
圖4.在含胚的雞蛋中rNDV/LaSota病毒的生長(zhǎng)曲線。用1×104EID50rNDV/LaSota接種胚雞蛋，在不同時(shí)刻(接種后24，48，和72小時(shí))收集尿囊液。通過(guò)EID50測(cè)定胚雞蛋的病毒滴度。數(shù)值獲自?xún)蓚€(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)一式三份進(jìn)行。Log滴度來(lái)源于平均病毒滴度。
圖5.重組新城疫病毒rLasota-H5wtHA和rLasota-H5mutHA表達(dá)H5HA蛋白質(zhì)印跡分析。泳道1蛋白質(zhì)標(biāo)記；泳道2感染rLasota-H5wtHA的雞胚原代細(xì)胞(CEF)(獲自哈爾濱獸醫(yī)研究所)；泳道3感染rLasota-H5mutHA的CEF細(xì)胞；泳道4感染rLaSota的CEF細(xì)胞；泳道5正常CEF細(xì)胞；泳道6H5亞型高致病力禽流感病毒接種雞胚尿囊液；泳道7新城疫病毒LaSota弱毒疫苗株接種9～10日齡SPF雞胚尿囊液；泳道8SPF雞胚尿囊液。
圖6.采用DNA免疫制備H5亞型禽流感病毒HA抗原特異雞抗高免血清進(jìn)行Western-blot檢測(cè)rLasota-H5mutHA感染細(xì)胞內(nèi)HA抗原表達(dá)。A.rLasota-H5mutHA雞胚傳代F2感染BHK-21細(xì)胞；B.未感染BHK-21細(xì)胞；C.陰性對(duì)照雞胚尿囊液；D.rLasota-H5mutHA感染雞胚尿囊液。
圖7.重組新城疫病毒活載體疫苗雞胚生長(zhǎng)動(dòng)力測(cè)定比較。
圖8.pBTRT的質(zhì)粒圖譜。
圖9.pBTRT質(zhì)粒的DNA序列。第一個(gè)斜體部分T7啟動(dòng)子；帶下劃線部分核酶序列；第二個(gè)帶下劃線的斜體部分T7終止子。
圖10.pBRN-FL-H5wtHA的質(zhì)粒圖譜。
圖11.pBRN-FL-H5wtHA質(zhì)粒的DNA序列。帶下劃線斜體部分wtHA基因序列。
圖12.pBRN-FL-H5mutHA的質(zhì)粒圖譜。
圖13.pBRN-FL-H5mutHA質(zhì)粒的DNA序列。帶下劃線斜體部分mutHA基因序列。
具體實(shí)施例方式
下文將參考實(shí)施例詳細(xì)描述本發(fā)明，所述實(shí)施例僅是意圖舉例說(shuō)明本發(fā)明，而不是意圖限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明的范圍由后附的權(quán)利要求具體限定。
實(shí)施例1 表達(dá)野生型或突變型禽流感病毒H5亞型血凝素(HA)蛋白的重組新城疫LaSota弱毒疫苗株的構(gòu)建細(xì)胞和病毒BHK-21細(xì)胞(乳倉(cāng)鼠腎細(xì)胞ATCC CCL-10)，培養(yǎng)基為含10％胎牛血清(Hyclone)及1μg/ml G418的DMEM(Dulbecco′s改良的Eagle′s培養(yǎng)基)；NDV Lasota疫苗株AV1615(購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心(CVCC))。接種9-10日齡SPF雞胚尿囊腔擴(kuò)增后-70℃凍存?zhèn)溆茫浑u抗NDV高免性血清由本研究室制備(Chu，H.P.，G.Snell，D.J.Alexander，和G.C.Schild.1982.Avian Pathol 11227-234)；SPF雞胚及SPF雞雛均由哈爾濱獸醫(yī)研究所SPF實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。H5亞型高致病力禽流感病毒(HPAIV)A/Goose/Guangdong/96/1/H5N1分離株[GD/1/96(H5N1)]購(gòu)自哈爾濱獸醫(yī)研究所，為我國(guó)最早分離的H5亞型高致病力禽流感病毒(唐秀英等.中國(guó)禽流感流行株的鑒定.中國(guó)畜禽傳染病，1998，20(1)1-5.)。
轉(zhuǎn)錄載體的構(gòu)建基因組RNA轉(zhuǎn)錄載體pBTRT以低拷貝克隆載體pBR322(Invitrogen)為骨架并在EcoRI/salI位點(diǎn)插入T7啟動(dòng)子(T7promotor)、丁肝病毒核酶(Rib)和T7轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)(T7terminal)，由本實(shí)驗(yàn)室自行構(gòu)建?？寺≡赥7啟動(dòng)子和核酶之間的DNA片段可以在T7RNA聚合酶的作用下得到轉(zhuǎn)錄，并且由于Rib的自身催化功能，可以保證轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的3′末端與克隆的DNA片斷精確一致。
插入野生型和突變型HA基因的重組NDV LaSota株基因組全長(zhǎng)cDNA的構(gòu)建為建立NDV新城疫Lasota疫苗株的反向遺傳操作系統(tǒng)，必須首先構(gòu)建相應(yīng)基因組的全長(zhǎng)cDNA克隆，作為基因組負(fù)鏈RNA轉(zhuǎn)錄模板，為此構(gòu)建了覆蓋整個(gè)基因組的十個(gè)cDNA克隆片段，利用各個(gè)片斷間重疊部分的酶切位點(diǎn)，在低拷貝質(zhì)粒轉(zhuǎn)錄載體質(zhì)粒pBTRT連接組裝獲得了15186nt的完整cDNA克隆，序列測(cè)定結(jié)果已經(jīng)登錄GenBank，登錄號(hào)為AY845400，并將H5亞型禽流感病毒的野生型和突變型HA基因H5wtHA(GenBank登錄號(hào)AF148678，圖11中帶下劃線斜體部分，序列表SEQ IDNo 1)和H5mutHA基因(基因全長(zhǎng)DNA序列見(jiàn)圖13中帶下劃線斜體部分，序列表SEQ ID No 2)克隆到P，M之間。在全長(zhǎng)cDNA片段5’末端前綴T7RNA聚合酶啟動(dòng)子，在cDNA片斷后連有具有自我催化功能的肝炎δ核酶(GenBank X04451)和T7轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)。構(gòu)建完成的質(zhì)粒分別命名為pBRN-FL-H5wtHA和pBRN-FL-H5mutHA(pBRN-FL-H5wtHA和pBRN-FL-H5mutHA的質(zhì)粒圖譜及其DNA全序列分別見(jiàn)圖10、11和圖12、13)。為避免Xba位點(diǎn)的甲基化，通過(guò)PCR基因組將基因組cDNA中F蛋白編碼區(qū)第6178位堿基由T同義突變?yōu)镃，并作為拯救病毒的分子標(biāo)記。與其他研究者一樣，我們同時(shí)在T7聚合酶啟動(dòng)子于基因組cDNA的5’末端引入兩個(gè)多余的G，這可能有助于副粘病毒反向遺傳操作的病毒拯救。具體如下NDV Lasota疫苗株病毒雞胚接種尿囊液經(jīng)常規(guī)方法(動(dòng)物病毒學(xué)，第二版)提取基因組RNA；整個(gè)基因組分為末端部分重疊的10個(gè)片段(F1-F10)進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，cDNA片段克隆至pBluescript(Clontech)SmaI位點(diǎn)并經(jīng)序列分析確證與病毒基因組RNA序列完全一致；序列測(cè)定結(jié)果已經(jīng)登錄GenBank，登錄號(hào)為AY845400。為引入特異的分子遺傳標(biāo)簽，選擇Lasota疫苗株基因組cDNA 6172bp處存在一甲基化的XbaI位點(diǎn)，序列為T(mén)CTAGATCA，利用PCR手段將其突變?yōu)門(mén)CTAGACCA，使其不再受甲基化酶識(shí)別，因而能夠被限制性?xún)?nèi)切酶XbaI所識(shí)別；利用相鄰片段重疊部分存在的限制酶切位點(diǎn)連接成組裝完整的NDV基因組cDNA(圖1A)，并分別將H5亞型禽流感病毒的野生型和突變型HA基因H5wtHA和H5mutHA基因(wtHA用Trizol(Invitrogen)提出IBDV基因組，反轉(zhuǎn)錄后，通過(guò)PCR擴(kuò)增該基因。體系中加入如下引物。上游引物5’GTTTAAACCTTAGAAAAAATACGGGTAGAACCAGTTGTGCCACCATGGAGAAAATAGTGCTTCTT 3’，下游引物5’GTTTAAACTTAAATGCAAATTCTGCATTGT3’。mutHA上游引物5’GTTTAAACCTTAGAAAAAATACGGGTAGAACCAGTTGTGCCACCATGGAGAAAATAGTGCTT，下游引物GTTTAAACTTAAATGCAAATTCTGCATTGT5’)克隆到P，M之間人工引入的PmeI位點(diǎn)，并在前綴基因終止和基因起始序列(GE/GS)(TTAAGAAAAAA/T/ACGGGTAGAA)，并克隆在轉(zhuǎn)錄載體pBTRT上，分別構(gòu)建成含有H5亞型禽流感病毒的野生型和突變型HA基因H5wtHA和H5mutHA基因的病毒基因組轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒pBRN-FL-H5wtHA和pBRN-FL-H5mutHA(圖1B)；表達(dá)核蛋白(NP)、磷酸蛋白(P)及大聚合酶蛋白(L)基因的開(kāi)放閱讀框架(ORF)cDNA分別緊接著克隆在pBluescript II(+/-)質(zhì)粒T7啟動(dòng)子下游，分別構(gòu)成轉(zhuǎn)錄輔助質(zhì)粒pBSNP，pBSP和pBSL。
從重組全長(zhǎng)cDNA克隆救獲感染性NDV(病毒拯救)為了從克隆的cDNA中拯救感染性NDV，首先分別以pBRN-FL-H5wtHA和pBRN-FL-H5mutHA及表達(dá)NDV NP、P、L蛋白的輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞。NDV的融合蛋白F0必須裂解成F1和F2才具有感染性，對(duì)于Lasota弱毒株而言，BHK-21細(xì)胞不能分泌裂解F0蛋白所需的蛋白酶，因此在培養(yǎng)基中加入相應(yīng)蛋白酶，所以此時(shí)應(yīng)換成無(wú)血清培養(yǎng)基并加入TPCK(甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲酮.Sigma)(1μg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)2-3天，收獲轉(zhuǎn)染細(xì)胞上清接種于9-11日齡的SPF雞胚。4天后收獲雞胚尿囊液，血凝(HA)試驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性，不同雞胚的HA價(jià)介于28-11.NDV免疫血清血凝抑制(HI)試驗(yàn)分析同樣呈現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果。收獲病毒陽(yáng)性尿囊液作為救獲病毒rLasota-H5wtHA和rLasota-H5mutHA的F1代。進(jìn)一步的RT-PCR及序列分析結(jié)果顯示，F(xiàn)1代救獲病毒基因組cDNA的6178位點(diǎn)堿基為C，而非原LaSota親本株的C，和預(yù)期完全相符(圖2)。結(jié)果表明，通過(guò)反遺傳操作技術(shù)，利用NDV LaSota疫苗株基因組cDNA克隆成功地救獲具有感染性的子代病毒rLasota-H5wtHA和rLasota-H5mutHA。更具體地，實(shí)驗(yàn)步驟如下BHK-21細(xì)胞接種于35mm六孔板內(nèi)生長(zhǎng)達(dá)50-80％單層時(shí)，將轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒及輔助質(zhì)粒pBRN-FL-H5wtHA或pBRN-FL-H5mutHA、pBSNP、pBSP和pBSL分別以5μg、2.5μg、1.25μg 1.25μg，共轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，采用CaPO4轉(zhuǎn)染試劑盒(Invitrogene)，操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。轉(zhuǎn)染后8-12小時(shí)，棄去轉(zhuǎn)染混合物，用含10％DMSO的PBS液休克細(xì)胞2.5分鐘，加入完全DMEM過(guò)夜孵育，第二天換成無(wú)血清培養(yǎng)基，并加入TPCK(1μg/ml)繼續(xù)孵育2-3天后，收獲培養(yǎng)物上清，0.22μm孔徑濾器過(guò)濾后接種9-11天的SPF胚尿囊腔；接種后的SPF胚繼續(xù)培養(yǎng)，3-5天，取雞胚尿囊液50μl進(jìn)行按常規(guī)進(jìn)行新城疫病毒的血凝(HA)和血凝抑制(HI)試驗(yàn)(Thayer SG，Nersessian BN，Rivetz B，F(xiàn)letcher OJ.Comparison ofserological tests for antibodies against Newcastle disease virus and infectiousbronchitis virus using ImmunoComb solid-phase immunoassay，a commercialenzyme-linked immunosorbent assay，and the hemagglutination-inhibitionassay.Avian Dis.1987Jul-Sep；31(3)459-63.)。收獲HA及HI試驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性尿囊液，-70℃凍存，并按常規(guī)方法分別于9-10日齡雞胚及雞胚成纖維細(xì)胞滴定每毫升EID50及PFU病毒含量(14)。分別命名為rLasota-H5wtHA和rLasota-H5mutHA。
實(shí)施例2 重組NDV表達(dá)AVIHA蛋白間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)試驗(yàn)NDV LaSota疫苗株能一過(guò)性感染體外培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。為證明rLasota-H5wtHA和rLasota-H5mutHA病毒在BHK-21細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制及病毒抗原表達(dá)，二者尿囊毒以MOI為1的病毒量分別感染約70-80％的單層BHK-21細(xì)胞(圖3A和B)，同時(shí)以NDV野生型LaSota疫苗株感染細(xì)胞為對(duì)照(圖3C)，感染后20小時(shí)細(xì)胞出現(xiàn)早期CPE(細(xì)胞病變)現(xiàn)象，立即以NDV高免SPF雞陽(yáng)性血清為檢測(cè)抗體進(jìn)行間接免疫熒光染色，結(jié)果三種病毒感染細(xì)胞熒光顯微鏡下觀察到強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)(圖3A、B和C)更具體地，實(shí)驗(yàn)步驟如下分別以雞胚接種傳代二代次尿囊病毒液rLasota-H5wtHA、rLasota-H5mutHA和野生型LaSota疫苗株(圖3D、E和F)DMEM適當(dāng)倍數(shù)稀釋?zhuān)碝OI＝5、50μl體積感染生長(zhǎng)于24孔板的BHK-21，37℃，孵育1h后用DMEM洗滌三遍，然后加入完全DMEM繼續(xù)培養(yǎng)，24h后用95％乙醇固定細(xì)胞5min，PBST(含有0.05％吐溫20的磷酸鹽緩沖液)洗細(xì)胞后用SPF雞血清進(jìn)行封閉1小時(shí)后，以雞抗H5亞型高致病力禽流感病毒高免SPF雞陽(yáng)性血清為一抗，作用30分鐘后PBST洗滌后，加入1∶160稀釋熒光素(FITC)標(biāo)記的兔抗雞IgG二抗(Sigma)，作用30min，PBST洗滌后熒光顯微鏡(Leica DMIRES2)觀察，rLasota-H5wtHA和rLasota-H5mutHA感染細(xì)胞全部出現(xiàn)強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)，而rLasota感染細(xì)胞則完全陰性。
結(jié)果表明，重組新城疫病毒rLasota-H5wtHA和rLasota-H5mutHA成功表達(dá)了H5亞型禽流感病毒HA抗原蛋白。
實(shí)施例3 重組NDV表達(dá)AVI HA蛋白的Western-Blot鑒定取病毒感染雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)裂解液(棄去培養(yǎng)液后，加入1/10體積的PBS，懸起細(xì)胞，加入等體積的2×SDS裂解緩沖液沸水裂解10min后，12000g離心10min，收獲上清)或病毒接種SPF雞胚尿囊原液，進(jìn)行SDS-PAGE(Bio-Rad)。將蛋白電轉(zhuǎn)移(Bio-Rad)到尼龍膜上(Ameresco)，10％脫脂乳封閉過(guò)夜，PBST(0.05％Tween20)洗滌后加入1∶50稀釋的DNA免疫制備雞抗H5亞型禽流感病毒HA抗原高免血清為一抗，辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記兔抗雞山羊抗鼠IgG(Sigma)二抗為，1∶2500倍PBST稀釋?zhuān)珼AB(二氨基聯(lián)苯膠，Sigma)顯色3～5分鐘后用去離子水終止反應(yīng)。結(jié)果如圖5，證明了重組NDV分別表達(dá)野生型和突變型AVI HA蛋白。結(jié)果顯示rLasota-H5wtHA和rLasota-H5mutHA感染CEF的HA抗原檢測(cè)均為陽(yáng)性，新城疫Lasota疫苗株病毒感染及未感染CEF的HA抗原檢測(cè)均為陰性；H5N1亞型高致病力禽流感病毒GD/1/96株接種SPF雞胚尿囊原液HA抗原檢測(cè)為陽(yáng)性，而新城疫Lasota疫苗株病毒接種及未接種SPF雞胚尿囊液HA抗原檢測(cè)為陰性。
結(jié)果表明，H5亞型禽流感病毒HA抗原在重組新城疫病毒rLasota-H5mutHA和rLasota-H5wtHA獲得正確表達(dá)。
實(shí)施例4 rNDV在雞胚的生長(zhǎng)特性及致病特性為確定反向遺傳操作救獲rLasota-H5wtHA和rLasota-H5mutHA的雞胚生長(zhǎng)特性及其對(duì)雞胚的致病性，將rLasota-H5wtHA病毒F1代尿囊病毒液按1×104EID50接種SPF雞胚尿囊腔。1×104EID50接種后96小時(shí)內(nèi)完全不致死SPF雞胚。接種后24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)及96小時(shí)收獲尿囊液，HA滴度平均值分別為27.5、210.3、211.3和211.6，而每毫升尿囊液EID50則分別為10-8.54、10-8.635、10-10.085和10-9.43(圖4)。結(jié)果表明反向遺傳操作救獲病毒rLasota-H5wtHA仍然保持NDV LaSota疫苗親本株在雞胚的高滴度生長(zhǎng)及低致死的生物學(xué)特性。
另外，對(duì)于rLasota-H5mutHA病毒，將其與NDV Lasota疫苗株AV1615的雞胚生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)進(jìn)行比較。具體如下SPF雞胚傳代F2代次種子毒尿囊液以1×103EID50劑量接種10日齡SPF雞胚50枚。于不同時(shí)間點(diǎn)10枚雞胚，每雞胚分別收獲尿原液100ul，10倍連續(xù)梯度稀釋按常規(guī)進(jìn)行EID50滴定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖7，表明rLasota-H5mutHA的雞胚生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)與野生株NDV Lasota疫苗株AV1615類(lèi)似。
接下來(lái)將rLasota-H5mutHA病毒和NDV Lasota疫苗株AV1615進(jìn)行致病性比較分析。具體如下9～10日齡SPF雞胚尿囊腔接種，每雞胚100ul體積1×103EID50病毒劑量；按OIE推薦標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，2日齡SPF白色來(lái)杭雛雞腦內(nèi)接種十分之一稀釋雞胚增殖病毒尿囊液100ul(約1×107EID50)，觀察8天，計(jì)算ICPI；用于新生芻雞的LaSota活毒疫苗株ICPI應(yīng)在0.4左右或低于0.4。結(jié)果如表1，表明rLasota-H5mutHA病毒不僅保持NDV Lasota疫苗株AV1615的低致病性，而且被更加致弱。上述結(jié)果表明了該重組NDV保持了親本LaSota疫苗株在SPF雞胚的高滴度生長(zhǎng)特性及低致病性。
表1.重組新城疫病毒致病性分析

實(shí)施例5 誘導(dǎo)保護(hù)性抗體的免疫效果為測(cè)定反向遺傳操作救獲病毒rLasota-H5wtHA和rLasota-H5mutHA對(duì)SPF雞雛的免疫原性，以rLasota-H5wtHA為例，雞胚擴(kuò)增尿囊毒2×106EID50劑量經(jīng)經(jīng)滴鼻加點(diǎn)眼途徑人工免疫12羽七日齡白色來(lái)亨SPF雞雛(哈爾濱獸醫(yī)研究所SPF實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，另設(shè)非免疫組對(duì)照組8羽；免疫組和非免疫對(duì)照組分別飼養(yǎng)于空氣負(fù)壓過(guò)濾隔離器中。3周以后翅靜脈采血分離血清按常規(guī)檢測(cè)檢測(cè)NDV和AIV的特異HI抗體。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果rLasota-H5wtHA尿囊病毒液F1代分別以2×106EID50劑量經(jīng)滴鼻加點(diǎn)眼途徑人工免疫七日齡白色來(lái)亨SPF雞雛，免疫后觀察3周，期間免疫組所有雛雞無(wú)任何異常，飼料消耗及生長(zhǎng)發(fā)育與非免疫對(duì)照組無(wú)明顯差異。免疫后3周檢測(cè)血清NDV特異HI抗體水平，全部介于27-29，平均為28.2(表2)結(jié)果顯示rLasota-H5wtHA一次免疫雛雞即可誘導(dǎo)高水平的保護(hù)性抗體反應(yīng)，具有良好的免疫原性，并且保留低致病性LaSota疫苗株良好的安全性。
另外，對(duì)于rLasota-H5mutHA病毒，將其與NDV Lasota疫苗株AV1615的誘導(dǎo)保護(hù)性抗體免疫反應(yīng)進(jìn)行比較。結(jié)果如表2，表明rLasota-H5mutHA病毒能夠同時(shí)誘導(dǎo)對(duì)NDV和AIV的保護(hù)性抗體免疫反應(yīng)。
表2 H5亞型禽流感新城疫病毒活載體雙價(jià)疫苗免疫1周齡SPF雛雞誘導(dǎo)保護(hù)性抗體免疫反應(yīng)

*疫苗經(jīng)滴鼻加點(diǎn)眼途徑免疫7日齡雛雞，每羽共100ul體積；**疫后19天(26日齡)采集血清進(jìn)行NDV和H5亞型AIV特異HI抗體檢測(cè)。
另外，對(duì)于rLasota-H5mutHA病毒，將其與NDV Lasota疫苗株AV1615對(duì)新城疫強(qiáng)毒F48E9(購(gòu)自CVCC)致死性攻擊的免疫保護(hù)進(jìn)行比較。結(jié)果如表3，表明rLasota-H5mutHA病毒與AV1615具有對(duì)新城疫強(qiáng)毒致死性攻擊的相同的免疫保護(hù)作用。
表3.H5亞型禽流感新城疫病毒活載體雙價(jià)疫苗免疫1周齡SPF雛雞對(duì)新城疫強(qiáng)毒致死性攻擊的免疫保護(hù)

*疫苗經(jīng)滴鼻加點(diǎn)眼途徑免疫7日齡雛雞，每羽2×106EID50劑量共100ul體積；**免疫后21天(28日齡)采用NDV強(qiáng)毒F48E9株(CVCC)600 EID50劑量經(jīng)鼻腔感染途徑攻擊，持續(xù)觀察21天；上述結(jié)果表明，rLasota-H5mutHA病毒重組疫苗常規(guī)劑量經(jīng)滴鼻、點(diǎn)眼途徑免疫雛雞，免疫后與新城疫LaSota疫苗株親本野毒免疫組及非免疫對(duì)照相比無(wú)任何異常，免疫后NDV和H5亞型禽流感病毒特異的保護(hù)性相關(guān)血凝抑制(HI)抗體能力與現(xiàn)有疫苗相當(dāng)，安全有效最后，將rLasota-H5mutHA病毒這種H5亞型禽流感新城疫病毒活載體雙價(jià)疫苗對(duì)1周齡SPF雛雞免疫，評(píng)估其對(duì)H5亞型高致病力禽流感致死性攻擊的免疫保護(hù)。結(jié)果如表4，結(jié)果表明，rLasota-H5mutHA病毒重組疫苗免疫雛雞對(duì)新城疫強(qiáng)毒株和H5亞型高致病力禽流感病毒致死攻擊形成100％完全免疫保護(hù)免疫保護(hù)，不發(fā)病、不死亡；H5亞型高致病力禽流感病毒攻擊后完全阻止呼吸道、消化道病毒排放。
表4.H5亞型禽流感新城疫病毒活載體雙價(jià)疫苗免疫1周齡SPF雛雞對(duì)H5亞型高致病力禽流感致死性攻擊的免疫保護(hù)


*疫苗經(jīng)滴鼻加點(diǎn)眼途徑免疫7日齡雛雞，每羽2×106EID50劑量，共100ul體積；**免疫后21天(28日齡)分別采用H5亞型高致病力禽流感病毒GD/96株(由哈爾濱獸醫(yī)研究所提供)和NanHui/04(NH/04)株(由哈爾濱獸醫(yī)研究所提供)經(jīng)鼻腔感染途徑攻擊，劑量均為100 EID50，，攻毒后持續(xù)觀察21天；***對(duì)照組以南匯04年分離株(NH/04)攻毒3天以?xún)?nèi)全部死亡，分離病毒的喉頭及泄殖腔拭子均采自攻毒后第2和第3天的病死雞本研究選擇我國(guó)自行培育、生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用多年、實(shí)踐證明免疫效果良好的一株新城疫病毒LaSota弱毒疫苗作為親本株，通過(guò)負(fù)鏈RNA病毒的反基因操作技術(shù)，構(gòu)建了表達(dá)H5亞型高致病力禽流感病毒HA免疫原基因的重組NDV活載體疫苗株。綜上所述，我們以新城疫病毒(NDV)的RGS為平臺(tái)，以國(guó)內(nèi)H5亞型高致病力禽流感病毒流行分離株的保護(hù)性免疫原HA蛋白為目的基因，對(duì)其裂解位點(diǎn)多個(gè)堿性氨基酸進(jìn)行缺失突變后，在5’端加上NDV基因組P基因相應(yīng)轉(zhuǎn)錄終止(GE)序列和M基因轉(zhuǎn)錄起始(GS)序列，插入基因組內(nèi)P基因和M基因間非編碼區(qū)，構(gòu)建表達(dá)HA的重組新城疫病毒，作為預(yù)防新城疫和H5亞型高致病力禽流感的雙價(jià)弱毒疫苗，并進(jìn)行了生物安全性和免疫原性的評(píng)估。研究表明，NDV基因組在不同位點(diǎn)插入外源報(bào)告基因或免疫原基因，經(jīng)細(xì)胞或雞胚連續(xù)高代次傳代仍保持高度的遺傳穩(wěn)定性。免疫試驗(yàn)結(jié)果表明，rLasota-H5mutHA重組疫苗一次免疫即可對(duì)H5亞型高致病力禽流感和新城疫強(qiáng)毒的致死攻擊形成100％完全免疫保護(hù)，誘導(dǎo)保護(hù)性抗體的能力與現(xiàn)有滅活疫苗相當(dāng)，而在誘導(dǎo)具有重要意義的粘膜免疫和細(xì)胞免疫方面更具優(yōu)勢(shì)；保持了親本LaSota疫苗株對(duì)新生雛雞安全有效、高滴度雞胚生長(zhǎng)特性、使用方便等優(yōu)點(diǎn)；環(huán)境社會(huì)效益顯著，與傳統(tǒng)禽流感疫苗相比，同樣劑量疫苗生產(chǎn)用雞胚量?jī)H為的百分之一，產(chǎn)品體積僅為千分之一，并且生產(chǎn)中無(wú)需礦物油的使用，完全避免了傳統(tǒng)油乳劑滅活疫苗注射對(duì)免疫對(duì)商品雞體的影響。
新城疫病毒作為活病毒載體構(gòu)建防治禽流感和新城疫雙價(jià)疫苗具有巨大優(yōu)越性。禽流感和新城疫被國(guó)際獸疫局列為A類(lèi)烈性傳染病，是危害世界養(yǎng)禽業(yè)發(fā)展的重要疾病，禽流感同時(shí)具有極其重要公共衛(wèi)生意義。我國(guó)每年用于新城疫防制的弱毒疫苗至少在百億羽份以上，NDV弱毒疫苗特別是LaSota疫苗株的應(yīng)用在我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)幾乎是所有新生雛雞必不可少的免疫程序。長(zhǎng)期以來(lái)，NDV弱毒疫苗安全有效性已被充分證明；NDV遺傳穩(wěn)定，僅有一個(gè)血清型；可同時(shí)誘導(dǎo)全身性體液免疫、局部粘膜免疫及細(xì)胞免疫的形成，形成更加全面、確實(shí)的免疫保護(hù)；可通過(guò)飲水、噴霧、滴鼻、點(diǎn)眼或注射多種方式給苗，使用極為方便；NDV具有高滴度的雞胚生長(zhǎng)特性，生產(chǎn)成本極為低廉。新城疫病毒(NDV)為不分節(jié)單股負(fù)鏈RNA病毒，基因組結(jié)構(gòu)與功能背景清楚，遺傳相對(duì)穩(wěn)定，重組NDV中插入的外源基因在細(xì)胞或雞胚經(jīng)高代次傳代后仍可保持穩(wěn)定表達(dá)，非常適合作為表達(dá)或疫苗載體。
rLasota-H5mutHA重組疫苗的應(yīng)用，將使得H5亞型高致病力禽流感的疫苗防制幾乎不再需要額外的制造和使用成本，全國(guó)每年可至少節(jié)約數(shù)千萬(wàn)元以上的防疫經(jīng)費(fèi)和大量社會(huì)勞動(dòng)成本，并減少免疫對(duì)象的不良應(yīng)激反應(yīng)。已有的數(shù)據(jù)表明本疫苗與現(xiàn)有新城疫和禽流感疫苗相比，具有巨大社會(huì)、經(jīng)濟(jì)和環(huán)境效益優(yōu)勢(shì)，國(guó)、內(nèi)外市場(chǎng)前景廣闊。新城疫病毒作為疫苗載體是國(guó)際先進(jìn)的新型技術(shù)，如果進(jìn)一步加快進(jìn)度，H5亞型禽流感新城疫病毒活載體疫苗將有望成為國(guó)際上第一個(gè)推向生產(chǎn)實(shí)際的負(fù)鏈RNA病毒活載體疫苗。
參考文獻(xiàn)1.Takaaki Nakaya，Jerome Cros，Man-Seong Park，Yurie Nakaya，Hongyong Zheng，Ana Sagrera，Enrique Villar，Adolfo Garci′A-Sastre，andPeter Palese.2001.Recombinant Newcastle Disease Virus as a Vaccine VectorJournal of Virology，7511868-118732.Ben P.H.Peeters，Olav S.Deleeuw，Guus Koch and Arnol.J.Gielkens1999.Rescue of Newcastle Disease Virus from Cloned cDNAEvidence thatCleavability of the Fusion Protein Is a Major Determinant for Virulence.Journal of Virology.735001-50093.Zhuhui Huang，Aruna Panda，Subbiah Elankumaran，DhanasekaranGovindarajan，Daniel D.Rockemann，and Siba K.Samal.2003.TheHemagglutinin-Neuraminidase Protein of Newcastle Disease Virus DeterminesTropism and Virulence.Journal of Virology.784176-41844.Zhuhui Huang，Sateesh Krishnamurthy，Aruna Panda，and Siba K.Samal.2003.Newcastle Disease Virus V Protein Is Associated with ViralPathogenesis and Functions as an AlphaInterferon Antagonist.Journal ofVirology.778676-86855.Teshome Mebatsion，Leonie T.C.de Vaan，Niels de Haas，AngelaRo“mer-Oberdo”rfer，and Marian Braber.2003.Identification of a Mutation inEditing of Defective Newcastle Disease Virus Recombinants That ModulatesP-Gene mRNA Editing and Restores Virus Replication and Pathogenicity inChicken Embryos.Journal of Virology.779259-92656.Man-Seong Park，Adolfo García-Sastre，Jerome F.Cros，Christopher F.Basler，and Peter Palese.2003.Newcastle Disease Virus V Protein Is aDeterminant of Host Range Restriction.Journal of Virology.779522-95327.Z.Huang，S.Elankumaran，A.Panda，and S.K.Samal.2003.RecombinantNewcastle Disease Virus as a Vaccine Vector.Poultry Science.82899-9068.Gabriele Neumann，Michael A.Whitt and Yoshihiro Kawaoka.2002.Adecade after the generation of a negative-sense RNA virus from clond cDNA-what have we learned？Journal of General Virology.832635-26629.Angela Romer-Oberdorfer，Egbert Mundt，Teshome Mebatsion，UrsulaJ.Buchholz.1999.Generation of recombinant lentogenic Newcastle diseasevirus from cDNA.Journal of General Virology.802987-299510.B.P.H.Peeters，Y.K.Gruijthuijsen，O.S.de Leeuw，和A.L.J.Gielkens.2000.Genome replication of Newcastle disease virusinvolvement ofthe rule-of-six.Archives of Virology.1451829-1845
序列表<110>中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所<120>表達(dá)禽流感病毒H5亞型HA蛋白的重組新城疫LaSota弱毒疫苗株<130>IB054591<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1711<212>DNA<213>野生型禽流感病毒H5亞型<400>1atggagaaaa tagtgcttct tcttgcaata gtcagtcttg tcaaaagtga tcagatttgc 60attggttacc atgcaaacaa ctcgacagag caggttgaca caataatgga aaagaacgtt120actgttacac atgcccaaga catactggaa aagacacaca atgggaagct ctgcgatcta180aatggagtga agcctctcat tttgagagat tgtagtgtag ctggatggct cctcggaaac240cctatgtgtg acgaattcat caatgtgccg gaatggtctt acatagtgga gaaggccagt300ccagccaatg acctctgtta cccaggggat ttcaacgact atgaagaact gaaacaccta360ttgagcagaa caaaccattt tgagaaaatt cagatcatcc ccaaaagttc ttggtccaat420catgatgcct catcaggggt gagctcagca tgtccatacc atgggaggtc ctcctttttc480agaaatgtgg tatggcttat caaaaagaac agtgcatacc caacaataaa gaggagctac540aataatacca accaagaaga tcttttagta ctgtggggga ttcaccatcc taatgatgcg600gcagagcaga caaagctcta tcaaaaccca accacttaca tttccgttgg aacatcaaca660ctgaaccaga gattggttcc agaaatagct actagaccca aagtaaacgg gcaaagtgga720agaatggagt tcttctggac aattttaaag ccgaatgatg ccatcaattt cgagagtaat780ggaaatttca ttgctccaga atatgcatac aaaattgtca agaaagggga ctcagcaatt840atgaaaagtg aattggaata tggtaactgc aacaccaagt gtcaaactcc aatgggggcg900ataaactcta gtatgccatt ccacaacata caccccctca ccatcgggga atgccccaaa960tatgtgaaat caaacagatt agtccttgcg actggactca gaaatacccc tcaaagagag 1020agaagaagaa aaaagagagg actatttgga gctatagcag gttttataga gggaggatgg 1080cagggaatgg tagatggttg gtatgggtac caccatagca atgagcaggg gagtggatac 1140gctgcagaca aagaatccac tcaaaaggca atagatggag tcaccaataa ggtcaactcg 1200
atcattgaca aaatgaacac tcagtttgag gccgttggaa gggaatttaa taacttggaa 1260aggaggatag agaatttaaa caagcagatg gaagacggat tcctagatgt ctggacttat 1320aatgctgaac ttctggttct catggaaaat gagagaactc tagactttca tgactcaaat 1380gtcaagaacc tttatgacaa ggtccgacta cagcttaggg ataatgcaaa ggagctgggt 1440aatggttgtt tcgagttcta tcacaaatgt gataatgaat gtatggaaag tgtaaaaaac 1500ggaacgtatg actacccgca gtattcagaa gaagcaagac taaacagaga ggaaataagt 1560ggagtaaaat tggaatcaat gggaacttac caaatactgt caatttattc aacagtggcg 1620agttccctag cactggcaat catggtagct ggtctatctt tatggatgtg ctccaatgga 1680tcgttacaat gcagaatttg catttaagtt t 1711<210>2<211>1699<212>DNA<213>人工序列<400>2atggagaaaa tagtgcttct tcttgcaata gtcagtcttg tcaaaagtga tcagatttgc 60attggttacc atgcaaacaa ctcgacagag caggttgaca caataatgga aaagaacgtt120actgttacac atgcccaaga catactggaa aagacacaca atgggaagct ctgcgatcta180aatggagtga agcctctcat tttgagagat tgtagtgtag ctggatggct cctcggaaac240cctatgtgtg acgaattcat caatgtgccg gaatggtctt acatagtgga gaaggccagt300ccagccaatg acctctgtta cccaggggat ttcaacgact atgaagaact gaaacaccta360ttgagcagaa caaaccattt tgagaaaatt cagatcatcc ccaaaagttc ttggtccaat420catgatgcct catcaggggt gagctcagca tgtccatacc atgggaggtc ctcctttttc480agaaatgtgg tatggcttat caaaaagaac agtgcatacc caacaataaa gaggagctac540aataatacca accaagaaga tcttttagta ctgtggggga ttcaccatcc taatgatgcg600gcagagcaga caaagctcta tcaaaaccca accacttaca tttccgttgg aacatcaaca660ctgaaccaga gattggttcc agaaatagct actagaccca aagtaaacgg gcaaagtgga720agaatggagt tcttctggac aattttaaag ccgaatgatg ccatcaattt cgagagtaat780ggaaatttca ttgctccaga atatgcatac aaaattgtca agaaagggga ctcagcaatt840atgaaaagtg aattggaata tggtaactgc aacaccaagt gtcaaactcc aatgggggcg900ataaactcta gtatgccatt ccacaacata caccccctca ccatcgggga atgccccaaa960tatgtgaaat caaacagatt agtccttgcg actggactca gaaatacccc tcaaagagag 1020actcgaggac tatttggagc tatagcaggt tttatagagg gaggatggca gggaatggta 1080gatggttggt atgggtacca ccatagcaat gagcagggga gtggatacgc tgcagacaaa 1140gaatccactc aaaaggcaat agatggagtc accaataagg tcaactcgat cattgacaaa 1200atgaacactc agtttgaggc cgttggaagg gaatttaata acttggaaag gaggatagag 1260aatttaaaca agcagatgga agacggattc ctagatgtct ggacttataa tgctgaactt 1320ctggttctca tggaaaatga gagaactcta gactttcatg actcaaatgt caagaacctt 1380
tatgacaagg tccgactaca gcttagggat aatgcaaagg agctgggtaa tggttgtttc 1440gagttctatc acaaatgtga taatgaatgt atggaaagtg taaaaaacgg aacgtatgac 1500tacccgcagt attcagaaga agcaagacta aacagagagg aaataagtgg agtaaaattg 1560gaatcaatgg gaacttacca aatactgtca atttattcaa cagtggcgag ttccctagca 1620ctggcaatca tggtagctgg tctatcttta tggatgtgct ccaatggatc gttacaatgc 1680agaatttgca tttaagttt1699
權(quán)利要求
1.一種表達(dá)編碼野生型或突變型禽流感病毒H5亞型血凝素(HA)蛋白的基因的重組新城疫LaSota弱毒疫苗株。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的重組新城疫LaSota弱毒疫苗株，其中所述編碼野生型HA蛋白的基因具有SEQ ID No 1所示的核苷酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的重組新城疫LaSota弱毒疫苗株，其中所述編碼突變型HA蛋白的基因具有SEQ ID No 2所示的核苷酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任何一項(xiàng)的重組新城疫LaSota弱毒疫苗株，其中所述新城疫LaSota弱毒疫苗株是AV1615。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的重組新城疫LaSota弱毒疫苗株，其中所述重組新城疫LaSota弱毒疫苗株是rLasota-H5wtHA和rLasota-H5mutHA。
6.一種生產(chǎn)根據(jù)權(quán)利要求1的重組新城疫LaSota弱毒疫苗株的方法，該方法包括(1)構(gòu)建轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒，該轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒包括其中插入編碼野生型或突變型禽流感病毒H5亞型HA蛋白的基因(野生型或突變型HA基因)的所述新城疫LaSota弱毒疫苗株的基因組cDNA序列；(2)構(gòu)建一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)錄輔助質(zhì)粒，該輔助質(zhì)粒包括編碼所述新城疫LaSota弱毒疫苗株的核蛋白(NP)的cDNA序列、編碼所述新城疫LaSota弱毒疫苗株的磷酸蛋白(P)的cDNA序列、和編碼所述新城疫LaSota弱毒疫苗株的大聚合酶蛋白(L)的cDNA序列；(3)將所述轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒和轉(zhuǎn)錄輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染所述病毒復(fù)制許可的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)轉(zhuǎn)染后的宿主細(xì)胞；(4)收獲上清液，過(guò)濾后繼續(xù)敏感細(xì)胞傳代或接種雞胚尿囊腔救獲重組病毒株。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中將編碼野生型或突變型禽流感病毒H5亞型HA蛋白的基因插入到新城疫LaSota弱毒疫苗株的基因組P，M之間人工引入的PmeI位點(diǎn)。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7的方法，其中所述LaSota弱毒疫苗株是AV1615(中國(guó)獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心，CVCC)。
9.根據(jù)權(quán)利要求6或7的方法，其中包括在所述轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒中的基因組cDNA序列位于T7啟動(dòng)子之后，而在編碼自我剪切的核酸酶的序列和T7轉(zhuǎn)錄終止子之前，構(gòu)成基因組cDNA轉(zhuǎn)錄模板。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中所述自我剪切的核酸酶是丁型肝炎病毒核酶(Rib)。
11.根據(jù)權(quán)利要求6或7的方法，其中包括在所述轉(zhuǎn)錄輔助質(zhì)粒中的編碼所述新城疫LaSota弱毒疫苗株的核蛋白(NP)的cDNA序列、編碼所述新城疫LaSota弱毒疫苗株的磷酸蛋白(P)的cDNA序列、和編碼所述新城疫LaSota弱毒疫苗株的大聚合酶蛋白(L)的cDNA序列都位于T7啟動(dòng)子之后。
12.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中所述轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒是pBRN-FL-H5wtHA或pBRN-FL-H5mutHA。
13.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中所述轉(zhuǎn)錄輔助質(zhì)粒是質(zhì)粒pBSNP，pBSP和pBSL。
14.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中所述宿主細(xì)胞是BHK-21。
15.根據(jù)權(quán)利要求1的重組新城疫LaSota弱毒疫苗株在制備預(yù)防禽流感的疫苗中的應(yīng)用。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的應(yīng)用，其中所述重組新城疫LaSota弱毒疫苗株是rLasota-H5wtHA和rLasota-H5mutHA。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種表達(dá)野生型或突變型禽流感病毒H5亞型血凝素(HA)蛋白的重組新城疫LaSota弱毒疫苗株，更具體地，重組新城疫LaSota弱毒疫苗株是prLasota－H5wtHA和rLasota－H5mutHA。本發(fā)明還公開(kāi)了制備所述重組新城疫LaSota弱毒疫苗株的方法和該重組新城疫LaSota弱毒疫苗株在制備預(yù)防禽流感的疫苗中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61K39/12GK1772887SQ20051009799
公開(kāi)日2006年5月17日 申請(qǐng)日期2005年9月2日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月2日
發(fā)明者步志高, 陳化蘭 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所