專利名稱：p53四聚化結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)的四價(jià)單鏈抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程抗體領(lǐng)域，更具體地，涉及一種p53四聚化結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)的四價(jià)單鏈抗體，特別是基因工程抗人TNF-α四價(jià)單鏈抗體；這種抗體的構(gòu)建、表達(dá)、純化和復(fù)性方法；含有該抗體編碼序列的載體和含有該載體的宿主細(xì)胞。
背景技術(shù)：
腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)是上世紀(jì)70年代中葉發(fā)現(xiàn)的一個(gè)細(xì)胞因子，最初發(fā)現(xiàn)它能引起某些腫瘤組織的出血性壞死，現(xiàn)在研究表明其除了具有抗腫瘤作用外，還在機(jī)體的免疫，炎癥和病理反應(yīng)中起著非常重要的作用(參考文獻(xiàn)1-2)。TNF-α的拮抗劑包括中和性抗體被認(rèn)為是多種急慢性炎癥疾病，如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬、局限性回腸炎和急性內(nèi)毒素休克等(參考文獻(xiàn)3-5)的有效治療劑。早在1988年，人們?cè)趯?duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)滑膜組織細(xì)胞的體外培養(yǎng)物的研究中發(fā)現(xiàn)，在無(wú)外界刺激劑存在時(shí)，前炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生仍然可持續(xù)幾天，提示在該培養(yǎng)體系中有內(nèi)源性刺激信號(hào)調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的產(chǎn)生(參考文獻(xiàn)6)，隨后在該培養(yǎng)體系中加入TNF-α的抗體，其它幾種前炎性細(xì)胞因子如IL-1、IL-6、IL-8和GM-CSF的產(chǎn)生都受到明顯的抑制(參考文獻(xiàn)6-11)。上述事實(shí)表明TNF-α是在類風(fēng)濕炎癥反應(yīng)中具有支配作用的前炎性細(xì)胞因子。因此，推測(cè)TNF-α抗體在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療中具有潛在的臨床應(yīng)用前景。隨后進(jìn)行的用抗TNF-α的單克隆抗體治療膠原誘導(dǎo)的小鼠關(guān)節(jié)炎模型驗(yàn)證了上述假說(shuō)，即抗TNF-α的單克隆抗體可明顯的改善小鼠關(guān)節(jié)炎的臨床癥狀并緩解關(guān)節(jié)的破壞(參考文獻(xiàn)12-14)。TNF-α被證實(shí)為RA的有效治療靶點(diǎn)后，大量靶向TNF-α的生物治療劑相繼被開發(fā)出來(lái)或正處于不同的研發(fā)階段，其中有三種得到美國(guó)FDA的批準(zhǔn)，etanercept，一種可溶性的TNF-α受體(參考文獻(xiàn)16)；infliximab，一種人-鼠嵌合抗TNF-α單克隆抗體(參考文獻(xiàn)15)以及adalimumab，一種抗TNF-α人源單克隆抗體(參考文獻(xiàn)17)，這三種上市的生物治療劑在臨床上對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎都取到了極其有效的治療作用，并對(duì)其它由免疫反應(yīng)造成的急慢性炎癥性疾病如牛皮癬、局限性回腸炎、僵直性脊椎炎、急性眼葡萄膜炎、急性膿毒血癥和腦脊髓膜炎等也顯示出了良好的治療前景(參考文獻(xiàn)18-21)。另外還有一些小分子的TNF-α的拮抗劑如PEG-sTNFR1、sLTr、CDP-571、CDP-870、MAK-195F和rTBP-1正處在開發(fā)階段和不同期的臨床試驗(yàn)階段。
20世紀(jì)80年代后，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展和抗體基因結(jié)構(gòu)的闡明，出現(xiàn)了第三代抗體-基因工程抗體，如ScFv及單域抗體等，這些抗體由于分子量小、穿透性強(qiáng)、易于構(gòu)建并可在大腸桿菌等原核系統(tǒng)中表達(dá)而降低生產(chǎn)成本，還可以進(jìn)一步進(jìn)行基因工程改造形成多價(jià)抗體以提高親和力和體內(nèi)的半壽期，而顯示出了很好的應(yīng)用前景(參考文獻(xiàn)22，23)。
人類p53基因產(chǎn)物是一個(gè)磷酸化蛋白，其主要功能是對(duì)細(xì)胞周期起負(fù)調(diào)控作用，抑制細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化。野生型的p53蛋白是以四聚體的形式發(fā)揮生理功能的，每個(gè)單體由393個(gè)氨基酸殘基組成，具有四個(gè)重要的結(jié)構(gòu)域，其中第20-40位的氨基酸殘基具有類似于轉(zhuǎn)錄因子的酸性活化區(qū)即反式激活域；第90-286位的氨基酸殘基為特異的DNA結(jié)合域；第319-360位的氨基酸殘基為四聚化結(jié)構(gòu)域，C-末端的第363-386位的氨基酸殘基構(gòu)成了p53蛋白的堿性區(qū)，對(duì)p53與特異的DNA結(jié)合起負(fù)調(diào)控作用。研究表明第319-360位的四聚化結(jié)構(gòu)域氨基酸殘基的可形成一段α-螺旋和一段β-折疊，兩個(gè)單體上的同一結(jié)構(gòu)分別以反向平行的方式結(jié)合在一起，形成二聚體，然后，兩個(gè)二聚體再以反向平行的方式形成四聚體(參考文獻(xiàn)24-26)。P53蛋白的這一特殊的結(jié)構(gòu)域?yàn)闃?gòu)建基因工程四價(jià)抗體提供了可能。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明將P53蛋白的四聚化結(jié)構(gòu)域引入基因工程抗體的構(gòu)建，通過(guò)它來(lái)介導(dǎo)單鏈抗體自我裝配成四聚體以增加單鏈抗體對(duì)抗原的親和力并延長(zhǎng)體內(nèi)的半壽期，構(gòu)建成抗TNF-α的四價(jià)單鏈抗體的原核表達(dá)質(zhì)粒，通過(guò)大腸桿菌的高效表達(dá)、目的蛋白的分離和純化及體外活性分析，表明構(gòu)建的四價(jià)抗體比單鏈抗體具有更高的親和力和中和TNF-α的能力，體內(nèi)活性表明，四價(jià)單鏈抗體能明顯的改善膠原誘導(dǎo)的大鼠關(guān)節(jié)炎臨床癥狀，抑制關(guān)節(jié)炎大鼠的自身免疫反應(yīng)，降低前炎性細(xì)胞因子TNF-α和IL-1β的表達(dá)量，顯示出了良好的臨床應(yīng)用前景。
因此在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種用于治療多種急慢性炎癥性疾病如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬、局限性回腸炎，急性內(nèi)毒素休克和急性膿毒血癥的基因工程四價(jià)單鏈抗體藥物。
本發(fā)明在另一個(gè)方面，提供了構(gòu)建該基因工程四價(jià)抗體的方法。
本發(fā)明所述的四價(jià)單鏈抗體TNF-TeAb包含的抗TNF-α鼠源單鏈抗體TNF-scFv的氨基酸序列(SEQ ID NO1)如下QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTHYGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTYTGEPTYADDFKEHFAFSLETSASTVFLQINNLKNEDTATYFCARERGDAMDYWGQGTSVTVSSTSGGGGSGGGGSGGGGSSRSIVMTQTPKFLLVSAGDRVTITCTASQSVSNDVVWYQQKPGQSPKMLMYSAFNRYTGVPDRFTGRGYGTDFTFTISSVQAEDLAVYFCQQDYNSPRTFGGGTKLEIK本發(fā)明所述的HSA連接肽的氨基酸序列(SEQ ID NO2)如下ALEVDETYVPKEFNAETFTFHADIEL本發(fā)明所述的四價(jià)單鏈抗體TNF-TeAb包含的P53四聚化結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列(SEQ ID NO3)如下KKKPLDGEYFTLQIRGRERFEMFRELNEALELKDAQAGKEPG本發(fā)明所述的四價(jià)單鏈抗體TNF-TeAb的核苷酸序列(SEQ ID NO4)如下1 CAGATCCAGCTGGTTCAGTCCGGTCCGGAACTGAAAAAACCGGGTGAAAC51CGTTAAAATCTCCTGCAAAGCTTCCGGTTACACCTTCACCCACTACGGTA101 TGAACTGGGTTAAACAGGCTCCGGGTAAAGGTCTGAAATGGATGGGTTGG151 ATCAACACCTACACCGGTGAACCGACCTACGCTGACGACTTCAAAGAACA201 CTTCGCTTTCTCCCTGGAAACCTCCGCTTCCACCGTTTTCCTGCAGATCA251 ACAACCTGAAAAACGAAGACACCGCTACCTACTTCTGCGCTCGTGAACGT
301 GGTGACGCTATGGACTACTGGGGTCAGGGTACCTCCGTTACCGTTTCCTC351 CACTAGTGGAGGCGGTGGGAGCGGCGGTGGTGGTTCTGGGGGTGGCGGAA401 GCTCTAGATCCATCGTTATGACCCAGACCCCGAAATTCCTGCTGGTTTCC451 GCTGGTGACCGTGTTACCATCACCTGCACCGCTTCCCAGTCCGTTTCCAA501 CGACGTTGTTTGGTACCAGCAGAAACCGGGTCAGTCCCCGAAAATGCTGA551 TGTACTCCGCTTTCAACCGTTACACCGGTGTTCCGGACCGTTTCACCGGT601 CGTGGTTACGGTACCGACTTCACCTTCACCATCTCCTCCGTTCAGGCTGA651 AGACCTGGCTGTTTACTTCTGCCAGCAGGACTACAACTCCCCGCGTACCT701 TCGGTGGTGGTACCAAACTGGAAATCAAAGAATTCGCGCTGGAAGTGGAT751 GAAACCTATGTGCCGAAAGAATTTAACGCGGAAACCTTTACCTTTCATGC801 GGATATTGAGCTCAAAAAAAAACCGCTGGATGGCGAATATTTTACCCTGC851 AGATTCGCGGCCGCGAACGCTTTGAAATGTTTCGCGAACTGAACGAAGCG901 CTGGAACTGAAAGATGCGCAGGCGGGCAAAGAACCGGGCGAACAGAAACT951 GATTAGCGAAGAAGATCTGAACGGATCCGTCGAGCACCACCACCACCACC1001 ACTGA本發(fā)明所述的四價(jià)單鏈抗體TNF-TeAb氨基酸序列(SEQ ID NO5)如下QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTHYGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTYTGEPTYADDFKEHFAFSLETSASTVFLQINNLKNEDTATYFCARERGDAMDYWGQGTSVTVSSTSGGGGSGGGGSGGGGSSRSIVMTQTPKFLLVSAGDRVTITCTASQSVSNDVVWYQQKPGQSPKMLMYSAFNRYTGVPDRFTGRGYGTDFTFTIS SVQAEDLAVYFCQQDYNSPRTFGGGTKLEIKEFALEVDETYVPKEFNAETFTFHADIELKKKPLDGEYFTLQIRGRERFEMFRELNEALELKDAQAGKEPGEQKLISEEDLNGSAEHHHHHH在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了一種用于表達(dá)該抗體的載體。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了一種含有上述表達(dá)載體的大腸桿菌宿主細(xì)胞。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了一種采用固定化金屬(Ni)離子親和層析純化該抗體的方法。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了一種通過(guò)緩慢透析逐漸除去變性劑復(fù)性該抗體的方法。
更具體地，本發(fā)明涉及一種四價(jià)的單鏈抗體，其特征在于由單鏈抗體與介導(dǎo)人類抑癌蛋白p53四聚體形成的結(jié)構(gòu)域(四聚化結(jié)構(gòu)域)構(gòu)成的融合蛋白在表達(dá)后自然聚合而成。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述的四價(jià)單鏈抗體，其特征在于由單鏈抗體、HSA連接肽和p53四聚化結(jié)構(gòu)域依次連接而成。
在本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案中，所述的四價(jià)單鏈抗體中所述的單鏈抗體是抗TNF-α抗體。
在本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案中，所述的四價(jià)單鏈抗體中所述抗TNF-α抗體可以是單鏈抗體片段，抗體Fab片段或單域抗體片段。
在本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案中，所述的四價(jià)單鏈抗體中所述的四價(jià)單鏈抗體的C-末端可帶有C-myc標(biāo)簽和組氨酸標(biāo)簽。
在本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案中，所述的四價(jià)單鏈抗體是由抗人TNF-α單鏈抗體，HSA連接肽和人類抑癌蛋白p53四聚化結(jié)構(gòu)域依次連接而成，所述的人TNF-α單鏈抗體具有SEQ ID NO1所示的氨基酸序列。
在本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案中，所述的四價(jià)單鏈抗體是由抗人TNF-α單鏈抗體，HSA連接肽和人類抑癌蛋白p53四聚化結(jié)構(gòu)域依次連接而成，所述的HSA連接肽具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
在本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案中，所述的四價(jià)單鏈抗體是由抗人TNF-α單鏈抗體，HSA連接肽和人類抑癌蛋白p53四聚化結(jié)構(gòu)域依次連接而成，所述介導(dǎo)人類抑癌蛋白p53四聚體形成的結(jié)構(gòu)域具有SEQ ID NO3所示的氨基酸序列。
在本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案中，所述的四價(jià)單鏈抗體是由抗人TNF-α單鏈抗體，HSA連接肽和人類抑癌蛋白p53四聚化結(jié)構(gòu)域依次連接而成的TNF-TeAb，具有SEQ ID NO5所示的氨基酸序列。
本發(fā)明還涉及DNA序列，其特征在于其編碼上述任何一種四價(jià)單鏈抗體。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述DNA序列具有SEQ ID NO4所示的核苷酸序列。
本發(fā)明還涉及一種表達(dá)載體，其特征在于含有上述DNA序列。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，表達(dá)載體是TNF-TeAb/pTTA。
本發(fā)明還涉及一種宿主細(xì)胞，其特征在于含有上述表達(dá)載體。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是大腸桿菌。在本發(fā)明的一個(gè)特別優(yōu)選實(shí)施方案中，所述大腸桿菌是含有上述表達(dá)載體的BL21(DE3)star大腸桿菌。
本發(fā)明還涉及一種構(gòu)建基因工程四價(jià)單鏈抗體的方法，其特征在于把單鏈抗體編碼序列和人p53蛋白四聚化結(jié)構(gòu)域的編碼序列進(jìn)行串聯(lián)表達(dá)。
本發(fā)明另外涉及一種復(fù)性上述任何一種的四價(jià)單鏈抗體的方法，其特征在于用硼酸鹽緩沖液為復(fù)性液，通過(guò)緩慢透析的方法逐漸去除變性劑尿素，使變性的的四價(jià)單鏈抗體重新折疊成有具有生物學(xué)活性的蛋白。
另外，本發(fā)明涉及一種用于治療或預(yù)防急慢性炎癥性疾病如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬、局限性回腸炎、僵直性脊椎炎、急性眼葡萄膜炎、急性膿毒血癥和腦脊髓膜炎的藥物組合物，其特征在于包含上述任何一種四價(jià)單鏈抗體和藥用載體。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及上述任何一種四價(jià)單鏈抗體在制備用于治療或預(yù)防急慢性炎癥性疾病如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬、局限性回腸炎、僵直性脊椎炎、急性眼葡萄膜炎、急性膿毒血癥和腦脊髓膜炎的藥物中的應(yīng)用。
發(fā)明詳述在本發(fā)明的上下文中，所使用的術(shù)語(yǔ)除非另外說(shuō)明，一般具有本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的含義。
本發(fā)明所構(gòu)建的基因工程四價(jià)單鏈抗體是采用基因工程重組的方法構(gòu)建的，是抗同一分子TNF-α的四個(gè)抗體分子形成的四聚體。具體地，本文所述的抗TNF-α四價(jià)單鏈抗體是指首先將抗TNF-α的抗體片段和p53蛋白四聚化結(jié)構(gòu)域通過(guò)HSA連接肽(HSA連接肽，來(lái)源于人血清白蛋白的一段小肽，序列如SEQ ID NO2所示)串聯(lián)在一起構(gòu)建成的抗TNF-α單體分子，然后通過(guò)四聚化結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)單體分子的同源四聚化而形成的四價(jià)抗TNF-α的抗體。對(duì)于每個(gè)單體分子，可以在該單體的C端添加c-myc標(biāo)簽(氨基酸序列為EQKLISEEDLN)和組氨酸標(biāo)簽((His)6-tag)(參考文獻(xiàn)27，28)，用于活性檢測(cè)和純化，也可以不加?？筎NF-α抗體片段可以是單鏈抗體片段(scFvsingle chain fragment of variable region)，抗體Fab片段或單域抗體片段(VH或VL)。更具體地，是將抗TNF-α的單鏈抗體片段和p53蛋白四聚化結(jié)構(gòu)域通過(guò)HSA連接肽串聯(lián)在一起構(gòu)建成的抗TNF-α單鏈抗體分子，然后通過(guò)四聚化結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)單鏈抗體分子的同源四聚化而形成的抗TNF-α四價(jià)單鏈抗體。它具有以下優(yōu)點(diǎn)1.具有基因工程抗體本身所固有的優(yōu)點(diǎn)如分子量小、穿透性強(qiáng)、易于構(gòu)建和表達(dá)、便于大量發(fā)酵生產(chǎn)。
2.不與Fc受體結(jié)合，可減少因廣泛存在的Fc受體而帶來(lái)的不利影響。
3.通過(guò)單鏈抗體的寡聚化克服了單鏈抗體親和力低和半壽期短而帶來(lái)的不利影響，具有很好的臨床應(yīng)用前景。
在本發(fā)明的工作中，為了證實(shí)四價(jià)單鏈抗體的優(yōu)越性，我們同時(shí)也構(gòu)建了抗TNF-α單鏈抗體，其構(gòu)建方式只是在單鏈抗體的C-末端不再連接P53蛋白的四聚體結(jié)構(gòu)域，構(gòu)建時(shí)所用的基因序列、酶切位點(diǎn)、質(zhì)粒載體以及后面的表達(dá)、純化和復(fù)性都與四價(jià)單鏈抗體一樣。為了更加詳細(xì)的介紹本發(fā)明的四價(jià)單鏈抗體，在下面的技術(shù)方案和實(shí)施例當(dāng)中，我們將不再具體地介紹抗TNF-α單鏈抗體本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選技術(shù)方案如下首先通過(guò)文獻(xiàn)報(bào)道的具有中和作用的抗TNF-α單克隆抗體Di62(參考文獻(xiàn)29)的重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(VL)的氨基酸序列設(shè)計(jì)成完整的單鏈抗體編碼DNA序列，同時(shí)根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的人類野生型p53蛋白的四聚化結(jié)構(gòu)域氨基酸序列設(shè)計(jì)成編碼這段結(jié)構(gòu)域的DNA序列。然后采用全合成的方式合成了兩段基因片段，第一段為單鏈抗體的編碼序列，第二段為編碼HSA肽和四聚化結(jié)構(gòu)域的序列。把兩段合成的基因片段通過(guò)酶切、連接和轉(zhuǎn)化反應(yīng)分別克隆進(jìn)表達(dá)載體pTMF中，構(gòu)建成四價(jià)單鏈抗體的表達(dá)載體TNF-TeAb/pTTA。
用此表達(dá)載體TNF-TeAb/pTTA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞BL21(DE3)菌株，利用IPTG在37℃條件下誘導(dǎo)抗體的高效表達(dá)，然后通過(guò)表達(dá)產(chǎn)物的分離和包涵體蛋白的制備，并在變性的條件下利用Ni離子親和層析柱純化TNF-TeAb，通過(guò)一步親和層析，TNF-TeAb可得到初步的純化。采用緩慢透析的方法逐漸的除去變性劑尿素，對(duì)四價(jià)單鏈抗體進(jìn)行復(fù)性，復(fù)性后的樣品用高效液相色譜檢測(cè)，確定復(fù)性產(chǎn)物中多價(jià)抗體的存在和各自所占的相對(duì)百分比。采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TNF-TeAb的抗原結(jié)合活性及特異性。采用ELISA方法檢測(cè)TNF-TeAb抑制TNF-α與其受體的結(jié)合，并確定其50％抑制時(shí)的濃度(IC50)。采用MTT法檢測(cè)TNF-TeAb體外抑制TNF-α對(duì)L929細(xì)胞的殺傷作用并與單鏈抗體進(jìn)行比較，測(cè)定它們的抑制50％細(xì)胞殺傷時(shí)的濃度(IC50)。建立膠原誘導(dǎo)的大鼠關(guān)節(jié)炎模型，利用通過(guò)分離、純化和復(fù)性的四價(jià)單鏈抗體TNF-TeAb對(duì)誘發(fā)關(guān)節(jié)炎的大鼠進(jìn)行治療，并通過(guò)大鼠關(guān)節(jié)炎臨床癥狀的變化，抗II型膠原抗體的變化，以及前炎性細(xì)胞因子的變化來(lái)評(píng)價(jià)四價(jià)抗體TNF-TeAb對(duì)大鼠關(guān)節(jié)炎模型是否具有治療作用。
應(yīng)當(dāng)指出，在本說(shuō)明書的上下文中，尤其是在實(shí)施例公開內(nèi)容的基礎(chǔ)上，本發(fā)明的其它方面和優(yōu)點(diǎn)對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是很容易理解的。


圖1.構(gòu)建TNF-TeAb的操作過(guò)程簡(jiǎn)圖。
圖2.用于構(gòu)建TNF-TeAb的各中間載體和構(gòu)建成功的含有TNF-TeAb的載體簡(jiǎn)圖。
圖3.采用重疊PCR拼接用于構(gòu)建TNF-TeAb的載體的抗TNF-α單鏈抗體DNA的過(guò)程簡(jiǎn)圖，其中數(shù)字1-20分別代表用于構(gòu)建的合成寡聚核苷酸片段，S1和S2分別表示最后一輪擴(kuò)增時(shí)兩端的引物。字母A、B、C、D、E、F、G、H、I、J分別表示第一輪配對(duì)延伸的產(chǎn)物；羅馬數(shù)字I、II、III、IV和V表示第二輪配對(duì)延伸的產(chǎn)物；符號(hào)UP、DOWN分別代表構(gòu)建過(guò)程中的第三輪配對(duì)延伸產(chǎn)物，符號(hào)WHOLE代表終產(chǎn)物。
圖4.構(gòu)建TNF-TeAb過(guò)程中采用重疊PCR拼接抗TNF-α單鏈抗體各中間產(chǎn)物和終產(chǎn)物的瓊脂糖電泳鑒定。其中泳道1為UP，泳道2為DOWN，泳道3為WHOLE，泳道4為標(biāo)準(zhǔn)分子量。
圖5.構(gòu)建TNF-TeAb過(guò)程中采用重疊PCR拼接P53四聚化結(jié)構(gòu)域DNA(上游帶有HSA連接肽，下游帶有C-myc標(biāo)簽)的過(guò)程簡(jiǎn)圖，其中數(shù)字1-9分別代表用于構(gòu)建的合成寡核苷酸片段，羅馬數(shù)字I、II、III、IV代表第一輪配對(duì)延伸產(chǎn)物，UP、DOWN分別代表第二輪配對(duì)延伸產(chǎn)物，WHOLE為終產(chǎn)物。
圖6.重疊PCR拼接構(gòu)建P53四聚化結(jié)構(gòu)域DNA終產(chǎn)物的瓊脂糖電泳鑒定，泳道1分子量標(biāo)準(zhǔn)(TaKaRa大連寶生物)DL2000；泳道2為包含有HSA連接肽、四聚化結(jié)構(gòu)域和C-myc標(biāo)簽的全長(zhǎng)片段WHOLE，大小為255bp。
圖7.載體TNF-TeAb/pTTA的酶切鑒定圖，泳道1為分子量標(biāo)準(zhǔn)(大連寶生物公司)DL2000；泳道2為用XhoI和BamHI的酶切結(jié)果，切下的大約為1000bp條帶，為四聚體編碼DNA片段，泳道3為XhoI和EcoRI雙酶切結(jié)果，切下的750bp條帶，為單鏈抗體編碼DNA片段。
圖8.37℃誘導(dǎo)TNF-TeAb胞內(nèi)高效表達(dá)的SDS-PAGE鑒定結(jié)果，泳道1標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白(上海生物化學(xué)研究所)；泳道2載體pTMF的全菌蛋白；泳道3載體pTTA的全菌蛋白；泳道4載體pTMF的超聲上清；泳道5載體pTTA的超聲上清；泳道6載體pTMF的超聲沉淀；泳道7載體pTTA的超聲沉淀。
圖9.37℃誘導(dǎo)TNF-TeAb表達(dá)產(chǎn)物的Western blot鑒定，泳道1TNF-TeAb/pTTA表達(dá)產(chǎn)物超聲沉淀的Western-blotting鑒定。泳道2預(yù)染蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)(NEB公司)圖10.固定化金屬(Ni)離子親和層析純化TNF-TeAb的SDS-PAGE鑒定，泳道1TNF-TeAb包涵體蛋白的變性上清；泳道2上樣后的流穿組分；泳道3Ni-NTA洗滌緩沖液的洗滌組分；泳道4目的蛋白利用包涵體洗脫液的洗脫組分；泳道5低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)(購(gòu)自上海生物化學(xué)研究所)。
圖11.高效液相色譜(HPLC)檢測(cè)TNF-TeAb復(fù)性樣品中的多價(jià)抗體的形成情況，其中A為樣品TNF-TeAb的色譜分析圖；B為標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白BSA(牛血清白蛋白)的色譜分析圖；C為標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白IgG(免疫球蛋白)的色譜分析圖。
圖12.TNF-TeAb的ELISA檢測(cè)結(jié)果。第一條曲線1μg/ml重組人TNF-α；第二條曲線1μg/ml BSA。
圖13.ELISA檢測(cè)TNF-TeAb及TNF-scFv體外抑制TNF-α與其受體結(jié)合。
圖14.MTT法檢測(cè)TNF-TeAb及TNF-scFv體外抑制TNF-α對(duì)小鼠成纖維細(xì)胞L929的細(xì)胞毒效應(yīng)。
圖15.治療過(guò)程中各組大鼠的臨床評(píng)分的變化情況和統(tǒng)計(jì)。
圖16.治療過(guò)程中，各組大鼠的左后腿(致炎側(cè))踝關(guān)節(jié)的周長(zhǎng)的變化情況和統(tǒng)計(jì)。
圖17.治療過(guò)程中，各組大鼠右后腿(非致炎側(cè))踝關(guān)節(jié)周長(zhǎng)的變化情況統(tǒng)計(jì)。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體的實(shí)施例，并參照附圖進(jìn)一步詳細(xì)地描述本發(fā)明。應(yīng)理解，本說(shuō)明書中的實(shí)施例只是為了舉例說(shuō)明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1重疊PCR構(gòu)建抗TNF-α單鏈抗體將抗TNF-α單克隆抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列，一段多肽序列(GGGGSGGGGSGGGGS)連接起來(lái)，設(shè)計(jì)成抗TNF-α單鏈抗體(SEQID No 1)。然后按照大腸桿菌偏愛(ài)的密碼子將其反向翻譯成一段DNA序列(見(jiàn)SEQ ID No 4)，并把這段DNA序列按照互補(bǔ)的原則進(jìn)一步拆分成22個(gè)寡聚核苷酸片段(下述序列1-20，S1和S2)，以便于使用重疊PCR技術(shù)拼接成全長(zhǎng)的抗TNF-α單鏈抗體DNA片段。以下為用于拼接抗TNF-α單鏈抗體全基因片段的寡聚核苷酸片段(5’→3’)。
1.TTC CTC GAG CAG ATC CAG CTG GTT CAG TCC GGT CCGGAA CTG AAA AAA CCG GGT(SEQ ID NO6)2.GTA ACC GGA AGC TTT GCA GGA GAT TTT AAC GGT TTCACC CGG TTT TTT CAG TTC(SEQ ID NO7)3.TGC AAA GCT TCC GGT TAC ACC TTC ACC CAC TAC GGTAAC TGG GTT AAA CAG(SEQ ID NO8)4.GAT CCA ACC CAT CCA TTT CAG ACC TTT ACC CGG AGCCTG TTT AAC CCA GTT CAT(SEQ ID NO9)
5.AAA TGG ATG GGT TGG ATC AAC ACC TAC ACC GGT GAACCG ACC TAC GCT GAC GAC(SEQ ID NO10)6.GGA GGT TTC CAG GGA GAA AGC GAA GTG TTC TTT GAAGTC GTC AGC GTA GGT CGG(SEQ ID NO11)7.TTC TCC CTG GAA ACC TCC GCT TCC ACC GTT TTC CTGCAG ATC AAC AAC CTG AAA(SEQ ID NO12)8.TTC ACG AGC GCA GAA GTA GGT AGC GGT GTC TTC GTTTTT CAG GTT GTT GAT GTC(SEQ ID NO13)9.TAC TTC TGC GCT CGT GAA CGT GGT GAC GCT ATG GACTAC TGG GGT CAG GGT ACC(SEQ ID NO14)10.CCC ACC GCC TCC ACT AGT GGA GGA AAC GGT AAC GGAGGT ACC CTG ACC CCA GTA(SEQ ID NO15)11.ACT AGT GGA GGC GGT GGG AGC GGC GGT GGT GGT TCTGGG GGT GGC GGA AGC TCT(SEQ ID NO16)12.CAG GAA TTT CGG GGT CTG GGT CAT AAC GAT GGA TCTAGA GCT TCC GCC ACC CCC(SEQ ID NO17)13.CAG ACC CCG AAA TTC CTG CTG GTT TCC GCT GGT GACCGT GTT ACC ATC ACC TGC(SEQ ID NO18)14.CCA AAC AAC GTC GTT GGA AAC GGA CTG GGA AGC GGTGCA GGT GAT GGT AAC ACG(SEQ ID NO19)15.TCC AAC GAC GTT GTT TGG TAC CAG CAG AAA CCG GGTCAG TCC CCG AAA ATG CTG(SEQ ID NO20)16.CGG AAC ACC GGT GTA ACG GTT GAA AGC GGA GTA CATCAG CAT TTT CGG GGA CTG(SEQ ID NO21)17.CGT TAC ACC GGT GTT CCG GAC CGT TTC ACC GGT CGTGGT TAC GGT ACC GAC TTC(SEQ ID NO22)18.CAG GTC TTC AGC CTG AAC GGA GGA GAT GGT GAA GGTGAA GTC GGT ACC GTA ACC(SEQ ID NO23)19.GTT CAG GCT GAA GAC CTG GCT GTT TAC TTC TGC CAGCAG GAC TAC AAC TCC CTG(SEQ ID NO24)
20.TTT GAT TTC CAG TTT GGT ACC ACC ACC GAA GGT ACGCGG GGA GTT GTA GTC CTG(SEQ ID NO25)S1.TTC CTC GAG CAG ATC CAG CT(SEQ ID NO26)S2.GGC GAA TTC TTT GAT TTC CAG TTT GGT(SEQ ID NO27)步驟1將片段1-20各自配對(duì)重疊延伸，不加引物，反應(yīng)產(chǎn)物不需要回收，直接進(jìn)行下一步反應(yīng)。用于反應(yīng)的每個(gè)片段各1μl(10pmol)；2μl10×PCR緩沖液(500mM KCl，50mM Tris pH 8.5，25mM MgCl2下同)；2μldNTPs(dATP，dCTP，dGTP，dTTP，每種2mM)(購(gòu)自大連寶生物技術(shù)公司，下同)；0.3μl pfu(1U)(購(gòu)自大連寶生物技術(shù)公司，下同)；水14μl。反應(yīng)條件94℃預(yù)變性1min；94℃變性30sec；50℃退火30sec；72℃延伸30sec；15個(gè)循環(huán)。得到反應(yīng)產(chǎn)物A(片段1和2配對(duì))、B(片段3和4配對(duì))、C(片段5和6配對(duì))、D(片段7和8配對(duì))、E(片段9和10配對(duì))，F(xiàn)(片段11和12配對(duì))、G(片段13和14配對(duì))、H(片段15和16配對(duì))、I(片段17和18配對(duì))、J(片段19和20配對(duì))。
步驟2將反應(yīng)產(chǎn)物A和B，C和D，E和F，G和H，I和J各自配對(duì)重疊延伸，不加引物。用于反應(yīng)的每種物質(zhì)各10μl(10pmol)。反應(yīng)條件94℃預(yù)變性1min；94℃變性30sec；50℃退火30sec；72℃延伸30sec；10個(gè)循環(huán)。經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳，采用膠回收試劑盒進(jìn)行回收反應(yīng)產(chǎn)物I(A和B配對(duì))、II(C和D配對(duì))、III(E和F配對(duì))、IV(G和H配對(duì))、V(I和J配對(duì))。每個(gè)拼接片段的大小大約為170bp。
步驟3將I、II和III配對(duì)，IV和V配對(duì)，形成2個(gè)反應(yīng)體系，每個(gè)反應(yīng)體系都添加各自的引物(片段1和片段12對(duì)應(yīng)I、II與III配對(duì)，片段13和片段20對(duì)應(yīng)、IV與V配對(duì))，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。用于反應(yīng)的每種物質(zhì)各1μl(約100ng)；2μl 10×PCR緩沖液；2μl dNTPs(每種2mM)；引物各1μl(10pmol)；0.3μl pfu(1U)；補(bǔ)加水至終體積為20μl。反應(yīng)條件94℃預(yù)變性1min；94℃變性30sec；50℃退火30sec；72℃延伸30sec；25個(gè)循環(huán)。經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳，采用膠回收試劑盒進(jìn)行回收，反應(yīng)產(chǎn)物為UP(I和II配對(duì))的大小約為430bp，DOWN(III、IV和V配對(duì))的大小約為340bp。
步驟4將反應(yīng)產(chǎn)物UP和DOWN配對(duì)，添加引物(片段S1和片段S2)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)產(chǎn)物UP和DOWN各1μl(約100ng)；2μl 10×PCR緩沖液；2μl dNTP(每種2mM)；引物各1μl(10pmol)；0.3μl Taq(1U)；水12μl。反應(yīng)條件94℃預(yù)變性1min；94℃變性30sec；50℃退火30sec；72℃延伸1min；25個(gè)循環(huán)。得到的反應(yīng)產(chǎn)物WHOLE(約750bp)經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳，采用膠回收試劑盒進(jìn)行回收。
上述操作步驟流程參見(jiàn)圖3，中間步驟的反應(yīng)產(chǎn)物的PCR鑒定見(jiàn)圖4。
將上述750bp的DNA片段和載體pTMF同時(shí)進(jìn)行XhoI和EcoRI(Promega)雙酶切反應(yīng)，具體酶切反應(yīng)條件參照酶供應(yīng)商的說(shuō)明書。載體pTMF來(lái)源于載體pET28a(+)(Novagen公司)，由本公司將合成的一段多克隆位點(diǎn)取代載體pET28a(+)的多克隆位點(diǎn)構(gòu)建而成(見(jiàn)參考文獻(xiàn)30)。采用膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物的酶切產(chǎn)物(750bp左右)和pTMF酶切大片段產(chǎn)物(5300bp左右)，進(jìn)行連接和轉(zhuǎn)化TOP10菌株，進(jìn)行陽(yáng)性重組克隆的鑒定和序列測(cè)定。選擇序列正確的克隆命名為TNF-scFv/pTMF。其中所進(jìn)行的酶切反應(yīng)、連接反應(yīng)、細(xì)菌感受態(tài)制備和轉(zhuǎn)化反應(yīng)的具體操作如下酶切反應(yīng)使用20μl體系，對(duì)約1μg pTMF空載體或多克隆位點(diǎn)DNA片段分別進(jìn)行XhoI和EcoRI(Promega公司)雙酶切反應(yīng)。酶的用量、緩沖溶液以及反應(yīng)條件參見(jiàn)所用限制性內(nèi)切酶的說(shuō)明書。酶切產(chǎn)物經(jīng)過(guò)1％瓊脂糖電泳后，采用膠回收試劑盒(上海華舜公司)回收特異大小的片段，pTMF空載體酶切產(chǎn)物大小約5300bp。
連接反應(yīng)酶切后的pTMF載體片段50-100ng；酶切后的單鏈抗體DNA片段載體的3-10倍(摩爾比)；10×T4 DNA連接酶緩沖溶液2μl；T4DNA連接酶(大連寶生物公司)1U；補(bǔ)加ddH2O至總體積為20μl。16℃過(guò)夜連接。
制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞將TOP10菌株(Invitrogen公司)轉(zhuǎn)接在2mlLB培養(yǎng)基((10g/l tryptone(GIBCO公司)，5g/l yeast extract(GIBCO公司)，5g/l NaCl，pH7.5))中37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。按1∶100的比例轉(zhuǎn)接至20-40ml無(wú)抗生素LB培養(yǎng)基中，快速振蕩培養(yǎng)至A600為0.3-0.4時(shí)(約2.5小時(shí))停止，冰浴15分鐘，4℃4,000rpm離心10分鐘收集菌體，棄上清，加入10ml預(yù)冷的0.1mol/ml CaCl2(Sigma公司)，重懸混勻，冰浴20分鐘，4℃4,000rpm離心10分鐘，棄上清后加入預(yù)冷的含12％甘油的0.1mol/ml CaCl21-2ml，輕輕懸起菌體，每管200μl，-80℃凍存?zhèn)溆谩?br> 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化在200μl感受態(tài)細(xì)胞中加入1μl上述連接混合物，混勻后冰浴30分鐘，42℃熱激100秒，然后迅速冰浴2分鐘。向冰浴后的混合物中加入0.8ml LB培養(yǎng)基，37℃輕搖(＜150rpm)或靜置45分鐘復(fù)蘇；10,000rpm離心1分鐘，棄上清，加50～100μl LB培養(yǎng)基重懸沉淀，涂布于LB-K平板(10g/l tryptone，5g/l yeast extract，5g/l NaCl，15g/l瓊脂(SIGMA公司)，50μg/ml卡那霉素(SIGMA公司)，pH7.5)，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。
陽(yáng)性重組克隆的篩選與鑒定挑取卡那霉素篩選陽(yáng)性的連接產(chǎn)物單克隆，接入2ml LB-K培養(yǎng)基(10g/l tryptone，5g/l yeast extract，5g/l NaCl，50μg/ml卡那霉素(SIGMA公司)，pH7.5)，37℃振蕩過(guò)夜培養(yǎng)，然后按照質(zhì)粒提取試劑盒(上海華舜公司)的說(shuō)明書提取質(zhì)粒DNA。按照下述方法進(jìn)行PCR鑒定。
PCR鑒定在20μl的擴(kuò)增體系中加入0.1-1μl質(zhì)粒DNA(約20-200ng)，上游引物(S1-TTC CTC GAG CAG ATC CAG CT)(SEQ ID NO25)和下游引物(S2-GGC GAA TTC TTT GAT TTC CAG TTT GGT)(SEQ IDNO26)各10pmol，2μl 10×Taq酶緩沖液和2μl 2mmol/ml的dNTPs，Taq酶1U，補(bǔ)水至總體積20μl。具體反應(yīng)程序94℃預(yù)變性5分鐘后，94℃變性40秒，54℃退火40秒，72℃延伸40秒，擴(kuò)增25個(gè)循環(huán)，取5μl PCR產(chǎn)物，1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，PCR產(chǎn)物大小約為750bp。
實(shí)施例2重疊PCR方法構(gòu)建四聚化結(jié)構(gòu)域和HSA的融合基因?qū)⑷祟愐吧蚿53四聚化結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列(SEQ ID No 3)和人血清白蛋白連接肽(HSA，SEQ ID No.2)的氨基酸序列融合并在C-末端加上C-myc標(biāo)簽，形成一段氨基酸序列，并按照大腸桿菌偏愛(ài)的密碼子反向翻譯成編碼的DNA序列(SEQ ID No 4)，把這段DNA序列按照互補(bǔ)的原則進(jìn)一步的拆分成9個(gè)聚核苷酸片段(1-9)，以便于利用重疊PCR拼接成完整的四聚化結(jié)構(gòu)域片段。以下為用于拼接四聚體結(jié)構(gòu)域全基因片段的寡聚核苷酸片段(5’→3’)。
1.TTC GAA TTC GCG CTG GAA GTG GAT GAA ACC TAT GTGCCG AAA GAA TTT AAC GCG(SEQ ID NO28)2.TTT GAG CTC AAT ATC CGC ATG AAA GGT AAA GGT TTCCGC GTT AAA TTC TTT CGG(SEQ ID NO29)3.GCG GAT ATT GAG CTC AAA AAA AAA CCG CTG GAT GGCGAA TAT TTT ACC CTG CAG(SEQ ID NO30)4.TTC GCG AAA CAT TTC AAA GCG TTC GCG GCC GCG AATCTG CAG GGT AAA ATA TTC(SEQ ID NO31)5.TTT GAA ATG TTT CGC GAA CTG AAC GAA GCG CTG GAACTG AAA GAT GCG CAG GCG(SEQ ID NO32)6.TTC GCT AAT CAG TTT CTG TTC GCC CGG TTC TTT GCC CGCCTG CGC ATC TTT CAG(SEQ ID NO33)7.CAG AAA CTG ATT AGC GAA GAA GAT CTG AAC GGA TCCGCC(SEQ ID NO34)8.GGC GGA TCC GTT CAG ATC TT(SEQ ID NO35)9.TTC GAA TTC GCG CTG GAA GT(SEQ ID NO36)步驟1將片段1和2、3和4、5和6、7和8各自配對(duì)延伸，不加引物，反應(yīng)產(chǎn)物不需回收，直接用于下一步的反應(yīng)。用于反應(yīng)的每個(gè)片段各1μl(10pmol)；2μl 10×PCR緩沖液(500mM KCl，50mM Tris pH 8.5，25mMMg(Cl)2下同)；2μl dNTPs(dATP，dCTP，dGTP，dTTP，每種2mM)(購(gòu)自大連寶生物技術(shù)公司，下同)；0.3μl pfu(1U)(購(gòu)自大連寶生物技術(shù)公司，下同)；水14μl。反應(yīng)條件94℃預(yù)變性1min；94℃變性30sec；54℃退火30sec；72℃延伸30sec；15個(gè)循環(huán)。得到反應(yīng)產(chǎn)物A(片段1和2配對(duì))、B(片段3和4配對(duì))、C(片段5和6配對(duì))、D(片段7和8配對(duì))。
步驟2將反應(yīng)產(chǎn)物A和B、C和D進(jìn)行配對(duì)重疊延伸，不加引物。用于反應(yīng)的每種物質(zhì)各10μl(10pmol)。反應(yīng)條件94℃預(yù)變性1min；94℃變性30sec；54℃退火30sec；72℃延伸30sec；10個(gè)循環(huán)。經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳，采用膠回收試劑盒進(jìn)行回收反應(yīng)產(chǎn)物UP(A和B配對(duì))和(C和D配對(duì))，其中片段UP的大小約為170bp，片段DOWN的大小約為120bp。
步驟3將反應(yīng)產(chǎn)物UP和DOWN配對(duì)，添加引物(片段8和片段9)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)產(chǎn)物UP和DOWN各1μl(約100ng)；2μl 10×PCR緩沖液；2μl dNTP(每種2mM)；引物各1μl(10pmol)；0.3μl Taq(1U)；水12μl。反應(yīng)條件94℃預(yù)變性1min；94℃變性30sec；54℃退火30sec；72℃延伸1min；25個(gè)循環(huán)。得到的反應(yīng)產(chǎn)物WHOLE(255bp)經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳，采用膠回收試劑盒進(jìn)行回收。
上述操作步驟流程參見(jiàn)圖5，反應(yīng)終產(chǎn)物WHOLE的瓊脂糖凝膠電泳見(jiàn)圖6。
步驟4將上述255bp的DNA片段和載體TNF-scFv/pTMF同時(shí)進(jìn)行EcoRI和BamHI(Promega)雙酶切反應(yīng)，具體酶切反應(yīng)條件參照酶供應(yīng)商的說(shuō)明書。采用膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物的酶切產(chǎn)物(250bp左右)和TNF-scFv/pTMF酶切大片段產(chǎn)物(6000bp左右)，進(jìn)行連接和轉(zhuǎn)化TOP10菌株，進(jìn)行陽(yáng)性重組克隆的鑒定和序列測(cè)定。選擇序列正確的克隆命名為TNF-TeAb/pTTA。其中所進(jìn)行的酶切反應(yīng)、連接反應(yīng)、細(xì)菌感受態(tài)制備和轉(zhuǎn)化反應(yīng)的具體操作參照實(shí)施例1的方法進(jìn)行。
陽(yáng)性重組克隆的鑒定同樣參照實(shí)施例1的方法進(jìn)行，所用的PCR擴(kuò)增引物為上游引物(P15’-TTC GAA TTC GCG CTG GAA GT-3’)，(SEQ IDNO36)下游引物(P25’-GGC GGA TCC GTT CAG ATC TT-3’)(SEQ IDNO35)，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為255bp。
步驟5質(zhì)粒TNF-TeAb/pTTA的酶切鑒定挑選步驟4鑒定出的陽(yáng)性克隆接種3ml LB-K(卡那霉素)液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，然后按照質(zhì)粒提取試劑盒(上海華舜公司)的說(shuō)明書提取質(zhì)粒DNA并按實(shí)施例1所述的方法進(jìn)行酶切鑒定，反應(yīng)分為2個(gè)體系，第1個(gè)體系為XhoI和BamHI酶切，第2個(gè)體系為EcoRI和XhoI酶切，酶切結(jié)果見(jiàn)圖7。
實(shí)施例3TNF-TeAb的誘導(dǎo)表達(dá)(1)將TNF-TeAb/pTTA轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)(Novagen公司)按照實(shí)施例1中所述制備感受態(tài)細(xì)胞的方法，制備大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞。按照質(zhì)粒提取試劑盒(上海華舜公司)的說(shuō)明書提取質(zhì)粒TNF-TeAb/pTTA，按照實(shí)施例1所述的轉(zhuǎn)化方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，并如實(shí)施例1所述進(jìn)行鑒定。
(2)誘導(dǎo)表達(dá)將分別轉(zhuǎn)化了載體TNF-TeAb/pTTA和載體pTMF的BL21(DE3)涂LB-K平板，37℃過(guò)夜培養(yǎng)，然后挑取單克隆，接種于5ml LB-K液體培養(yǎng)基中，在大試管內(nèi)，37℃搖床培養(yǎng)過(guò)夜(200轉(zhuǎn)/分鐘)。次日取過(guò)夜培養(yǎng)物按1/100的比例轉(zhuǎn)接到250ml LB-K液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)37℃搖床培養(yǎng)(200轉(zhuǎn)/分鐘)至A600＝0.6，補(bǔ)加IPTG(大連寶生物公司)至終濃度為0.4mmol/ml，繼續(xù)在37培養(yǎng)4小時(shí)，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。室溫8000rpm離心10分鐘，收集菌體，懸于1/5培養(yǎng)體積的PBS緩沖液中，進(jìn)行菌體超聲破碎。經(jīng)過(guò)室溫12,000m離心10分鐘后，收集離心上清和沉淀，將離心沉淀懸浮在1/5培養(yǎng)體積的PBS中。按照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(金冬雁，黎孟楓譯，1996，科學(xué)出版社)，采用還原SDS-PAGE電泳和Western blot檢測(cè)上述超聲上清和超聲沉淀中的TNF-TeAb表達(dá)情況，并使用數(shù)字圖象分析儀(美國(guó)Alpha Innotech公司，AlphaImage 2200 Documentation &analysis system)確定胞內(nèi)可溶表達(dá)和包涵體表達(dá)的相對(duì)比例。SDS-PAGE電泳(圖8)和Western blot(圖9)的結(jié)果表明，采用上述誘導(dǎo)表達(dá)的方法，TNF-TeAb主要以包涵體的形式表達(dá)，其通過(guò)SDS-PAGE電泳的單體形式大約為40kD，與理論計(jì)算值相符，包涵體表達(dá)量大約占菌體蛋白的30％，占包涵體蛋白的50％。
實(shí)施例4變性條件下采用固定化金屬(Ni2+)親和層析純化TNF-TeAb將上述250ml的37℃誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物室溫12,000rpm離心10分鐘，并重懸在1/5體積(50ml)的超聲緩沖液(50mM Tris-HCl pH8.0，100mM NaCl，2mM EDTA，100μg/ml溶菌酶)中，攪拌2小時(shí)，4℃放置過(guò)夜。用連續(xù)超聲儀超聲30分鐘，功率為800W。于4℃，8000rpm離心20分鐘，棄上清，沉淀用超聲緩沖液洗一次，然后用包涵體洗滌緩沖液洗一次，每次洗滌均在室溫下?lián)u床振搖2小時(shí)，然后，于4℃，8000rpm離心20分鐘，收集沉淀。在沉淀中加入少許(1ml)的包涵體變性液(8mol/L Urea，20mmol/LTris-Cl(pH8.0)，0.15mol/L NaCl，10mmol/L imidazole)，用玻棒碾磨沉淀使其分散，然后補(bǔ)加包涵體變性液至50ml。室溫下?lián)u床振搖過(guò)夜，使包涵體蛋白充分變性溶解，然后于4℃，8000rpm離心20分鐘，收集離心上清。將鎳離子親和層析柱料(Ni2+-NTA)進(jìn)行裝柱，然后用10體積的包涵體變性緩沖液進(jìn)行平衡，將上述的包涵體變性上清上柱，待上清流穿柱體后，用Ni-NTA洗滌緩沖液(8mol/L Urea，20mmol/L Tris-Cl(pH8.0)，0.15mol/LNaCl，20mmol/L imidazole)洗滌20柱體積至基線，充分的去除非特異結(jié)合的蛋白。用含有250mM咪唑的包涵體洗脫緩沖液(8mol/L Urea，20mmol/L Tris-Cl(pH8.0)，0.15mol/L NaCl，250mmol/L imidazole)洗脫結(jié)合在柱上的目的蛋白，收集洗脫峰。用0.5M的NaOH洗柱，去除除殘留在柱上的少量蛋白和非蛋白的雜質(zhì)，然后再用20％的乙醇過(guò)柱，將柱保存在4備用。
上面的流穿組分、洗滌組分和洗脫組分直接進(jìn)行還原SDS-PAGE檢測(cè)，鑒定純化效果(圖10)。SDS-PAGE的結(jié)果顯示目的蛋白在變性的條件下掛柱良好，流穿組分中幾乎不含目的蛋白，小量非特異結(jié)合的雜蛋白可用20mM的咪唑進(jìn)行充分的洗滌而除去。用數(shù)字圖象分析儀(美國(guó)Alpha Innotech公司，AlphaImage 2200 Documentation & analysis system)確定TNF-TeAb經(jīng)上述方法純化后，純度可達(dá)到95％以上。
實(shí)施例5利用緩慢透析除去變性劑的方法復(fù)性TNF-TeAb將剪成適當(dāng)長(zhǎng)度的透析袋在較大體積的2％NaHCO3，1mmol/L EDTApH8.0中煮10分鐘后用ddH2O沖洗，再在1mmol/L EDTA pH8.0中煮10分鐘，存于4℃，用前以ddH2O沖洗。將實(shí)施例4純化的包涵體蛋白用包涵體體變性液調(diào)整濃度到250μg/ml，裝入上述經(jīng)處理過(guò)的20ml的透析袋中，首先對(duì)1L含有4M尿素的復(fù)性緩沖液(0.9％硼酸，0.3％NaOH，pH9.5)透析，透析時(shí)間為4小時(shí)，溫度控制在4-10℃，并置于電磁攪拌器攪拌。然后依次對(duì)含有2M、1M尿素的復(fù)性緩沖液透析，每次透析4小時(shí)，條件同上。最后將上述復(fù)性的樣品對(duì)20mM的Tris-HCl(pH8.0)透析，時(shí)間為4小時(shí)，條件同上。取出透析袋里復(fù)性好的樣品，采用Bradford法對(duì)透析后的樣品進(jìn)行蛋白定量，具體操作按照《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》(顏?zhàn)臃f，王海林譯，金冬雁校，1999，科學(xué)出版社，)進(jìn)行。定量后的樣品補(bǔ)加NaN3(Sigma公司)至終濃度0.05％(W/V)，作為防腐劑；補(bǔ)加海藻糖(購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院微生物研究所)至終濃度0.15mol/L，作為穩(wěn)定劑。然后分裝為1ml/份凍存于-80℃，待用。
實(shí)施例6利用高效液相色譜檢測(cè)四價(jià)抗體的形成將用實(shí)施例5的方法復(fù)性的樣品(純度95％以上)對(duì)高效液相色譜的流動(dòng)相進(jìn)行透析，調(diào)整蛋白濃度為500μg/ml，上樣20μl，記錄蛋白峰的數(shù)量和各自的保留時(shí)間，并用標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白IgG(150kD)、牛血清白蛋白(BSA)(66kD)作為對(duì)照，上樣并記錄各自的保留時(shí)間，用TNF-TeAb的各蛋白峰的保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)蛋白進(jìn)行比較，即可推測(cè)出TNF-TeAb各峰蛋白分子量的大小和形成聚體的情況。所用高效液相為Waters Delta 600(MILLENNIUM色譜工作站)，分子篩柱料為G-3000SWXL，分離范圍為5kD-500kD。樣品和標(biāo)準(zhǔn)分子量的色譜分析見(jiàn)圖11。
上述結(jié)果表明，樣品TNF-TeAb樣品主要有三個(gè)蛋白峰，其中第一峰的保留時(shí)間為7.819分，第二峰的保留時(shí)間為9.596分，第三峰的保留時(shí)間為15.299分。標(biāo)準(zhǔn)蛋白IgG的保留時(shí)間為7.906分，BSA的保留時(shí)間為10.791分，于是推定第一峰為四聚體即四價(jià)抗體，分子量大約為160kD，與理論計(jì)算值156kD基本相符；第二峰為二聚體，分子量大約為80kD，與理論計(jì)算值78kD基本相符第三峰為極少量的單體，分子量大約為40kD。通過(guò)色譜儀的計(jì)算，四價(jià)抗體所占比率58.9％，雙價(jià)抗體為36.59％，單體所占比率為4.51％。由此可見(jiàn)TNF-TeAb主要以多價(jià)抗體而存在。
實(shí)施例7ELISA方法檢測(cè)TNF-TeAb的抗原結(jié)合活性重組人TNF-α購(gòu)自英國(guó)Peprotech公司，對(duì)L929細(xì)胞的殺傷的ED50≤0.1ng/ml，相對(duì)應(yīng)的生物學(xué)活性為≥2×107U/mg?？筩myc-tag單抗9E10，購(gòu)自SANTA CRUTZ公司，HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG華美公司。ELISA操作步驟如下(1)包被用抗原包被緩沖液稀釋重組人TNF-α為1μg/ml并加入到96孔ELISA板中，每孔100μl，于37℃包被2小時(shí)或4℃包被過(guò)夜。為了證明抗體結(jié)合的特異性，同時(shí)包被牛血清白蛋白(BSA)作為抗體結(jié)合的特異性檢測(cè)。包被緩沖液配方1.36g Na2CO3，7.35g NaHCO3，950ml水，使用1mol/L HCl或1mol/L的NaOH調(diào)pH9.2，補(bǔ)水至1L。
(2)封閉PBST洗板1-2次后，加入封閉液(PBS-4％脫脂奶粉(W/V))，200μl/孔，37℃封閉1-2小時(shí)。
(3)加樣PBS洗板三次后，加入純化樣品，100μl/孔，37℃孵育1-2小時(shí)。樣品使用方法以40μg/ml的純化樣品(TNF-TeAb)作為起始濃度，進(jìn)行倍比稀釋10個(gè)梯度，每個(gè)梯度兩復(fù)孔。
(4)加入第一抗體PBST(PBS-0.05％Twen-20(V/V))洗板三次后，以封閉液1/1000稀釋抗cmyc-tag單抗(9E10，購(gòu)自SANTA CRUTZ公司)，100μl/孔，37℃孵育1-2小時(shí)。
(5)加入第二抗體PBST洗板三次后，以封閉液1/10000稀釋HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG(購(gòu)自華美公司)，100μl/孔，37℃孵育1-2小時(shí)。
(6)顯色PBST洗板5次后，添加顯色液(48.6ml 0.1M檸檬酸，51.4ml0.2M Na2HPO4加水至1L，pH5.0，配成底物緩沖液；10ml底物緩沖液中加入4mg OPD即鄰苯二胺(Sigma公司)，15μl 30％H2O2配成顯色液)，100μl/孔，室溫避光顯色15-30分鐘。
(7)終止反應(yīng)添加終止液(2mol/L H2SO4)，100μl/孔。
(8)測(cè)定結(jié)果在490nm讀取吸光值。
上述結(jié)果表明，TNF-TeAb能與重組人TNF-α以高親和力結(jié)合，OD490與TNF-TeAb的濃度是呈現(xiàn)正相關(guān)的，TNF-TeAb與牛血清白蛋白(BSA)沒(méi)有結(jié)合活性，說(shuō)明TNF-TeAb是特異性結(jié)合的。ELISA結(jié)果見(jiàn)圖12。
實(shí)施例8ELISA方法檢測(cè)TNF-TeAb抑制TNF-α與其受體蛋白的結(jié)合TNF-α是通過(guò)結(jié)合其受體引起細(xì)胞特定的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)而發(fā)揮生理功能，L929細(xì)胞表面高效表達(dá)p55和p75兩種TNF受體，重組人TNF-α只與L929細(xì)胞受體p55特異結(jié)合，中和性的抗體可抑制TNF-α與其受體的結(jié)合，從而影響其生理功能的發(fā)揮。采用ELISA方法可在體外檢測(cè)到TNF-TeAb抑制重組人TNF-α與其受體結(jié)合。具體操作如下(1)培養(yǎng)、收集L929細(xì)胞(購(gòu)自美國(guó)ATCC)細(xì)胞培養(yǎng)條件為RPMI-1640液體培養(yǎng)基(GIBCO公司)，10％胎牛血清(黑龍江江海生物工程技術(shù)公司)，5％CO2，37℃孵箱培養(yǎng)；在細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期后，收集細(xì)胞2×106個(gè)。
(2)TNF受體蛋白的制備將上述收集的細(xì)胞用PBS緩沖液洗兩次，細(xì)胞重懸于0.8ml的PBS(含0.05％NaN3，1mmol/L EDTA)中，凍融2次，14,000rpm離心60分鐘，棄上清。沉淀重懸于0.8ml的PBS(含0.05％ NaN3，1mmol/L EDTA)中，超聲破碎細(xì)胞(輸出功率≤50％，脈沖20-30％，40秒，間隔超聲)至溶液清亮。12,000rpm離心30分鐘，取上清，測(cè)定蛋白濃度，儲(chǔ)存待用。
(3)ELISA操作將上述提取的L929細(xì)胞TNF受體蛋白包被96孔ELISA板，100μg/ml/孔4℃過(guò)夜，用4％的脫脂奶粉封閉各包被孔2小時(shí)，同時(shí)在另一塊ELISA板中每一行孔中加入50μl PBS，并從第3孔對(duì)單鏈抗體TNF-scFv和四價(jià)抗體TNF-TeAb進(jìn)行倍比稀釋到第12孔，留下第1和第2孔；于第2到第12孔中加入50μl TNF-α并使其終濃度為1μg/ml，留下第一孔，并用PBS補(bǔ)足到100μl，37℃保溫2小時(shí)。PBST洗滌包被板三次，每次1分鐘，將第二塊板對(duì)應(yīng)的各孔中的抗原抗體混合液轉(zhuǎn)入包被板的對(duì)應(yīng)的各孔中，37℃保溫1小時(shí)；于每孔中加入100μl抗TNF-α的單克隆抗體(5μg/ml)，37℃保溫1小時(shí)；PBST洗板3次，每次1分鐘，于每孔中加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG(1∶5000稀釋)，37℃保溫1小時(shí)；PBST洗板5次，每次1分鐘，于每孔中加入100顯色液，室溫避光顯色到滿意為止；于每孔中加入50μl2M的H2SO4終止反應(yīng)；利用酶標(biāo)儀讀取每孔在490nm的吸收值OD490，根據(jù)以下的公式計(jì)算抗體在不同濃度下的抑制率和IC50。上述實(shí)驗(yàn)每個(gè)濃度做雙復(fù)孔。抑制率的計(jì)算公式為[(ODAg-ODAg/Ab)/(ODAg-ODPBS)]×100％其中ODAg為只有TNF-α的孔的吸收值；ODAg/Ab為同時(shí)加有TNF-α和單鏈抗體或四價(jià)抗體的吸收值；ODPBS為不加TNF-α和單鏈抗體或四價(jià)抗體的吸收值。
上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果(見(jiàn)圖13)顯示，TNF-scFv和TNF-TeAb能夠抑制TNF-α與其受體的結(jié)合，抑制效應(yīng)對(duì)兩種抗體都顯示出劑量依賴性，抑制1μg/ml的TNF-α與其受體結(jié)合，TNF-TeAb 50％抑制的抗體濃度為大約為0.4μM，TNF-scFv 50％抑制的抗體濃度大約為3.2μM。
實(shí)施例9MTT法檢測(cè)TNF-TeAb抑制TNF-α對(duì)L929細(xì)胞的殺傷TNF-α受體是一種細(xì)胞死亡受體，可介導(dǎo)細(xì)胞的凋亡，中和性抗體可抑制TNF-α結(jié)合細(xì)胞表面受體，從而抑制TNF-α對(duì)敏感細(xì)胞的細(xì)胞毒效應(yīng)。MTT法可檢測(cè)TNF-TeAb抑制TNF-α對(duì)L929的細(xì)胞毒效應(yīng)。具體操作如下1.培養(yǎng)、收集L929細(xì)胞(美國(guó)ATCC)細(xì)胞培養(yǎng)條件為RPMI-1640液體培養(yǎng)基(GIBCO公司)，10％胎牛血清(黑龍江江海生物工程技術(shù)公司)，5％CO2，37℃孵箱培養(yǎng)；在細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期后，收集細(xì)胞2×106個(gè)。
2.用含10％胎牛血清的RPMI-1640液體培養(yǎng)基調(diào)整收集的細(xì)胞至2×105個(gè)/ml，加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100μl，于5％CO2，37℃孵箱培養(yǎng)過(guò)夜。
3.取另一塊細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔中加入100μl含有2％胎牛血清的RPMI-1640液體培養(yǎng)基，于每排的第3孔中加入100μl經(jīng)培養(yǎng)基稀釋至濃度為10μg/ml TNF-TeAb進(jìn)行倍比稀釋至第12孔，留下第1和第2孔。一共做2排，即每個(gè)樣品梯度做2復(fù)孔。
4.用含2％胎牛血清的RPMI-1640液體培養(yǎng)基稀釋重組人TNF-α至4ng/ml，并加入50μl于每排的第2孔到第12孔中，留下第1孔并用培養(yǎng)基補(bǔ)足到150μl。
5.用含2％胎牛血清的RPMI-1640液體培養(yǎng)基稀釋放線菌素D至濃度4μg/ml，并加入50μl于上述的每孔中，使其終濃度為1μg/ml。
6.將細(xì)胞培養(yǎng)板置37℃溫箱中孵育2小時(shí)，讓TNF-TeAb與TNF-α進(jìn)行充分的反應(yīng)。
7.棄去第一塊37℃孵箱培養(yǎng)過(guò)夜的細(xì)胞培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液，于上述的第二塊細(xì)胞培養(yǎng)板每孔中取100μl抗體/抗原反應(yīng)液加入到第一塊板相對(duì)應(yīng)的孔中。并將細(xì)胞板置5％CO2，37℃溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。
8.于細(xì)胞培養(yǎng)板的每孔中加入10μl濃度為500mg/ml的MTT溶液，置37℃溫箱中染色4小時(shí)。
9.棄去每孔中的液體，用PBS洗板一次，于每孔中加入100μl MTT溶劑二甲亞砜(DMSO)，置板于37℃溫箱中使MTT充分溶解。
10.用酶標(biāo)儀在570nm讀取上述每孔的吸收值(OD570)，計(jì)算上述每孔中對(duì)應(yīng)的細(xì)胞殺傷保護(hù)率。保護(hù)率(Inhibition rate)計(jì)算的公式為保護(hù)率(Inhibition rate)＝[(ODAb/Ag-ODAg)/(ODN-ODAg)]×100％其中，ODAb/Ag為同時(shí)含有TNF-TeAb和TNF-α的孔的吸收值；ODAg為僅含有TNF-α的孔的吸收值；ODN為既不含有TNF-TeAb也不含有TNF-α的孔的吸收值。計(jì)算每孔的保護(hù)率后，以抗體的濃度為橫軸，保護(hù)率為縱軸作一曲線，確定50％抑制時(shí)的TNF-TeAb濃度(IC50)。
上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明單鏈抗體TNF-scFv和四價(jià)抗體TNF-TeAb都能夠抑制TNF-α對(duì)L929細(xì)胞的細(xì)胞毒作用，抑制lng(20U)/ml TNF-α的細(xì)胞毒作用，單鏈TNF-scFv 50％抑制的濃度(IC50)為40nM，四價(jià)抗體的50％的抑制濃度(IC50)2.5nM。說(shuō)明四價(jià)抗體比單鏈抗體具有更高的中和活性。中和保護(hù)曲線見(jiàn)圖14。
實(shí)施例10四價(jià)抗體對(duì)膠原誘導(dǎo)的大鼠關(guān)節(jié)炎模型的治療作用(1)大鼠關(guān)節(jié)炎模型的建立27只SD雄性大鼠(購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所)年齡在6-7周，體重在150±10g，在SPF級(jí)的動(dòng)物房每天用標(biāo)準(zhǔn)的嚙齒動(dòng)物飼料進(jìn)行飼養(yǎng)，并供給必要的水份。隨機(jī)分成4組，即對(duì)照組(未致病組)5只、模型組(未用藥組或陰性對(duì)照組)10只、地塞米松治療組(陽(yáng)性藥物組)6只、四價(jià)抗體治療組(處理組)6只。除對(duì)照組外，其它組的每只大鼠在左后足跖皮內(nèi)注射0.1ml牛II型膠原CII乳劑(配方CII(購(gòu)于Sigma公司)溶解于0.1mol/L的醋酸中，濃度為4mg/mL，4度過(guò)夜。將CII溶液滴加入等量冰冷的不完全弗氏佐劑中，充分乳化混合，制成CII乳劑，其最終濃度為2mg/mL)進(jìn)行免疫，對(duì)照組注射不含CII的不完全弗氏佐劑制成的乳劑，初次免疫7天后，于尾巴根部皮內(nèi)注射0.1ml上述CII乳劑進(jìn)行強(qiáng)化，大鼠關(guān)節(jié)炎的形成一般在初次免疫的第20天發(fā)病。
(2)治療在大鼠開始出現(xiàn)臨床癥狀第一天開始給藥，四價(jià)抗體采用腹腔注射的方式，劑量為15mg/kg，注射濃度為1mg/ml，每周注射二次；以地塞米松這一特效抗炎藥物為對(duì)照藥物，并采用灌胃的方式給藥，劑量為0.1mg/kg，每天給藥一次，模型組的大鼠每天腹腔注射等體積的生理鹽水，治療時(shí)間為3周。
(3)治療效果的評(píng)價(jià)1.臨床評(píng)分采用足腫脹度，關(guān)節(jié)評(píng)分和嘶叫次數(shù)相結(jié)合的方法對(duì)多發(fā)性關(guān)節(jié)炎進(jìn)行評(píng)價(jià)。足腫脹度采用特制小尺測(cè)量大鼠踝關(guān)節(jié)的周長(zhǎng)的方法，關(guān)節(jié)評(píng)分根據(jù)下面的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，0分正常；1紅，2紅+輕腫；3嚴(yán)重腫；4關(guān)節(jié)變形，強(qiáng)直。每肢最高關(guān)節(jié)指數(shù)(arthritic index，AI)為4分，四肢AI之和代表每只動(dòng)物的AI，最高AI為16分。嘶叫次數(shù)的計(jì)數(shù)方法是以手握住大鼠后腿踝關(guān)節(jié)把大鼠足向內(nèi)側(cè)折，每腿折5次，計(jì)數(shù)大鼠總的嘶叫次數(shù)，嘶叫次數(shù)最高為10次。
通過(guò)3周的治療，四價(jià)抗體治療組和地塞米松治療組的大鼠關(guān)節(jié)炎臨床癥狀有了明顯的改善。圖15是治療過(guò)程中各組大鼠的臨床評(píng)分變化，可以看出，四價(jià)抗體TNF-TeAb治療組的臨床評(píng)分明顯低于模型組，略高于地塞米松治療組；圖16和圖17分別為治療過(guò)程中各組大鼠左后腿踝關(guān)節(jié)(致炎側(cè))與右后腿踝關(guān)節(jié)(非致炎側(cè))的周長(zhǎng)變化，可以看出，與模型組相比，四價(jià)抗體TNF-TeAb治療組和地塞米松治療組的大鼠的左右后腿踝關(guān)節(jié)的周長(zhǎng)都小于模型組，其中四價(jià)抗體TNF-TeAb治療組踝關(guān)節(jié)周長(zhǎng)略高于地塞米松組。表1和表2是治療3周后各實(shí)驗(yàn)組組的臨床評(píng)分和左右踝關(guān)節(jié)周長(zhǎng)的差異性統(tǒng)計(jì)，其中p＜0.05表示治療組與模型組具有明顯的差異，表3是治療3周后各實(shí)驗(yàn)組大鼠的嘶叫次數(shù)的差異性統(tǒng)計(jì)，結(jié)果表明四價(jià)抗體能明顯的降低關(guān)節(jié)炎大鼠的嘶叫次數(shù)(p＜0.05)，以上結(jié)果充分說(shuō)明四價(jià)抗體能明顯的改善關(guān)節(jié)炎大鼠的臨床癥狀。
表1治療3周后各組大鼠關(guān)節(jié)炎癥狀的臨床評(píng)分統(tǒng)計(jì)

表2治療3周后，各組大鼠后腿左右踝關(guān)節(jié)周長(zhǎng)的統(tǒng)計(jì)

表3治療3周后各組大鼠嘶叫次數(shù)的差異性統(tǒng)計(jì)

2.抗II型膠原抗體的變化抗II型膠原抗體的產(chǎn)生，預(yù)示大鼠產(chǎn)生了自身免疫反應(yīng)，大鼠血清中抗II型膠原抗體滴度的高低，直接反映了大鼠自身免疫反應(yīng)的強(qiáng)弱，同時(shí)與大鼠關(guān)節(jié)的炎癥反應(yīng)也是正相關(guān)的。通過(guò)測(cè)定治療組和對(duì)照組大鼠血清中抗II型膠原抗體滴度，可以評(píng)價(jià)藥物治療的效果。在治療21天后，處死大鼠并采血，制備血清。利用大鼠抗II型膠原抗體檢測(cè)試劑盒(Chondrex公司)檢測(cè)大鼠血清中抗II型膠原抗體的濃度，具體的操作見(jiàn)試劑盒說(shuō)明。通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，分析治療組和模型組抗II型膠原抗體的差異，來(lái)評(píng)價(jià)藥物治療的效果。表4是治療3周后，對(duì)照組、模型組、地塞米松治療組和四價(jià)抗體治療組的大鼠血清中抗II型膠原抗體的滴度及差異性統(tǒng)計(jì)。結(jié)果表明，通過(guò)3周的治療，四價(jià)抗體治療組和地塞米松治療組與模型組相比，抗II型膠原抗體都有明顯的下降p＜0.05。說(shuō)明四價(jià)抗體TNF-TeAb能夠明顯的降低關(guān)節(jié)炎大鼠的自身免疫反應(yīng)。
表4治療3周后，各組大鼠血清抗II型膠原抗體滴度的統(tǒng)計(jì)


3.細(xì)胞因子的變化腫瘤壞死因子α(TNF-α)和白細(xì)胞介素1β(IL-1β)是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病理中最為重要的兩個(gè)細(xì)胞因子，處于細(xì)胞因子調(diào)節(jié)的最上游，在人類類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中(RA)，TNF-α除可上調(diào)IL-1β、IL-6、IL-8等前炎性細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)外，同時(shí)還能上調(diào)血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子和細(xì)胞表面黏附分子的表達(dá)，這些前炎性細(xì)胞因子和黏附分子表達(dá)的上調(diào)是RA發(fā)病的最為直接的原因。另外TNF-α和IL-1β還是促進(jìn)關(guān)節(jié)骨組織和軟骨組織發(fā)生損傷的最主要的細(xì)胞因子，它們可作用于關(guān)節(jié)滑膜的纖維原細(xì)胞和軟骨細(xì)胞，促進(jìn)其分泌基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)，后者則介導(dǎo)骨和軟骨組織的損傷。在大鼠的關(guān)節(jié)炎模型中，TNF-α和IL-1β具有同樣的作用。故治療后TNF-α和IL-1β兩中前炎性細(xì)胞因子的變化將直接反映藥物的療效。本實(shí)施例對(duì)對(duì)照組、模型組和治療組的大鼠血清中TNF-α和IL-1β的進(jìn)行了定量檢測(cè)，具體操作按照TNF-α和IL-1β定量檢測(cè)試劑盒(購(gòu)自Biosource)。表5是治療3周后各組大鼠血清中TNF-α和IL-1β濃度的統(tǒng)計(jì)，結(jié)果表明通過(guò)治療后，地塞米松組治療組和四價(jià)抗體TNF-TeAb治療組兩種細(xì)胞因子的血清濃度都有所下降，其中TNF-α明顯的降低(p＜0.05)，IL-1β下降也比較明顯(p＜0.05)，說(shuō)明四價(jià)抗體TNF-TeAb具有明顯的抗炎作用。
表5治療3周后，各組大鼠血清前炎性細(xì)胞因子含量統(tǒng)計(jì)

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序列表<110>北京安波特基因工程技術(shù)有限公司<120>p53四聚化結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)的四價(jià)單鏈抗體<130>IB055022<160>5<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>243<212>PRT<213>人類<400>1Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu1 5 10 15Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr20 25 30Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met35 40 45Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe50 55 60Lys Glu His Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Val Phe65 70 75 80Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys85 90 95Ala Arg Glu Arg Gly Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser100 105 110Val Thr Val Ser Ser Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly115 120 125Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Arg Ser Ile Val Met Thr Gln Thr Pro130 135 140
Lys Phe Leu Leu Val Ser Ala Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Thr145 150 155 160Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp Val Val Trp Tyr Gln Gln Lys Pro165 170 175Gly Gln Ser Pro Lys Met Leu Met Tyr Ser Ala Phe Asn Arg Tyr Thr180 185 190Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Arg Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr195 200 205Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys210 215 220Gln Gln Asp Tyr Asn Ser Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu225 230 235 240Glu Ile Lys<210>2<211>26<212>PRT<213>人類<400>2Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu1 5 10 15Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Glu Leu20 25<210>3<211>42<212>PRT<213>人類<400>3Lys Lys Lys Pro Leu Asp Gly Glu Tyr Phe Thr Leu Gln Ile Arg Gly1 5 10 15
Arg Glu Arg Phe Glu Met Phe Arg Glu Leu Asn Glu Ala Leu Glu Leu20 25 30Lys Asp Ala Gln Ala Gly Lys Glu Pro Gly35 40<210>4<211>1005<212>DNA<213>人工序列<400>4cagatccagc tggttcagtc cggtccggaa ctgaaaaaac cgggtgaaac cgttaaaatc 60tcctgcaaag cttccggtta caccttcacc cactacggta tgaactgggt taaacaggct120ccgggtaaag gtctgaaatg gatgggttgg atcaacacct acaccggtga accgacctac180gctgacgact tcaaagaaca cttcgctttc tccctggaaa cctccgcttc caccgttttc240ctgcagatca acaacctgaa aaacgaagac accgctacct acttctgcgc tcgtgaacgt300ggtgacgcta tggactactg gggtcagggt acctccgtta ccgtttcctc cactagtgga360ggcggtggga gcggcggtgg tggttctggg ggtggcggaa gctctagatc catcgttatg420acccagaccc cgaaattcct gctggtttcc gctggtgacc gtgttaccat cacctgcacc480gcttcccagt ccgtttccaa cgacgttgtt tggtaccagc agaaaccggg tcagtccccg540aaaatgctga tgtactccgc tttcaaccgt tacaccggtg ttccggaccg tttcaccggt600cgtggttacg gtaccgactt caccttcacc atctcctccg ttcaggctga agacctggct660gtttacttct gccagcagga ctacaactcc ccgcgtacct tcggtggtgg taccaaactg720gaaatcaaag aattcgcgct ggaagtggat gaaacctatg tgccgaaaga atttaacgcg780gaaaccttta cctttcatgc ggatattgag ctcaaaaaaa aaccgctgga tggcgaatat840tttaccctgc agattcgcgg ccgcgaacgc tttgaaatgt ttcgcgaact gaacgaagcg900ctggaactga aagatgcgca ggcgggcaaa gaaccgggcg aacagaaact gattagcgaa960gaagatctga acggatccgt cgagcaccac caccaccacc actga 1005<210>5<211>334<212>PRT<213>人工序列
<400>5Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu1 5 10 15Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr20 25 30Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met35 40 45Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe50 55 60Lys Glu His Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Val Phe65 70 75 80Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys85 90 95Ala Arg Glu Arg Gly Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser100 105 110Val Thr Val Ser Ser Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly115 120 125Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Arg Ser Ile Val Met Thr Gln Thr Pro130 135 140Lys Phe Leu Leu Val Ser Ala Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Thr145 150 155 160Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp Val Val Trp Tyr Gln Gln Lys Pro165 170 175Gly Gln Ser Pro Lys Met Leu Met Tyr Ser Ala Phe Asn Arg Tyr Thr180 185 190Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Arg Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr195 200 205Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys210 215 220Gln Gln Asp Tyr Asn Ser Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
225 230 235 240Glu Ile Lys Glu Phe Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys245 250 255Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Glu Leu Lys260 265 270Lys Lys Pro Leu Asp Gly Glu Tyr Phe Thr Leu Gln Ile Arg Gly Arg275 280 285Glu Arg Phe Glu Met Phe Arg Glu Leu Asn Glu Ala Leu Glu Leu Lys290 295 300Asp Ala Gln Ala Gly Lys Glu Pro Gly Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu305 310 315 320Glu Asp Leu Asn Gly Ser Ala Glu His His His His His His325 330
權(quán)利要求
1.一種四價(jià)的單鏈抗體，其特征在于由單鏈抗體與介導(dǎo)人類抑癌蛋白p53四聚體形成的結(jié)構(gòu)域(四聚化結(jié)構(gòu)域)構(gòu)成的融合蛋白在表達(dá)后自然聚合而成。
2.權(quán)利要求1所述的四價(jià)單鏈抗體，其特征在于由單鏈抗體、HSA連接肽和p53四聚化結(jié)構(gòu)域依次連接而成。
3.權(quán)利要求1所述的四價(jià)單鏈抗體，其中所述的單鏈抗體是抗TNF-α抗體。
4.權(quán)利要求3所述的四價(jià)單鏈抗體，其中所述抗TNF-α抗體可以是單鏈抗體片段，抗體Fab片段或單域抗體片段。
5.權(quán)利要求1所述的四價(jià)單鏈抗體，其特征在于所述的四價(jià)單鏈抗體的C-末端可帶有C-myc標(biāo)簽和組氨酸標(biāo)簽。
6.權(quán)利要求3所述的四價(jià)單鏈抗體，該抗體是由抗人TNF-α單鏈抗體，HSA連接肽和人類抑癌蛋白p53四聚化結(jié)構(gòu)域依次連接而成，所述的人TNF-α單鏈抗體具有SEQ ID NO1所示的氨基酸序列。
7.權(quán)利要求3所述的四價(jià)單鏈抗體，該抗體是由抗人TNF-α單鏈抗體，HSA連接肽和人類抑癌蛋白p53四聚化結(jié)構(gòu)域依次連接而成，所述的HSA連接肽具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
8.權(quán)利要求3所述的四價(jià)單鏈抗體，該抗體是由抗人TNF-α單鏈抗體，HSA連接肽和人類抑癌蛋白p53四聚化結(jié)構(gòu)域依次連接而成，所述介導(dǎo)人類抑癌蛋白p53四聚體形成的結(jié)構(gòu)域具有SEQ ID NO3所示的氨基酸序列。
9.權(quán)利要求3所述的四價(jià)單鏈抗體，其特征在于該抗體是由抗人TNF-α單鏈抗體，HSA連接肽和人類抑癌蛋白p53四聚化結(jié)構(gòu)域依次連接而成的TNF-TeAb，具有SEQ ID NO5所示的氨基酸序列。
10.DNA序列，其特征在于編碼權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的四價(jià)單鏈抗體。
11.權(quán)利要求10所述的DNA序列，其具有SEQ ID NO4所示的核苷酸序列。
12.一種表達(dá)載體，其特征在于含有權(quán)利要求10或11所述的DNA序列。
13.權(quán)利要求12的表達(dá)載體，其是TNF-TeAb/pTTA。
14.一種宿主細(xì)胞，其特征在于含有權(quán)利要求12或13的表達(dá)載體。
15.權(quán)利要求14的宿主細(xì)胞，其是大腸桿菌。
16.權(quán)利要求15的宿主細(xì)胞，其中所述大腸桿菌是含有權(quán)利要求12或13的表達(dá)載體的BL21(DE3)star大腸桿菌。
17.一種構(gòu)建基因工程四價(jià)單鏈抗體的方法，其特征在于把單鏈抗體編碼序列和人p53蛋白四聚化結(jié)構(gòu)域的編碼序列進(jìn)行串聯(lián)表達(dá)。
18.一種復(fù)性權(quán)利要求1-9中任何一項(xiàng)的四價(jià)單鏈抗體的方法，其特征在于用硼酸鹽緩沖液為復(fù)性液，通過(guò)緩慢透析的方法逐漸去除變性劑尿素，使變性的的四價(jià)單鏈抗體重新折疊成有具有生物學(xué)活性的蛋白。
19.一種用于治療或預(yù)防急慢性炎癥性疾病如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬、局限性回腸炎、僵直性脊椎炎、急性眼葡萄膜炎、急性膿毒血癥和腦脊髓膜炎的藥物組合物，其特征在于包含權(quán)利要求1-9中任何一項(xiàng)的四價(jià)單鏈抗體和藥用載體。
20.權(quán)利要求1-9中任何一項(xiàng)的四價(jià)單鏈抗體在制備用于治療或預(yù)防急慢性炎癥性疾病如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬、局限性回腸炎、僵直性脊椎炎、急性眼葡萄膜炎、急性膿毒血癥和腦脊髓膜炎的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種基因工程四價(jià)抗體，其特征在于由抗TNF－α抗體、HSA連接肽和人類抑癌蛋白p53四聚化結(jié)構(gòu)域依次連接而成。更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及抗TNF－α的基因工程四價(jià)單鏈抗體TNF－TeAb，該抗體是將一種抗人TNF－α單鏈抗體片段和介導(dǎo)人類抑癌蛋白p53的四聚體形成的結(jié)構(gòu)域片段通過(guò)HSA連接肽串聯(lián)在一起構(gòu)建而成的，并可在其C－末端添加C－myc標(biāo)簽和組氨酸標(biāo)簽((His)
文檔編號(hào)A61P29/00GK1948343SQ200510109319
公開日2007年4月18日 申請(qǐng)日期2005年10月14日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月14日
發(fā)明者黃華樑, 劉夢(mèng)元, 王祥斌, 尹長(zhǎng)城, 林晴 申請(qǐng)人:北京安波特基因工程技術(shù)有限公司