專利名稱：鋅指蛋白hzf1基因的功能及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一個編碼蛋白基因的功能及其應(yīng)用，更具體地，本發(fā)明涉及一個鋅指蛋白HZF1基因的功能及其在診斷或治療與HZF1功能有關(guān)的紅系分化和巨核細胞分化相關(guān)的腫瘤、貧血和細胞減少癥中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
真核生物有機體的發(fā)育涉及生長及按照準確時空的細胞和組織分化。分化了的細胞形態(tài)和功能特異性是由特定基因的表達決定的。作為維持生命重要生理過程的造血涉及骨髓多能造血干細胞向具有不同形態(tài)及功能的血細胞的分化和發(fā)育成熟。雖然已提出不同的造血機制模型，但人們相信干細胞向某類細胞鏈系的分化決定和進一步分化發(fā)育成熟可能涉及許多基因的表達，由這些基因表達形成的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)最終決定了細胞的特異形態(tài)及功能。確定與造血細胞分化有關(guān)的重要基因及調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)對揭示細胞分化機制具有重要的理論意義，并可能對某些與造血相關(guān)的血液性疾病(如血液系統(tǒng)腫瘤及與細胞分化相關(guān)的貧血和細胞減少或增多癥)的防治產(chǎn)生實際意義。
發(fā)明人現(xiàn)已從人骨髓cDNA文庫中分離鑒別了一個新的C2H2型鋅指蛋白(定名為HZF1)基因，并首先在GenBank注冊(注冊號AF244088)。此基因編碼的蛋白由670個氨基酸殘基組成，其中包含17個連續(xù)的鋅指模體。
鋅指模體已被證明是一類常見的轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合區(qū)。已經(jīng)鑒別了多個C2H2型鋅指蛋白基因，許多被證明在組織和細胞的分化發(fā)育中具有重要作用(Ganss，B.and Jheon，A.，Crit Rev.Oral Biol.Med.15282-297，2004；Perry，C.and Soreq，H.，Eur.J.Biochem.2693607-3618，2002；Aruga，J.，Mol.Cell Neurosci.26205-221，2004；Orkin，S.H.Nat.Rev.Genet.157-64，2000；Asano，H.et al.，Blood 953578-3584，2000；Mitsuma，A.et al.，Biochim，Biophys.Acta1727125-133，2005)。對我們發(fā)現(xiàn)的HZF1，至今尚無任何功能研究的報告。對我們發(fā)現(xiàn)的HZF1，至今尚無任何關(guān)于其功能的研究報告。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及鋅指蛋白HZF1基因的功能，特別是HZF1在紅系細胞分化和巨核細胞分化中的重要作用，進一步地，本發(fā)明提供了一個HZF1基因相關(guān)疾病的診斷方法，進一步地，本發(fā)明還提供了一種通過控制HZF1基因表達治療相關(guān)疾病的方法。
通過生物信息學(xué)分析，揭示了HZF1蛋白的結(jié)構(gòu)特點，即包含具有DNA結(jié)合特征的C2H2型鋅指結(jié)構(gòu)域及酸性激活結(jié)構(gòu)域。附表顯示了克隆的新的鋅指蛋白HZF1cDNA的核苷酸順序(已在GenBank注冊)。酸性結(jié)構(gòu)域已被報告常具有調(diào)節(jié)功能(Sigler，P.B.Nature333210-212，1988；Cunliffe，V.，et al.，Genomics8331-339，1990；Cunliffe，V.，et al.EMBOJ.9197-205，1990)。
我們利用細胞轉(zhuǎn)染和報告基因技術(shù)證明HZF1蛋白定位于細胞核，這與從蛋白結(jié)構(gòu)推斷HZF1可能作為一個轉(zhuǎn)錄因子在基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用相一致。用Northern雜交分析證明了HZF1mRNA在廣泛的組織和多種血液細胞系中有不同程度的表達，說明其可能在多種細胞和組織中行使功能。HZF1mRNA在處于紅系和巨核系共同祖細胞階段的紅白血病K562細胞中表達很低，但隨著hemin誘導(dǎo)的紅系分化及PMA誘導(dǎo)的巨核系分化表達上調(diào)，暗示HZF1可能在紅系分化和巨核細胞分化中發(fā)揮作用。更關(guān)鍵地，應(yīng)用反義核酸和RNA干擾技術(shù)，發(fā)現(xiàn)HZF1內(nèi)源表達的抑制嚴重阻遏K562細胞向紅系和巨核系兩個方向的分化，對HZF1在紅系和巨核系分化和發(fā)育中的重要作用提供了有力證據(jù)。
造血細胞分化發(fā)育的異常常與疾病相關(guān)，如血液系統(tǒng)腫瘤(白血病)細胞的分化阻遏或逆向分化，再生障礙性貧血中的干/祖細胞分化阻遏，與某種血液細胞鏈系分化發(fā)育異常相關(guān)的貧血或細胞減少癥等。一個與細胞分化相關(guān)的基因的表達改變可能導(dǎo)致嚴重的疾病。GATA1可作為典型的例子。GATA1基因于1989年被鑒別(Evans T and Felsenfold G，Cell，58877-885，1989)，隨后證明了其對紅細胞分化和巨核細胞分化具有重要作用。近幾年發(fā)現(xiàn)GATA1表達異常與多種人類疾病相關(guān)，如紅細胞生成不良性貧血、血小板減少癥、Down綜合癥的急性巨核細胞性白血病(Del Vecchio GC et al.，ActaHaematol.114113-116，2005；CantorAB，Int J Hematol.，81378-384，2005)。HZF1與GATA1僅在兩個鋅指模體區(qū)(約50個氨基酸)有序列同源性，但在其他區(qū)域(占蛋白92.5％區(qū)域)氨基酸順序差異很大。HZF1也在紅系和巨核系的分化中起著重要的作用，影響HZF1功能和表達的因素也可能導(dǎo)致與紅系分化和巨核細胞分化相關(guān)疾病。
與HZF1表達及紅系分化和巨核細胞分化相關(guān)疾病的確定和診斷是非常重要的。在我們研究HZF1功能的過程中，建立了特異檢測HZF1mRNA的方法。在知道了基因cDNA順序之后，利用Northen blot方法和RT-PCR方法檢測mRNA表達水平的方法是公知的，但不是可以輕而易舉地獲得對任何mRNA的特異性檢測。以前的研究已經(jīng)鑒別了多個C2H2型鋅指蛋白基因，近來從對基因組順序的分析預(yù)測人類基因組包含700多個編碼C2H2型鋅指蛋白的基因(Lander，ES，et al，Nature 409860-921，2001)。由于這些基因順序的高度同源性，獲得對于某一mRNA的特異檢測有一定難度。我們選擇HZF1基因外顯子2和3中編碼非鋅指區(qū)的DNA順序特異為探針，獲得了對于HZF1mRNA的高特異性雜交結(jié)果。使用HZF1基因外顯子2和3中編碼非鋅指區(qū)DNA順序內(nèi)并靠近兩端的順序設(shè)計引物，獲得了對于HZF1mRNA的高特異性擴增。這些為發(fā)展通過檢測HZF1mRNA表達水平診斷與HZF1表達及紅系分化和巨核細胞分化相關(guān)疾病奠定了很好基礎(chǔ)。
HZF1在紅系和巨核系分化中重要作用的揭示，使HZF1基因有可能成為控制和治療相關(guān)疾病的靶基因。這使得針對通過控制HZF1基因表達戰(zhàn)略，發(fā)展治療與HZF1功能及紅系分化和巨核細胞分化相關(guān)的疾病成為可能。
本發(fā)明已證明HZF1在造血組織以外的許多組織表達，因此HZF1可能在其他組織細胞的分化發(fā)育中具有重要作用。這也可能導(dǎo)致發(fā)展通過通過檢測HZF1mRNA表達水平診斷和通過控制HZF1基因表達治療與HZF1功能相關(guān)的其他疾病的方法。
附表(SEQUENCE LISTING)說明附表列出了HZF1cDNA的核苷酸順序。表中第224-226核苷酸ATG為翻譯起始密碼子，第2234-2236核苷酸TAG為翻譯終止密碼子。


圖1顯示了推斷的HZF1基因的外顯子(exon)和內(nèi)含子(intron)結(jié)構(gòu)位置。
圖2(A)說明了HZF1基因編碼蛋白的氨基酸順序。下面劃線部分顯示了C2H2型鋅指結(jié)構(gòu)區(qū)。陰影方框標示了為鋅離子配位的半胱氨酸(C)、組氨酸(H)和精氨酸(R)殘基；圖2(B)示意蛋白的結(jié)構(gòu)域。從49至108位氨基酸為酸性區(qū)，可能是一個具有激活功能的結(jié)構(gòu)域。HZF1蛋白的結(jié)構(gòu)特征說明其可能作為DNA結(jié)合蛋白調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄。
圖3顯示了HZF1mRNA在多種人組織(A)及造血細胞系中(B)的表達，說明HZF1可能在這些組織和細胞中行使功能。同時說明一個800bp相應(yīng)于HZF1基因外顯子3和4中非鋅指編碼區(qū)的cDNA片段可被用作Northern雜交的探針，特異檢測HZF1mRNA表達。如果對雜交帶進行掃描，可進行HZF1mRNA表達的半定量分析。
圖4顯示人造血細胞系中HZF1mRNA的RT-PCR擴增，說明獲得了HZF1cDNA特異的RT-PCR擴增。如果對雜交帶進行掃描，可進行組織和細胞內(nèi)HZF1mRNA表達的半定量分析。
圖5說明了HZF1mRNA在處于紅系和巨核系共同前體階段停止分化的紅白血病細胞系K562中低表達，但隨著Hemin誘導(dǎo)的紅系分化(A)和PMA誘導(dǎo)的巨核細胞分化而表達增加(C)，提示HZF1在紅系分化和巨核細胞分化中起作用。同時說明這個800bp的cDNA片段可被用作Northern雜交的探針，特異檢測HZF1mRNA表達。圖5(B)顯示在對雜交帶進行掃描并用actin雜交帶校正后可進行組織和細胞內(nèi)HZF1mRNA表達的半定量分析。
圖6說明了利用細胞轉(zhuǎn)染和報告基因技術(shù)證明HZF1蛋白定位于細胞核。(A)NIH3T3細胞用轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-HZF1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，融合蛋白定位于細胞核；(B)NIH3T3細胞用pEGFP-N1質(zhì)粒(對照)轉(zhuǎn)染，熒光蛋白呈現(xiàn)全細胞分布。因為真核基因轉(zhuǎn)錄在細胞核進行，這從一個方面說明HZF1可能作為一個轉(zhuǎn)錄因子在基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用。
圖7顯示通過用特異擴增HZF1mRNA反義鏈的PCR方法證明獲得了表達HZF1反義RNA的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子K562cDNA3.1antiHZF1。作為對照的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子K562cDNA3.1不表達HZF1反義RNA。
圖8顯示了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子K562cDNA3.1antiHZF1細胞(實心方框所示)用hemin誘導(dǎo)后，聯(lián)苯氨染色正性細胞不增加，說明HZF1mRNA的反義阻遏嚴重抑制了K562細胞hemin誘導(dǎo)的紅系分化。而對照穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子K562cDNA3.1細胞(空心方框所示)隨hemin誘導(dǎo)時間的增加，聯(lián)苯氨染色正性細胞增加，保持hemin誘導(dǎo)的紅系分化能力。
圖9顯示了用RT-PCR分析方法證明了，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子K562cDNA3.1antiHZF1細胞用hemin誘導(dǎo)后，作為紅系分化標志的γ-珠蛋白mRNA的表達，明顯低于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子K562cDNA3.1細胞用hemin誘導(dǎo)后的表達，說明HZF1mRNA的反義阻遏嚴重抑制了K562細胞hemin誘導(dǎo)的紅系分化。圖中，對于γ-globin的檢測，從左向右分別代表進行了13、15和17個循環(huán)的PCR反應(yīng)，對于β-actin的檢測，從左向右分別代表進行了20、23和26個循環(huán)的PCR反應(yīng)。
圖10顯示了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子K562antiHZF1細胞用PMA誘導(dǎo)后，作為巨核細胞分化標志的4倍體細胞的增加，明顯低于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子K562cDNA3.1細胞用PMA誘導(dǎo)后4倍體細胞的增加，說明HZF1mRNA的反義阻遏明顯減弱了K562細胞PMA誘導(dǎo)的巨核細胞分化。圖中左側(cè)峰代表2倍體細胞，右側(cè)峰代表4倍體細胞。
圖11顯示用HZF1抗體的Western blot檢測說明獲得的K562pAVu6HZF1i穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子用hemin(A)或PMA(B)誘導(dǎo)48h后，檢測不到HZF1蛋白，而對照穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子K562cDNA3.1細胞用hemin或PMA誘導(dǎo)48h后，檢測到HZF1蛋白表達。這些說明K562pAVu6HZF1i穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子成功表達了HZF1特異干擾RNA(siRNA)，有效地抑制了HZF1蛋白的表達。
圖12顯示穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子K562pAVu6HZF1i細胞用hemin誘導(dǎo)后(實心方框所示)，聯(lián)苯氨染色正性細胞不增加，說明HZF1mRNA被siRNA干擾的翻譯阻遏嚴重抑制了K562細胞hemin誘導(dǎo)的紅系分化。而對照穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子K562cDNA3.1細胞(空心方框所示)隨hemin誘導(dǎo)時間的增加，聯(lián)苯氨染色正性細胞增加，保持hemin誘導(dǎo)的紅系分化能力。
圖13顯示穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子K562pAVu6HZF1i細胞用hemin誘導(dǎo)后，作為紅系分化標志的γ-珠蛋白mRNA的表達，明顯低于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子K562pAVu6細胞用hemin誘導(dǎo)后的表達，說明HZF1mRNA被siRNA干擾的翻譯阻遏嚴重抑制了K562細胞hemin誘導(dǎo)的紅系分化。圖中，對于γ-globin的檢測，從左向右分別代表進行了13、15和17個循環(huán)的PCR反應(yīng)，對于β-actin的檢測，從左向右分別代表進行了20、23和26個循環(huán)的PCR反應(yīng)。
圖14顯示穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子K562pAVu6HZF1i細胞用PMA誘導(dǎo)后，作為巨核細胞分化標志的4倍體細胞的增加，明顯低于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子K562pAVu6細胞用PMA誘導(dǎo)后4倍體細胞的增加，說明HZF1mRNA被siRNA干擾的翻譯阻遏明顯減弱了K562細胞PMA誘導(dǎo)的巨核細胞分化。圖中左側(cè)峰代表2倍體細胞，右側(cè)峰代表4倍體細胞。
實施例以下是實施例中具體實驗方法的相關(guān)說明1 細胞培養(yǎng)及誘導(dǎo)實驗中所用的細胞均培養(yǎng)于1640中，每100ml 1640完全培養(yǎng)液中加入10ml胎牛血清(FBS)，100U青霉素，100μg鏈霉素。培養(yǎng)條件為37℃，5％CO2及飽和濕度。在一些實驗中，K562細胞用40μmol/L hemin或5ng/mL PMA，誘導(dǎo)48h。
2 細胞轉(zhuǎn)染處于對數(shù)生長期的細胞用與脂質(zhì)體混合的DNA脂在24孔板中轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后48h開始用G418篩選。篩選大約兩到三周后，挑出克隆，轉(zhuǎn)到24孔板繼續(xù)用含G418的培養(yǎng)基培養(yǎng)。待細胞長到一定數(shù)量后再擴大體積培養(yǎng)。
3 Northern雜交應(yīng)用TRIZOL Reagent試劑盒(GiBcoBRL，USA)分別提取誘導(dǎo)和非誘導(dǎo)細胞的總RNA，進行1.5％的甲醛凝膠電泳，然后轉(zhuǎn)移到尼龍膜上。用隨機引物法標記DNA探針。雜交過夜，然后放射自顯影。
4 RT-PCR根據(jù)引物的不同采取相應(yīng)的循環(huán)條件。擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳。
對于Northern雜交HZF1 mRNA的探針模板擴增以及分析細胞中HZF1 mRNA表達的RT-PCR擴增94℃，5min；94℃，5min/56℃，30s/72℃，1min，33個循環(huán)；72℃，10min。
對于檢測antiHZF1mRNA在細胞中的表達94℃，5min；94℃，5min/55℃，30s/72℃，1min，33個循環(huán)；72℃，10min。
對于檢測γ-globin mRNA在細胞中的表達94℃，5min；94℃，5min/57℃，30s/72℃，1s，33個循環(huán)；72℃，10min。
對于檢測β-actin mRNA在細胞中的表達94℃，5min；94℃，5min/56℃，30s/72℃，45s，33個循環(huán)；72℃，10min。
5 細胞的聯(lián)苯胺染色染色液的配置(現(xiàn)配現(xiàn)用)在50μl(50μg/ml)聯(lián)苯胺中加入1μl過氧化氫混勻即為染色液。取少量細胞，離心收集，用PBS洗一遍后，重懸在100μlPBS中，取81μl上述細胞懸液加入9μl染色液混勻后，放置3-5min，然后取部分細胞涂片觀察，計數(shù)。一般計200個細胞，算出其中的陽性細胞百分比。
6 FACS(fluorescence activating cell sorting)測定細胞多倍性收集細胞后，用PBS洗兩遍，過400目網(wǎng)使細胞成單個細胞，計數(shù)。用500μlPBS重懸細胞。逐滴加入5ml預(yù)冷的無水乙醇，邊加邊震蕩，以防細胞成團快，置4℃固定過夜。取上述固定好的細胞(5×106)，于15ml離心管中，1000rpm離心，去乙醇。用PBS重懸細胞，加入1％BSA或小牛血清，1000rpm離心，去上清，重復(fù)一遍。沉淀用適量含1％BSA或小牛血清的PBS重懸。加入100μl 10XPI溶液(500μg/ml PI，溶于3.8×10-2M枸櫞酸鈉，pH7.0)。加入100μl RNaseA(10mg/ml)，37℃溫育30min。用PBS漂洗細胞。用流式細胞儀檢測。
實施例1HZF1基因及三個轉(zhuǎn)錄物的鑒別我們通過篩選人骨髓cDNA文庫，發(fā)現(xiàn)了一個新的鋅指蛋白全長cDNA(HZF1)，于2000年3月9日注冊(注冊號AF244088)。之后，相似的序列被Blum.H et al.、StrausbergRL et al.、Ota T et al.和Thiesen HJ等人注冊，注冊號分別是AL834451.1、BC010996.2、AK127625.1和NM_006958.2。NM_006958.2具有較長的5′順序。最近，利用PCR擴增、克隆和測序，除鑒別到已有的兩種轉(zhuǎn)錄物外，我們又發(fā)現(xiàn)了比NM_006958.2多了86bp的轉(zhuǎn)錄物(比AF244088在5’端多了178bp)的轉(zhuǎn)錄物(注冊號為DQ117529，見附表)。
將三個轉(zhuǎn)錄物在GenBank中進行同源性比較，確定HZF1基因有4個外顯子和3個內(nèi)含子(圖1)。HZF1基因至少有3個轉(zhuǎn)錄物，分別是由全部4個外顯子組成的DQ117529，包含1、3和4號外顯子的NM_006958.2以及僅包含3和4號外顯子的AF244088。外顯子1和2不編碼氨基酸。盡管有3個轉(zhuǎn)錄物，它們編碼的氨基酸順序是相同的。外顯子1和2不編碼氨基酸。
實施例2HZF1蛋白結(jié)構(gòu)分析通過DNAMAN分析發(fā)現(xiàn)了一個最長的開放閱讀框(ORF)，推測出了HZF1 mRNA所編碼的670個氨基酸殘基的蛋白序列(圖2A)。在HZF1蛋白的C末端有17個連續(xù)的鋅指模體，其中有2個不典型的C2RH鋅指模體和15個典型的C2H2鋅指模體，每兩個鋅指模體之間有保守的TGEKPYE序列連接。在HZF1蛋白的N末端存在一個酸性區(qū)(從49到108位氨基酸殘基)(圖2B)，此區(qū)包含有32％谷氨酸和天門冬氨酸，使這個酸性區(qū)帶-14的電荷并且等電點為4.1。
由于鋅指結(jié)構(gòu)是一類常見的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白的DNA結(jié)合模體，并且已鑒別的具有調(diào)節(jié)功能的鋅指蛋白的酸性結(jié)構(gòu)域常顯示調(diào)節(jié)功能，因此推測HZF1也可能作為DNA結(jié)合蛋白調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄。
實施例3HZF1mRNA的表達譜為了獲得HZF1的功能線索，使用Clontech公司的多組織雜交膜(MTN)對HZF1 mRNA在人的不同組織中的表達情況進行了檢測。我們使用α-32P標記的HZF1cDNA5’端的一個799bp的DNA片段為探針，對MTN膜進行Northern blot雜交，在各個組織中均發(fā)現(xiàn)一個大約2500nt的雜交帶(圖3A)。發(fā)現(xiàn)HZF1 mRNA在人腦、心臟、骨骼肌、腎、肝、胎盤和胎肝中高表達，在脾、小腸和骨髓中中等程度的表達而在大腸、胸腺、肺和外周血白細胞中低表達。
使用從多種人造血細胞系中的提取的總RNA進行HZF1表達譜分析，發(fā)現(xiàn)在巨核細胞系CMK和B細胞系3D5細胞中HZF1的mRNA高表達，在紅系細胞系HEL和T細胞系Jurkat細胞中中等程度表達，在紅系細胞系K562和單核細胞系U937細胞中微量表達而在髓系HL60細胞中幾乎檢測不到HZF1的表達(圖3B)。
使用從多種人造血細胞系中的提取的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，使用HZF1基因外顯子2和3中編碼非鋅指區(qū)DNA順序內(nèi)并靠近兩端的順序設(shè)計引物，獲得了對于HZF1mRNA的高特異性擴增用特異擴增(圖4)。
實施例4K562細胞誘導(dǎo)分化過程中HZF1mRNA的表達分析我們實驗了HZF1在K562細胞hemin誘導(dǎo)的紅系分化過程中的表達(圖5A)，發(fā)現(xiàn)HZF1mRNA的表達隨著hemin誘導(dǎo)而增加。對雜交顯影帶掃描，可獲得相對的定量表達量(圖5B)。
我們也分析了HZF1在K562細胞PMA誘導(dǎo)的巨核細胞分化過程中的表達，發(fā)現(xiàn)HZF1mRNA的表達隨著PMA誘導(dǎo)逐步增加(圖5C)。
實施例5HZF1蛋白的亞細胞定位為了分析HZF1在真核細胞中的表達定位，我們將HZF1完整表達框插入到pEGFP-N1質(zhì)粒中，構(gòu)建真核表達載體pEGFP-N1-HZF1。將pEGFP-N1-HZF1和pEGFP-N1質(zhì)粒分別瞬時轉(zhuǎn)染NIH3T3細胞，48h在熒光顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)HZF1融合蛋白主要分布在細胞核中，而對照蛋白分布在全細胞(圖6)。這與從蛋白結(jié)構(gòu)推斷HZF1可能作為一個轉(zhuǎn)錄因子在基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用相一致(因為真核基因轉(zhuǎn)錄過程發(fā)生在細胞核)。
實施例6HZF1的反義核酸表達抑制了K562細胞的紅系分化和巨核分化6.1.表達HZF1反義RNA的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子的獲得為了分析K562細胞中HZF1內(nèi)源表達被反義RNA抑制情況下對K562細胞分化的影響，我們把HZF1cDNA5’端非鋅指區(qū)的一段486bp序列(相應(yīng)于附表中從221到706核苷酸)反向插入到真核表達載體pcDNA3.1中，構(gòu)建了表達質(zhì)粒pcDNA3.1antiHZF1。使用純化的pcDNA3.1antiHZF1和pcDNA3.1質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染K562細胞，48h后用500μg/ml G418篩選穩(wěn)定克隆。收集到4個轉(zhuǎn)染了pcDNA3.1antiHZF1質(zhì)粒的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子庫(pcDNA3.1antiHZF1-1～4)以及3個轉(zhuǎn)染了K562pcDNA3.1的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子庫(K562pcDNA3.1-1～3)。
從細胞中提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。使用載體上的T7引物(TAATACGACTCACTATAGGG)作為上游引物和HZF1cDNA上5’末端一段序列(AGATGGAGCTCTCAGTTCC)作為下游引物，PCR檢測克隆中的外源HZF1表達。在K562pcDNA3.1antiHZF1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子中檢測到了含有T7引物序列的外源antiHZF1RNA，而在K562pcDNA3.1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子中沒有檢測到含有T7引物序列的外源antiHZF1RNA。這說明篩選到預(yù)期的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子。(圖7)6.2.K562pcDNA3.1antiHZF1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子hemin誘導(dǎo)的紅系分化被抑制將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子細胞在40μM hemin誘導(dǎo)下培養(yǎng)，每隔12h使用聯(lián)苯氨染色分析紅系分化情況。K562 pcDNA3.1antiHZF1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子細胞在hemin的誘導(dǎo)下聯(lián)苯氨陽性細胞比例沒有顯著的增加，而K562pcDNA3.1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子細胞在hemin的誘導(dǎo)下聯(lián)苯氨陽性的細胞比例逐步增加。這說明K562pcDNA3.1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子細胞hemin誘導(dǎo)的紅系分化特性沒有改變，而K562pcDNA3.1antiHZF1克隆的細胞hemin誘導(dǎo)的紅系分化被抑制。(圖8)我們還用半定量RT-PCR方法檢測了在hemin誘導(dǎo)下轉(zhuǎn)染子細胞中γ-珠蛋白mRNA的表達。結(jié)果顯示，γ-珠蛋白mRNA的表達在K562pcDNA3.1轉(zhuǎn)染子中明顯高于K562pcDNA3.1antiHZF1轉(zhuǎn)染子中，也說明K562pcDNA3.1antiHZF1轉(zhuǎn)染子細胞中hemin誘導(dǎo)的紅系分化被抑制。(圖9)上述兩種分析方法均證明，內(nèi)源HZF1mRNA的反義阻遏嚴重抑制了K562細胞hemin誘導(dǎo)的紅系分化。
6.3.K562pcDNA3.1antiHZF1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子PMA誘導(dǎo)的巨核細胞分化被抑制將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子細胞用5ng/ml PMA誘導(dǎo)48h后進行PI染色，然后用流式細胞儀分析細胞的多倍性(Ploidy)。發(fā)現(xiàn)K562pcDNA3.1antiHZF1和K562pcDNA3.1轉(zhuǎn)染子在沒有PMA誘導(dǎo)的情況下二倍體細胞遠多于四倍體細胞。PMA誘導(dǎo)的情況下K562pcDNA3.1克隆的四倍體細胞大幅增加，超過了二倍體細胞。然而PMA誘導(dǎo)的K562pcDNA3.1antiHZF1克隆的四倍體細胞比例雖然增加，但是二倍體仍然多于四倍體(圖10)。這說明反義核酸對HZF1的內(nèi)源表達的抑制明顯減弱了PMA誘導(dǎo)的K562細胞向巨核細胞分化。
實施例7HZF1特異的RNA干擾抑制了K562細胞的紅系分化和巨核分化7.1.表達HZF1特異干擾RNA的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子的獲得為了進一步分析抑制K562細胞中HZF1內(nèi)源表達對K562細胞分化的影響，根據(jù)HZF1cDNA 5’端非鋅指區(qū)的一段序列設(shè)計siRNA(AATGTCGACCTTCACAAGGAAGACATTCACCTCTGAATGTCTTCCTTGTGAAGTTTTTCTAGAATA)，插入到真核表達載體pAVu6中，構(gòu)建針對HZF1的RNA干擾質(zhì)粒pAVu6-HZF1。大量提取純化pAVu6HZF1i質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染K562細胞，48h后用500μg/ml G418篩選，得到4個穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子庫(K562pAVu6HZF1i-1～4)。同時用pAVu6轉(zhuǎn)染K562細胞，獲取4個穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子庫(K562pAVu6-1～4)作為對照。
從穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子細胞提取蛋白，用BCA法定量。用Westem blot鑒定細胞中的HZF1蛋白，在兩種細胞中均未見HZF1條帶。由于K562細胞中HZF1 mRNA表達很低，因此可能是由于在沒有誘導(dǎo)的K562細胞中HZF1蛋白極少，無法通過western blot檢測。我們把K562pAVu6-HZF1i和K562pAVu6轉(zhuǎn)染子細胞分別用hemin和PMA誘導(dǎo)，結(jié)果顯示K562pAVu6轉(zhuǎn)染子細胞在hemin或PMA誘導(dǎo)下都檢測到HZF1蛋白的表達，而在K562pAVu6HZF1i轉(zhuǎn)染子細胞中均沒有檢測到HZF1蛋白的表達，這說明pAVu6HZF1質(zhì)粒成功的表達了siRNA，有效地抑制了HZF1蛋白的表達。(圖11)7.2.K562pAVu6HZF1i穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子hemin誘導(dǎo)的紅系分化被抑制將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子細胞在40μM hemin誘導(dǎo)下培養(yǎng)，每隔12h使用聯(lián)苯氨染色分析紅系分化情況。K562pAVu6-HZF1i穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子細胞在hemin的誘導(dǎo)下聯(lián)苯氨陽性細胞比例沒有顯著的增加，而K562pAVu6穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子細胞在hemin的誘導(dǎo)下聯(lián)苯氨陽性的細胞比例逐步增加。這說明K562pAVu6穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子細胞hemin誘導(dǎo)的紅系分化特性沒有改變，而K562pAVu6HZF1i克隆的細胞hemin誘導(dǎo)的紅系分化被抑制。(圖12)也用半定量RT-PCR的方法檢測在hemin誘導(dǎo)情況下轉(zhuǎn)染子細胞中γ-珠蛋白mRNA的表達。結(jié)果顯示，γ-珠蛋白mRNA的表達在K562pAVu6轉(zhuǎn)染子中明顯高于K562pAVu6-HZF1i轉(zhuǎn)染子中。這也說明了在K562pAVu6-HZF1i轉(zhuǎn)染子中hemin誘導(dǎo)的紅系分化被抑制。(圖13)兩種分析方法均證明，內(nèi)源HZF1mRNA被RNA干擾的阻遏嚴重抑制了K562細胞hemin誘導(dǎo)的紅系分化。
7.3.K562pAVu6HZF1i穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子PMA誘導(dǎo)的巨核細胞分化被抑制將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子細胞用5ng/ml PMA誘導(dǎo)48h后進行PI染色，然后用流式細胞儀分析細胞的多倍性(Ploidy)。發(fā)現(xiàn)K562pAVu6HZF1i和K562pAVu6轉(zhuǎn)染子在沒有PMA誘導(dǎo)的情況下二倍體細胞遠多于四倍體細胞。PMA誘導(dǎo)的情況下K562pAVu6轉(zhuǎn)染子的四倍體細胞大幅增加，超過了二倍體細胞。然而PMA誘導(dǎo)的K562pAVu6HZF1i轉(zhuǎn)染子的四倍體細胞比例雖然增加，但是二倍體仍然多于四倍體(圖14)。這說明RNA干擾對HZF1的內(nèi)源表達的抑制阻礙了K562細胞PMA誘導(dǎo)的巨核系分化。
SEQUENCE LISTING<110>中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所<120>鋅指蛋白HZF1基因的功能及其應(yīng)用<140>200510109116X<141>2005-10-18<160>1<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>2632<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<300>
<308>GenBank/DQ117529<309>2005-07-26<313>(1)..(2632)<400>1aattcggggc gggacttccg ggggtcagcc ggcgttggct gagacgtctt cgtgccacgg60tgctgcctcc tttccaagcg cgacccgttg agatcccctt gaccacaccc tcattctcag120ctggtgctca tgaaggacag aagagtcaat gtcagtacaa tgtgagtgaa gggctgaggt180ccttgtcatg cccagcctca gaactcgccg tgaggaggca gagatggagc tctcagttcc240aggaccatcc ccctggaccc ctgcagccca ggcccgtgtg agagatgctc ctgctgtgac300ccaccctgga tctgcagcct gtggtacccc ctgctgtagt gatactgagc tggaagccat360ctgccctcac tatcagcagc cagattgtga caccaggact gaagacaagg agtttcttca420caaggaagac attcatgaag atttggaatc acaggcagaa atatcagaaa actatgctgg480tgatgtttcc caggtacccg agcttggaga tctgtgtgat gatgtatcag aaagagactg540gggagtcccc gaaggcagga ggctgccaca gtccctctcc caggaggggg acttcacacc600agctgccatg gggctcctta ggggcccctt aggggagaaa gatctggact gtaatggttt660tgacagtcgc ttcagtctga gcccaaacct gatggcatgt caggaaatcc ctacagaaga720gaggccacat ccatatgaca tgggtggcca gagtttccag cacagtgtgg acctaactgg780tcatgagggg gttcccacag ctgaaagtcc actcatatgt aatgagtgtg ggaaaacctt840ccaaggaaat cctgacctta ttcagcgtca aatagtccac actggggagg cttcctttat900gtgtgatgat tgtgggaaaa ccttcagcca gaactcagtt cttaaaaacc gtcatcgatc960tcatatgagt gagaaagctt accagtgcag cgaatgtggg aaagccttcc gagggcactc1020agacttttct aggcatcaga gtcaccacag cagtgagagg ccttatatgt gtaatgaatg1080tggaaaagcc ttcagccaga actcgagcct taaaaagcac caaaagtctc acatgagtga1140gaagccctat gaatgcaatg aatgtgggaa ggcttttagg cggagctcaa acctcatcca1200acatcaaaga atccattctg gggagaaacc gtatgtgtgc agtgagtgtg ggaaggcctt1260
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1.鋅指蛋白HZF1基因，序列如SEQ ID NO1所示，在篩選治療與HZF1相關(guān)紅系細胞分化異常疾病有關(guān)的藥物中的應(yīng)用。
2.鋅指蛋白HZF1基因，序列如SEQ ID NO1所示，在篩選治療與HZF1相關(guān)巨核細胞分化異常疾病有關(guān)的藥物中的應(yīng)用。
3.鋅指蛋白HZF1基因，序列如SEQ ID NO1所示，在制備治療與HZF1相關(guān)紅系細胞分化異常疾病有關(guān)的藥物中的應(yīng)用。
4.鋅指蛋白HZF1基因，序列如SEQ ID NO1所示，在制備治療與HZF1相關(guān)巨核細胞分化異常疾病有關(guān)的藥物中的應(yīng)用。
5.權(quán)利要求1-4中的藥物，包括能夠控制HZF1表達而達到HZF1相關(guān)疾病治療目的的化學(xué)合成和從天然物質(zhì)中提取的藥物。
6.權(quán)利要求1-4中的藥物，也包括利用其反義核酸制備治療與HZF1相關(guān)疾病藥物中的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求1-4中的藥物，也包括利用能特異表達干擾RNA的核酸順序制備治療與HZF1相關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用。
8.鋅指蛋白HZF1基因，序列如SEQ ID NO1所示，在發(fā)展診斷試劑中的應(yīng)用，所述的診斷試劑應(yīng)用于診斷HZF1相關(guān)紅系細胞分化異常疾病和巨核細胞分化異常疾病。
9.如權(quán)利要求8中所述的應(yīng)用，其中所述的診斷是指通過檢測HZF1mRNA水平的疾病診斷，包括使用能獲得HZF1mRNA特異檢測的cDNA片段為探針進行Northern blot雜交檢測方法以及能獲得HZF1cDNA特異擴增的RT-PCR方法。
全文摘要
本發(fā)明涉及一個編碼蛋白基因的功能及其應(yīng)用，更具體地，本發(fā)明涉及一個鋅指蛋白HZF1基因的功能及其在診斷或治療與HZF1功能相關(guān)的紅系分化和巨核細胞分化相關(guān)的腫瘤、貧血和細胞減少癥中的應(yīng)用。
文檔編號A61P7/06GK1951504SQ20051010911
公開日2007年4月25日 申請日期2005年10月18日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月18日
發(fā)明者張俊武, 彭瀚, 杜占文 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所