專利名稱：重組人白細(xì)胞介素－15在制備腫瘤免疫治療藥物中的應(yīng)用以及一種免疫治療藥物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物制藥領(lǐng)域，具體涉及一種重組蛋白的醫(yī)藥用途，即涉及腫瘤免疫治療中含有重組人白細(xì)胞介素-15(recombinant human interleukin-15，rhIL-15)的藥物。本發(fā)明還涉及包含所述重組蛋白的藥物組合物以及具體的注射用粉針劑。
背景技術(shù)：
白細(xì)胞介素-15(IL-15)是Grabstein等人于1994年發(fā)現(xiàn)的一種具有免疫調(diào)節(jié)活性的細(xì)胞因子，成熟蛋白由114個(gè)氨基酸殘基組成，分子量為14～15kD(Grabstein KH，et al.Cloning of a T cell growth factor that interacts with the βchainof the interleukin-2 receptor.Science，1994；264965-68.)。隨著對其研究的不斷深入，人們對IL-15的結(jié)構(gòu)、功能等有了更新的認(rèn)識。IL-15的體外活性類似于IL-2，促進(jìn)T細(xì)胞、B細(xì)胞和自然殺傷(NK)細(xì)胞的增殖分化，增強(qiáng)細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(CTL)/NK細(xì)胞毒活性等，在機(jī)體的免疫應(yīng)答中發(fā)揮著重要作用。但是，它對T細(xì)胞的作用又不完全同于IL-2，有時(shí)甚至作用相反。IL-2促進(jìn)T細(xì)胞活化和增殖，但也可能通過IL-2受體誘導(dǎo)活化淋巴細(xì)胞凋亡和/或功能抑制，IL-15卻有助于維持記憶性CD8+T細(xì)胞存活。IL-15是一個(gè)多效能細(xì)胞因子，低劑量的外源IL-15能誘導(dǎo)NK細(xì)胞、NK-T細(xì)胞和記憶性CD8+T細(xì)胞的發(fā)育、增殖及活化，提高機(jī)體CD8+T細(xì)胞的抗腫瘤或抗病原體功能，而不產(chǎn)生明顯的毒副作用。由于IL-15作用的多樣性，可在天然免疫和獲得性免疫反應(yīng)中產(chǎn)生交叉的調(diào)節(jié)作用，因而可將其看作天然免疫和獲得性免疫系統(tǒng)間的橋梁。
在IL-15的功能研究中，其抗腫瘤作用受到重視(Munger W，Dejoy SQ，Jeyaseelan R，Torley LW，Grabstein KH，Eisenmann J，Paxton R，Cox T，Wick MM，Kerwar SS.Studies evaluating the antitumor activity and toxicity of interleukin-15.anew T cell growth factorcomparison with interleukin-2.Cellular Immunology.1995.165289-293.)。在大鼠結(jié)腸癌模型中發(fā)現(xiàn)，IL-15能顯著降低化療引起的胃腸道毒性，增加藥物的最大耐受劑量。并且，低濃度IL-15(10ng/ml)不刺激外周血單核細(xì)胞產(chǎn)生一定程度的增殖，卻增強(qiáng)它們的抗腫瘤細(xì)胞毒作用，因?yàn)樵谙薅▌┝糠秶鷥?nèi)，IL-15在發(fā)揮抗腫瘤細(xì)胞毒作用同時(shí)，僅誘導(dǎo)最低程度的淋巴細(xì)胞增殖，從而降低了炎性細(xì)胞因子的釋放和毒副作用的產(chǎn)生(Jong JL，F(xiàn)arner NL，JavorskyBR，Lindstrom MJ，Hank JA，Sondel PM.Differential quantitative effects of IL-2 andIL-15 on cytotoxic activity and proliferation by lymphocytes from patients receiving invivo IL-2therapy.Clin Cancer Res.1998.4(5)1287-1296.)。
發(fā)明人通過對IL-15的深入研究發(fā)現(xiàn)，IL-15基因修飾的小鼠肺腺癌細(xì)胞LA795A的致瘤性明顯降低，有明顯的抑制腫瘤生長作用；IL-15基因修飾的人肺鱗癌細(xì)胞PG1在裸鼠體內(nèi)能夠產(chǎn)生抗腫瘤肺轉(zhuǎn)移作用，其抗瘤作用的產(chǎn)生至少為NK和T細(xì)胞依賴的；IL-15裸質(zhì)粒DNA對小鼠肺腺癌LA795模型小鼠有明顯的早期局部治療作用，可提高小鼠的存活率，延長存活期，并對防止腫瘤發(fā)生有一定的保護(hù)作用。為將IL-15的這些作用應(yīng)用到工業(yè)制藥方面，應(yīng)用發(fā)明人先前的專利申請200310115197.5中的技術(shù)，制備了重組人白細(xì)胞介素-15(rhIL-15)，它比人自身的白細(xì)胞介素-15多一個(gè)氨基酸，即多出氨基端的第一個(gè)氨基酸——蛋氨酸，該重組蛋白是否具有和IL-15同樣的作用，以及是否可以應(yīng)用到工業(yè)制藥方面有待進(jìn)一步研究。
目前臨床上可用于腫瘤免疫治療的藥物有重組人白細(xì)胞介素-2(rhIL-2)，但是，IL-2的某些副作用使它不可能成為最佳的免疫治療性T細(xì)胞生長/活化因子。這些副作用表現(xiàn)為活化-誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡(Van Parijs，L.，Refaeli，Y.，Lord，J.D.，Nelson，B.H.，Abbas，A.K.and Baltimore，D.Uncoupling IL-2 signals that regulate T cellproliferation，survival，and Fas-mediated activation-induced cell death.Immunity；1999，11281-286.Refaeli Y，Van Parijs L，London C A，et al.Biochemical mechanisms ofIL-2-regulated Fas-mediated T cell apoptosis.Immunity，1998，8(5)615～623.Lenardo，M.J.Fas and the art of lymphocyte maintenance.J.Exp.Med.1996 183721-724.)，抑制記憶性CD8+T細(xì)胞的增殖和存活(Ku CC，Murakami M，Sakamoto A，Kappler J，Marrack P.Control of homeostasis of CD8+memory T cells by opposing cytokines.Science.2000 Apr 28；288(5466)675-8.X.Zhang，S.Sun，and I.Hwang.Potent andselective stimulation of memory-phenotype CD8+T cells in vivo by IL-15.Immunity1998.8591-599.)，以及高劑量IL-2還會引起劑量限制性毒性等(S.A.Rosenberg，J.C.Yang，and S.L.Topalian，et al.Treatment of 283 consecutive patients withmetastatic melanoma or renal cell cancer using high dose bolus interleukin 2[comment]JAMA 1994.271907-913.)。并且，發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，rhIL-2的抗腫瘤轉(zhuǎn)移和預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)的效果還不夠理想。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供重組人白細(xì)胞介素-15(rhIL-15)在制備可用于抗腫瘤轉(zhuǎn)移和預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)的藥物中的應(yīng)用。
在所述藥物應(yīng)用中，rhIL-15可以是重組DNA分子在原核細(xì)胞中的表達(dá)產(chǎn)物，也可以是在真核細(xì)胞如酵母中的表達(dá)產(chǎn)物。
具體地說，本發(fā)明還提供了以該重組人白細(xì)胞介素-15作為藥用成分的藥物組合物，可用于抗腫瘤轉(zhuǎn)移和預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)。所述組合物為藥學(xué)上可接受的劑型。
更具體地說，本發(fā)明提供了一種重組人白細(xì)胞介素-15注射用粉針劑，可用于提高機(jī)體免疫力，增強(qiáng)腫瘤免疫治療。該粉針劑是將50mg/100ml的重組人白細(xì)胞介素-15和0.1～5g/100ml甘露醇凍干而成。該注射用粉針劑以重組人白細(xì)胞介素-15(0.5mg/ml)為藥效成分，并佐以1％(g/100ml)甘露醇作為賦型劑，使用時(shí)以0.9％生理鹽水為溶媒。適用于多種給藥途徑，包括皮內(nèi)、皮下、肌內(nèi)、腹腔、局部或靜脈內(nèi)給藥。
本發(fā)明將重組人白細(xì)胞介素-15(rhIL-15)制備成可用于抗腫瘤轉(zhuǎn)移和預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)的藥物，并首次成功地在小鼠肺腺癌LA795移植瘤模型和小鼠黑色素瘤B16移植瘤模型上證明了rhIL-15的抗腫瘤作用，結(jié)果表明rhIL-15能有效抑制或延緩荷瘤小鼠腫瘤結(jié)節(jié)的形成，明顯抑制腫瘤生長，甚至完全清除腫瘤細(xì)胞，防止腫瘤復(fù)發(fā)，延長荷瘤小鼠的存活時(shí)間，提高存活率。此外，rhIL-15還能有效抑制荷瘤小鼠的腫瘤轉(zhuǎn)移。因此，將rhIL-15開發(fā)成抗腫瘤轉(zhuǎn)移和預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)的創(chuàng)新藥物并用于臨床腫瘤治療具有很好的前景。


圖1-1為不同劑量rhIL-15治療對小鼠肺腺癌LA795皮下移植瘤模型小鼠的抑瘤作用實(shí)驗(yàn)的給藥過程示意圖；圖1-2為經(jīng)過圖1-1治療后荷瘤小鼠的腫瘤生長曲線；圖1-3為經(jīng)過圖1-1治療后荷瘤小鼠存活率曲線；圖2-1為相同生物活性劑量的rhIL-15和rhIL-2對小鼠肺腺癌LA795皮下移植瘤模型的抑瘤作用實(shí)驗(yàn)的給藥過程示意圖；圖2-2為經(jīng)過圖2-1治療后荷瘤小鼠的腫瘤大小比較圖片；圖2-3為經(jīng)過圖2-1治療后荷瘤小鼠的腫瘤生長曲線；圖2-4為經(jīng)過圖2-1治療后荷瘤小鼠存活率曲線；圖2-5為經(jīng)過圖2-1治療后小鼠腫瘤肺轉(zhuǎn)移圖片，其中A為生理鹽水組，B為rhIL-2治療組，C為rhIL-15治療組；圖2-6為經(jīng)過圖2-1治療后小鼠腫瘤肝轉(zhuǎn)移圖片，其中A為生理鹽水組，B為rhIL-2治療組，C為rhIL-15治療組；圖3-1為不同細(xì)胞接種量的小鼠肺腺癌LA795皮下移植瘤模型抑瘤作用實(shí)驗(yàn)的給藥過程示意圖；
圖3-2為腫瘤接種量為5×104/只的小鼠肺腺癌LA795皮下移植瘤模型小鼠腫瘤結(jié)節(jié)形成情況分析曲線；圖3-3為腫瘤接種量為1×105/只的小鼠肺腺癌LA795皮下移植瘤模型小鼠腫瘤結(jié)節(jié)形成情況分析曲線；圖3-4為腫瘤接種量為5×105/只的小鼠肺腺癌LA795皮下移植瘤模型小鼠腫瘤結(jié)節(jié)形成情況分析曲線；圖3-5為腫瘤接種量為5×104/只的小鼠肺腺癌LA795皮下移植瘤模型小鼠存活率分析曲線；圖3-6為腫瘤接種量為1×105/只的小鼠肺腺癌LA795皮下移植瘤模型小鼠存活率分析曲線；圖3-7為腫瘤接種量為5×105/只的小鼠肺腺癌LA795皮下移植瘤模型小鼠存活率分析曲線；圖4-1為rhIL-15對不同細(xì)胞接種數(shù)量的小鼠肺腺癌LA795靜脈播散模型的抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用實(shí)驗(yàn)給藥過程示意圖；圖4-2為rhIL-15治療對小鼠肺腺癌LA795靜脈播散模型小鼠的肺腫瘤灶數(shù)量和大小的影響圖片；圖5-1為不同劑量rhIL-15對小鼠黑色素瘤B16皮下移植瘤模型的抑瘤作用實(shí)驗(yàn)給藥過程示意圖；圖5-2為不同劑量rhIL-15治療對小鼠黑色素瘤B16皮下移植瘤模型小鼠的腫瘤生長的抑制曲線；圖5-3為不同劑量rhIL-15治療對小鼠黑色素瘤B16皮下移植瘤模型小鼠存活率的影響曲線；圖6-1為rhIL-15治療對不同細(xì)胞接種量的小鼠黑色素瘤B16靜脈播散模型的抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用實(shí)驗(yàn)給藥過程示意圖；圖6-2為rhIL-15治療后小鼠黑色素瘤B16靜脈播散模型小鼠的存活時(shí)間圖；圖7-1為rhIL-15治療對小鼠肺腺癌LA795皮下移植瘤模型小鼠的CTL/NK活性的影響實(shí)驗(yàn)給藥過程示意圖；圖7-2為rhIL-15治療對小鼠肺腺癌LA795皮下移植瘤模型小鼠脾細(xì)胞的CTL細(xì)胞毒活性的影響曲線。
圖7-3為rhIL-15治療對小鼠肺腺癌LA795皮下移植瘤模型小鼠脾細(xì)胞的NK殺傷活性的影響曲線。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明的重組人細(xì)胞介素-15或以該重組人白細(xì)胞介素-15為藥性成分的藥物可以用于手術(shù)后腫瘤治療，或/和協(xié)同化療和放療，清除殘余的腫瘤細(xì)胞，增強(qiáng)機(jī)體抗腫瘤免疫，抗腫瘤轉(zhuǎn)移和預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)。
本發(fā)明中，所使用的術(shù)語定義如下術(shù)語“荷瘤小鼠”是指接種LA795腫瘤細(xì)胞的T739小鼠或接種B16腫瘤細(xì)胞的C57小鼠。
通過參閱下述實(shí)施例可以更容易地了解本發(fā)明的內(nèi)容，這些實(shí)施例只是進(jìn)一步說明，并不意味著限定本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1重組人白細(xì)胞介素-15的制備制備重組人白細(xì)胞介素-15，可采用發(fā)明人先前申請的專利中介紹的方法(中國專利申請?zhí)?00310115197.5，發(fā)明名稱可用于生產(chǎn)人重組白細(xì)胞介素-15的原核表達(dá)工程菌及純化方法)。在此不贅述。
實(shí)施例2重組人白細(xì)胞介素-15的比活性測定用對數(shù)生長期的CTLL-2細(xì)胞以3H-TdR摻入法測量上述實(shí)施例1的重組人白細(xì)胞介素-15的促細(xì)胞增殖活性，以IL-2標(biāo)準(zhǔn)品對照，計(jì)算出重組人白細(xì)胞介素-15的單位質(zhì)量活性。具體步驟如下1)1000×g離心8min收集對數(shù)生長期CTLL-2細(xì)胞，用含10％FCS的1640培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞2次，每次1000×g離心8min，除去原培養(yǎng)基中的IL-2。
2)調(diào)整細(xì)胞濃度至1～2×105/ml。
3)96孔培養(yǎng)板，加100μl/孔CTLL-2細(xì)胞懸液(1～2×104/孔)。
4)加入100μl/孔不同稀釋濃度的標(biāo)準(zhǔn)品IL-2(終濃度最好在200U/ml以內(nèi))或待測樣品，設(shè)3個(gè)重復(fù)孔。
5)37℃，5％CO2孵箱培養(yǎng)24～48h，待對照孔細(xì)胞死亡超過90％時(shí)，每孔加入3H-TdR 0.5μCi/50μl，繼續(xù)培養(yǎng)4～6h。
6)用細(xì)胞收集器將細(xì)胞收集于玻璃纖維紙上。
7)干燥后移入液閃瓶，每瓶加入5ml閃爍液，用液閃儀測β射線的cpm值。
計(jì)算視最大放射活性孔為100％摻入孔，其他各孔測得的cpm值與之相除即為摻入百分?jǐn)?shù)。將不同稀釋度的IL-2標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品所對應(yīng)的摻入百分?jǐn)?shù)作圖，縱軸為概率坐標(biāo)，橫軸為稀釋倍數(shù)取log2后的值。自摻入百分?jǐn)?shù)50％處畫一橫線，與IL-2標(biāo)準(zhǔn)品摻入百分?jǐn)?shù)和待測樣品摻入百分?jǐn)?shù)斜線的交點(diǎn)，即可得到樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋倍數(shù)，由以下公式計(jì)算出待測樣品的活性單位。
結(jié)果顯示該重組人白細(xì)胞介素-15的體外比生物活性為6.7×106U/mg。
實(shí)施例3rhIL-15體內(nèi)藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)-對小鼠肺腺癌LA795移植瘤模型的治療作用。
該實(shí)驗(yàn)中，試驗(yàn)藥物為重組人白細(xì)胞介素-15注射用粉針劑。使用甘露醇作為賦型劑，溶液中甘露醇含量為1％，重組人白細(xì)胞介素-15含量為0.5mg/ml，將其分裝成每支含2mg rhIL-15于安瓿內(nèi)凍干。使用時(shí)，將凍干物溶于0.9％生理鹽水備用。
1.不同劑量rhIL-15對小鼠肺腺癌LA795皮下移植瘤模型的抑瘤作用T739近交系小鼠，6～8周齡，雌、雄各半，每組10只，共50只。新鮮傳代培養(yǎng)的LA795細(xì)胞，用胰酶消化，RPMI-1640培養(yǎng)液洗滌2次，重懸，離心，計(jì)數(shù)并制成1×107/ml的細(xì)胞懸液，小鼠左后肢腋窩(腹股溝)靠外側(cè)皮下接種0.1ml(即1×106/只)。
分組1)生理鹽水組生理鹽水0.1ml/天。
2)rhIL-2治療組40kU/天(市售rhIL-2，歐耐特，北京瑞得合通藥業(yè)有限公司)。
3)低劑量rhIL-15治療組10kU/天(自制rhIL-15)。(1kU相當(dāng)于0.15μg)4)中劑量rhIL-15治療組20kU/天(自制rhIL-15)。
5)高劑量rhIL-15治療組40kU/天(自制rhIL-15)。
給藥方案接種腫瘤(D0)后第7天(D7)開始腹腔注射給藥，每周連續(xù)給藥5天，停藥2天，連續(xù)給藥4周，共給藥20天，第33天(D33)開始停藥。給藥過程參見圖1-1。
給藥途徑腹腔注射，每次給藥體積為0.1ml，給藥溶劑為生理鹽水。
觀察每天觀察一次各治療組小鼠腫瘤生長及存活情況。每三天測量一次腫瘤的長徑和短徑，并計(jì)算出腫瘤結(jié)節(jié)大小(腫瘤大?。?.4×長徑×短徑2)，結(jié)束給藥后繼續(xù)觀察4周。解剖實(shí)驗(yàn)結(jié)束前死亡或最終處死的小鼠，取肺、肝、脾、腎、淋巴結(jié)和腫瘤組織進(jìn)行病理檢查。鏡下觀察肺、肝、淋巴結(jié)和腫瘤組織中淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞浸潤情況以及腫瘤轉(zhuǎn)移情況。
結(jié)果1)抑瘤效果接種腫瘤后7～10天，各組小鼠開始有腫瘤結(jié)節(jié)形成，隨著時(shí)間推移，腫瘤結(jié)節(jié)不斷長大。接種腫瘤后第7天開始給藥治療，共治療4周。給藥后腫瘤仍見生長，但是相對生理鹽水治療組，rhIL-2治療組和rhIL-15治療組腫瘤生長受到抑制，并且所有3個(gè)劑量的rhIL-15治療組的小鼠腫瘤結(jié)節(jié)均比rhIL-2治療組生長慢。第65天時(shí)，不同劑量rhIL-15治療組間，腫瘤大小有隨給藥劑量增加而遞減的趨勢，即不同劑量rhIL-15治療組的腫瘤大小有簡單的量效關(guān)系趨勢，詳見圖1-2。圖1-2為不同劑量rhIL-15治療對小鼠肺腺癌LA795皮下移植瘤模型的腫瘤生長的抑制作用。
2)對荷瘤小鼠存活率影響圖1-3示出rhIL-15治療可以提高荷瘤小鼠存活率，從圖中可以看出，接種腫瘤后第24天，小鼠開始死亡，但rhIL-2治療組和所有rhIL-15治療組小鼠同期存活率均高于生理鹽水組。第60天時(shí)，高劑量rhIL-15治療組和中劑量rhIL-15治療組的小鼠存活率分別為100％和91％，均顯著高于生理鹽水組的30％(均為p＜0.01)。低劑量rhIL-15治療組小鼠存活率為60％，高于生理鹽水組小鼠存活率，但無顯著性差異。rhIL-2治療組小鼠存活率為81％，顯著高于生理鹽水組(p＜0.05)。由此可知，rhIL-2和rhIL-15能有效延長小鼠肺腺癌LA795皮下移植瘤模型小鼠的存活期。
高劑量rhIL-15治療組和中劑量rhIL-15治療組的小鼠存活率高于rhIL-2治療組，但差異均無顯著性。此外，不同劑量rhIL-15治療組間小鼠存活率也有隨給藥劑量增加而遞增的趨勢，呈現(xiàn)出簡單的劑量-效應(yīng)關(guān)系。圖1-3為不同劑量rhIL-15治療對小鼠肺腺癌LA795皮下移植瘤模型小鼠存活率的影響(*p＜0.05，**p＜0.01)。
2.相同生物活性劑量的rhIL-15和rhIL-2對小鼠肺腺癌LA795皮下移植瘤模型的抑瘤作用T739近交系小鼠，雄性，12周齡，生理鹽水組10只，rhIL-2治療組和rhIL-15治療組各12只，共34只。新鮮傳代培養(yǎng)的LA795細(xì)胞，胰酶消化，RPMI-1640培養(yǎng)液洗滌2次，重懸，離心，計(jì)數(shù)并制成1×107/ml的細(xì)胞懸液。小鼠左后肢腋窩(腹股溝)靠外側(cè)皮下接種0.1ml LA795細(xì)胞，即1×106/只。
分組生理鹽水組生理鹽水0.1ml/天。
rhIL-2治療組40kU/天(市售rhIL-2)。
rhIL-15治療組40kU/天(自制rhIL-15)。
給藥方案接種腫瘤(D0)后第3天(D3)開始腹腔注射給藥，每天1次，連續(xù)給藥3天，停藥1天，繼續(xù)給藥2天，再停藥1天，每周給藥5天，連續(xù)給藥4周，共給藥20天，第30天(D30)開始停藥。給藥過程參見圖2-1。
給藥途徑腹腔注射，每次給藥體積為0.1ml，給藥溶劑為生理鹽水。
觀察每天觀察一次各治療組小鼠腫瘤生長及存活情況。每三天測量一次腫瘤的長徑和短徑，并計(jì)算出腫瘤結(jié)節(jié)大小，結(jié)束給藥后繼續(xù)觀察4周。解剖實(shí)驗(yàn)結(jié)束前死亡或最終處死的小鼠，取肺、肝、脾、腎、淋巴結(jié)和腫瘤組織進(jìn)行病理檢查。鏡下觀察肺、肝、淋巴結(jié)和腫瘤組織中淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞浸潤情況以及腫瘤轉(zhuǎn)移情況。
結(jié)果1)抑制腫瘤生長效果接種腫瘤后第10天，生理鹽水組的所有10只小鼠全部長出腫瘤結(jié)節(jié)，而rhIL-2治療組和rhIL-15治療組分別只有11只(共12只)和5只(共12只)長出腫瘤結(jié)節(jié)。rhIL-15治療組，直至接種腫瘤后第27天，最后一只小鼠才長出腫瘤結(jié)節(jié)。隨著時(shí)間推移，各組小鼠的腫瘤結(jié)節(jié)均不斷長大。接種腫瘤后第3天開始給藥治療，共治療4周，治療后腫瘤仍見生長，但是rhIL-2治療組和rhIL-15治療組腫瘤生長受到抑制(參見圖2-2，圖中，從左到右依次為生理鹽水組、rhIL-2治療組和rhIL-15治療組)，同期腫瘤大小依次為生理鹽水組＞rhIL-2治療組＞rhIL-15治療組。圖2-2為rhIL-15治療或rhIL-2治療后荷瘤小鼠的腫瘤大小的比較方差分析結(jié)果顯示，自第11天起，直至研究結(jié)束，rhIL-15治療組小鼠的腫瘤大小均明顯小于生理鹽水組(p＜0.001)，rhIL-2治療組小鼠自第14天起，腫瘤大小明顯小于生理鹽水組(p＜0.05)。此外，在第14-49天，rhIL-15治療組小鼠腫瘤大小也明顯小于rhIL-2治療組(p＜0.05)。此研究結(jié)果表明，rhIL-2或rhIL-15治療均能有效抑制LA795小鼠肺腺癌腫瘤生長，并且相同生物活性劑量的rhIL-2和rhIL-15的比較顯示，rhIL-15抑制LA795小鼠肺腺癌腫瘤生長的能力更強(qiáng)(參見圖2-3)。圖2-3中，rhIL-15治療抑制小鼠肺腺癌LA795皮下移植瘤模型小鼠的腫瘤生長(*p＜0.05，***p＜0.001)。
2)提高荷瘤小鼠存活率，延長荷瘤小鼠存活時(shí)間如圖2-4所示，接種腫瘤后第32天，小鼠開始陸續(xù)死亡。終止治療給藥(第30天)4周后，第59天rhIL-2治療組和rhIL-15治療組小鼠存活率分別為67％和100％，生理鹽水組為60％。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析表明，終止治療給藥4周后，rhIL-15治療組小鼠存活率顯著高于生理鹽水組和rhIL-2治療組(均為p＜0.05)。但是，由于第30天荷瘤小鼠開始停止給藥治療，腫瘤生長不受抑制，因此自接種腫瘤后第60天，rhIL-2治療組小鼠存活率開始接近生并自此開始低于生理鹽水組。rhIL-15治療組小鼠也開始快速死亡，但是荷瘤小鼠最大存活期還是長于生理鹽水組。此研究結(jié)果表明，rhIL-15能明顯提高荷瘤小鼠的存活率，延長荷瘤小鼠存活時(shí)間，并且rhIL-15比rhIL-2更為有效。圖2-4為rhIL-15治療對小鼠肺腺癌LA795皮下移植瘤模型小鼠的存活率的影響(*p＜0.05)。
3)抑制小鼠腫瘤轉(zhuǎn)移效果解剖所有實(shí)驗(yàn)結(jié)束前死亡小鼠，進(jìn)行大體病理學(xué)檢查，取肺、肝、淋巴結(jié)和腫瘤組織進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。肺、肝和淋巴結(jié)組織石蠟切片H.E.染色結(jié)果顯示，生理鹽水組有7只小鼠(7/10只)發(fā)生腫瘤的肺、肝或淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，而rhIL-2治療組和rhIL-15治療組分別為8只(8/11只)和7只(7/12只)，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析表明，發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移的小鼠數(shù)量沒有顯著性差異。但是，各組小鼠腫瘤轉(zhuǎn)移程度有差別，生理鹽水組小鼠腫瘤肺轉(zhuǎn)移和肝轉(zhuǎn)移相對嚴(yán)重，基本上為III級和IV級，而rhIL-15治療組腫瘤轉(zhuǎn)移相對較輕，基本上為I級和II級，rhIL-2治療組居中(參見圖2-5小鼠腫瘤肺轉(zhuǎn)移和圖2-6小鼠腫瘤肝轉(zhuǎn)移)。腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移較少發(fā)生，發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的小鼠也都是存活時(shí)間較長的荷瘤小鼠，轉(zhuǎn)移程度也往往較嚴(yán)重。表1示出小鼠肺腺癌LA795皮下移植瘤模型小鼠腫瘤肺、肝、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況分析。
如表1所示，生理鹽水組腫瘤肺轉(zhuǎn)移III級或III級以上為4只(4/10只)，而rhIL-2治療組和rhIL-15治療組分別為2只(2/11只)和無(0/12只)。生理鹽水組腫瘤肝轉(zhuǎn)移III級或III級以上為6只(6/9只)，而rhIL-2治療組和rhIL-15治療組分別為7只(7/10只)和無(0/12只)。生理鹽水組腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移III級或III級以上為1只(1/10只)，而rhIL-2治療組和rhIL-15治療組也分別為1只(1/11只)和1只(1/12只)。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析表明，rhIL-15治療組小鼠腫瘤肺III級或III級以上轉(zhuǎn)移明顯少于生理鹽水組(p＜0.05)，rhIL-2治療組也少于生理鹽水組，但無顯著性差異。rhIL-15治療組小鼠腫瘤肝III級或III級以上轉(zhuǎn)移也明顯少于生理鹽水組和rhIL-2治療組(均為p＜0.01)，rhIL-2治療組與生理鹽水組間無明顯差別。腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移在三組間均無明顯差別。此研究結(jié)果提示，rhIL-15具有良好的抗LA795小鼠肺腺癌腫瘤轉(zhuǎn)移作用，并且其抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用強(qiáng)于rhIL-2。
表1

注N為此治療組組織病理學(xué)鑒定為有腫瘤轉(zhuǎn)移的小鼠只數(shù)，n為此治療組組織病理學(xué)鑒定例數(shù)。腫瘤轉(zhuǎn)移程度分級I級——個(gè)別或少數(shù)散在較小的腫瘤細(xì)胞團(tuán)(全肺5個(gè)以下)。II級——較多散在的小腫瘤細(xì)胞灶(全肺5個(gè)以上)。III級——較大的轉(zhuǎn)移腫瘤團(tuán)塊(不計(jì)數(shù)量)。IV級——布滿一個(gè)肺葉或肝葉的轉(zhuǎn)移瘤(*p＜0.05，**p＜0.01)。
3.rhIL-15對不同細(xì)胞接種數(shù)的小鼠肺腺癌LA795皮下移植瘤模型的早期治療作用T739近交系小鼠，雌性，7周齡，生理鹽水組8只，rhIL-2治療組和rhIL-15治療組每組各9只，共78只。新鮮傳代培養(yǎng)的LA795細(xì)胞，胰酶消化，RPMI-1640培養(yǎng)液洗滌2次，重懸，離心，計(jì)數(shù)并制成5×105/ml、1×106/ml和5×106/ml的細(xì)胞懸液，分別于小鼠右后側(cè)背部皮下接種0.1ml，即分別接種5×104/只、1×105/只或5×105/只的LA795細(xì)胞。
治療分組(1)5×104/只(接種細(xì)胞數(shù))生理鹽水組生理鹽水0.1ml/天。
rhIL-2組40kU/次(市售rhIL-2)。
rhIL-15組40kU/次(自制rhIL-15)。
(2)1×105/只(接種細(xì)胞數(shù))生理鹽水組生理鹽水0.1ml/天。
rhIL-2組40kU/次(市售rhIL-2)。
rhIL-15組40kU/次(自制rhIL-15)。
(3)5×105/只(接種細(xì)胞數(shù))生理鹽水組生理鹽水0.1ml/天。
rhIL-2組40kU/次(市售rhIL-2)。
rhIL-15組40kU/次(自制rhIL-15)。
給藥方案接種腫瘤(D0)前3天(D-3)開始預(yù)防性給藥，每天1次，連續(xù)給藥3天，接種腫瘤后第1天(D1)開始治療性給藥，連續(xù)給藥3天，停藥1天，繼續(xù)給藥2天，再停藥1天，每周給藥5天，共連續(xù)給藥12周(第82天停藥，D82)。停藥8周后仍未長出腫瘤結(jié)節(jié)的小鼠，再次(第138天，D138)在第一次接種部位的對側(cè)皮下接種5×104/只的LA795細(xì)胞進(jìn)行攻擊，繼續(xù)觀察60天(至第198天，D198)，看能否長出腫瘤結(jié)節(jié)。給藥過程參見圖3-1。
給藥途徑腹腔注射，每次給藥體積為0.1ml，給藥溶劑為生理鹽水。
觀察腫瘤結(jié)節(jié)的長出率、長出時(shí)間和腫瘤大小，荷瘤小鼠的存活時(shí)間。每天觀察1次，每3天測量一次腫瘤大小。
結(jié)果1)抑制小鼠腫瘤結(jié)節(jié)的形成如圖3-2所示，在腫瘤細(xì)胞接種量為5×104/只的小鼠中，生理鹽水組小鼠在接種腫瘤后第14天開始長出腫瘤結(jié)節(jié)，至第24天時(shí)，所有小鼠均長出腫瘤結(jié)節(jié)(8/8只，100％)。rhIL-2治療組小鼠在第19天開始長出腫瘤結(jié)節(jié)，至第35天最后一只小鼠長出腫瘤結(jié)節(jié)，累計(jì)共有3只(3/9只，33％)小鼠長出腫瘤結(jié)節(jié)。而直到第138天時(shí)，rhIL-2治療組另外6只小鼠(6/9只)和rhIL-15治療組的全部小鼠均未長出腫瘤結(jié)節(jié)(0/9只，0％)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示，第35天起，rhIL-15治療組小鼠腫瘤結(jié)節(jié)長出率顯著低于生理鹽水組(p＜0.001)，rhIL-2治療組小鼠腫瘤結(jié)節(jié)長出率也顯著低于生理鹽水組(p＜0.01)。此外，rhIL-15治療組小鼠腫瘤結(jié)節(jié)長出率低于rhIL-2治療組，但差異無顯著性。此研究結(jié)果初步表明，rhIL-15和rhIL-2均能顯著延緩和抑制腫瘤結(jié)節(jié)的形成，并且相對于rhIL-2，rhIL-15可能更為有效。
圖3-3顯示另一組實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在腫瘤細(xì)胞接種量為I×105/只小鼠中，生理鹽水組和rhIL-2治療組小鼠在接種腫瘤后第14天開始長出腫瘤結(jié)節(jié)，至第24天時(shí)此兩組所有小鼠均長出腫瘤結(jié)節(jié)(分別為8/8只和9/9只，均為100％)，第24天前，生理鹽水組小鼠腫瘤結(jié)節(jié)長出率一直高于rhIL-2治療組，但只在第16天差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(p＜0.05)。而rhIL-15治療組小鼠直到第138天時(shí)均未長出腫瘤結(jié)節(jié)(0/9只，0％)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示，自第24天起，rhIL-15治療組小鼠腫瘤結(jié)節(jié)長出率均顯著低于生理鹽水組和rhIL-2治療組(均為p＜0.001)。此實(shí)驗(yàn)結(jié)果再次表明，rhIL-15能顯著延緩和抑制腫瘤結(jié)節(jié)的形成，并且rhIL-15相對rhIL-2更為有效。
圖3-4顯示腫瘤細(xì)胞接種量為5×105/只小鼠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，接種腫瘤后第10天開始長出腫瘤結(jié)節(jié)，第14天時(shí)，生理鹽水組和rhIL-2治療組分別有8只(8/8只)和6只(6/9只)小鼠長出腫瘤結(jié)節(jié)，而rhIL-15治療組無小鼠長出腫瘤結(jié)節(jié)。接種腫瘤后第24天，生理鹽水組和rhIL-2治療組小鼠均全部長出腫瘤結(jié)節(jié)，即長出率均為100％，而rhIL-15治療組僅有1只小鼠長出腫瘤結(jié)節(jié)。至第50天時(shí)，rhIL-15治療組最后一只小鼠長出腫瘤結(jié)節(jié)，至此，rhIL-15治療組累計(jì)共有5只(5/9只，56％)小鼠長出腫瘤結(jié)節(jié)，其他4只(4/9只，44％)直至第138天也未長出腫瘤結(jié)節(jié)。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析表明，接種腫瘤后，第50天前，rhIL-15治療組小鼠腫瘤結(jié)節(jié)長出率一直顯著低于rhIL-2治療組和生理鹽水組(均為p＜0.05)。因此，此實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步表明，rhIL-15能顯著抑制腫瘤結(jié)節(jié)的形成，并且作用比rhIL-2強(qiáng)。
至接種腫瘤后第138天，此研究的所有小鼠，有4組共28只沒有長出腫瘤結(jié)節(jié)，這些小鼠分別為細(xì)胞接種量5×104/只組和1×105/只組的rhIL-15治療組的全部18只小鼠、5×104/只組的rhIL-2治療組的6只和5×105/只組的rhIL-15治療組的4只小鼠。第138天，即停止治療給藥(第82天停藥)8周后，所有未長出腫瘤結(jié)節(jié)的小鼠，再次在第一次接種腫瘤部位的對側(cè)背部皮下接種5×104/只的小鼠肺腺癌LA795細(xì)胞進(jìn)行攻擊，兩個(gè)月后(即至第198天)均未長出腫瘤結(jié)節(jié)。此研究結(jié)果表明，這些小鼠已經(jīng)完全治愈，并且已經(jīng)有對小鼠肺腺癌LA795細(xì)胞的記憶免疫。
綜上所述，可以得出結(jié)論，rhIL-15和rhIL-2均能顯著延緩和抑制腫瘤結(jié)節(jié)的形成，并且rhIL-15相對rhIL-2更為有效。
2)提高荷瘤小鼠存活率，延長荷瘤小鼠存活期如圖3-5所示，在腫瘤細(xì)胞接種量為5×104/只小鼠中，生理鹽水組小鼠自接種腫瘤后第69天開始死亡，至第101天，生理鹽水組所有小鼠死亡(8/8只)，因此，生理鹽水組小鼠最大存活期為101天，第138天存活率為0％。rhIL-2治療組小鼠自接種腫瘤后第77天開始死亡，至第105天最后一只荷瘤小鼠死亡，累計(jì)共死亡3只(3/9只)，直至第138天，仍有6只小鼠(6/9只)存活，因此，第138天存活率為67％。rhIL-15治療組小鼠因均未長出腫瘤結(jié)節(jié)(0/9只)，所以直至第138天，9只小鼠(9/9只)均存活，存活率為100％。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析表明，rhIL-15治療組(p＜0.001)和rhIL-2治療組(p＜0.01)小鼠第138天存活率均顯著高于生理鹽水組。rhIL-15治療組小鼠第138天存活率也高于rhIL-2治療組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。rhIL-15治療組和rhIL-2治療組存活小鼠再次腫瘤攻擊60天后(第198天)，仍未長出腫瘤結(jié)節(jié)，并且存活，因此，認(rèn)為這些荷瘤小鼠已經(jīng)治愈，并對LA795小鼠肺腺癌細(xì)胞有記憶免疫。此外，各組小鼠存活時(shí)間的方差分析結(jié)果顯示，rhIL-15治療組小鼠的存活時(shí)間顯著長于生理鹽水組(p＜0.001)，rhIL-2治療組小鼠的存活時(shí)間也顯著長于生理鹽水組(p＜0.01)。此研究結(jié)果表明，rhIL-15治療和rhIL-2治療均能顯著提高荷瘤小鼠存活率，延長荷瘤小鼠存活期，并且rhIL-15相對rhIL-2可能更為有效。
如圖3-6所示，在腫瘤細(xì)胞接種量為1×105/只小鼠中，生理鹽水組小鼠自接種腫瘤后第69天開始死亡，至第96天，所有小鼠死亡(8/8只)，因此，生理鹽水組小鼠最大存活期為96天，第138天存活率為0％。rhIL-2治療組小鼠自接種腫瘤后第69天開始死亡，至第86天最后一只荷瘤小鼠死亡，累計(jì)共死亡9只(9/9只)，因此，rhIL-2治療組小鼠最大存活期為86天，第138天存活率為0％。rhIL-15治療組小鼠因均未長出腫瘤結(jié)節(jié)(0/9只)，所以直到第138天，9只小鼠(9/9只)均存活，存活率為100％。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析表明，rhIL-15治療組第138天存活率均顯著高于生理鹽水組和rhIL-2治療組(p＜0.001)。rhIL-15治療組小鼠再次腫瘤攻擊60天后(第198天)，仍未長出腫瘤結(jié)節(jié)，并且存活，因此，認(rèn)為這些荷瘤小鼠已經(jīng)治愈，并對LA795小鼠肺腺癌細(xì)胞有記憶免疫。此外，各組小鼠存活時(shí)間的方差分析結(jié)果顯示，rhIL-15治療組小鼠存活期明顯長于生理鹽水組和rhIL-2治療組(p＜0.001)。此研究結(jié)果進(jìn)一步證明，rhIL-15能顯著提高荷瘤小鼠存活率，延長荷瘤小鼠存活時(shí)間，并且比rhIL-2更為有效。
如圖3-7所示，腫瘤細(xì)胞接種量為5×105/只的小鼠，其中生理鹽水組小鼠自接種腫瘤后第57天開始死亡，至第65天時(shí)，生理鹽水組所有小鼠死亡(8/8只)，因此，生理鹽水組小鼠最大存活期為65天，第138天存活率為0％。rhIL-2治療組小鼠自接種腫瘤后第44天開始死亡，至第94天最后1只荷瘤小鼠死亡，累計(jì)9只(9/9只)小鼠全部死亡，因此，rhIL-2治療組小鼠最大存活期為94天，第138天存活率為0％。rhIL-15治療組小鼠自接種腫瘤后第90天開始死亡，至第130天最后1只荷瘤小鼠死亡，累計(jì)共死亡5只(5/9只)，直至第138天，尚有4只小鼠(4/9只)存活，即第138天存活率為44％，并且認(rèn)為此4只小鼠為治愈。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析表明，rhIL-15治療組荷瘤小鼠的存活率，自第61天起顯著高于生理鹽水組(p＜0.01)，自第66天起顯著高于rhIL-2治療組(p＜0.05)。rhIL-2治療組小鼠存活率，自第61天起就高于生理鹽水組，但由于動物數(shù)少，至第65天才開始有顯著性差異(p＜0.05)。rhIL-15治療組存活的4只小鼠再次腫瘤攻擊60天后(至第198天)，仍未長出腫瘤結(jié)節(jié)，并且存活，因此，認(rèn)為這些荷瘤小鼠已經(jīng)治愈，并對LA795小鼠肺腺癌細(xì)胞有記憶免疫。此外，各組小鼠存活時(shí)間的方差分析結(jié)果顯示，rhIL-15治療組小鼠存活時(shí)間明顯長于生理鹽水組和rhIL-2治療組(p＜0.001)。此研究結(jié)果進(jìn)一步證明，rhIL-15治療能顯著延長荷瘤小鼠的存活時(shí)間，提高荷瘤小鼠存活率，并且rhIL-15比rhIL-2治療更為有效。
第138天，即停止治療(第82天停藥)8周后，所有未長出腫瘤結(jié)節(jié)并存活的小鼠，再次皮下接種5×104/只的小鼠肺腺癌LA795細(xì)胞進(jìn)行腫瘤攻擊，2個(gè)月后(即至第198天)均未長出腫瘤結(jié)節(jié)，因此，認(rèn)為這些小鼠為完全治愈，并且已經(jīng)有對小鼠肺腺癌LA795細(xì)胞的記憶免疫。
綜上所述，可以得出結(jié)論，rhIL-15和rhIL-2均能顯著提高荷瘤小鼠的存活率，延長荷瘤小鼠的存活期，并且rhIL-15相對rhIL-2更為有效。
4.rhIL-15對不同細(xì)胞接種數(shù)的小鼠肺腺癌LA795靜脈播散模型的抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用T739近交系小鼠，雄性或雌性，8周齡，每組9只，共81只。新鮮傳代培養(yǎng)的LA795細(xì)胞，用胰酶消化，RPMI-1640培養(yǎng)液洗滌2次，重懸，離心，計(jì)數(shù)并制成5×105/ml，1×106/ml，5×106/ml的細(xì)胞懸液，每只小鼠分別經(jīng)尾靜脈注射接種0.1ml，即分別接種5×104/只、1×105/只或5×105/只的LA795細(xì)胞。
治療分組(1)5×104/只(雄性小鼠)生理鹽水組生理鹽水0.1ml/天。
rhIL-2組40kU/次(市售rhIL-2)。
rhIL-15組40kU/次(自制rhIL-15)。
(2)1×105/只(雄性小鼠)生理鹽水組生理鹽水0.1ml/天。
rhIL-2組40kU/次(市售rhIL-2)。
rhIL-15組40kU/次(自制rhIL-15)。
(3)5×105/只(雌性小鼠)生理鹽水組生理鹽水0.1ml/天。
rhIL-2組40kU/次(市售rhIL-2)。
rhIL-15組40kU/次(自制rhIL-15)。
給藥方案接種腫瘤細(xì)胞(D0)前6天(D-6)開始預(yù)防給藥，每天1次，連續(xù)給藥3天，停藥1天，然后連續(xù)給藥2天，第0天(D0)接種腫瘤，第1天(D1)開始治療給藥，連續(xù)給藥3天，停藥1天，繼續(xù)給藥2天，再停藥1天，每周給藥5天，共連續(xù)給藥6周，即給藥直至第40天(D0)。給藥過程參見圖4-1。
給藥途徑腹腔注射，每次給藥體積為0.1ml，給藥溶劑為生理鹽水。
觀察和處理每天觀察一次小鼠存活狀態(tài)。腫瘤細(xì)胞接種量為1×105/只和5×105/只的小鼠，第41天(D41)摘眼球放血處死。腫瘤細(xì)胞接種量為5×104/只的小鼠，給藥6周后即停止治療，直到第106天(D106)尚未死亡的小鼠，摘眼球放血處死。取心、肝、肺、淋巴結(jié)和腫瘤組織進(jìn)行病理學(xué)檢查，肺經(jīng)氣管充墨汁染色，計(jì)數(shù)肺表面的腫瘤灶個(gè)數(shù)，其余各臟器常規(guī)石臘切片，鏡下觀察腫瘤轉(zhuǎn)移情況。
結(jié)果表2給出小鼠肺腺癌LA795靜脈播散模型細(xì)胞數(shù)梯度實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤轉(zhuǎn)移情況分析。
表2

注N為此治療組病理學(xué)鑒定為有腫瘤轉(zhuǎn)移的小鼠例數(shù)，n為此治療組病理學(xué)鑒定的小鼠例數(shù)。(*p＜0.05，2-sided Fisher’s Exact Test，雙側(cè)費(fèi)歇爾精確概率法)
如表2所示，在所有腫瘤細(xì)胞接種量為5×104/只的小鼠中，rhIL-15治療組小鼠腫瘤肺轉(zhuǎn)移為2只(2/9只)，低于生理鹽水組的5只(5/9只)和rhIL-2治療組的3只(4/9只)。rhIL-15治療組小鼠腫瘤肝轉(zhuǎn)移或其他器官轉(zhuǎn)移分別為0和1只(1/9只)，均低于生理鹽水組的3只(3/9只)和5只(5/9只)，也低于rhIL-2治療組的2只(2/9只)和2只(2/9只)。rhIL-15治療組發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移的小鼠為2只(2/9只)，少于生理鹽水組的6只(6/9只)和rhIL-2治療組的5只(5/9只)。
在腫瘤細(xì)胞接種量為1×105/只的小鼠中，rhIL-15治療組小鼠腫瘤肺轉(zhuǎn)移為4只(4/9只)(p＜0.05)，rhIL-2治療組為5只(5/9只)(p＜0.05)，均低于生理鹽水組的9只(9/9只)。rhIL-15治療組小鼠腫瘤肝轉(zhuǎn)移或其他器官轉(zhuǎn)移均為0，即沒有發(fā)生，顯著低于生理鹽水組的4只(4/9只)和4只(4/9只)(均為p＜0.05)，也低于rhIL-2治療組的1只(1/9只)和1只(1/9只)。rhIL-15治療組發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移的小鼠為4只(4/9只)，少于生理鹽水組的9只(9/9只)(p＜0.05)和rhIL-2治療組的6只(6/9只)。
在腫瘤細(xì)胞接種量為5×105/只的小鼠中，rhIL-15治療組小鼠腫瘤肺轉(zhuǎn)移為6只(6/9只)，低于生理鹽水組的9只(9/9只)，也低于rhIL-2治療組的8只(8/9只)。rhIL-15治療組小鼠腫瘤肝轉(zhuǎn)移或其他器官轉(zhuǎn)移均為1只(1/9只)和0，低于生理鹽水組的1只(1/9只)和2只(2/9只)，rhIL-2治療組分別為0和1只(1/9只)。rhIL-15治療組發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移的小鼠為6只(6/9只)，低于生理鹽水組的9只(9/9只)和rhIL-2治療組的8只(8/9只)。
因此，從腫瘤肺轉(zhuǎn)移、肝轉(zhuǎn)移、其他器官轉(zhuǎn)移以及轉(zhuǎn)移小鼠的例數(shù)上看，均可以得出結(jié)論rhIL-15治療可以減少小鼠肺腺癌LA795靜脈播散模型腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生，并且作用有比rhIL-2強(qiáng)的趨勢。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示，腫瘤細(xì)胞接種量為5×104/只的小鼠，生理鹽水組1只、rhIL-2治療組2只及rhIL-15治療組1只小鼠腫瘤肺轉(zhuǎn)移嚴(yán)重，程度相差不大。此4只小鼠均在停止治療之后研究結(jié)束之前死亡，死亡時(shí)間依次為生理鹽水組Day 61、rhIL-2治療組Day 72和Day 101、rhIL-15治療組Day 83。其他肉眼檢查不能判定的腫瘤肺轉(zhuǎn)移者均為組織病理學(xué)鑒定結(jié)果，轉(zhuǎn)移程度均在I～I(xiàn)I級。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示，腫瘤細(xì)胞接種量為1×105/只和5×105/只的小鼠，發(fā)生腫瘤肺轉(zhuǎn)移的例數(shù)比較多，而且多數(shù)肺表面可見腫瘤灶。如圖4-2所示，在此兩組不同腫瘤細(xì)胞接種量的小鼠中，rhIL-15治療組小鼠肺腫瘤轉(zhuǎn)移灶個(gè)數(shù)少，而且小，一般只有1個(gè)或者沒有肉眼可見的腫瘤灶。rhIL-2治療組小鼠肺腫瘤轉(zhuǎn)移灶一般為1～3個(gè)，甚至更多，腫瘤轉(zhuǎn)移灶也較大。生理鹽水組小鼠的肺腫瘤轉(zhuǎn)移灶一般都在5個(gè)以上，整個(gè)肺葉幾乎都長滿腫瘤轉(zhuǎn)移灶，組織結(jié)構(gòu)完全被破壞。不同治療組間，肺腫瘤灶數(shù)目及大小依次為生理鹽水組＞rhIL-2治療組＞rhIL-15治療組，腫瘤肺轉(zhuǎn)移嚴(yán)重程度也依次為生理鹽水組＞rhIL-2治療組＞rhIL-15治療組。因此，從腫瘤轉(zhuǎn)移的嚴(yán)重程度上看，得出結(jié)論，rhIL-15治療能有效抑制肺腫瘤轉(zhuǎn)移灶的形成，并且作用比rhIL-2強(qiáng)。
綜上所述，rhIL-15有良好的抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用，并且作用比rhIL-2強(qiáng)。
實(shí)施例4rhIL-15體內(nèi)藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)-對小鼠黑色素瘤B16移植瘤模型的治療作用。
該實(shí)驗(yàn)中，試驗(yàn)藥物為重組人白細(xì)胞介素-15注射用粉針劑。使用1％(g/100ml)甘露醇作為賦型劑，重組人白細(xì)胞介素-15含量為0.5mg/ml，將其分裝成每支含2mg rhIL-15于安瓿內(nèi)凍干。使用時(shí)，將凍干物溶于0.9％生理鹽水備用。
1.不同劑量rhIL-15對小鼠黑色素瘤B16皮下移植瘤模型的抑瘤作用C57BL/6小鼠，雌性，7周齡，每組12只，6組共72只。新鮮傳代培養(yǎng)的小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞，用RPMI-1640培養(yǎng)液洗滌，重懸，離心，計(jì)數(shù)并制成5×106/ml的細(xì)胞懸液。每只小鼠于左后肢腋窩(腹股溝)皮下接種0.1ml，即5×105/只。
分組1)生理鹽水組生理鹽水0.1ml/天。
2)rhIL-2治療組40kU/次(市售rhIL-2)。
3)rhIL-15(高劑量)治療組80kU/次(自制rhIL-15)。
4)rhIL-15(中劑量)治療組40kU/次(自制rhIL-15)。
5)rhIL-15(低劑量)治療組10kU/次(自制rhIL-15)。
6)IL-2+rhIL-15聯(lián)合治療組rhIL-15(自制)和rhIL-2(市售)各20kU/次。
給藥方案接種腫瘤(D0)后第3天(D3)開始給藥，每天1次，連續(xù)給藥3天，停藥1天，繼續(xù)給藥2天，再停藥1天，每周給藥5天，連續(xù)給藥數(shù)周，直至其中某一組超過半數(shù)小鼠死亡，停藥當(dāng)天處死。給藥過程參見圖5-1。
給藥途徑腹腔注射，每次給藥體積為0.1ml，給藥溶劑為生理鹽水。
觀察觀察并記錄腫瘤結(jié)節(jié)的長出時(shí)間和腫瘤大小，荷瘤小鼠的存活時(shí)間。每天觀察1次，每3天測量一次腫瘤大小。
結(jié)果
腫瘤接種后第3天開始治療給藥，并以生理鹽水作為治療對照。如圖5-2所示，接種腫瘤后4～7天，各組小鼠腫瘤結(jié)節(jié)形成，隨著時(shí)間推移，腫瘤結(jié)節(jié)不斷長大。治療給藥后，腫瘤仍見生長，但是相對生理鹽水組，各治療組小鼠腫瘤生長受到不同程度的抑制。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析表明，除rhIL-2治療組小鼠在第18天腫瘤大小與生理鹽水組有顯著性差異外(p＜0.05)，其他治療組均無顯著性差異。
如圖5-3所示，接種腫瘤后第14天，小鼠開始死亡。至接種腫瘤后第23天，生理鹽水組已死亡8只，存活4只，存活率為33％。rhIL-2(40kU/次)治療組死亡6只，存活6只，存活率為50％。rhIL-15(80kU/次)治療組死亡5只，存活7只，存活率為58％。rhIL-15(40kU/次)治療組死亡4只，存活8只，存活率為67％。rhIL-15(10kU/次)治療組死亡5只，存活7只，存活率為58％。rhIL-2+rhIL-15聯(lián)合治療組(各20kU/次)死亡1只，存活11只，存活率92％。由此可見，各治療組第23天的小鼠存活率均高于生理鹽水組，但是，數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，除rhIL-2+rhIL-15聯(lián)合治療組與生理鹽水組有顯著性差異(p＜0.01)外，其他各治療組與生理鹽水組間均無顯著性差異。高劑量和低劑量rhIL-15治療組的小鼠存活率一致，均低于中劑量rhIL-15治療組，卻均高于rhIL-2治療組，但差異無顯著性。此外，rhIL-2+rhIL-15聯(lián)合治療組小鼠第23天的存活率同rhIL-2治療組相比有顯著性差異(p＜0.05)。此研究結(jié)果表明，rhIL-2或rhIL-15治療能夠有效提高黑色素瘤荷瘤小鼠的存活率，此外，rhIL-2+rhIL-15聯(lián)合應(yīng)用比rhIL-2或rhIL-15單獨(dú)應(yīng)用更能有效提高黑色素瘤荷瘤小鼠的存活率。
2.rhIL-15對不同細(xì)胞接種量的小鼠黑色素瘤B16靜脈播散模型的抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用C57BL/6近交系小鼠，雌性，5周齡，每組2～3只，共15只。新鮮傳代培養(yǎng)的小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞，用RPMI-1640培養(yǎng)液洗滌，重懸，離心，計(jì)數(shù)并制成5×105/ml、1×106/ml和5×106/ml的細(xì)胞懸液，每只小鼠分別尾靜脈注射接種0.1ml，即分別接種5×104/只、1×105/只或5×105/只的小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞。
實(shí)驗(yàn)分組(1)5×104/只生理鹽水組(2只)生理鹽水0.1ml/天。
rhIL-15組(3只)40kU/次(自制rhIL-15)。
(2)1×105/只生理鹽水組(2只)生理鹽水0.1ml/天。
rhIL-15組(3只)40kU/次(自制rhIL-15)。
(3)5×105/只生理鹽水組(2只)生理鹽水0.1ml/天。
rhIL-15組(3只)40kU/次(自制rhIL-15)。
給藥方案接種腫瘤(D0)前3天(D-3)開始預(yù)防給藥，每天1次，連續(xù)給藥3天，接種腫瘤后第1天(D1)開始治療性給藥，連續(xù)給藥3天，停藥1天，繼續(xù)給藥2天，再停藥1天，每周給藥5天，持續(xù)給藥至全部小鼠死亡。給藥過程參見圖6-1。
給藥途徑腹腔注射，每次給藥體積為0.1ml，給藥溶劑為生理鹽水。
觀察每天觀察一次小鼠的存活狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束前死亡或最終處死的小鼠均取心、肝、肺和腎，肉眼觀察腫瘤轉(zhuǎn)移情況。
結(jié)果此項(xiàng)實(shí)驗(yàn)為小鼠黑色素瘤B16靜脈播散模型的研究，主要觀察各組小鼠存活時(shí)間和實(shí)驗(yàn)結(jié)束前死亡時(shí)腫瘤肺轉(zhuǎn)移程度。腫瘤細(xì)胞接種量為1×104/只的小鼠，生理鹽水組自接種腫瘤后第24天開始死亡，最大存活時(shí)間為26天，平均存活時(shí)間25.0天。rhIL-15治療組小鼠自第29天開始死亡，最大存活時(shí)間32天，平均存活時(shí)間30.0天。腫瘤細(xì)胞接種量為5×104/只的小鼠中，生理鹽水組小鼠自接種腫瘤后第22天開始死亡，最大存活時(shí)間為26天，平均存活時(shí)間24.0天。rhIL-15治療組小鼠自第21天開始死亡，最大存活時(shí)間31天，平均存活時(shí)間24.7天。腫瘤細(xì)胞接種量為1×105/只的小鼠中，生理鹽水組小鼠自接種腫瘤后第15天開始死亡，最大存活時(shí)間為17天，平均存活時(shí)間16.0天。rhIL-15治療組小鼠自第19天開始死亡，最大存活時(shí)間21天，平均存活時(shí)間20.0天。由此可見，所有不同腫瘤細(xì)胞接種量的小鼠，rhIL-15治療組的最大存活時(shí)間和平均存活時(shí)間均長于生理鹽水組。如圖6-2所示，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析表明，腫瘤細(xì)胞接種量1×104/只和1×105/只的小鼠，rhIL-15治療組的平均存活時(shí)間均長于生理鹽水組，且差異顯著(p＜0.05)。腫瘤細(xì)胞接種量為5×104/只的小鼠，rhIL-15治療組的平均存活時(shí)間與生理鹽水組比較，無顯著差異。因此，rhIL-15治療可以有效延長小鼠黑色素瘤B16靜脈播散模型小鼠的存活期。
解剖各組實(shí)驗(yàn)結(jié)束前死亡小鼠，發(fā)現(xiàn)全部小鼠均有腫瘤肺轉(zhuǎn)移，但是相同腫瘤細(xì)胞接種量的小鼠中，rhIL-15治療組小鼠腫瘤肺轉(zhuǎn)移總是比生理鹽水組的輕，生理鹽水組小鼠肺葉基本全部被腫瘤破壞，已經(jīng)看不到肺葉結(jié)構(gòu)，而rhIL-15治療組小鼠多數(shù)還有完整的肺葉。由此可見，rhIL-15治療可以有效延緩小鼠黑色素瘤B16靜脈播散模型小鼠腫瘤肺轉(zhuǎn)移。
綜上所述，rhIL-15治療能有效延長小鼠黑色素瘤B16靜脈播散模型小鼠存活期，并抑制小鼠黑色素瘤B16肺轉(zhuǎn)移。
實(shí)施例5rhIL-15對小鼠肺腺癌LA795皮下移植瘤模型的CTL/-NK活性的影響該實(shí)驗(yàn)中，試驗(yàn)藥物為重組人白細(xì)胞介素-15注射用粉針劑。甘露醇作為賦型劑，含量為0.1～5％(g/ml)，重組人白細(xì)胞介素-15含量為0.5mg/ml，將其分裝成每支含2mg rhIL-15于安瓿內(nèi)凍干。使用時(shí)，將凍干物溶于0.9％生理鹽水備用。
T739近交系小鼠，雄性，8周齡，每組5只，共15只。新鮮傳代培養(yǎng)的LA795細(xì)胞，用胰酶消化，RPMI-1640培養(yǎng)液洗滌，重懸，離心，計(jì)數(shù)并制成5×106/ml的細(xì)胞懸液。左后肢腹股溝靠外側(cè)皮下接種0.1ml LA795細(xì)胞懸液，即5×105/只。分組生理鹽水組生理鹽水0.1ml/天。
rhIL-2組40kU/次(市售rhIL-2)。
rhIL-15組40kU/次(自制rhIL-15)。
給藥方案接種腫瘤(D0)后第10天(D10)開始給藥，每天1次，連續(xù)給藥3天，停藥1天，繼續(xù)給藥2天，再停藥1天，每周給藥5天，共連續(xù)給藥2周。分別于給藥前、給藥后一周和給藥后兩周斷尾取血，測定血清中IFN-γ和TNF-α的水平。最后一次給藥24h后即第23天(D23)各組小鼠摘眼球放血處死，無菌條件下取脾臟，分別以LA795和YAC-1為靶細(xì)胞，3H-TdR摻入法測脾細(xì)胞CTL/NK活性。給藥過程參見圖7-1。
給藥途徑腹腔注射，每次給藥體積為0.1ml，給藥溶劑為生理鹽水。
結(jié)果皮下接種腫瘤后第10天開始給藥治療，連續(xù)給藥2周，最后一次給藥24h后，各組小鼠摘眼球放血處死，無菌條件下取脾臟，分離出脾細(xì)胞，分別以LA795和YAC-1為靶細(xì)胞，3H-TdR摻入法測脾細(xì)胞的CTL活性和NK活性。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果參見圖7-2和圖7-3，表明rhIL-15治療組和rhIL-2治療組小鼠脾細(xì)胞的CTL活性和NK殺傷活性均高于生理鹽水組。效靶比20∶1之后，rhIL-2治療組小鼠脾細(xì)胞的CTL活性略高于rhIL-15治療組，而其NK殺傷活性略低于rhIL-15治療組。方差分析結(jié)果顯示，效靶比20∶1之后，rhIL-15治療組和rhIL-2治療組小鼠脾細(xì)胞CTL活性和NK殺傷活性均與生理鹽水組有顯著差異(p＜0.05)，但rhIL-15治療組與rhIL-2治療組之間差異不顯著。
權(quán)利要求
1.重組人白細(xì)胞介素-15在制備免疫治療藥物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述應(yīng)用，為制備用于抗腫瘤轉(zhuǎn)移和預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)的藥物。
3.一種用于腫瘤免疫治療的藥物，以重組人白細(xì)胞介素-15作為藥性成分。
4.一種用于腫瘤免疫治療的藥物組合物，其包含重組人白細(xì)胞介素-15，制成藥學(xué)上可接受的劑型。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述用于腫瘤免疫治療的藥物組合物，其特征在于，為一種重組人白細(xì)胞介素-15注射用粉針劑，是將50mg/100ml的重組人白細(xì)胞介素-15和0.1～5g/100ml甘露醇凍干而成。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述用于腫瘤免疫治療的藥物組合物，其特征在于，所述甘露醇濃度為1g/100ml。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種重組蛋白的用途。更具體地說，本發(fā)明包含重組人白細(xì)胞介素－15(recombinant human interleukin－15，rhIL－15)在制備腫瘤免疫治療藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明還涉及包含所述重組蛋白的藥物組合物。
文檔編號A61P35/00GK1927387SQ20051009828
公開日2007年3月14日 申請日期2005年9月5日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月5日
發(fā)明者何維, 唐峰, 崔蓮仙, 沈永泉, 薛莉, 巴德年 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所