專利名稱：一種抗cd20嵌合抗體的制備及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種特異性靶向CD20的嵌合抗體(命名為TGLA)的制備方法。
背景技術(shù)：
CD20是人類B淋巴細胞表面特有的標識，表達于95％以上正?；驉夯腂細胞表面，起始表達于pre-B細胞階段，到B細胞終端分化成漿細胞時結(jié)束[1]。它高表達于所有正常B細胞和多數(shù)惡性B細胞表面，不會發(fā)生明顯的內(nèi)化和脫落，是治療非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin′s Iymphoma，NHL)理想的靶抗原。
從1975年，Kohler和Milstein第一次描述制備單克隆抗體以來，人們花了大量的時間去研究單抗，以便將其應(yīng)用于人類疾病的治療，然而進展緩慢。直到1989年，才有一株抗T細胞的單克隆抗體-OKT3被批準用于腎同種移植時的抗排斥反應(yīng)。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，到2004年12月美國FDA已批準24個治療性抗體藥物上市，抗體藥物占蛋白藥物80％以上[2]。單克隆抗體(mAb)以其特異性、均一性好、可大量生產(chǎn)等優(yōu)點，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于疾病的診斷和治療[3]。
近年來，NHL發(fā)病率逐漸攀升，嚴重危害著人類健康。以前的治療方法無法治愈，患者最終因淋巴瘤的復(fù)發(fā)而死亡。研究新型藥物用于NHL的治療成為一種必然趨勢?？笴D20單克隆抗體是一種新的有效抑制腫瘤細胞增長的治療方案，在治療NHL中的地位將會逐步提高[4]。
目前，抗CD20抗體的研究與應(yīng)用發(fā)展迅速。IDEC-C2B8，又名Rituximab，商品名為美羅華，1997年由FDA批準上市。它是一個人鼠嵌合抗體，包含鼠源抗CD20單克隆抗體2B8(Ibritumomab)的可變區(qū)和人源IgG1重鏈及κ鏈的恒定區(qū)，用于B細胞淋巴瘤的治療[5]。2002年2月，F(xiàn)DA批準了第一個放射性免疫治療藥物——Zevalin，由小鼠IgG1-κ單克隆抗體2B8連接同位素90Y用于治療復(fù)發(fā)性或難治性低惡性度/濾泡性或轉(zhuǎn)化的B細胞NHL，其中包括美羅華難治性的濾泡性NHL[6]。2003年6月27日，F(xiàn)DA批準Bexxar(Tositumomab和131I Tositumomab)用于治療癌細胞已經(jīng)或未發(fā)生轉(zhuǎn)移，對美羅華有耐藥性，化療后又復(fù)發(fā)的CD20+、濾泡性NHL。它由鼠源單克隆抗體——抗B1單克隆抗體(Tositumomab，IgG2a-λ)與放射性同位素131I共價偶聯(lián)而成[7]。
多中心臨床試驗結(jié)果表明目前上市的這三種抗體單獨使用都獲得了很好療效。其中美羅華與化療藥物CHOP(環(huán)磷酰胺、多柔比星、長春新堿、潑尼松)聯(lián)合使用治療低惡性度或濾泡性NHL，效果要好于單獨使用的效果[8]。Bexxar與化療藥物聯(lián)合使用有協(xié)同的治療效果。Zevalin和Bexxar用來治療對美羅華治療有抗性的患者有良好效果[6，9]。使用抗CD20抗體治療NHL的費用高，部分患者還發(fā)生了HAMA和HACA的反應(yīng)，如何使治療方案要更加完善，還需要進一步的探索。
目前抗CD20單克隆抗體正廣泛應(yīng)用于臨床治療B細胞淋巴瘤，但國內(nèi)目前還沒有具有自主知識產(chǎn)權(quán)的抗CD20嵌合抗體的商業(yè)化產(chǎn)品，臨床上使用的治療性抗體均來源于國外，價格昂貴。

發(fā)明內(nèi)容
以克隆的抗原CD20cDNA轉(zhuǎn)染鼠源性NIH3T3細胞作為重組抗原，采用細胞融合技術(shù)制備了一種分泌抗CD20的鼠源單克隆抗體(IgG1/κ亞型)雜交瘤細胞系M3-4。MTT和PI染色、光鏡、電鏡結(jié)果顯示M3-4具有抑制B淋巴瘤細胞增殖和直接誘導(dǎo)其凋亡的功能，這是它能用于淋巴瘤治療的基礎(chǔ)。為克服鼠源抗體M3-4應(yīng)用的局限性，通過RT-PCR的方法從雜交瘤細胞中釣取其可變區(qū)基因，構(gòu)建了抗CD20嵌合抗體的表達載體C3-4H和C3-4L，獲得抗CD20嵌合抗體TGLA。
具體實施例方式
1、材料
293T細胞、293T細胞用含10％FCS的DMEM(Gibco BRL公司)傳代培養(yǎng)。
Daudi和Raji用含10％FCS的RPMI-1640(Gibco BRL公司)傳代培養(yǎng)。
培養(yǎng)基中添加100U的青霉素和100U的鏈霉素。
AMV反轉(zhuǎn)錄試劑盒及pGEM-T Easy購自promega公司。
嵌合抗體的真核表達載體pCMV163。
限制性內(nèi)切酶為Biolabs公司產(chǎn)品。
rTaq DNA聚合酶、T4DNA連接酶、dNTP、DNA分子量標準DL2000購自Takara公司。
DNA膠回收試劑盒(OMEGA生物科技公司)；Trizol和LipofectamineTM2000(Invitrogen)；溴化十六碳烷基三甲銨(CTAB)、OPD(Sigma公司)。
羊抗人IgG(H+L)和辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG(CALTAG Laboratories)；FITC標記的羊抗人Fc和ECL化學(xué)發(fā)光底物檢測試劑盒(Pierce公司)；胎牛血清(北京元亨圣馬生物技術(shù)研究所)。
兔補體由307醫(yī)院免疫室制備，人補體為取自正常人的AB血清；陽性對照抗體人源化嵌合抗體(美羅華)購自羅氏公司；引物合成在北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司；DNA序列測定在上海博亞生物技術(shù)有限責(zé)任公司；鼠成纖維細胞系NIH3T3，小鼠骨髓瘤細胞系SP2/0由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所分子免疫室提供；純系Balb/c(4-6周齡)雌性小鼠，購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物中心。
2、方法2.1免疫Balb/c小鼠選用4-6周齡的雌性Balb/c小鼠4只，用1×107CD20+的NIH3T3細胞對小鼠腹腔注射免疫，每三周免疫一次，共免疫3次。第三次免疫后采取小鼠靜脈血，間接免疫熒光法測抗CD20抗體產(chǎn)生情況，融合前三天，再以同樣方法加強免疫一次。
2.2單克隆抗體的鑒定與制備取免疫小鼠脾細胞與SP2/0細胞融合，選擇性培養(yǎng)體系篩選的陽性克隆細胞，亞克隆篩選，最終獲得穩(wěn)定分泌抗人CD20的單克隆抗體的雜交瘤細胞株(M3-4)；細胞1200轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，棄上清，用生理鹽水洗3次，將細胞數(shù)調(diào)整為6×106/ml，每只小鼠腹腔注射0.5ml。約10天后，獲取富含CD20單克隆抗體(M3-4)的腹水，經(jīng)親和純化后，進行生物活性分析。
2.3免疫沉淀法鑒定M3-4識別的抗原分子量將Daudi(抗原的陽性細胞)和K562(抗原的陰性細胞)用含Ca2+和Mg2+的PBS洗液洗三次，加入Biotin冰浴振蕩30分鐘對細胞表面分子進行生物素化，洗3次，棄上清，去除未結(jié)合的Biotin。加細胞裂解液，冰浴20分鐘對細胞裂解，10000轉(zhuǎn)/分鐘，4℃離心10分鐘，裂解上清液中加入雜交瘤細胞上清和ProteinA-Sephorose一起沉淀后，將抗原抗體復(fù)合物加入含巰基乙醇的樣品處理液煮沸5分鐘，進行SDS-PAGE蛋白電泳，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，5％脫脂奶粉37℃封閉1小時，0.2％PBS-T洗膜3次，加HRP標記的Avidin反應(yīng)1小時，PBS-T洗3次，暗室里用增強的化學(xué)發(fā)光(ECL)檢測試劑與膜作用，對X光片放射自顯影。再向膜上加DAB溶液10ml和30％H2O210μl進行顯色，出現(xiàn)清晰條帶后用H2O中止反應(yīng)。
2.4流式細胞術(shù)(FCM)鑒定M3-4反應(yīng)細胞譜系的特異性分別取處于生長期的B細胞(Daudi，Raji，Nalm-6)，T細胞(Molt-4，Jurkat，HPB-ALL)，單個核細胞(U937)，骨髓瘤細胞(SKO-007)，紅白血病細胞(K562)，粒系細胞(HL-60，KG1-a)，扁桃體細胞等12株細胞，正常人外周血單個核細胞(PBMC)，正常人骨髓單個核細胞，以標準CD20-mAb(由第5屆白細胞分化抗原國際會議贈送)為陽性對照，以PBS為陰性對照，用FCM測M3-4單抗與各細胞株的反應(yīng)特異性。
2.5FCM檢測M3-4單抗對標準CD20-FITC單抗的競爭抑制作用Daudi細胞中分別加入標準抗CD20-FITC單抗0，1，2，5，10μl，冰浴反應(yīng)20分鐘，F(xiàn)CM檢測陽性細胞百分比以確定剛好與Daudi細胞完全反應(yīng)的標準抗CD20-FITC的用量。在此用量的基礎(chǔ)上向Daudi細胞中加入不同量的M3-4單抗，F(xiàn)CM檢測能否對標準抗CD20-FITC單抗產(chǎn)生競爭作用。
2.6FCM檢測轉(zhuǎn)染細胞的膜熒光取2×105處于對數(shù)生長期的NIH-3T3細胞系，以插入人CD20基因的pcDNA3.1質(zhì)粒和脂質(zhì)體共轉(zhuǎn)染NIH-3T3細胞，PBS洗3次，加入待測雜交瘤細胞上清進行間接免疫熒光，以標準CD20-McAb為陽性對照，以空載體為陰性對照驗證M3-4的特異性；用FCM檢測雜交瘤細胞上清的反應(yīng)性。
2.7引物設(shè)計、抗體基因釣取、表達載體構(gòu)建與鑒定(1)引物設(shè)計TGLA重鏈引物Fd引物(上游)5’AGGTCCAGCTTCTCGAGTCAGG3’Fd引物(下游)5’GTTCTGACTAGTGGGCACTCTGGGCTC3’TGLA輕鏈引物K引物(上游)5’CCAGTTCCGAGCTCCAGATGACCCAGTCTCCA3’K引物(下游)5’GCGCCGTCTAGAATTAACACTCATTCCTGTTGAA3’(2)總RNA提取按照Trizol總RNA抽提試劑說明書，從分泌抗CD20單抗的M3-4雜交瘤細胞中提取總RNA。
(3)cDNA合成以總RNA為模板，oligo(dT)15為引物，按照AMV反轉(zhuǎn)錄酶說明書進行反轉(zhuǎn)錄，總反應(yīng)體積為20μl。
(4)載體構(gòu)建分別擴增M3-4重鏈、輕鏈可變區(qū)基因，Pvu II及BstE II雙酶切重鏈可變區(qū)基因，EcoRV及Xho I雙酶切輕鏈可變區(qū)基因，分別與經(jīng)同樣酶切的重鏈表達載體pCMV-VH和輕鏈表達載體pCMV-VL連接。
連接體系為15μl∶1μl載體，1μl酶切回收片段(保證片段與載體的比例在1∶3到1∶10之間)，T4DNA連接酶0.5μl，連接緩沖液1.5μl，加水補足15μl，16℃連接過夜，取7.5μl連接產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL1-Blue。
操作按照分子克隆方法進行。挑取抗性選擇陽性克隆，并進行酶切鑒定，選擇雙重鑒定均為陽性的抗CD20嵌合抗體的真核表達載體M3-4/H和M3-4/L各3個送至博亞生物技術(shù)有限公司測序。
擴增抗體重、輕鏈可變區(qū)基因，分別與重鏈表達載體pCMV-VHL表達載體連接。連接體系為15μl∶1μl載體，1μl酶切回收片段(保證片段與載體的比例在1∶3到1∶10之間)，T4DNA連接酶0.5μl，連接緩沖液1.5μl，加水補足15μl。
16℃連接過夜，取7.5μl連接產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL1-Blue。
操作按照分子克隆方法進行。
抗性選擇陽性克隆，并進行酶切鑒定，選擇雙重鑒定均為陽性的抗CD20嵌合抗體的真核表達載體TGLAH、TGLAL各5個送至博亞生物技術(shù)有限公司測序。
2.8轉(zhuǎn)染與鑒定(1)瞬時轉(zhuǎn)染以含有10％的FCS的DMEM培養(yǎng)基，在37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)293T細胞至對數(shù)生長期。用不含有抗生素的10％FCS的DMEM培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度到2×105，于24孔板中加入500μl細胞懸液，繼續(xù)培養(yǎng)24小時。
(2)RT-PCR收集轉(zhuǎn)染后60小時的293T細胞，PBS洗三遍，按Trizol試劑的使用說明書提取總RNA。OD260/OD280測定總RNA純度，1％瓊脂糖電泳。擴增后檢測目的基因的轉(zhuǎn)錄。
2.9Western blot將嵌合抗體的表達上清及空載體轉(zhuǎn)染細胞上清以12％的SDS-PAGE分離后，100V電轉(zhuǎn)50分鐘至硝酸纖維素膜(NC)上。用5％脫脂奶粉封閉1小時，加入HRP標記的羊抗人IgG(H+L)(1∶400)抗體室溫振蕩反應(yīng)1小時，PBS-T洗膜3次，每次10分鐘。采用增強的化學(xué)發(fā)光(enhanced chemiluminescence，ECL)法檢測結(jié)合的HRP標記的羊抗人IgG(H+L)，從而確定表達上清中目的蛋白特異性。
2.10間接免疫熒光將嵌合抗體表達上清及空載體轉(zhuǎn)染細胞上清與CD20+的B淋巴細胞系Daudi細胞共同孵育20分鐘，用GAH-IgG-Fc-FITC抗體檢測細胞表面結(jié)合的嵌合抗體分子，同時設(shè)未加二抗的陰性對照。通過倒置熒光顯微鏡下觀察和流式細胞儀檢測，判定嵌合抗體與Daudi細胞結(jié)合的情況。
2.11競爭性抑制實驗先將FITC標記的TGLA與靶細胞Daudi結(jié)合，選擇TGLA-FITC 2.5μg/管進行競爭性抑制實驗。取不同濃度的美羅華與TGLA-FITC預(yù)先混合均勻后(美羅華∶TGLA＝4∶1；8∶1；16∶1；40∶1；100∶1)，與Daudi(3×105個/管)室溫振蕩孵育20分鐘，用2％FCS-PBS洗去未結(jié)合的過量抗體，以1％多聚甲醛400μL固定，流式細胞儀測定陽性細胞百分率，分析美羅華與TGLA的競爭性抑制。
2.12CDC效應(yīng)評價取處于對數(shù)生長期的Daudi、Raji細胞，用10％FCS-RPMI 1640培養(yǎng)基洗1次，將細胞重懸于10％FCS-RPMI 1640培養(yǎng)基中，調(diào)整細胞濃度至3×105個/ml，以每孔100μl接種至96孔板中。加入對倍梯度稀釋的TGLA6.25～50μg/ml，10μl/孔，37℃孵育20分鐘。加補體(1∶20)10μl/孔37℃孵育20分鐘后用MTT法檢測TGLA補體依賴的細胞毒活性。
3、結(jié)果3.1 抗CD20單克隆抗體M3-4的產(chǎn)生經(jīng)融合、篩選及反復(fù)克隆化，最終獲得一株分泌抗人CD20抗體的雜交瘤細胞株M3-4，經(jīng)間接免疫熒光檢測腹水中抗體效價為1∶4000，體外連續(xù)傳代(＞30代)并能穩(wěn)定分泌單抗，凍存半年以上的細胞株復(fù)蘇后，細胞上清與Daudi細胞的反應(yīng)仍為陽性。
3.2 M3-4識別抗原的分子量經(jīng)免疫沉淀DAB顯色結(jié)果顯示，M3-4識別B淋巴細胞Daudi細胞表面分子量約為33kD的膜抗原，而不與K562細胞反應(yīng)，與標準CD20-McAb識別抗原的分子量相同(圖3.1)。
3.3 M3-4的特異性鑒定間接免疫熒光法證明，標準CD20-mAb和M3-4與pcDNA3.1/CD20+轉(zhuǎn)染的NIH-3T3細胞反應(yīng)后產(chǎn)生膜熒光，而與轉(zhuǎn)染空載體的細胞反應(yīng)無膜熒光出現(xiàn)。M3-4與Daudi，Raji細胞反應(yīng)呈陽性，與Nalm-6、HPB-ALL、K562、HL-60等細胞反應(yīng)呈陰性，與扁桃體、外周血和骨髓單個核細胞反應(yīng)的陽性率均符合文獻報道的范圍(表3.1，圖3.2)，此結(jié)果表明獲得的M3-4為針對人CD20抗原的特異性抗體。
表3.1 M3-4與各細胞系及正常人單個核細胞的反應(yīng)性(陽性％)

3.4 M3-4單抗對標準CD20-FITC單抗的競爭抑制作用由圖3.3可看出，用標準CD20-FITC單抗2μl可與Daudi細胞表面的CD20分子反應(yīng)達飽和，故此量作為競爭抑制試驗中標準抗CD20-FITC單抗的用量。在競爭抑制試驗中加入不同量的M3-4，對標準抗CD20-FITC產(chǎn)生相應(yīng)的抑制作用，而且抑制作用隨著M3-4加入量的增加而增強，當(dāng)加入200μg的M3-4時，陽性細胞百分比由65.70％下降為19.72％(圖3.4)。
3.5 M3-4誘導(dǎo)Daudi細胞凋亡的FCM檢測Daudi細胞與M3-4孵育后經(jīng)PI染色測得其出現(xiàn)凋亡細胞的百分比(40.48％)明顯高于其對照組(10.36％)，而陰性細胞HPB-ALL加入M3-4前(16.28％)后(12.79％)無變化(圖3.5)。
3.6 M3-4單抗VH和VL基因的克隆及序列分析用Trizol試劑提取的雜交瘤細胞系M3-4總RNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定出現(xiàn)清晰的28s、18s和5s 3條帶。合成第1鏈cDNA后，利用通用引物PCR擴增得到VH-CH1-CH2和VL-CL基因。分別與pGEM-T Easy連接后，篩選出重組質(zhì)粒，完成pGEM-3-4H和pGEM-3-4L測序載體的構(gòu)建。經(jīng)DNA序列測定得到釣取基因序列信息，分析結(jié)果表明獲得的基因均符合小鼠抗體可變區(qū)框架結(jié)構(gòu)[10]。
表3.2給出了M3-4單抗的輕、重鏈可變區(qū)基因及蛋白序列。
3.7 嵌合抗體TGLA真核表達載體的構(gòu)建與鑒定將獲得的抗CD20抗體輕、重鏈可變區(qū)基因分別構(gòu)建到pCMV-VHL163上，經(jīng)PCR、酶切測定正確，得到TGLA嵌合抗體表達載體TGLAHL/pCMV-VHL163(圖3.6)。
3.8 瞬時轉(zhuǎn)染的嵌合抗體TGLA鑒定與純化TGLAHL/pCMV-VHL163瞬時轉(zhuǎn)染293T細胞，轉(zhuǎn)染后72小時后應(yīng)用ELISA方法檢測細胞上清中抗體含量，并用RT-PCR檢測mRNA水平抗體基因的表達(圖3.7)；非還原SDS-PAGE結(jié)果證實轉(zhuǎn)染上清中有分子量為150kD的嵌合抗體，與美羅華結(jié)果一致(圖3.8a)；取瞬時轉(zhuǎn)染嵌合抗體TGLA上清經(jīng)ProteinA-Sephroase4B親和純化(圖3.8b)，獲得可進行生物活性分析的TGLA抗體。
3.9 嵌合抗體TGLA的結(jié)合活性鑒定分別將嵌合抗體TGLA的表達上清、空載體轉(zhuǎn)染細胞上清與CD20+B淋巴細胞系Daudi細胞共同孵育，利用GAH-IgG-Fc-FITC檢測細胞表面結(jié)合的嵌合抗體分子。熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示TGLA培養(yǎng)上清可與靶細胞結(jié)合(圖3.9)；流式細胞術(shù)檢測TGLA與靶細胞結(jié)合的陽性率為97.67％。TGLA嵌合抗體對Daudi細胞的免疫沉淀結(jié)果進一步證實TGLA抗體對分子量為33kD的CD20分子具有特異性識別功能(圖3.10)。
3.10 TGLA嵌合抗體與CD20抗體(美羅華)競爭結(jié)合CD20靶位點抗體所結(jié)合的抗原表位與抗體的功能密切相關(guān)。競爭性抑制試驗表明當(dāng)美羅華用量為TGLA 40倍時可競爭抑制TGLA 54.64％，美羅華用量增加至100倍競爭抑制率達87.43％。實驗結(jié)果如圖3.11所示。
3.11 TGLA嵌合抗體親和力以Daudi為靶細胞，測定TGLA嵌合抗體的親和力是5.16×10-9M(圖3.12)。
3.12 TGLA嵌合抗體的CDC效應(yīng)以Daudi和Raji細胞為靶細胞，以Jurkat(人T淋巴白血病病細胞)細胞為非靶對照細胞，測定TGLA的CDC活性(兔補體)，實驗結(jié)果表明TGLA可以激活兔補體殺傷靶細胞，殺傷效應(yīng)與抗體劑量呈正相關(guān)，對無CD20表達的T淋巴白血病細胞無殺傷活性，TGLA抗體的靶向殺傷效應(yīng)是具有特異性(圖3.13)。
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權(quán)利要求
1.分泌抗CD20單克隆抗體的雜交瘤細胞M3-4細胞及其抗體輕重鏈序列
2.抗CD20嵌合抗體輕重鏈可變區(qū)基因的序列及其制備方法
3.權(quán)力要求1、2的分離抗體或其抗原結(jié)合部分；
4.權(quán)力要求1、2、3具有如下特征的抗體或其抗原結(jié)合部分(A)具有重鏈CDR1、CDR2、CDR3域；該域包含SEQ ID NO1的氨基酸序列，或通過于位置1、4、5、7、或10的氨基酸替換或通過位置1、3、4、8、12的氨基酸替換；(B)具有輕鏈CDR1、CDR2、CDR3域，該域包含SEQ ID NO2的氨基酸序列，或通過于位置2、3、4、6、7、9、10的氨基酸置換或通過于位置3、6、10、11、12的氨基酸替換
5.權(quán)力要求1-4任何一項的TGLA嵌合抗體制備或抗體與131I-TGLA嵌合抗體對非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphoma，NHL)、美羅華治療有耐藥性、化療后又復(fù)發(fā)的CD20+濾泡型的NHL臨床治療。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種特異性靶向CD20分子的TGLA嵌合抗體的制備及其用途。具體而言是在獲得抗人CD20單克隆抗體的雜交瘤細胞M3－4及其抗體基因的基礎(chǔ)上，制備了抗CD20嵌合抗體，通過實驗驗證該嵌合抗體識別表位特性及介導(dǎo)殺傷靶細胞的功能，并提供一種設(shè)計抗體藥物分子的方案。
文檔編號A61P35/00GK1931877SQ200510102649
公開日2007年3月21日 申請日期2005年9月13日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月13日
發(fā)明者沈倍奮, 馮建男, 黃英, 孫英勛, 耿樹生, 谷欣, 王玉剛, 黎燕 申請人:北京天廣實生物技術(shù)有限公司