專利名稱：格爾德霉素類苯醌的芳香化還原衍生物及其制備方法與用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及格爾德霉素類苯醌的芳香化還原衍生物、通過發(fā)酵制備該類化合物的方法、含有該類化合物作為活性成分的藥物組合物以及該類化合物用于制備細(xì)胞周期抑制劑、細(xì)胞增殖抑制劑及抗腫瘤藥物的用途。
背景技術(shù)：
格爾德霉素最早于1970年從鏈霉菌產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)[C.DeBoer，et al.；Geldanamycin，a new antibioticJ.Antibiot.，1970，23(9)，442-447]，其后，從微生物產(chǎn)物中或通過人工合成陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了許多同類化合物并發(fā)現(xiàn)該類化合物具有多種生物活性。如文獻(xiàn)[M.Muroi，et al.；Thestructures of macbecin I and IITetrahedron，1981，37，pp.1123-1131]、文獻(xiàn)[R.C.Schnur，et al.；Inhibition of the oncogeneproduct p185erbB-2in vitro and in vivo by geldanamycin anddihydrogeldanamycin derivativesJ.Med.Chem.，1995，38，3806-3812]、文獻(xiàn)[M.Bendin，et al.；Geldanamycin，an inhibitor of thechaperone activity of HS90.induces MAPK-independent cell cyclearrestInt.J.Cancer，2004，109，643-652]、文獻(xiàn)[Z.-Q.Tian et al.；Synthesis and biological activities of novel 17-aminogeldanamycinderivativesBioorg.Med.Chem.，2004，12，5317-5329]以及文獻(xiàn)[J.-Y.L.Brazidec，et al.；Synthesis and biological evaluation of a new classof geldanamycin derivatives as potent inhibitors of Hsp90J.Med.Chem.，2004，47，3865-3873]等都曾記載了天然或人工合成的格爾德霉素類化合物及其生物活性。該類化合物的生物活性多與熱休克蛋白90有關(guān)。熱休克蛋白90是細(xì)胞內(nèi)最活躍的一種分子伴侶，許多信號(hào)傳導(dǎo)途徑均依賴于熱休克蛋白90，并且，它在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)比正常細(xì)胞高出2～10倍，在腫瘤細(xì)胞生長和存活中可能起重要的調(diào)節(jié)作用。格爾德霉素類化合物能與熱休克蛋白90特異性結(jié)合并抑制其功能，導(dǎo)致多種癌基因產(chǎn)物和細(xì)胞周期調(diào)控蛋白的降解，從而顯示多種抗癌等生物活性，因此，該類化合物受到了癌癥研究者的極大關(guān)注和深入研究。其中，17-烯丙胺-17-脫甲氧格爾德霉素(17-AAG)作為治療多發(fā)性骨髓瘤的藥物產(chǎn)品在歐洲剛剛上市，而在美國則正在進(jìn)行治療腫瘤的II期臨床試驗(yàn)。
格爾德霉素類化合物屬于苯醌安莎霉素類抗生素，它們的結(jié)構(gòu)特征是一個(gè)苯醌片段與一個(gè)大環(huán)安莎橋相連，形成大環(huán)內(nèi)酰胺苯醌的骨架結(jié)構(gòu)。從結(jié)構(gòu)類型上，在迄今文獻(xiàn)中已有記載的所有格爾德霉素類化合物中，尚未見到該類化合物的苯醌被還原成芳環(huán)并在該芳環(huán)上并有氧雜環(huán)的衍生物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提供一類格爾德霉素的苯醌被還原成芳香環(huán)的新化合物，它們具有細(xì)胞周期抑制等抗腫瘤活性。
本發(fā)明人通過堅(jiān)韌不拔的努力，發(fā)現(xiàn)了下述式I所示的一類具有細(xì)胞周期抑制活性的格爾德霉素類化合物 式I其中，R1和R2各自獨(dú)立地代表氫、羥基、氨基、C4-C6直鏈或支鏈烷基、C4-C6烷氧基、羥甲基、-CH2OC(CH3)2OH，或者R1和R2一起代表-OOC(CH3)2OCH2-或-OC(CH3)2OCH2-；R3為氫、羥基、羥甲基或甲基；R4、R5、R6、R7和R8各自獨(dú)立地代表氫、甲基、磺酸基或氨甲?；?。
本發(fā)明的上述式I化合物的一個(gè)結(jié)構(gòu)特征是格爾德霉素骨架結(jié)構(gòu)中的對(duì)苯醌還原成芳環(huán)，并在其上連有R1、R2、R3等取代基；本發(fā)明的上述式I化合物的另一個(gè)結(jié)構(gòu)特征是當(dāng)R1和R2為一個(gè)取代基團(tuán)如為-OOC(CH3)2OCH2-或-OC(CH3)2OCH2-等時(shí)，形成氧雜環(huán)并苯的骨架結(jié)構(gòu)。
因此，本發(fā)明的第一個(gè)方面涉及式I所示的格爾德霉素類苯醌的芳香化還原衍生物及其藥學(xué)上可接受的鹽 式I其中，R1和R2各自獨(dú)立地代表氫、羥基、氨基、C4-C6直鏈或支鏈烷基、C4-C6烷氧基、羥甲基、-CH2OC(CH3)2OH，或者R1和R2一起代表-OOC(CH3)2OCH2-或-OC(CH3)2OCH2-；R3為氫、羥基、羥甲基或甲基；R4、R5、R6、R7和R8各自獨(dú)立地代表氫、甲基、磺酸基或氨甲酰基。
本發(fā)明的第二個(gè)方面涉及制備式I化合物的方法，所述方法包括通過發(fā)酵培養(yǎng)能生產(chǎn)式I化合物的微生物、例如鏈霉菌屬的假輪枝鏈霉菌(Streptomyces pseudoverticillus)YN17707，首先獲取含有式I化合物的發(fā)酵物，繼而再從發(fā)酵物中經(jīng)過分離純化得到式I化合物。
本發(fā)明的第三個(gè)方面涉及含有作為活性成分的式I格爾德霉素類苯醌的芳香化還原衍生物以及一種或多種藥用載體或賦形劑的藥物組合物。
本發(fā)明的第四個(gè)方面涉及式I格爾德霉素類苯醌的芳香化還原衍生物用于制備細(xì)胞周期抑制劑、腫瘤細(xì)胞增殖抑制劑和抗腫瘤劑的用途。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及式I所示的格爾德霉素類苯醌的芳香化還原衍生物及其藥學(xué)上可接受的鹽 式I其中，R1和R2各自獨(dú)立地代表氫、羥基、氨基、C4-C6直鏈或支鏈烷基、C4-C6烷氧基、羥甲基、-CH2OC(CH3)2OH，或者R1和R2一起代表-OOC(CH3)2OCH2-或-OC(CH3)2OCH2-；R3為氫、羥基、羥甲基或甲基；R4、R5、R6、R7和R8各自獨(dú)立地代表氫、甲基、磺酸基或氨甲?；?。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及式I格爾德霉素類苯醌的芳香化還原衍生物及其藥學(xué)上可接受的鹽 式I其中，R1和R2各自獨(dú)立地代表甲氧基、羥基，或者R1和R2一起代表-OOC(CH3)2OCH2-或-OC(CH3)2OCH2-；R3為羥基、甲基或羥甲基；R4、R5、R6、R7和R8各自獨(dú)立地代表氫、甲基或氨甲?；?。
在本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及式I格爾德霉素類苯醌的芳香化還原衍生物及其藥學(xué)上可接受的鹽 式I其中，R1和R2各自獨(dú)立地代表甲氧基、羥基，或者R1和R2一起代表-OOC(CH3)2OCH2-；R3為羥基；
R4和R7為甲基；R5和R8為氫；R6為氨甲?；?。
在本發(fā)明更優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明式I格爾德霉素類苯醌的芳香化還原衍生物為具有下式的化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽 本發(fā)明的式I化合物可通過微生物發(fā)酵法來制取，具體而言，通過發(fā)酵培養(yǎng)能生產(chǎn)式I化合物的微生物，首先獲取含式I化合物的發(fā)酵物，再從發(fā)酵物中分離純化而得到式I化合物。
所述能夠生產(chǎn)式I化合物的微生物包括鏈霉菌屬的生產(chǎn)菌，如鏈霉菌屬的假輪枝鏈霉菌(Streptomyces pseudoverticillus)。
所述分離純化包括利用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的天然產(chǎn)物分離純化的常規(guī)方法，如液液萃取、柱層析、薄層層析及重結(jié)晶等。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所用生產(chǎn)菌是從西雙版納土壤樣品中分離并經(jīng)分類學(xué)研究鑒定為假輪枝鏈霉菌(Streptomycespseudoverticillus)的YN17707株。該菌株已于2005年9月6日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(中心登記入冊(cè)編號(hào)CGMCC No.1452)。該菌株有如下微生物菌學(xué)特征各種培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特征和形態(tài)特征培養(yǎng)特征在高氏合成一號(hào)瓊脂、葡萄糖天門冬素瓊脂、無機(jī)鹽淀粉瓊脂、酵母精麥芽瓊脂、燕麥粉瓊脂、馬鈴薯塊等六種培養(yǎng)基上，于28攝氏度培養(yǎng)7～10天后觀察氣生菌絲和基內(nèi)菌絲的顏色和色素的產(chǎn)生等情況，有關(guān)特征見表1。
表1菌株YN17707在6種培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特征

形態(tài)特征 在高氏合成一號(hào)瓊脂和葡萄糖天門冬素瓊脂上28攝氏度培養(yǎng)7～10天后，用光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡，按常規(guī)方法進(jìn)行菌絲及孢子表面特征的觀察，結(jié)果觀察到菌絲無橫隔，不斷裂；氣生菌絲呈假輪生狀，一根主軸，兩側(cè)不對(duì)稱地生有孢子絲，在孢子絲頂端彎曲成圈環(huán)狀；孢子卵圓形，表面略有突起(光學(xué)顯微鏡電子顯微鏡照片略)。
化學(xué)分類特征胞壁化學(xué)組分分析 按照Lechevalier的薄層層析(TLC)法進(jìn)行了該菌株全細(xì)胞水解液氨基酸和糖型分析，結(jié)果表明，YN17707菌株全細(xì)胞水解液含有LL-DAP(左旋二氨基庚二酸，Diaminopimelic acid)，甘氨酸；無特征性糖(糖型C)。細(xì)胞壁化學(xué)組分屬于I型。
生理生化特征參照《Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology》Vol.IV的內(nèi)容對(duì)菌株進(jìn)行了生理生化鑒定。YN17707菌株的生理生化特征見表2。
表2菌株YN17707的生理生化特征

根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將該菌株鑒定為鏈霉菌屬的假輪枝鏈霉菌(Streptomyces pseudoverticillus)YN17707。
需要特別說明的是本發(fā)明通過微生物發(fā)酵法來制取式I化合物的方法可以采用但絕不限于采用假輪枝鏈霉菌(Streptomycespseudoverticillus)YN17707，鏈霉菌屬的其它任何微生物只要能生產(chǎn)式I化合物均可作為產(chǎn)素菌用于制備式I化合物。
本發(fā)明采用流式細(xì)胞術(shù)結(jié)合顯微鏡下檢測(cè)細(xì)胞形態(tài)特征的方法，測(cè)試了式I化合物對(duì)小鼠乳腺癌tsFT210細(xì)胞的細(xì)胞周期抑制和細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)等作用。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，式I化合物可顯著抑制癌細(xì)胞的細(xì)胞周期周轉(zhuǎn)，從而對(duì)腫瘤細(xì)胞顯示出抑制其增殖的生物學(xué)活性，因而具有抗腫瘤作用。
本發(fā)明的式I化合物與各種藥物可接受的載體、賦形劑或輔料配伍，可制成抗腫瘤藥物，用于腫瘤的治療。
本發(fā)明中的術(shù)語“藥學(xué)上可接受的鹽”可以是藥用無機(jī)或有機(jī)鹽。本發(fā)明式I中具有堿性基團(tuán)的化合物可以與無機(jī)酸形成藥用鹽，例如硫酸鹽、鹽酸鹽、氫溴酸鹽、磷酸鹽；也可與有機(jī)酸形成藥用鹽，例如乙酸鹽、草酸鹽、檸檬酸鹽、葡萄糖酸鹽、琥珀酸鹽、酒石酸鹽、對(duì)甲苯磺酸鹽、甲磺酸鹽、苯甲酸鹽、乳酸鹽、馬來酸鹽等。本發(fā)明式I中具有酸性基團(tuán)的化合物可以與堿金屬或堿土金屬形成藥用鹽，優(yōu)選但不限于鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽或鈣鹽。
本發(fā)明化合物可單獨(dú)或以藥物組合物的形式給藥。給藥途徑可以是口服、非腸道或局部給藥。藥物組合物可根據(jù)給藥途徑配成各種適宜的劑型。
本發(fā)明化合物的藥物組合物可以以下面的任意方式施用口服，噴霧吸入，直腸用藥，鼻腔用藥，頰部用藥，局部用藥，非腸道用藥，如皮下，靜脈，肌內(nèi)，腹膜內(nèi)，鞘內(nèi)，心室內(nèi)，胸骨內(nèi)和顱內(nèi)注射或輸入，或借助一種外植儲(chǔ)器用藥。其中優(yōu)選口服、腹膜內(nèi)或靜脈內(nèi)給藥方式。
當(dāng)口服用藥時(shí)，本發(fā)明化合物可制成任意口服可接受的制劑形式，包括但不限于片劑、膠囊、水溶液或水懸浮液。其中，片劑使用的載體一般包括乳糖和玉米淀粉，另外也可加入潤滑劑如硬脂酸鎂。膠囊制劑使用的稀釋劑一般包括乳糖和干燥玉米淀粉。水懸浮液制劑則通常是將活性成分與適宜的乳化劑和懸浮劑混合使用。任選地，以上口服制劑形式中還可加入一些甜味劑、芳香劑或著色劑。
當(dāng)皮膚局部施用時(shí)，本發(fā)明化合物可制成適當(dāng)?shù)能浉?、洗劑或霜?jiǎng)┲苿┬问剑渲袑⒒钚猿煞謶腋』蛉芙庥谝环N或多種載體中。軟膏制劑可使用的載體包括但不限于礦物油、液體凡士林、白凡士林、丙二醇、聚氧化乙烯、聚氧化丙烯、乳化蠟和水；洗劑或霜?jiǎng)┛墒褂玫妮d體包括但不限于礦物油、脫水山梨糖醇單硬脂酸酯、吐溫60、十六烷酯蠟、十六碳烯芳醇、2-辛基十二烷醇、芐醇和水。
本發(fā)明化合物還可以無菌注射制劑形式用藥，包括無菌注射水或油懸浮液或無菌注射溶液。其中，可使用的載體和溶劑包括水、林格氏溶液和等滲氯化鈉溶液。另外，滅菌的非揮發(fā)油也可用作溶劑或懸浮介質(zhì)，如單甘油酯或二甘油酯。
另外需要指出，本發(fā)明化合物使用劑量和使用方法取決于諸多因素，包括患者的年齡、體重、性別、自然健康狀況、營養(yǎng)狀況、化合物的活性強(qiáng)度、服用時(shí)間、代謝速率、病癥的嚴(yán)重程度以及診治醫(yī)師的主觀判斷。優(yōu)選的使用劑量介于0.01～100mg/kg體重/天。
本發(fā)明式I化合物還可作為抑制細(xì)胞周期的低分子生物探針用于生命科學(xué)研究中。當(dāng)把式I化合物用于生命科學(xué)研究中時(shí)，可溶于甲醇或含水甲醇中，也可溶于二甲基亞砜的含水溶液中加以應(yīng)用。
具體實(shí)施例方式下列實(shí)施例將進(jìn)一步說明本發(fā)明，但并不對(duì)本發(fā)明構(gòu)成限制。
在以下實(shí)施例中，稱為化合物1的本發(fā)明化合物經(jīng)核磁共振等鑒定具有如下結(jié)構(gòu) 化合物1
稱為化合物2的本發(fā)明化合物經(jīng)核磁共振等鑒定具有如下結(jié)構(gòu) 化合物2在結(jié)構(gòu)研究中，熔點(diǎn)用北京天地宇科技有限責(zé)任公司X-4型精密顯微熔點(diǎn)測(cè)定儀測(cè)定，溫度未校正。比旋光度用JSASCO P-1020型旋光儀測(cè)定。正負(fù)離子TOF-MS和HR-TOF-MS分別用美國ABI公司API 3000型液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀和英國Micromass公司LCT型質(zhì)譜儀測(cè)定，紫外光譜用Shimadzu UV2501PC型紫外分光光度儀測(cè)定，紅外光譜用Nicolet Magna-IRTM550型紅外光譜儀測(cè)定，核磁共振譜用JEOL Eclips-600型超導(dǎo)核磁共振儀(600MHz1H-NMR，150MHz13C-NMR)測(cè)定。
實(shí)施例1化合物1的發(fā)酵生產(chǎn)及分離精制發(fā)酵生產(chǎn)產(chǎn)素菌本實(shí)施例中用于發(fā)酵生產(chǎn)化合物1的產(chǎn)素菌從采自西雙版納的土壤樣品中分離并經(jīng)分類學(xué)研究鑒定為假輪枝鏈霉菌(Streptomyces pseudoverticillus)的YN17707 CGMCC No.1452株。
產(chǎn)素菌的發(fā)酵培養(yǎng) 按培養(yǎng)微生物的常規(guī)方法，取假輪枝鏈霉菌Streptomyces pseudoverticillus YN17707 CGMCC No.1452株適量，接種到茄形瓶中高氏合成一號(hào)瓊脂固體斜面培養(yǎng)基上，在28攝氏度培養(yǎng)箱中活化培養(yǎng)7天。取活化培養(yǎng)7天的茄形瓶斜面，加入15毫升無菌水，用接種針刮下孢子，制成孢子懸液，倒入接種瓶中，接入含20升液體種子培養(yǎng)基(含豆粉0.5％，可溶性淀粉1.5％，甘油1.5％，蛋白胨1.5％，CaCO30.2％；滅菌前調(diào)pH 7.4)的50升發(fā)酵罐中，28攝氏度培養(yǎng)48小時(shí)。取種子培養(yǎng)液，按10％的接種量接入含120升發(fā)酵培養(yǎng)基(組成與種子培養(yǎng)基相同)的250升發(fā)酵罐中，在罐壓為0.8個(gè)大氣壓、溫度為28攝氏度、轉(zhuǎn)速為350rpm的條件下發(fā)酵培養(yǎng)4天，獲得發(fā)酵物約120升。
含化合物1的氯仿提取物的制備上述發(fā)酵物經(jīng)過濾分為濾液和菌絲體兩部分。濾液直接用等量的氯仿萃取三次；菌絲體用80％丙酮水溶液提取，減壓濃縮至無丙酮，所得水溶液用等量的氯仿萃取三次。合并由濾液和菌絲體得到的氯仿萃取液，減壓濃縮至干，得到含化合物1的氯仿萃取物70克。
化合物1的分離精制取氯仿萃取物30克，用適量氯仿溶解，加青島海洋化工廠產(chǎn)硅膠G(200-300目)50克拌樣，添加到裝有300克薄層層析用硅膠60H(青島海洋化工廠產(chǎn)品)的玻璃減壓柱上，進(jìn)行減壓柱層析，用氯仿-甲醇系統(tǒng)(100∶0→80∶20)梯度洗脫，每500ml為一個(gè)流份，得到若干流份。根據(jù)薄層檢測(cè)及活性測(cè)試結(jié)果，合并相應(yīng)流份，得到含化合物1的活性組分Fr-3(氯仿-甲醇90∶10洗脫部位)。將該活性組分Fr-3溶于適量氯仿中，加硅膠G(200-300目)適量拌樣，添加到裝有適量薄層層析用硅膠60H的玻璃減壓柱上，以氯仿-甲醇(30∶1)為洗脫劑進(jìn)行減壓柱層析分離，接取含化合物1的層析組分，經(jīng)制備硅膠薄層層析(石油醚-丙酮13∶7展開)及Sephadex LH-20凝膠小柱(氯仿)精制，得化合物1(11mg)。
化合物1淡黃色無定型粉末，[α]D27+70.1°(c 1，氯仿)，分子式C32H46O10N2。正離子TOF-MS m/z619[M+H]+，641[M+Na]+；負(fù)離子TOF-MS m/z617[M-H]-。負(fù)離子HR-TOF-MS m/z實(shí)測(cè)值617.3088[M-H]-，計(jì)算值617.3074。UVλmaxnm(logε)in MeOH240.5(4.16)，258(4.12)，312(3.55)。IR vmaxcm-1(KBr)3346，3196，2825，1716，1652，1525，1377，1192，1105，1057，1026。1H及13CNMR數(shù)據(jù)見表3。
表3化合物1在氘代氯仿中的600MHz1H和150MHz13C NMR數(shù)據(jù)a)

a)本表信號(hào)歸屬基于DEPT、PFG1H-1H COSY、PFG HMQC及PFG HMBC圖譜解析結(jié)果。b)此欄中的數(shù)字代表在PFG1H-1H COSY譜中與相應(yīng)行中的1H給出偶合相關(guān)信號(hào)的1H核。c)此欄中的數(shù)字分別代表在PFG HMBC譜(1JCH＝8Hz)中與相應(yīng)行中的碳給出HMBC信號(hào)的1H核。
實(shí)施例2化合物2的分離精制取上述實(shí)施例1中得到的氯仿萃取物30克，用適量氯仿溶解，加青島海洋化工廠產(chǎn)硅膠G(200-300目)50克拌樣，添加到裝有300克薄層層析用硅膠60H(青島海洋化工廠產(chǎn)品)的玻璃減壓柱上，進(jìn)行減壓柱層析，用氯仿-甲醇系統(tǒng)(100∶0→80∶20)梯度洗脫，每500ml為一個(gè)流份，得到若干流份。根據(jù)薄層檢測(cè)及活性測(cè)試結(jié)果，合并相應(yīng)流份，得到含化合物2的活性組分Fr-4(氯仿-甲醇80∶20洗脫部位)。將該活性組分Fr-4溶于適量氯仿中，加硅膠G(200-300目)適量拌樣，添加到裝有適量薄層層析用硅膠60H的玻璃減壓柱上，以氯仿-甲醇(30∶1)為洗脫劑進(jìn)行減壓柱層析分離，接取含化合物2的層析組分，經(jīng)制備硅膠薄層層析(氯仿-甲醇9∶1展開)及Sephadex LH-20凝膠小柱(氯仿)精制，得化合物2(15mg)。
化合物2黃色無定型粉末，[α]D27+126.2°(c 1，氯仿)，分子式C29H42O9N2。正離子TOF-MS m/z545[M-H2O+H]+，567[M-H2O+Na]+；負(fù)離子TOF-MS m/z543[M-H2O-H]-。UVλmaxnm(logε)in MeOH290.5(4.09)，339(4.17)。IR vmaxcm-1(KBr)3334，1716，1585。1H及13C NMR數(shù)據(jù)見表4。
表4化合物2在氘代氯仿中的600MHz1H和150MHz13CNMR數(shù)據(jù)a)

a)本表信號(hào)歸屬基于DEPT、PFG1H-1H COSY、PFG HMQC及PFG HMBC圖譜解析結(jié)果。
b)此欄中的數(shù)字代表在PFG1H-1H COSY譜中與相應(yīng)行中的1H給出偶合相關(guān)信號(hào)的1H核。
c)此欄中的數(shù)字分別代表在PFG HMBC譜(1JCH＝8Hz)中與相應(yīng)行中的碳給出HMBC信號(hào)的1H核。
實(shí)施例3化合物1和化合物2的細(xì)胞周期抑制活性測(cè)試實(shí)驗(yàn)樣品及實(shí)驗(yàn)方法被測(cè)樣品溶液的配制測(cè)試樣品為上述實(shí)施例1和實(shí)施例2中分離精制的純品化合物1和化合物2。精密稱取適量樣品，用甲醇配成所需濃度的溶液，供測(cè)活性。
細(xì)胞系及細(xì)胞的繼代培養(yǎng) 活性測(cè)試采用溫敏型小鼠乳腺癌tsFT210細(xì)胞系，細(xì)胞用含10％FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基，在32攝氏度于通入5％二氧化碳的細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼代培養(yǎng)。
流式細(xì)胞術(shù)活性測(cè)試方法非同步化培養(yǎng)測(cè)試法取對(duì)數(shù)生長期的tsFT210細(xì)胞，用新鮮的RPMI-1640培養(yǎng)基配制成密度為每毫升2×105個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液，按每孔0.5毫升接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入5微升不同濃度的樣品溶液，32攝氏度下培養(yǎng)17小時(shí)。取藥物作用下培養(yǎng)后的細(xì)胞，首先在光學(xué)顯微鏡下觀察藥物處理引起的形態(tài)學(xué)變化，初步判斷有無細(xì)胞周期抑制、細(xì)胞凋亡或細(xì)胞壞死的形態(tài)學(xué)特征，必要時(shí)進(jìn)行拍照。繼而，將細(xì)胞分別從24孔細(xì)胞培養(yǎng)板轉(zhuǎn)移至1.5毫升Eppendorf離心管中，4攝氏度下每分鐘3000轉(zhuǎn)離心3分鐘，吸去上清液，加0.5毫升磷酸緩沖溶液(PBS)震蕩洗滌一次，相同條件下離心收集細(xì)胞，加150微升碘化丙啶(PI)水溶液(在100毫升水中含5毫克PI、100毫克檸檬酸鈉和200毫克NP-40)，4攝氏度下染色30分鐘后，加入180微升PBS稀釋，用流式細(xì)胞儀分析測(cè)定細(xì)胞中的DNA含量。細(xì)胞在細(xì)胞周期各時(shí)相中的分布利用庫爾特公司產(chǎn)計(jì)算機(jī)軟件WinCycle進(jìn)行分析計(jì)算。
同步化培養(yǎng)測(cè)試法取對(duì)數(shù)生長期的tsFT210細(xì)胞，用新鮮的RPMI-1640培養(yǎng)基配制成密度為每毫升2×105個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液，按每孔0.5毫升接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，置于39.4攝氏度二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)17小時(shí)，使細(xì)胞在細(xì)胞周期的G2期同步化。再往每孔細(xì)胞中分別加入0.5微升待測(cè)樣品的甲醇溶液，置于32攝氏度二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時(shí)。取藥物作用下培養(yǎng)后的細(xì)胞，首先在光學(xué)顯微鏡下觀察藥物處理引起的形態(tài)學(xué)變化，初步判斷有無細(xì)胞周期抑制、細(xì)胞凋亡或細(xì)胞壞死的形態(tài)學(xué)特征，必要時(shí)進(jìn)行拍照。繼而將細(xì)胞分別從24孔細(xì)胞培養(yǎng)板轉(zhuǎn)移至1.5毫升Eppendorf離心管中，4攝氏度下每分鐘3000轉(zhuǎn)離心3分鐘，吸去上清液，加0.5毫升PBS震蕩洗滌一次，相同條件下離心收集細(xì)胞，加150微升碘化丙啶水溶液，4攝氏度下染色30分鐘后，加入180微升PBS稀釋，用流式細(xì)胞儀分析測(cè)定細(xì)胞中的DNA含量。細(xì)胞在細(xì)胞周期各時(shí)相中的分布利用庫爾特公司產(chǎn)計(jì)算機(jī)軟件WinCycle進(jìn)行分析計(jì)算。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果非同步化培養(yǎng)法測(cè)試結(jié)果流式細(xì)胞術(shù)測(cè)試結(jié)果經(jīng)用不同濃度的化合物1和化合物2分別處理非同步化的tsFT210細(xì)胞17小時(shí)后，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)分析的tsFT210細(xì)胞在細(xì)胞周期各時(shí)中的分布情況見表5和表6?；衔?和化合物2對(duì)非同步化的tsFT210細(xì)胞在低濃度時(shí)顯示出一定的G2/M期抑制活性，但隨著濃度增高，主要將細(xì)胞周期抑制在G0/G1期(參見表5和表6)。
表5非同步化tsFT210細(xì)胞經(jīng)化合物1處理17小時(shí)后的流式細(xì)胞術(shù)測(cè)試結(jié)果(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，n＝3)

**P值小于0.01，*P值小于0.05(t檢驗(yàn)，與空白對(duì)照組比較)表6非同步化tsFT210細(xì)胞經(jīng)化合物2處理17小時(shí)后的流式細(xì)胞術(shù)測(cè)試結(jié)果(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，n＝3)

*P值小于0.05(t檢驗(yàn)，與空白對(duì)照組比較)形態(tài)學(xué)檢測(cè)結(jié)果 用不同濃度的化合物1處理非同步化tsFT210細(xì)胞17小時(shí)后，在光學(xué)倒置顯微鏡下觀察到與空白對(duì)照組比較，化合物1的12.5～50.0μg/ml處理組，視野中體積較大的細(xì)胞的數(shù)目明顯增多；而當(dāng)化合物1的濃度高于100μg/ml時(shí)，視野中體積較小的細(xì)胞的數(shù)目增多?；衔?處理組細(xì)胞中也觀測(cè)到現(xiàn)實(shí)的結(jié)果，只是濃度范圍有所偏低，當(dāng)化合物2的濃度達(dá)50μg/ml時(shí)，視野中體積較小的細(xì)胞的數(shù)目顯著增多。形態(tài)學(xué)觀測(cè)結(jié)果與上述流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果(參見表5和表6)吻合。
同步化培養(yǎng)法測(cè)試結(jié)果流式細(xì)胞術(shù)測(cè)試結(jié)果 用不同濃度的化合物1處理G2期同步化的tsFT210細(xì)胞4小時(shí)后，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)分析的tsFT210細(xì)胞在細(xì)胞周期各時(shí)中的分布情況見表7?；衔?對(duì)同步化tsFT210細(xì)胞主要顯示出細(xì)胞周期G2/M期抑制活性(參見表7)。
表7 G2期同步化tsFT210細(xì)胞經(jīng)化合物1處理4小時(shí)后測(cè)得的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)分析結(jié)果(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，n＝3)

**P值小于0.01，*P值小于0.05(t檢驗(yàn)，與空白對(duì)照組比較)形態(tài)學(xué)檢測(cè)結(jié)果 用不同濃度的化合物1處理G2期同步化的tsFT210細(xì)胞4小時(shí)后，在光學(xué)倒置顯微鏡下觀察到與空白對(duì)照組比較，細(xì)胞形狀雖然沒有太大變化，但隨著樣品濃度的增高，視野中體積較大的細(xì)胞的數(shù)目顯著增多。形態(tài)學(xué)觀測(cè)結(jié)果與上述流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)分析結(jié)果(表7)吻合。
結(jié)論化合物1和化合物2將癌細(xì)胞阻滯在細(xì)胞周期的G0/G1期或G2/M期，從而抑制其增殖，因此可用作為細(xì)胞周期抑制劑、腫瘤細(xì)胞增殖抑制劑或抗腫瘤劑。
權(quán)利要求
1.式I所示的格爾德霉素類苯醌的芳香化還原衍生物及其藥學(xué)上可接受的鹽 式I其中，R1和R2各自獨(dú)立地代表氫、羥基、氨基、C4-C6直鏈或支鏈烷基、C4-C6烷氧基、羥甲基、-CH2OC(CH3)2OH，或者R1和R2一起代表-OOC(CH3)2OCH2-或-OC(CH3)2OCH2-；R3為氫、羥基、羥甲基或甲基；R4、R5、R6、R7和R8各自獨(dú)立地代表氫、甲基、磺酸基或氨甲?；?。
2.權(quán)利要求1的化合物，其中，R1和R2各自獨(dú)立地代表甲氧基、羥基，或者R1和R2一起代表-OOC(CH3)2OCH2-或-OC(CH3)2OCH2-；R3為羥基、甲基或羥甲基；R4、R5、R6、R7和R8各自獨(dú)立地代表氫、甲基或氨甲?；?。
3.權(quán)利要求1的化合物，其中，R1和R2各自獨(dú)立地代表甲氧基、羥基，或者R1和R2一起代表-OOC(CH3)2OCH2-；R3為羥基；R4和R7為甲基；R5和R8為氫；R6為氨甲酰基。
4.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的化合物，其為
5.權(quán)利要求1所述的式I化合物的制備方法，該方法包括通過發(fā)酵培養(yǎng)能生產(chǎn)式I化合物的微生物，首先獲取含有式I化合物的發(fā)酵物，繼而從發(fā)酵物中分離純化出式I化合物。
6.權(quán)利要求5的方法，所述的能生產(chǎn)式I化合物的微生物為鏈霉菌屬的假輪枝鏈霉菌YN17707CGMCC No.1452。
7.含有作為活性成分的權(quán)利要求1所述的式I化合物以及一種或多種藥用載體或賦形劑的藥物組合物。
8.權(quán)利要求1所述的式I化合物用于制備細(xì)胞周期抑制劑和腫瘤細(xì)胞增殖抑制劑的用途。
9.權(quán)利要求1所述的式I化合物用于制備抗腫瘤藥物的用途。
10.假輪枝鏈霉菌YN17707CGMCC No.1452。
11.權(quán)利要求10所述菌株用于生產(chǎn)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的化合物的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及一類具有式I化學(xué)結(jié)構(gòu)的格爾德霉素類苯醌芳香化還原衍生物、其制備方法、含有該類化合物作為活性成分的藥物組合物及其用途，其中R
文檔編號(hào)A61P35/00GK1927840SQ200510098738
公開日2007年3月14日 申請(qǐng)日期2005年9月7日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月7日
發(fā)明者崔承彬, 韓冰, 蔡兵 申請(qǐng)人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所