專利名稱：一種藥物組合物的質(zhì)量控制方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是一種藥物組合物的質(zhì)量控制方法，屬于藥品的技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：
心腦血管疾病如冠心病、腦血栓、老年性癡呆等均是當(dāng)今世界最常見和危害最大的疾病之一，在許多國家已成為人口死亡的主要原因之一；據(jù)調(diào)查，近年來的發(fā)病率有逐年增高趨勢，而且中、青年患者不斷增加，心腦缺血性疾病已成為危害我國人民健康的常見病、多發(fā)?。粸榱诉_(dá)到防治目的，許多發(fā)明人及藥品企業(yè)對其做了大量的研究工作。藥物制劑必須要在保證產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定可控安全的基礎(chǔ)之上，才能不斷的更新發(fā)展，為了更好的控制該制劑的質(zhì)量，保證用藥的安全性，更好的指導(dǎo)生產(chǎn)，使工藝控制更加嚴(yán)格合理，使消費者能全面認(rèn)識產(chǎn)品質(zhì)地，需要研究、控制該藥物組合物質(zhì)量的方法；目前，在相關(guān)藥物制劑中，一般僅以野黃芩苷、黃芪甲苷、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1中的某種成分為檢測指標(biāo)，但是它根本不能全面反應(yīng)產(chǎn)品的質(zhì)量，僅以此用來控制藥物組合物的質(zhì)量不是十分合理；如果用別的指標(biāo)進(jìn)行控制，由于沒有現(xiàn)成的檢測方案、檢測條件等等，所以比較難于實施。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種新的藥物組合物的質(zhì)量控制方法。這種方法向相關(guān)的生產(chǎn)、檢測機(jī)構(gòu)提供了檢測的指標(biāo)、檢測的手段、技術(shù)方法等等，以便更好的控制該制劑的質(zhì)量，保證用藥的安全性，能夠更好的指導(dǎo)生產(chǎn)，使生產(chǎn)工藝控制更加嚴(yán)格合理，使消費者能全面認(rèn)識產(chǎn)品質(zhì)地。
該藥物組合物的藥味組成及配比如下(按重量份) 由燈盞花素0.1～50份、黃芪10～5000份與三七10～5000份制作而成；或是由相應(yīng)重量份黃芪藥材、三七藥材經(jīng)提取精制后得到的提取物與相應(yīng)重量份燈盞花素加適當(dāng)輔料制作而成。
上述藥物組合物的劑型為注射劑或口服制劑；其中注射劑包括直接用于注射給藥的注射液、直接供靜脈滴注的靜脈輸液、需稀釋后用于靜脈滴注的注射用濃溶液和用冷凍干燥法或噴霧干燥法制備的注射用無菌粉末或無菌塊狀物；口服制劑包括片劑、分散片劑、膠囊劑、軟膠囊劑、微囊劑、顆粒劑、丸劑、微丸劑、散劑、滴丸劑、緩釋制劑、控釋制劑、口服液體制劑、凝膠劑、煎膏劑、浸膏劑和膜劑。臨床上用于治療冠心病、心絞痛、心律失常、腦血栓、老年性癡呆、肝腎綜合癥、心肺病、糖尿病及其并發(fā)癥等疾病。
本發(fā)明是這樣構(gòu)成的 藥物組合物的質(zhì)量控制方法，其特征在于該方法包括以下全部或部分內(nèi)容 (1)指紋圖譜測試，包括以黃芪黃酮類成分特征為主的指紋圖譜和以黃芪皂苷類、三七皂苷類成分特征為主的指紋圖譜中的一種或兩種； (2)黃芪對照藥材、三七對照藥材、野黃芩苷、黃芪甲苷、芒柄花素、毛蕊異黃酮、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1中全部或部分成分的鑒別測試方法； (3)野黃芩苷、黃芪甲苷、芒柄花素、毛蕊異黃酮、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、總皂苷、總多糖中全部或部分成分的含量測試方法。
所述的以燈盞花素、三七、黃芪制成的藥物組合物的質(zhì)量控制方法，其特征在于該方法采用液相色譜法測試以黃芪黃酮類成分特征為主的指紋圖譜和以黃芪皂苷類、三七皂苷類成分特征為主的指紋圖譜中的一種或兩種 a、采用液相色譜法測試以黃芪黃酮類成分特征為主的指紋圖譜 (1)供試品溶液的制備供試品溶液的制備取待測藥物組合物適量，加水或甲醇或乙醇溶解或稀釋，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液； (2)參照物溶液的制備取芒柄花素，用甲醇或乙醇溶解，定容至合適濃度，作為參照物溶液； (3)色譜條件色譜柱采用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料流動相為乙腈或甲醇-水或0.1％～5％冰醋酸或0.1％～5％甲酸或0.005％～5％磷酸溶液，梯度洗脫，流速為0.5～2.0ml/min、檢測波長為190-400nm范圍內(nèi)的一個或幾個，柱溫在20～60℃范圍內(nèi)； (4)標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的制定以上述方法作為制定以黃芪黃酮類成分特征為主的指紋圖譜的測試手段；依據(jù)10批或10批以上供試品所測得的圖譜，制定標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，以確定的參照物色譜峰的保留時間為基準(zhǔn)，計算其它共有色譜峰的相對保留時間，所述標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜中，共有峰有3～50個； (5)以(1)～(3)所述方法作為待測藥物組合物中以黃芪黃酮類成分特征為主的指紋圖譜的測試手段，制備待測樣品的指紋圖譜； (6)將待測藥物組合物的指紋圖譜與上述標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜對比，應(yīng)符合下列要求中的部分或全部 I.計算待測藥物組合物的指紋圖譜與標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的相似度，應(yīng)為0.80～1.00； II.待測藥物組合物指紋圖譜中，非共有峰面積不得超過總峰面積的10％； III.除參照物色譜峰之外的其他共有色譜峰與參照物色譜峰的相對保留時間與標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜比較，相對偏差不得超過±20％； b、采用液相色譜法測試以黃芪皂苷類、三七皂苷類成分特征為主的指紋圖譜 (1)供試品溶液的制備取待測藥物組合物適量，加甲醇或乙醇或水稀釋至合適濃度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液； (2)參照物溶液的制備取適量黃芪和三七藥材中的主要活性成分對照品，包括人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、三七皂苷R1、黃芪甲苷中的一種，用水或甲醇或乙醇溶解，定容至合適濃度，作為參照物溶液； (3)色譜條件色譜柱采用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料流動相為乙腈或甲醇-水或0.1％～5％冰醋酸或0.1％～5％甲酸或0.005％～5％磷酸溶液，梯度洗脫，流速為0.5～2.0ml/min、檢測波長為190～400nm范圍內(nèi)的一個或幾個或蒸發(fā)光散射檢測器檢測，柱溫在20～60℃范圍內(nèi)； (4)標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的制定以上述方法作為制定以黃芪皂苷類、三七皂苷類成分特征為主的指紋圖譜的測試手段；依據(jù)10批或10批以上供試品所測得的圖譜，制定標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，以確定的參照物色譜峰的保留時間為基準(zhǔn)，計算其它共有色譜峰的相對保留時間，所述標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜中，共有峰有3～40個； (5)以(1)～(3)所述方法作為待測藥物組合物中以黃芪皂苷類、三七皂苷類成分特征為主的指紋圖譜的測試手段，制備待測樣品的指紋圖譜； (6)將待測藥物組合物的指紋圖譜與上述標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜對比，應(yīng)符合下列要求中的部分或全部 I.計算待測藥物組合物的指紋圖譜與標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的相似度，應(yīng)為0.80～1.00； II.待測藥物組合物指紋圖譜中，非共有峰面積不得超過總峰面積的10％； III.除參照物色譜峰之外的其他共有色譜峰與參照物色譜峰的相對保留時間與標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜比較，相對偏差不得超過±20％。
所述的以燈盞花素、三七、黃芪制成的藥物組合物的質(zhì)量控制方法，其特征在于該方法采用液相色譜法測試以黃芪黃酮類成分特征為主的指紋圖譜和以黃芪皂苷類、三七皂苷類成分特征為主的指紋圖譜中的一種或兩種 a、采用液相色譜法測試以黃芪黃酮類成分特征為主的指紋圖譜 (1)供試品溶液的制備精密稱取待測藥物組合物適量，加水制成每1ml含1mg的溶液，搖勻，即得； (2)參照物溶液的制備取芒柄花素，用甲醇溶解并稀釋至合適濃度，作為參照物溶液； (3)色譜條件色譜柱采用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料流動相為乙腈-水，梯度洗脫，溶劑比例為從0分鐘至20分鐘，乙腈的比例為從4％升至25％，從20分鐘至40分鐘，乙腈的比例為從25％升至45％，從40分鐘至60分鐘，乙腈的比例為從45％升至70％，從60分鐘至70分鐘，乙腈的比例為從70％升至80％，從70分鐘至80分鐘，乙腈的比例為從80％升至100％，流速為1ml/min、檢測波長為254±2nm，柱溫25℃； (4)標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的制定以上述方法作為制定以黃芪黃酮類成分特征為主的指紋圖譜的測試手段；依據(jù)10批或10批以上供試品所測得的圖譜，制定標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，以確定的參照物色譜峰的保留時間為基準(zhǔn)，計算其它共有色譜峰的相對保留時間，所述標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜中，共有峰有3～30個； (5)以(1)～(3)所述方法作為待測藥物組合物中以黃芪黃酮類成分特征為主的指紋圖譜的測試手段，制備待測樣品的指紋圖譜； (6)將待測藥物組合物的指紋圖譜與上述標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜對比，應(yīng)符合下列要求中的部分或全部 I.計算待測藥物組合物的指紋圖譜與標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的相似度，應(yīng)為0.90～1.00； II.待測藥物組合物指紋圖譜中，非共有峰面積不得超過總峰面積的5％； III.除參照物色譜峰之外的其他共有色譜峰與參照物色譜峰的相對保留時間與標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜比較，相對偏差不得超過±10％； b、采用液相色譜法測試以黃芪皂苷類、三七皂苷類成分特征為主的指紋圖譜 (1)供試品溶液的制備精密稱取待測藥物組合物適量，加甲醇制成每1ml含50mg的溶液，搖勻，即得； (2)參照物溶液的制備精密稱取人參皂苷Rg1適量，加甲醇制成每1ml含0.3mg的溶液，作為參照物溶液； (3)色譜條件色譜柱采用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料流動相為乙腈-水，梯度洗脫，溶劑比例為從0分鐘至14分鐘，乙腈的比例為15％，從14分鐘至45分鐘，乙腈的比例為從15％升至30％，從45分鐘至60分鐘，乙腈的比例為從30％升至80％，流速為1ml/min、檢測波長203±2nm，柱溫30℃； (4)標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的制定以上述方法作為制定以黃芪皂苷類、三七皂苷類成分特征為主的指紋圖譜的測試手段；依據(jù)10批或10批以上供試品所測得的圖譜，制定標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，以確定的參照物色譜峰的保留時間為基準(zhǔn)，計算其它共有色譜峰的相對保留時間，所述標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜中，共有峰有3～20個； (5)以(1)～(3)所述方法作為待測藥物組合物中以黃芪皂苷類、三七皂苷類成分特征為主的指紋圖譜的測試手段，制備待測樣品的指紋圖譜； (6)將待測藥物組合物的指紋圖譜與上述標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜對比，應(yīng)符合下列要求中的部分或全部 I.計算待測藥物組合物的指紋圖譜與標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的相似度，應(yīng)為0.90～1.00； II.待測藥物組合物指紋圖譜中，非共有峰面積不得超過總峰面積的5％； III.除參照物色譜峰之外的其他共有色譜峰與參照物色譜峰的相對保留時間與標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜相比，相對偏差不得超過±10％。
所述的以燈盞花素、三七、黃芪制成的藥物組合物的質(zhì)量控制方法，其特征在于所述藥物組合物的鑒別方法包括以下中的一種或幾種 a、藥物組合物中野黃芩苷的薄層色譜鑒別方法 取待測藥物組合物適量，加醋酸乙酯或乙醇或甲醇或正丁醇提取，濾過或離心，取濾液或上清液作為供試品溶液；另取野黃芩苷對照品，加甲醇或乙醇制成每1ml含1mg的溶液，作為對照品溶液；采用中國藥典附錄公開的薄層色譜法試驗，吸取上述溶液各1～30μl，分別點于同一硅膠G薄層板或硅膠H薄層板或硅膠GF254薄層板或聚酰胺薄膜上，以醋酸乙酯或甲酸乙酯-甲酸或乙酸-水或甲醇0.2～60∶0.2～10∶0.3～20或苯或甲苯-醋酸乙酯或甲酸乙酯-甲酸或乙酸-水1～30∶0.5～15∶0.05～5∶0.01～3為展開劑，展開，取出，晾干，噴以0.3％～10％三氯化鋁乙醇或0.3～10％三氯化鋁甲醇溶液或0.3～10％三氯化鐵乙醇溶液，置日光下或紫外光燈365nm或254nm下檢視或105℃烘1～15分鐘后置日光下或紫外光燈365nm或254nm下檢視，供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，應(yīng)顯相同顏色斑點； b、藥物組合物中野黃芩苷的液相色譜鑒別方法 取待測藥物組合物適量，加甲醇或乙醇或流動相或水溶解或稀釋至合適濃度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液；以野黃芩苷對照品的甲醇或乙醇溶液為對照，采用液相色譜法，色譜柱用十八烷基硅烷鍵合硅膠或八烷基硅烷鍵合硅膠或二烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以甲醇或乙腈-水或0.05％～10％冰醋酸水溶液或0.05％～10％甲酸水溶液或0.01％～5％磷酸水溶液5％～95％∶95％～5％或甲醇或乙腈-四氫呋喃-0.01％～5％磷酸水溶液2％～30％∶2％～30％∶96％～40％或乙腈-0.005 moL/L～0.3moL/L磷酸二氫鈉(1～99％磷酸調(diào)pH＝2.0～5.0)梯度洗脫系統(tǒng)為流動相，檢測波長為200～410nm；供試品色譜中，應(yīng)具與對照品色譜有保留時間一致的色譜峰； c、藥物組合物中三七、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、三七皂苷R1中一種或幾種的薄層色譜鑒別方法 取待測藥物組合物適量，用正丁醇或乙醇或甲醇或醋酸乙酯或三氯甲烷提取，濾過，濾液作為供試品溶液；另取三七對照藥材、人參皂苷Rg1對照品、人參皂苷Rb1對照品、三七皂苷R1對照品中的一種或幾種，制備對照溶液；三七對照藥材溶液的制備取三七對照藥材適量，加三氯甲烷或二氯甲烷或乙醚回流提取，棄去三氯甲烷或二氯甲烷或乙醚液，殘渣加水飽和正丁醇或醋酸乙酯提取，提取液加氨試液，分取上層，蒸干，殘渣用甲醇或乙醇溶解，作為對照藥材溶液；對照品溶液的制備取人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、三七皂苷R1中的一種或幾種對照品，分別加甲醇或乙醇制成每1ml含2mg的溶液，作為對照品溶液；采用中國藥典附錄公開的薄層色譜法試驗，吸取上述溶液各1～30μl，分別點于同一硅膠G薄層板或硅膠H薄層板或硅膠GF254薄層板上，以三氯甲烷-醋酸乙酯或甲酸乙酯-甲醇-水5～40∶10～100∶5～50∶0.2～30 10℃以下放置的下層溶液或正丁醇-醋酸乙酯或甲酸乙酯-水1～10∶0.2～2∶1～15的上層為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5～50％硫酸乙醇試劑或50％硫酸試劑，80℃～160℃烘至斑點顯色清晰，分別置日光及紫外光燈365nm下檢視，供試品色譜中，在與對照藥材色譜及對照品色譜相應(yīng)的位置上，應(yīng)顯相同顏色的斑點； d、藥物組合物中人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、三七皂苷R1中一種或幾種的液相色譜鑒別 取待測藥物組合物適量，置量瓶中，加水或甲醇或流動相或乙醇至刻度，搖勻，用微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液；以人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、三七皂苷R1中的一種或幾種對照品的甲醇或乙醇溶液為對照，采用液相色譜法，色譜柱用十八烷基硅烷鍵合硅膠或八烷基硅烷鍵合硅膠或二烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，甲醇或乙腈-水或0.5％～5％冰醋酸水溶液或0.02％～5％磷酸水溶液或0.5％～5％甲酸溶液5％～40％∶95％～60％為流動相，梯度洗脫，流速為0.5～2.0ml/min，檢測波長為190～410nm范圍內(nèi)的一個或幾個或蒸發(fā)光檢測器檢測，柱溫在20～60℃范圍內(nèi)；供試品色譜中，應(yīng)具與對照品色譜有保留時間一致的色譜峰； e、藥物組合物中黃芪的薄層色譜鑒別方法 取待測藥物組合物適量，加醋酸乙酯或乙醇或甲醇或正丁醇提取，濾過，濾液蒸干，殘渣加0.05％～5％氫氧化鈉溶液溶解，濾過，濾液用鹽酸條件pH值至3～6，用醋酸乙酯或正丁醇提取，濾過，濾液蒸干，殘渣加醋酸乙酯或甲醇或乙醇溶解，作為供試品溶液；另取黃芪對照藥材、同法制成對照藥材溶液；采用中國藥典附錄公開的薄層色譜法試驗，吸取上述溶液各1～30μl，分別點于同一硅膠G薄層板或硅膠H薄層板或硅膠GF254薄層板或聚酰胺薄膜上，以三氯甲烷或二氯甲烷-甲醇或乙醇1～30∶0.2～10為展開劑，展開，取出，晾干，置氨蒸汽中熏后置日光下或紫外光燈365nm或254nm下檢視，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，應(yīng)顯相同顏色斑點； f、藥物組合物中黃芪甲苷的薄層色譜鑒別方法 取待測藥物組合物適量，加甲醇或乙醇溶解后加于中性氧化鋁柱，用10％～70％甲醇洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣加水溶解后加水飽和正丁醇提取，合并正丁醇液，用水洗滌，棄去水液，正丁醇液蒸干，殘渣用甲醇溶解，作為供試品溶液；另取黃芪甲苷對照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作為對照品溶液；采用中國藥典附錄公開的薄層色譜法試驗，吸取上述溶液各1～30μl，分別點于同一硅膠G薄層板或硅膠H薄層板或硅膠GF254薄層板或聚酰胺薄膜上，以三氯甲烷或二氯甲烷-甲醇或乙醇-水1～30∶1～20∶0.2～10的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以2％～50％硫酸乙醇溶液，80～160℃加熱至斑點顯色清晰，置日光下或紫外光燈365nm或254nm下檢視，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，應(yīng)顯相同顏色斑點； g、藥物組合物中黃芪甲苷的液相色譜鑒別方法 取待測藥物組合物適量，加水溶解后用正丁醇或醋酸乙酯提取，合并提取液，用氨試液洗滌，棄去氨液，正丁醇液蒸干，殘渣加水溶解后通過D101大孔吸附樹脂柱，依次用水、40％乙醇或70％乙醇洗脫，收集70％乙醇洗脫部分，蒸干，殘渣用甲醇溶解或稀釋至合適濃度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液；以黃芪甲苷對照品的甲醇或乙醇溶液為對照，采用液相色譜法，色譜柱用十八烷基硅烷鍵合硅膠或八烷基硅烷鍵合硅膠或二烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，15％～85％∶85％～15％甲醇或乙腈-水或0.05％～10％冰醋酸水溶液或0.05％～10％甲酸水溶液或0.01％～5％磷酸水溶液為流動相，檢測波長為190～410nm或蒸發(fā)光散射檢測器檢測，柱溫在20～60℃范圍內(nèi)；供試品色譜中，應(yīng)具與對照品色譜有保留時間一致的色譜峰； h、藥物組合物中芒柄花素、毛蕊芒柄花素的一種或兩種的薄層色譜鑒別方法 取待測藥物組合物適量，加甲醇或乙醇提取，提取液作為供試品溶液；另取芒柄花素、毛蕊芒柄花素對照品中的一種或兩種，加甲醇制成每1ml各含1mg的溶液，作為對照品溶液；采用中國藥典附錄公開的薄層色譜法試驗，吸取上述溶液各1～30μl，分別點于同一硅膠G薄層板或硅膠H薄層板或硅膠GF254薄層板上，以三氯甲烷或二氯甲烷-甲醇或乙醇-醋酸乙酯或甲酸乙酯-水0.5～10∶1～15∶1～20∶0.1～3為展開劑，展開，取出，晾干，置日光下或紫外光燈365nm或254nm下檢視，供試品色譜中，在與對照品色譜與對照藥材相應(yīng)的位置上，應(yīng)顯相同顏色斑點； i、藥物組合物中芒柄花素、毛蕊芒柄花素的一種或兩種的液相色譜鑒別方法 取待測藥物組合物適量，加甲醇或乙醇提取，提取液作為供試品溶液；以芒柄花素、毛蕊芒柄花素對照品的甲醇或乙醇溶液為對照，采用液相色譜法，色譜柱用十八烷基硅烷鍵合硅膠或八烷基硅烷鍵合硅膠或二烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，流動相A為甲醇或乙腈，流動相B為水或0.05％～10％冰醋酸水溶液或0.05％～10％甲酸水溶液或0.01％～5％磷酸水溶液為流動相，梯度洗脫，檢測波長為190～410nm，柱溫在20～60℃范圍內(nèi)；供試品色譜中，應(yīng)具與對照品色譜有保留時間一致的色譜峰。
所述的以燈盞花素、三七、黃芪制成的藥物組合物的質(zhì)量控制方法，其特征在于所述藥物組合物的鑒別方法包括以下中的一種或幾種 a、藥物組合物中野黃芩苷的薄層色譜鑒別方法 取待測藥物組合物適量，加甲醇提取，離心，取上清液作為供試品溶液；另取野黃芩苷對照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作為對照品溶液；采用中國藥典附錄公開的薄層色譜法試驗，吸取上述溶液各3μl，分別以條狀帶點于同一聚酰胺膜上，以甲醇-醋酸乙酯-甲酸7∶2∶1為展開劑，展開，取出，晾干，噴以2％三氯化鐵乙醇溶液，供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的條斑； b、藥物組合物中野黃芩苷的液相色譜鑒別方法 取待測藥物組合物適量，加甲醇溶解或稀釋至合適濃度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液；以野黃芩苷對照品的甲醇或乙醇溶液為對照，采用液相色譜法，色譜柱用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，甲醇-0.1％磷酸水溶液50％∶50％為流動相，檢測波長為335nm；供試品色譜中，具與對照品色譜有保留時間一致的色譜峰； c、藥物組合物中三七、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、三七皂苷R1中一種或幾種的薄層色譜鑒別方法 取待測藥物組合物適量，用正丁醇提取，濾過，濾液作為供試品溶液；另取三七對照藥材、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、三七皂苷R1中的一種或幾種，制備對照藥材溶液；三七對照藥材溶液的制備取三七對照藥材適量，加三氯甲烷回流提取，棄去三氯甲烷液，殘渣加水飽和正丁醇提取，提取液加氨試液，分取上層，蒸干，殘渣用甲醇溶解，作為對照藥材溶液；對照品溶液的制備取人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、三七皂苷R1中的一種或幾種對照品，分別加甲醇制成每1ml含2mg的溶液，作為對照品溶液；采用中國藥典附錄公開的薄層色譜法試驗，吸取上述溶液各5μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-醋酸乙酯-甲醇-水15∶40∶22∶10在10℃以下放置的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10％硫酸乙醇試劑，105℃烘至斑點顯色清晰，分別置日光及紫外光燈365nm下檢視，供試品色譜中，在與對照藥材色譜及對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點； d、藥物組合物中人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、三七皂苷R1中一種或幾種的液相色譜鑒別 取待測藥物組合物適量，置量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，用微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液；以人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、三七皂苷R1中的一種或幾種對照品的甲醇溶液為對照，采用液相色譜法，色譜柱用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，乙腈-水為流動相，梯度洗脫，溶劑比例為從0分鐘至15分鐘，乙腈的比例為20％，從15分鐘至21分鐘，乙腈的比例由20％上升至40％，從21分鐘至25分鐘，乙腈的比例為20％；流速為1.0ml/min，檢測波長203nm，柱溫在30℃；供試品色譜中，具與對照品色譜有保留時間一致的色譜峰； e、藥物組合物中黃芪的薄層色譜鑒別方法 取待測藥物組合物適量，加乙醇提取，濾過，濾液蒸干，殘渣加0.3％氫氧化鈉溶液溶解，濾過，濾液用鹽酸條件pH值至5～6，用醋酸乙酯提取，濾過，濾液蒸干，殘渣加醋酸乙酯溶解，作為供試品溶液；另取黃芪對照藥材、同法制成對照藥材溶液；采用中國藥典附錄公開的薄層色譜法試驗，吸取上述溶液各10μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇10∶1為展開劑，展開，取出，晾干，置氨蒸汽中熏后置紫外光燈365nm下檢視，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色斑點； f、藥物組合物中黃芪甲苷的薄層色譜鑒別方法 取待測藥物組合物適量，加甲醇溶解后加于中性氧化鋁柱，用40％甲醇洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣加水溶解后加水飽和正丁醇提取，合并正丁醇液，用水洗滌，棄去水液，正丁醇液蒸干，殘渣用甲醇溶解，作為供試品溶液；另取黃芪甲苷對照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作為對照品溶液；采用中國藥典附錄公開的薄層色譜法試驗，吸取上述溶液各2μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水13∶7∶2的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10％硫酸乙醇溶液，105℃加熱至斑點顯色清晰，置日光下及紫外光燈365nm下檢視，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，應(yīng)顯相同顏色斑點； g、藥物組合物中黃芪甲苷的液相色譜鑒別方法 取待測藥物組合物適量，加水溶解后用水飽和正丁醇提取，合并提取液，用氨試液洗滌，棄去氨液，正丁醇液蒸干，殘渣加水溶解后通過D101大孔吸附樹脂柱，依次用水、40％乙醇或70％乙醇洗脫，收集70％乙醇洗脫部分，蒸干，殘渣用甲醇溶解或稀釋至合適濃度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液；以黃芪甲苷對照品的甲醇或乙醇溶液為對照，采用液相色譜法，色譜柱用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，32％∶68％乙腈-水為流動相，蒸發(fā)光散射檢測器檢測，柱溫30℃；供試品色譜中，具與對照品色譜有保留時間一致的色譜峰； h、藥物組合物中芒柄花素、毛蕊芒柄花素的一種或兩種的薄層色譜鑒別方法 取待測藥物組合物適量，加甲醇提取，提取液作為供試品溶液；另取芒柄花素、毛蕊芒柄花素中的一種或兩種，加甲醇制成每1ml各含1mg的溶液，作為對照品溶液；采用中國藥典附錄公開的薄層色譜法試驗，吸取上述溶液各5μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-醋酸乙酯-水2.5∶3∶4∶0.5為展開劑，展開，展距5cm，取出，晾干，置紫外光燈365nm下檢視，供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色斑點； i、藥物組合物中芒柄花素、毛蕊芒柄花素的一種或兩種的液相色譜鑒別方法 取待測藥物組合物適量，加甲醇提取，提取液作為供試品溶液；以芒柄花素、毛蕊芒柄花素對照品的甲醇溶液為對照，采用液相色譜法，色譜柱用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，流動相A為甲醇，流動相B為水，梯度洗脫，溶劑比例為從0分鐘至10分鐘，水的比例為從40％升至50％，從10分鐘至20分鐘，水的比例為從50％升至60％，從30分鐘至50分鐘，水的比例為60％，檢測波長為250nm，柱溫30℃；供試品色譜中，具與對照品色譜有保留時間一致的色譜峰。
所述的以燈盞花素、三七、黃芪制成的藥物組合物的質(zhì)量控制方法，其特征在于所述藥物組合物含量的測試方法應(yīng)包括以下中的一種或幾種 a、藥物組合物中野黃芩苷的含量測定 取待測藥物組合物適量，加甲醇或乙醇或流動相或水溶解或稀釋至合適濃度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液；以野黃芩苷對照品的甲醇或乙醇溶液為對照，采用液相色譜法，色譜柱用十八烷基硅烷鍵合硅膠或八烷基硅烷鍵合硅膠或二烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以甲醇或乙腈-水或0.05％～10％冰醋酸水溶液或0.05％～10％甲酸水溶液或0.01％～5％磷酸水溶液5％～95％∶95％～5％或甲醇或乙腈-四氫呋喃-0.01％～5％磷酸水溶液2％～30％∶2％～30％∶96％～40％或乙腈-0.005moL/L～0.3moL/L磷酸二氫鈉(1～99％磷酸調(diào)pH＝2.0～5.0)梯度洗脫系統(tǒng)為流動相，檢測波長為200～410nm；以外標(biāo)一點法或標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行計算，各制劑以相當(dāng)于每日用成品量為單位量，每單位量含野黃芩苷的限度不得少于2mg； b、藥物組合物中人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、三七皂苷R1中一種或幾種的含量測定 取待測藥物組合物適量，置量瓶中，加水或甲醇或流動相或乙醇至刻度，搖勻，用微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液；以人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、三七皂苷R1中的一種或幾種對照品的甲醇或乙醇溶液為對照，采用液相色譜法，色譜柱用十八烷基硅烷鍵合硅膠或八烷基硅烷鍵合硅膠或二烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，甲醇或乙腈-水或0.5％～5％冰醋酸水溶液或0.02％～5％磷酸水溶液或0.5％～5％甲酸溶液為流動相，梯度洗脫，流速為0.5～2.0ml/min，檢測波長為190～410nm范圍內(nèi)的一個或幾個或蒸發(fā)光檢測器檢測，柱溫在20～60℃范圍內(nèi)；以外標(biāo)法或標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行計算，待測藥物組合物以相當(dāng)于每日用成品量為單位量，含量限度應(yīng)為以下一項或幾項 每單位量含人參皂苷Rg1的限度不得少于2.5mg； 每單位量含人參皂苷Rb1的限度不得少于3.5mg； 每單位量含三七皂苷R1的限度不得少于0.25mg； 每單位量含人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、三七皂苷R1的總和的限度不得少于6mg； c、藥物組合物中總皂苷的含量測定 取待測藥物組合物適量，置量瓶中，加蒸餾水適量使溶解并定至刻度，搖勻，精密量取適量，置量瓶中，水浴蒸干，立即取出，精密加1％～50％香草醛-冰醋酸溶液0.1～10ml，高氯酸0.1～15ml，搖勻，30～80℃水浴上加熱3～50分鐘，取出，立即以冰水浴或流水冷卻，精密加冰醋酸至刻度，搖勻，作為供試品溶液，以黃芪甲苷或人參皂苷Rgl或人參皂苷Rbl或三七皂苷R1為對照品，同法制得對照品溶液。以隨行溶劑為空白，采用中國藥典附錄公開的分光光度法，在547±10nm的波長處測定吸收度，以外標(biāo)一點法或標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行計算，待測藥物組合物以相當(dāng)于每日用成品量為單位量，每單位量含總皂苷以黃芪甲苷或人參皂苷Rg1或人參皂苷Rb1或三七皂苷R1計，不得少于10mg； d、藥物組合物中黃芪甲苷的含量測定 取待測藥物組合物適量，加水溶解后用正丁醇或醋酸乙酯提取，合并提取液，用氨試液洗滌，棄去氨液，正丁醇液蒸干，殘渣加水溶解后通過D101大孔吸附樹脂柱，依次用水、40％乙醇、70％乙醇洗脫，收集70％乙醇洗脫部分，蒸干，殘渣用甲醇溶解或稀釋至合適濃度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液；以黃芪甲苷對照品的甲醇或乙醇溶液為對照，采用液相色譜法，色譜柱用十八烷基硅烷鍵合硅膠或八烷基硅烷鍵合硅膠或二烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，15％～85％∶85％～15％甲醇或乙腈-水或0.05％～10％冰醋酸水溶液或0.05％～10％甲酸水溶液或0.01％～5％磷酸水溶液為流動相，檢測波長為190～410nm或蒸發(fā)光散射檢測器檢測，柱溫在20～60℃范圍內(nèi)；以外標(biāo)一點法或標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行計算，各制劑以相當(dāng)于每日用成品量為單位量，每單位量含黃芪甲苷的限度不得少于0.02mg； e、藥物組合物中總多糖的含量測定 取待測藥物組合物適量，加60％～無水乙醇適量，超聲處理使溶散，離心，取沉淀，加蒸餾水適量使溶解并稀釋至合適濃度，搖勻，精密量取適量，至具塞試管中，加蒸餾水適量，精密加1％～10％苯酚溶液適量，混勻，迅速加入硫酸適量，搖勻，30℃～60℃水浴5～60分鐘，取出，立即以冰水浴冷卻1～30分鐘，取出，以隨行溶劑為空白，采用中國藥典附錄公開的分光光度法，在488nm±10的波長處測定吸收度，以外標(biāo)一點法或標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行計算，待測藥物組合物以相當(dāng)于每日用成品量為單位量，每單位量含總多糖以無水葡萄糖計，不得少于1.6mg； f、藥物組合物中芒柄花素、毛蕊芒柄花素的一種或兩種的含量測定 取待測藥物組合物適量，加甲醇或乙醇提取，提取液作為供試品溶液；以芒柄花素、毛蕊芒柄花素對照品的甲醇或乙醇溶液為對照，采用液相色譜法，色譜柱用十八烷基硅烷鍵合硅膠或八烷基硅烷鍵合硅膠或二烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，流動相A為甲醇或乙腈，流動相B為水或0.05％～10％冰醋酸水溶液或0.05％～10％甲酸水溶液或0.01％～5％磷酸水溶液為流動相，梯度洗脫，檢測波長為190～410nm，柱溫在20～60℃范圍內(nèi)；以外標(biāo)一點法或標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行計算，待測藥物組合物以相當(dāng)于每日用成品量為單位量，含量限度應(yīng)為以下一項或兩項 (1)每單位量含芒柄花素的限度不得少于0.01mg； (2)每單位量含人毛蕊芒柄花素的限度不得少于0.01mg。
所述的以燈盞花素、三七、黃芪制成的藥物組合物的質(zhì)量控制方法，其特征在于所述藥物組合物含量的測試方法是以下一種或幾種方法 a、藥物組合物中野黃芩苷的含量測定 取待測藥物組合物適量，加甲醇溶解或稀釋至合適濃度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液；以野黃芩苷對照品的甲醇或乙醇溶液為對照，采用液相色譜法，色譜柱用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，甲醇-0.1％磷酸水溶液50％∶50％為流動相，檢測波長為335nm；以外標(biāo)一點進(jìn)行計算，各制劑以相當(dāng)于每日用成品量為單位量，每單位量含野黃芩苷的限度不得少于4mg； b、藥物組合物中人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、三七皂苷R1中一種或幾種的含量測定 取待測藥物組合物適量，置量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，用微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液；以人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、三七皂苷R1中的一種或幾種對照品的甲醇溶液為對照，采用液相色譜法，色譜柱用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，乙腈-水為流動相，梯度洗脫，溶劑比例為從0分鐘至15分鐘，乙腈的比例為20％，從15分鐘至21分鐘，乙腈的比例由20％上升至40％，從21分鐘至25分鐘，乙腈的比例為20％；流速為1.0ml/min，檢測波長203nm，柱溫為30℃；以外標(biāo)法或標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行計算，待測藥物組合物以相當(dāng)于每日用成品量為單位量，含量限度應(yīng)為以下一項或幾項 (1)每單位量含人參皂苷Rg1的限度不得少于5mg； (2)每單位量含人參皂苷Rb1的限度不得少于7mg； (3)每單位量含三七皂苷R1的限度不得少于0.5mg； (4)每單位量含人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、三七皂苷R1的總和的限度不得少于12mg； c、藥物組合物中總皂苷的含量測定 取待測藥物適量，置10ml量瓶中，加蒸餾水適量使溶解并定至刻度，搖勻，精密量取0.6，置25ml量瓶中，水浴蒸干，立即取出，精密加5％香草醛-冰醋酸溶液0.5ml，高氯酸2.0ml，搖勻，60℃水浴上加熱15分鐘，取出，立即以冰水浴或流水冷卻，精密加冰醋酸至刻度，搖勻，作為供試品溶液，以人參皂苷Rg1為對照品，同法制得對照品溶液。以隨行溶劑為空白，采用中國藥典附錄公開的分光光度法，在547nm的波長處測定吸收度，以外標(biāo)一點法進(jìn)行計算，待測藥物組合物以相當(dāng)于每日用成品量為單位量，每單位量含總皂苷以人參皂苷Rg1計，不得少于20mg； d、藥物組合物中黃芪甲苷的含量測定 取待測藥物組合物適量，加水溶解后用水飽和正丁醇提取，合并提取液，用氨試液洗滌，棄去氨液，正丁醇液蒸干，殘渣加水溶解后通過D101大孔吸附樹脂柱，依次用水、40％乙醇、70％乙醇洗脫，收集70％乙醇洗脫部分，蒸干，殘渣用甲醇溶解或稀釋至合適濃度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液；以黃芪甲苷對照品的甲醇或乙醇溶液為對照，采用液相色譜法，色譜柱用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，32％∶68％乙腈-水為流動相，蒸發(fā)光散射檢測器檢測，柱溫30℃；以外標(biāo)一點法進(jìn)行計算，各制劑以相當(dāng)于每日用成品量為單位量，每單位量含黃芪甲苷的限度不得少于0.04mg； e、藥物組合物中總多糖的含量測定 取待測藥物組合物適量，加80％乙醇20ml，超聲處理使溶散，離心，取沉淀，加蒸餾水適量使溶解并稀釋至合適濃度，搖勻，精密量取適量，至10ml具塞試管中，加蒸餾水至2ml，精密加4％苯酚溶液1ml，混勻，迅速加入硫酸7ml，搖勻，40℃水浴30分鐘，取出，立即以冰水浴冷卻5分鐘，取出，以隨行溶劑為空白，采用中國藥典附錄公開的分光光度法，在488nm的波長處測定吸收度，以外標(biāo)一點法進(jìn)行計算，待測藥物組合物以相當(dāng)于每日用成品量為單位量，每單位量含總多糖以無水葡萄糖計，不得少于3.2mg； f、藥物組合物中芒柄花素、毛蕊芒柄花素的一種或兩種的含量測定 取待測藥物組合物適量，加甲醇提取，提取液作為供試品溶液；以芒柄花素、毛蕊芒柄花素對照品的甲醇溶液為對照，采用液相色譜法，色譜柱用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，流動相A為甲醇，流動相B為水，梯度洗脫，溶劑比例為從0分鐘至10分鐘，水的比例為從40％升至50％，從10分鐘至30分鐘，水的比例為從50％升至60％，從30分鐘至50分鐘，水的比例為60％，檢測波長為250nm，柱溫30℃；以外標(biāo)一點法進(jìn)行計算，待測藥物組合物以相當(dāng)于每日用成品量為單位量，含量限度應(yīng)為以下一項或兩項 (1)每單位量含芒柄花素的限不得少于0.02mg； (2)每單位量含人毛蕊芒柄花素的限度不得少于0.02mg。
所述的以燈盞花素、三七、黃芪制成的藥物組合物的質(zhì)量控制方法，其特征在于所述的注射制劑的含量測定結(jié)果，按照重量百分比計算，野黃芩苷、黃芪甲苷、芒柄花素、毛蕊異黃酮、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、三七皂苷R1、總皂苷、總多糖中的全部或部分物質(zhì)的總含量占制劑中扣除輔料和水分外的總固體量的25％以上。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明能更加完善的控制以燈盞花素、三七、黃芪制成的藥物組合物的質(zhì)量。中藥成分復(fù)雜，如果只用其中一、兩種成分來說明其內(nèi)在質(zhì)量，具有一定的片面性，更無法判斷其藥效的指標(biāo)成分。因此本申請人制定了以黃芪黃酮類成分特征為主的指紋圖譜和以黃芪皂苷類、三七皂苷類成分特征為主的指紋圖譜、鑒別和含量測定來全面控制藥物組合物的質(zhì)量。但是由于藥物組合物中的各藥材之間所含的化學(xué)成分復(fù)雜，對指紋圖譜的制定、鑒別和含量測定造成干擾，導(dǎo)致鑒別、含量測定和各部分指紋圖譜特征不穩(wěn)定，所以必須控制流動相、展開劑等色譜條件，才能得到良好的薄層色譜、含測條件和指紋圖譜。也就是說，由于處方中各成分相互之間的干擾影響，導(dǎo)致藥物組合物中以黃芪黃酮類成分特征為主的指紋圖譜和以黃芪皂苷類、三七皂苷類成分特征為主的指紋圖譜特征峰發(fā)生改變，而只有采用本發(fā)明的條件，才能得到理想的薄層色譜、含測條件和指紋圖譜。
通過實驗證明，本發(fā)明質(zhì)量控制方法對以燈盞花素、三七、黃芪制成的藥物組合物產(chǎn)品的質(zhì)量控制更為有效，方法精密度、穩(wěn)定性均較高。
實驗例1 以黃芪黃酮類成分特征為主的指紋圖譜 a、實驗儀器、試劑及樣品 對照品芒柄花素中國藥品生物制品檢定所 b、色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性實驗 1.色譜柱的選擇 研究過程中，選用了常規(guī)的十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的液相色譜柱，分別試用了Inertsil ODS-3(250mm×4.6mm，5μm)Kromasil C18(200mm×4.6mm，5μm)、Diamonsil C18(250mm×4.6mm，5μm)三種牌號的色譜柱，結(jié)果顯示三種牌號的色譜柱均可達(dá)到較好的分離效果，其中Diamonsil C18色譜柱分離效果最好，柱效最高(以參照物芒柄花素計算)。故最終選用Diamonsil C18(250mm×4.6mm，5μm)為實驗研究柱。
2.流動相的選擇 研究過程中分別考察了(1)甲醇-0.05mol/L磷酸二氫鈉(20∶80)，(2)乙腈-0.05mol/L磷酸二氫鈉(10∶90)，(3)乙腈-0.05mol/L磷酸氫二鈉(梯度洗脫)(4)乙腈-水(梯度洗脫)，溶劑比例為從0分鐘至20分鐘，乙腈的比例為從4％升至25％，從20分鐘至40分鐘，乙腈的比例為從25％升至45％，從40分鐘至60分鐘，乙腈的比例為從45％升至70％，從60分鐘至70分鐘，乙腈的比例為從70％升至80％，從70分鐘至80分鐘，乙腈的比例為從80％升至100％。結(jié)果顯示流動相(1)條件下，峰形較差，1小時內(nèi)出峰較少，仍有不少組分滯留在后出峰；流動相(2)流動相條件下，峰形較差，分離不好；(3)條件下，峰拖尾嚴(yán)重，出峰不完全；流動相(4)條件下，峰形較好，出峰完全且分布均勻，故而最終被選用。
3.檢測波長的確定 研究中在乙腈-水(梯度洗脫)流動相條件下，分別考察了在不同波段典型波長230、254、270、300下的色譜峰情況，結(jié)果表明，254nm檢測時能兼顧各成分色譜峰的峰度、分離度和基線，故選擇254nm為本品指紋圖譜檢測波長。
4.儀器、色譜柱及積分參數(shù) 4.1儀器參數(shù)選用了液相色譜分析領(lǐng)域主流配置和性能良好的LC-10Avp高效液相色譜儀，WML-2010色譜工作站。色譜柱為Diamonsil C18(250mm×4.6mm，5μm)；柱溫40℃，流速1.0ml/min。
4.2積分參數(shù)峰寬10；斜率100；最小峰面積500。如此設(shè)定可以避免一些很小面積的色譜峰(單峰面積占總峰面積小于0.5％)的計算，同時保證與參照物的相關(guān)性。
5.供試品溶液的制備 取待測藥物組合物0.1g，加正丁醇溶解，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇稀釋至5ml，作為供試品溶液。
6.參照物溶液的制備 取芒柄花素，加甲醇制成每1ml含0.1mg的溶液，作為參照物溶液。
7.指紋圖譜及技術(shù)參數(shù) 根據(jù)10批樣品制定標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，將供試品指紋圖譜與標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜比較，相似度均在0.90～1.00之間。
實驗例2 以黃芪皂苷類、三七皂苷類成分特征為主的指紋圖譜 a、實驗儀器、試劑及樣品 對照品人參皂苷Rg1中國藥品生物制品檢定所 b、色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性實驗 1.色譜柱的選擇 研究過程中，選用了常規(guī)的十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的液相色譜柱，分別試用了Zorbax、Inertsil ODS-3、Diamonsil ODS(均為C18，4.6mm×200mm，5μm)三種牌號的色譜柱，結(jié)果顯示三種牌號的色譜柱均可達(dá)到較好的分離效果，其中Diamonsil ODS色譜柱分離效果最好，柱效最高，可以達(dá)到5400(以參照物人參皂苷Rg1計算)。故最終選用Diamonsil ODS色譜柱(4.6mm×200mm，5μm)為實驗研究柱。
2.流動相的選擇 研究過程中分別考察了(1)甲醇-水(20∶80)，(2)乙腈-水(10∶90)，(3)乙腈-0.05mol/L磷酸二氫鈉溶液(梯度洗脫)(4)乙腈-水(梯度洗脫)(梯度洗脫體積配比為從0分鐘至14分鐘，乙腈的比例為15％，從14分鐘至45分鐘，乙腈的比例為從15％升至30％，從45分鐘至60分鐘，乙腈的比例為從30％升至80％)四種流動相系統(tǒng)。結(jié)果顯示流動相(1)條件下，峰形較差，1小時內(nèi)出峰較少，仍有不少組分滯留在后出峰；流動相(2)流動相條件下，峰形較差，分離不好；(3)條件下，峰拖尾嚴(yán)重，出峰不完全；流動相(4)條件下，峰形較好，出峰完全且分布均勻，故而最終被選用。
3.檢測波長的確定 研究中在乙腈-水(梯度洗脫)流動相條件下，分別考察了在不同波段典型波長203、210、230、254下的色譜峰情況，結(jié)果顯示，在203nm下色譜峰較多，峰形較好，故最終選用203nm±2作為檢測波長。
4.儀器、色譜柱及積分參數(shù) 4.1儀器參數(shù)選用了液相色譜分析領(lǐng)域主流配置和性能良好的Agilent1100系列高效液相色譜儀，Chemstation色譜工作站。色譜柱為Diamonsil ODS(4.6mm×200mm，5μm)；柱溫40℃，流速1.0ml/min。
4.2積分參數(shù)Slope Sensitivity1，peak width0.05，最小峰面積為參照物(S)峰峰面積的5％，最小峰高為S峰峰高的5％。如此設(shè)定可以避免一些很小面積的色譜峰(單峰面積占總峰面積小于0.5％)的計算，同時保證與參照物的相關(guān)性。
5.供試品溶液的制備 精密稱取本品適量，加水制成每1ml含50mg的溶液，即得。
6.參照物溶液的制備 人參皂苷Rg1為三七主要活性成分之一，其積分面積在指紋圖譜中所占比例較大且較穩(wěn)定，同時兼顧中間體和藥材的研究，因此選定人參皂苷Rg1作為參照物。
7.指紋圖譜及技術(shù)參數(shù) 根據(jù)10批樣品制定標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，將供試品指紋圖譜與標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜比較，相似度均在0.90～1.00之間。
實驗例3藥物組合物中野黃芩苷的薄層色譜鑒別方法 為了突出燈盞細(xì)辛的特征，選擇了野黃芩苷作為其特征，但是由于藥材中存在較多與野黃芩苷結(jié)構(gòu)相近、極性相似的成分，普通條件難以達(dá)到質(zhì)量控制的要求，因此我們篩選了以下薄層板和展開條件對野黃芩苷進(jìn)行了展開 經(jīng)過篩選，確定了以聚酰胺膜為固定相，以甲醇-醋酸乙酯-甲酸(7-2-1)為展開劑，在此條件下，野黃芩苷的Rf值適中，和其它斑點分離清晰，陰性無干擾。
實驗例4 藥物組合物中野黃芩苷的液相色譜鑒別方法 為了突出燈盞細(xì)辛的特征，除了薄層鑒別方法以外，選擇了野黃芩苷作為其特征成分，但是由于藥材中存在較多與野黃芩苷結(jié)構(gòu)相近、極性相似的成分，普通條件難以達(dá)到質(zhì)量控制的要求，因此我們篩選了以下色譜柱和流動相對野黃芩苷進(jìn)行了分離 經(jīng)過篩選，確定了以十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相，甲醇-0.1％磷酸水溶液(50∶50)為流動相，在此條件下，野黃芩苷保留時間適中，峰行尖銳，對稱，陰性無干擾。
實驗例5 藥物組合物人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、三七皂苷R1的薄層色譜鑒別方法 為了突出三七的特征，選擇了人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、三七皂苷R1作為其特征斑點，但是由于藥材中存在較多與人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、三七皂苷R1結(jié)構(gòu)相近、極性相似的成分，普通條件難以達(dá)到質(zhì)量控制的要求，因此我們篩選了以下薄層板和展開條件對麥冬進(jìn)行了展開 經(jīng)過篩選，確定了以硅膠G薄層板為固定相，以氯仿-醋酸乙酯-甲醇-水(15∶40∶22∶10)10℃以下放置的下層溶液為展開劑，在此條件下，人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、三七皂苷R1的Rf值適中，和其它斑點分離清晰，陰性無干擾。
實驗例6 藥物組合物中人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、三七皂苷R1的液相色譜鑒別方法 為了突出三七的特征，選擇了人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、三七皂苷R1作為其特征成分，但是由于藥材中存在較多與人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、三七皂苷R1結(jié)構(gòu)相近、極性相似的成分，普通條件難以達(dá)到質(zhì)量控制的要求，因此我們篩選了以下色譜柱和流動相對人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、三七皂苷R1進(jìn)行了分離 經(jīng)過篩選，確定了以十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相，乙腈-水為流動相，梯度洗脫，溶劑比例為從0分鐘至15分鐘，乙腈的比例為20％，從15分鐘至21分鐘，乙腈的比例由20％上升至40％，從21分鐘至25分鐘，乙腈的比例為20％，在此條件下，人人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、三七皂苷R1保留時間適中，峰行尖銳，對稱，陰性無干擾。
實驗例7 藥物組合物中黃芪的薄層色譜鑒別方法 為了突出黃芪的特征，選擇了黃芪對照藥材作為其特征斑點，但是由于藥物組合物中存在較多與黃芪對照藥材結(jié)構(gòu)相近、極性相似的成分，普通條件難以達(dá)到質(zhì)量控制的要求，因此我們篩選了以下薄層板和展開條件對黃芪對照藥材進(jìn)行了展開條件 問題 正丁醇-冰醋酸-水(6∶4∶3)硅膠H薄層板 陰性有干擾 丙酮-冰醋酸-水(8∶2∶1)硅膠G薄層板 特征斑點不清晰 二氯甲烷-甲醇(7-3)硅膠GF254薄層板陰性有干擾 三氯甲烷-丙酮-甲酸(20∶2∶1)硅膠G薄層板 陰性有干擾 三氯甲烷-丙酮-甲醇(20∶3∶2)硅膠H薄層板 陰性有干擾 三氯甲烷-丙酮-甲醇(20∶2∶10)硅膠G薄層板 對照品展開至前沿 三氯甲烷-甲醇(10-1)硅膠G薄層板 分離清晰，Rf值適中陰性無干擾 經(jīng)過篩選，確定了以硅膠G薄層板為固定相，以三氯甲烷-甲醇(10-1)為展開劑，在此條件下，黃芪對照藥材特征斑點的Rf值適中，和其它斑點分離清晰，陰性無干擾。
實驗例8 藥物組合物中黃芪甲苷的薄層色譜鑒別方法 為了突出黃芪的特征，選擇了黃芪甲苷作為其特征斑點，但是由于藥物組合物中存在較多與黃芪甲苷結(jié)構(gòu)相近、極性相似的成分，普通條件難以達(dá)到質(zhì)量控制的要求，因此我們篩選了以下薄層板和展開條件對黃芪甲苷進(jìn)行了展開 經(jīng)過篩選，確定了以硅膠G薄層板為固定相，以三氯甲烷-甲醇-水(13-7-2)的下層溶液為展開劑，在此條件下，黃芪甲苷特征斑點的Rf值適中，和其它斑點分離清晰，陰性無干擾。
實驗例9 藥物組合物中黃芪甲苷的液相色譜鑒別方法 為了突出黃芪的特征，除了薄層鑒別方法以外，選擇了黃芪甲苷作為其特征成分，但是由于藥物組合物中存在較多與黃芪甲苷結(jié)構(gòu)相近、極性相似的成分，普通條件難以達(dá)到質(zhì)量控制的要求，因此我們篩選了以下色譜柱和流動相對黃芪甲苷進(jìn)行了分離 經(jīng)過篩選，確定了以十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相，乙腈-水(32∶68)為流動相，在此條件下，黃芪甲苷保留時間適中，峰行尖銳，對稱，陰性無干擾。
實驗例10 藥物組合物中芒柄花素、毛蕊芒柄花素的薄層色譜鑒別方法 為了突出黃芪黃酮類成分的特征，選擇了芒柄花素、毛蕊芒柄花素作為其特征斑點，但是由于藥物組合物中存在較多與芒柄花素、毛蕊芒柄花素結(jié)構(gòu)相近、極性相似的成分，普通條件難以達(dá)到質(zhì)量控制的要求，因此我們篩選了以下薄層板和展開條件對芒柄花素、毛蕊芒柄花素進(jìn)行了展開 經(jīng)過篩選，確定了以硅膠G薄層板為固定相，以三氯甲烷-甲醇-醋酸乙酯-水(2.5-3-4-0.5)為展開劑，在此條件下，芒柄花素、毛蕊芒柄花素特征斑點的Rf值適中，和其它斑點分離清晰，陰性無干擾。
實驗例11 藥物組合物中芒柄花素、毛蕊芒柄花素的液相色譜鑒別方法 為了突出黃芪黃酮類成分的特征，除了薄層鑒別方法以外，選擇了芒柄花素、毛蕊芒柄花素作為其特征成分，但是由于藥物組合物中存在較多與芒柄花素、毛蕊芒柄花素結(jié)構(gòu)相近、極性相似的成分，普通條件難以達(dá)到質(zhì)量控制的要求，因此我們篩選了以下色譜柱和流動相對芒柄花素、毛蕊芒柄花素進(jìn)行了分離 經(jīng)過篩選，確定了以十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相，甲醇-水為流動相，梯度洗脫，溶劑比例為從0分鐘至10分鐘，水的比例由40％升至50％，從10分鐘至30分鐘，水的比例由50％升至60％，從30分鐘至50分鐘，水的比例為60％為流動相，在此條件下，芒柄花素、毛蕊芒柄花素保留時間適中，峰行尖銳，對稱，陰性無干擾。
實驗例12 藥物組合物中野黃芩苷含量測定 1儀器與試藥 1.1主要儀器 高效液相色譜儀 LC-2010AHT SHIMADZU 紫外/可見分光光度儀 TU-1810SPC 北京普析通用儀器有限公司 電子分析天平 BP211D SARTORIUS 超聲波清洗機(jī) KQ250DB 昆山市超聲儀器有限公司 1.2試藥 野黃芩苷 中國藥品生物制品檢定所 甲醇 分析純北京化工廠 乙腈 色譜純迪馬公司 磷酸 分析純北京化學(xué)試劑公司 2野黃芩苷 由中國藥品生物制品檢定所提供野黃芩苷，經(jīng)高效液相色譜法(歸-化法)測定純度為96.40％，符合含量測定用對照品要求(在測定中，按照96.40％的純度進(jìn)行折算)。
3檢測波長的選擇 取野黃芩苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1ml含0.0463mg的溶液，在190～400nm波長范圍內(nèi)掃描。結(jié)果表明，野黃芩苷在284nm及335nm處有最大吸收，根據(jù)《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑》相關(guān)品種并結(jié)合文獻(xiàn)報道，選擇335nm作為野黃芩苷含量測定的檢測波長。
4色譜條件 色譜儀SHIMADZU LC-2010AHT； 色譜柱Diamonsil ODS 250mm×4.6mm 5μm； 流動相甲醇-0.1％磷酸水溶液(5050)； 流 速1.0ml/min； 柱 溫30℃； 進(jìn)樣量10μl； 檢測波長335nm。
對照品溶液的制備 精密稱取野黃芩苷對照品適量，加甲醇制成每1ml含0.05mg的溶液，即得。
供試品溶液的制備 取裝量差異項下本品，取內(nèi)容物，混勻，從中取約0.25g，精密稱定，置25ml量瓶中，加甲醇適量超聲處理(功率250W，頻率33KHz)5min，取出，放至室溫，加甲醇定至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0.45μm)濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。
測定法 分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10μl，注入液相色譜儀，測定，即得。
根據(jù)上述色譜條件得到野黃芩苷對照品、供試品色譜圖，其理論板數(shù)n均大于2000，野黃芩苷色譜峰與相近峰分離清晰完全，分離度均大于1.5，溶劑無干擾。
5線性關(guān)系考察 精密量取野黃芩苷對照品溶液(C＝0.978mg/ml)0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml，分置10ml量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，分別從中精密吸取10μl，注入液相色譜儀，照高效液相色譜法(中國藥典2000年版一部附錄VI D)測定。以峰面積為縱坐標(biāo)，野黃芩苷的量(μg)為橫坐標(biāo)作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 野黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)曲線測定結(jié)果 回歸方程Y＝3222232.53x+3654.50 相關(guān)系數(shù)γ＝0.9999 結(jié)果表明野黃芩苷在0.1886μg～0.9428μg范圍內(nèi)線性良好。
經(jīng)計算，野黃芩苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線過原點，因此選用外標(biāo)一點法測定野黃芩苷的含量。
6精密度實驗 精密吸取野黃芩苷對照品溶液(0.0489mg/ml)10μl，注入液相色譜儀，測定5次，考察對照品溶液精密度，測定結(jié)果見下表。 精密度試驗 結(jié)果表明，對照品溶液精密度良好。
7穩(wěn)定性實驗 7.1對照品溶液的穩(wěn)定性實驗 精密吸取野黃芩苷對照品溶液(0.0489mg/ml)10μl，注入液相色譜儀，注入液相色譜儀，分別在0、2、4、8、24小時進(jìn)樣測定。
對照品溶液穩(wěn)定性試驗 結(jié)果表明，對照品溶液24小時內(nèi)穩(wěn)定性良好。
7.2供試品溶液的穩(wěn)定性實驗精密吸取供試品溶液10μl，注入液相色譜儀，分別在0、2、4、8、24小時進(jìn)樣測定。
供試品溶液穩(wěn)定性實驗 結(jié)果表明，供試品溶液24小時內(nèi)穩(wěn)定性良好。
8重復(fù)性實驗 取本品，按正文供試品溶液的制備和測定法項下進(jìn)行操作。
重復(fù)性實驗 9加樣回收率實驗 采用加樣回收法，取裝量差異項下本品，取內(nèi)容物，混勻，從中取約0.12g(共5份)，精密稱定，分置25ml量瓶中，分別精密加入野黃芩苷對照品溶液(C＝0.668mg/ml)1.0ml，加甲醇適量超聲處理(功率250W，頻率33KHz)5min，取出，放至室溫，加甲醇至刻度，搖勻，用微孔濾膜( 0.45μm)濾過，精密吸取續(xù)濾液10μl，注入液相色譜儀，測定，即得。
藥物組合物中野黃芩苷的含量為5.271mg/g。
加樣回收率實驗 平均回收率＝97.84％，RSD＝0.99％ 11樣品含量測定 取本品三批樣品，按照正文供試品溶液的制備和測定法項下的操作。
野黃芩苷含量測定 實驗例13 藥物組合物中總皂苷含量測定 1儀器、試藥 1.1儀器普析通 TU-1810SPC 紫外/可見分光光度儀 SARTORIUS BP211D 電子分析天平 1.2試藥香草醛 分析純 天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所 甲醇 色譜純 J.T.Baker 冰醋酸 分析純 上海試劑一廠 高氯酸 分析純 天津市鑫源化工廠 純凈水 娃哈哈 2方法與結(jié)果 2.1檢測波長的選擇 精密稱取人參皂苷Rg15.14mg，置100ml量瓶中，加適量甲醇超聲處理(功率250W，頻率33KHz)使溶解，加甲醇至刻度，搖勻，精密量取1.2ml，置10ml具塞試管中，水浴蒸干溶劑，取出，精密加入5％香草醛-冰醋酸溶液0.2ml，高氯酸0.8ml，搖勻，置60℃水浴中加熱15分鐘，取出，立即在冰水浴中冷卻2分鐘，精密加入冰醋酸5ml，搖勻，在700～400nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，結(jié)果表明，黃芪甲苷在547nm處有最大吸收，空白無干擾，因此選擇547nm為分光光度法測定藥物組合物中總皂苷的檢測波長。
2.2對照品溶液的制備 人參皂苷Rg15mg，加甲醇制成每1ml含0.05mg的溶液，即得。
2.3供試品溶液的制備 取裝量差異項下本品，取內(nèi)容物，混勻，從中取約50mg，精密稱定，置25ml量瓶中，加甲醇適量超聲處理(功率250W，頻率33KHZ)使溶解，取出，放至室溫，加甲醇至刻度，搖勻，精密量取1.0ml，置10ml具塞試管中，水浴蒸干溶劑，取出，精密加入5％香草醛-冰醋酸溶液0.2ml，高氯酸0.8ml，搖勻，置60℃水浴中加熱15分鐘，取出，立即在冰水浴中冷卻2分鐘，精密加入冰醋酸5ml，搖勻，以隨行溶劑為空白，照分光光度法(中國藥典2000年版一部附錄V A)，在547nm的波長處測定吸收度。以外標(biāo)一點法計算，即得。
3線性關(guān)系的考察 精密稱取人參皂苷Rg1對照品5.03mg，置100ml量瓶中，加甲醇適量超聲處理(功率250W，頻率33KHZ)使溶解，取出，放至室溫，加甲醇至刻度，搖勻，精密量取0.4、0.8、1.2、1.6、2.0ml，分置10ml具塞試管中，水浴蒸干溶劑，取出，精密加入5％香草醛-冰醋酸溶液0.2ml，高氯酸0.8ml，搖勻，置60℃水浴中加熱15分鐘，取出，立即在冰水浴中冷卻2分鐘，精密加入冰醋酸5ml，搖勻，以隨行溶劑為空白，照分光光度法(中國藥典2000年版一部附錄V A)，在547nm的波長處測定吸收度。以吸收度為縱坐標(biāo)，黃芪甲苷的量(μg)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
回歸方程Y＝0.0062X+0.0047；r＝0.9999 人參皂苷Rg1在20.12～100.6μg范圍線性良好。
人參皂苷Rg1標(biāo)準(zhǔn)曲線測定數(shù)據(jù) 3精密度試驗 精密量取對照品溶液(0.0503mg/ml)1.2ml，置10ml具塞試管中，水浴蒸干溶劑，取出，精密加入5％香草醛-冰醋酸溶液0.2ml，高氯酸0.8ml，搖勻，置60℃水浴中加熱15分鐘，取出，立即在冰水浴中冷卻2分鐘，精密加入冰醋酸5ml，搖勻，以隨行溶劑為空白，按正文測定法項下操作，連續(xù)測定5次。
精密度實驗 5穩(wěn)定性試驗 5.1對照品溶液的穩(wěn)定性試驗 精密量取對照品溶液(0.0503mg/ml)1.2ml，置10ml具塞試管中，水浴蒸干溶劑，取出，精密加入5％香草醛-冰醋酸溶液0.2ml，高氯酸0.8ml，搖勻，置60℃水浴中加熱15分鐘，取出，立即在冰水浴中冷卻2分鐘，精密加入冰醋酸5ml，搖勻，以隨行溶劑為空白，按正文測定法項下操作，分別在0、10、20、40、60分鐘時測定。
對照品溶液穩(wěn)定性實驗 5.2供試品溶液的穩(wěn)定性實驗 取本品裝量差異項下本品，取內(nèi)容物，研細(xì)，從中取約50mg，按正文測定法項下進(jìn)行操作，分別在0、10、20、40、60分鐘時測定。
供試品溶液穩(wěn)定性實驗 6重復(fù)性試驗 取本品裝量差異項下本品，取內(nèi)容物，研細(xì)，從中取約50mg(共5份)，按正文測定法項下進(jìn)行操作。
重復(fù)性實驗 7回收率試驗 采用加樣回收法，取裝量差異項下本品，取內(nèi)容物，研細(xì)，從中取約25mg(共5份)，精密稱定，分置25ml量瓶中；精密量取人參皂苷Rg1對照品溶液(0.712mg/ml)1ml(共5份)，精密稱定，分置上述25ml量瓶中，加水適量使溶解并定至刻度，搖勻，精密量取1ml，置10ml具塞試管中，按正文測定法項下進(jìn)行操作，以隨行溶劑為空白，依法測定吸收度，按外標(biāo)一點法計算，即得。
藥物組合物中總皂苷的含量28.87mg/g 加樣回收率實驗 平均回收率＝97.59％ RSD＝0.61％ 8三批中試樣品含量測定 取本品樣品三批，按正文所述方法處理。
三批樣品含量測定結(jié)果 實驗例14 藥物組合物中三七皂苷R1，人參皂苷Rg1，人參皂苷Rb1含量測定 1儀器與試藥 1.1儀器 Alltech UVIS-201高效液相色譜儀，Alltech HPLC system工作站(美國) KQ250B超聲波清洗機(jī)(昆山市超聲儀器有限公司) ZK-30ABX電熱真空干燥箱(北京中興偉業(yè)儀器公司) Mettler AE240電子天平(上海梅特勒公司) 1.2試藥 三七皂苷R1中國藥品生物制品檢定所 人參皂苷Rg1中國藥品生物制品檢定所 人參皂苷Rb1中國藥品生物制品檢定所 所用甲醇、乙腈均為色譜純，均購于德國Merck公司 水為重蒸水，其它試劑均為分析純。
2色譜條件 色譜柱Diamonsil(TM)C18，5μm；250×4.6mm； 流動相乙腈-水為流動相，梯度洗脫； 梯度洗脫系統(tǒng) 流速1ml/min，兩次進(jìn)樣間隔平衡時間3min； 檢測波長203nm； 柱溫30℃； 進(jìn)樣量10μl 理論板數(shù)按人參皂苷Rg1峰計算應(yīng)不低于3000。
檢測波長的選擇 三七皂苷R1，人參皂苷Rg1，人參皂苷Rb1，均在203nm波長處有最大吸收，因此選用203nm作為本品的檢測波長。
3對照品溶液的制備 取三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1對照品適量，精密稱定，分別加甲醇制成每ml含三七皂苷R10.62mg、人參皂苷Rg11.42mg和人參皂苷Rb12.14mg的溶液，作為貯備液；再分別吸取上述溶液各1ml，置同一5ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得每ml含三七皂苷R10.124mg、人參皂苷Rg10.284mg和人參皂苷Rb10.428mg的對照品溶液。
4供試品溶液的制備 取裝量差異項下本品，取內(nèi)容物，混勻，從中精密稱取2.5g，置50ml量瓶中，加甲醇40ml，超聲處理(功率250W，頻率33KHz)使溶解，取出，放至室溫，加甲醇至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0.45μm)濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。
5陰性供試品溶液的制備 照本品處方稱取除三七外的其它成分，按本品制備工藝制成陰性供試品。精密稱取2.40572g，照供試品溶液的制備項下方法制備，作為陰性供試品溶液。
6系統(tǒng)適用性試驗 根據(jù)上述色譜條件得到三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、混合對照品、樣品、陰性色譜圖，理論板數(shù)n大于3000，樣品中各對照品峰與相近峰分離清晰完全，分離度大于1.5，陰性無干擾。
7線性關(guān)系的考察 取三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1對照品適量，精密稱定，分別加甲醇制成每ml含三七皂苷R10.62mg、人參皂苷Rg11.42mg和人參皂苷Rb12.14mg的溶液，作為貯備液；精密量取前述對照品貯備液各0.2，0.4，0.8，1.2，1.6，2.0ml，分置5ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，分別從中精密吸取10μl，依次注入液相色譜儀，以峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)做圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
回歸方程為三七皂苷R1Y＝208361.76X-1972.29 r＝0.9995； 人參皂苷Rg1Y＝293933.01X-13982.75 r＝0.9994； 人參皂苷Rb1Y＝192503.18X-9202.56 r＝0.9993。
結(jié)果表明三七皂苷R1在0.248-2.480μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好； 人參皂苷Rg1在0.568-5.680μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好； 人參皂苷Rb1在0.856-8.560μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。
線性關(guān)系試驗測定結(jié)果 三七皂苷R1X(μg)0.248 0.496 0.992 1.488 1.9842.480 峰面積 50263 100526 200106 305920 413269 511633 人參皂苷Rg1X(μg) 0.568 1.136 2.272 3.408 4.5445.680 峰面積 160211 319838 652866 984424 1298968 1675375 人參皂苷Rb1X(μg) 0.856 1.712 3.424 5.136 6.8488.560 峰面積 160162 338350 629600 961552 1313361 1650024 8精密度試驗 取對照品混合溶液(三七皂苷R10.124mg/ml、人參皂苷Rg10.284mg/ml和人參皂苷Rb10.428mg/ml)，連續(xù)測定5次，考察對照品溶液精密度。
精密度試驗 9穩(wěn)定性試驗 9.1對照品溶液穩(wěn)定性試驗 取對照品混合溶液(三七皂苷R10.124mg/ml、人參皂苷Rg10.284mg/ml和人參皂苷Rb10.428mg/ml)，分別在0、2、6、10、24小時進(jìn)樣測定，考察對照品溶液穩(wěn)定性。
對照品溶液的穩(wěn)定性試驗 9.2供試品溶液的穩(wěn)定性試驗 取裝量差異項下本品，取內(nèi)容物，混勻，從中精密稱取2.30587g，按正文供試品溶液制備下進(jìn)行操作，分別在0、2、6、10、24小時進(jìn)樣測定。
穩(wěn)定性試驗 結(jié)果表明供試品溶液在24小時內(nèi)基本穩(wěn)定。
10重復(fù)性試驗 取裝量差異項下本品，取內(nèi)容物，混勻，從中取約2.5g(共5份)，按正文測定法供試品溶液制備和測定項下進(jìn)行操作。
重復(fù)性試驗 結(jié)果表明，本法重復(fù)性較好。
11、加樣回收率試驗 采用加樣回收法，取裝量差異項下本品，取內(nèi)容物，混勻，從中取約1.25g(共5份)，分別置50ml量瓶中，另精密量取混合對照品溶液4ml(其中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1及人參皂苷Rb1的濃度為0.4024mg/ml、1.842mg/ml、2.4432mg/ml)，加甲醇適量超聲處理(功率250W，頻率33KHz)使溶解，取出，放至室溫，加甲醇至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0.45μm)濾過，精密吸取10μl，注入液相色譜儀，測定，即得。
經(jīng)測定己知藥物組合物中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1及人參皂苷Rb1的含量分別是1.407、7.871、9.525mg/g。
三七皂苷R1加樣回收率試驗 平均回收率＝97.16％；RSD＝1.15％。
人參苷Rg1加樣回收率試驗 平均回收率＝97.73％；RSD＝0.91％。
人參苷Rb1加樣回收率試驗 平均回收率＝97.68％；RSD＝0.92％。
12三批中試樣品含量測定 取本品樣品三批，按正文所述方法處理。
三批樣品含量測定結(jié)果 實驗例15 黃芪甲苷含量測定 儀器與試藥 (1)主要儀器 高效液相色譜儀 P-426 Alltech 蒸發(fā)光散射檢測器 2000ES Alltech 高效液相色譜儀 1100 series Agilent 超聲波清洗機(jī) KQ250B 昆山市超聲儀器有限公司 電熱真空干燥箱 ZK-30ABX 北京中興偉業(yè)儀器公司 電子分析天平 AE240 Mettler (2)試藥黃芪甲苷中國藥品生物制品檢定所 所用甲醇、乙腈均為色譜純，均購于天津四友生物醫(yī)學(xué)技術(shù)開發(fā)公司 水為重蒸水，其它試劑均為分析純。
照高效液相色譜法(中國藥典2000年版一部附錄VI D)測定。
1色譜條件 色譜柱Platinum C18 4.6×250mm 5μm； 流動相乙腈-水(32∶68)； 流速1.0ml/min； 蒸發(fā)光檢測器檢測漂移管溫度110℃，氣流量2.7L/min； 柱溫30℃。
根據(jù)上述條件得到黃芪甲苷、供試品、陰性色譜圖；黃芪甲苷峰達(dá)到基線分離，與相近峰分離清晰完全，保留時間適中，峰形尖銳，對稱，理論板數(shù)按黃芪甲苷峰計算應(yīng)不低于2000。
2對照品溶液的制備 分別精密稱取經(jīng)五氧化二磷干燥器減壓干燥24小時的黃芪甲苷對照品適量，加甲醇制成每1ml各含0.2mg的混合溶液，即得。
3供試品溶液的制備 取裝量差異項下本品，取內(nèi)容物，研細(xì)，從中精密稱取約5g，加水20ml溶解后用水飽和正丁醇提取，每次40ml，合并正丁醇液，用氨試液充分洗滌2次，每次40ml，棄去氨液，正丁醇液蒸干，殘渣加水5ml溶解后通過D101大孔吸附樹脂柱(內(nèi)徑1.5cm，長12cm)，依次用水50ml、40％乙醇30ml、70％乙醇80ml洗脫，收集70％乙醇洗脫部分，蒸干，殘渣用甲醇5ml溶解，搖勻，濾過，取續(xù)濾液即得。
4測定法 分別精密吸取對照品溶液10μl、20μl，供試品溶液200μl，注入液相色譜儀，測定，用外標(biāo)兩點法對數(shù)方程計算黃芪甲苷的含量，即得。
5線性關(guān)系考察 精密吸取黃芪甲苷(0.2085mg/ml)對照品溶液2、4、8、12、16μl，注入液相色譜儀，以黃芪甲苷的量(μg)的常用對數(shù)值為橫坐標(biāo)，峰面積的常用對數(shù)值為縱坐標(biāo)做圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
黃芪甲苷線性關(guān)系 黃芪甲苷回歸方程Y＝1.0700X+6.0705； 黃芪甲苷相關(guān)系數(shù)γ＝0.9999； 黃芪甲苷在0.417～3.336μg范圍內(nèi)線性良好。
6精密度試驗 精密吸取對照品溶液(0.1668mg/ml)10μl，注入液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣5次。
對照品溶液精密度試驗 結(jié)果表明，精密度良好。
7穩(wěn)定性試驗 7.1對照品穩(wěn)定性試驗 精密吸取對照品溶液(0.1668mg/ml)10μl，注入液相色譜儀，注入液相色譜儀，分別于0、6、12、24、48小時重復(fù)測定1次，記錄峰面積積分值。
對照品溶液穩(wěn)定性試驗 結(jié)果表明，對照品溶液在48小時內(nèi)穩(wěn)定性良好。
7.2供試品穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一供試品溶液20μl，注入液相色譜儀，分別在0、6、12、24、48小時重復(fù)測定1次，記錄峰面積積分值。
供試品溶液穩(wěn)定性試驗 結(jié)果表明，供試品溶液在48小時內(nèi)穩(wěn)定性良好。
8重復(fù)性試驗 取裝量差異項下本品，取內(nèi)容物，研細(xì)，從中精密稱取約5g(共5份)，按正文供試品溶液的制備和測定項下的方法進(jìn)行處理，分別從中精密吸取20μl，注入液相色譜儀，測定，即得。
供試品重復(fù)性試驗結(jié)果 結(jié)果表明，重現(xiàn)性良好。
9加樣回收率試驗 采用加樣回收法，取裝量差異項下本品，取內(nèi)容物，研細(xì)，從中精密稱取約2.5g(共5份)，分置具塞錐形瓶中；精密吸取黃芪甲苷對照品水溶液(0.1631mg/ml)1ml(共6份)，分置上述具塞錐形瓶中，加水20ml溶解后用水飽和正丁醇提取，每次40ml，合并正丁醇液，用氨試液充分洗滌2次，每次40ml，棄去氨液，正丁醇液蒸干，殘渣加水5ml溶解后通過D101大孔吸附樹脂柱(內(nèi)徑1.5cm，長12cm)，依次用水50ml、40％乙醇30ml、70％乙醇80ml洗脫，收集70％乙醇洗脫部分，蒸干，殘渣用甲醇5ml溶解，搖勻，濾過，取續(xù)濾液即得。精密吸取續(xù)濾液20μl，注入液相色譜儀，測定，即得。經(jīng)測定已知藥物組合物中黃芪甲苷的含量分別是0.07097mg/g。
黃芪甲苷加樣回收率試驗 黃芪甲苷平均回收率＝97.54％；RSD＝0.70％ 10三批樣品黃芪甲苷含量測定 取中試樣品三批，按正文所述方法處理，精密吸取20μl進(jìn)樣測定。
三批中試樣品黃芪甲苷含量測定結(jié)果 實驗例16 總多糖含量測定 儀器、試藥 儀器普析通 TU-1810SPC 紫外/可見分光光度儀 SARTORIUS BP211D電子分析天平 試藥苯酚 分析純 天津市化學(xué)試劑六廠分廠 硫酸 分析純 天津市化學(xué)試劑三廠 純凈水 娃哈哈 方法與結(jié)果 2.1檢測波長的選擇 精密稱取在105℃干燥至恒重的D-無水葡萄糖4.44mg，置100ml量瓶中，加水適量使溶解并定至刻度，搖勻，精密量取1.2ml，置10ml具塞試管中，加水至2ml，精密加入4％苯酚溶液1ml，搖勻，迅速加入硫酸7ml，搖勻，于40℃水浴中保溫30分鐘，取出，在冰水浴中冷卻5分鐘，搖勻，于700～400nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，結(jié)果表明，D-無水葡萄糖在488nm處有最大吸收，空白無干擾，因此選擇488nm為分光光度法測定藥物組合物中黃芪多糖的檢測波長。
2.2對照品溶液的制備 取在105℃干燥至恒重的D-無水葡萄糖約5mg，精密稱定，置100ml量瓶中，加蒸餾水適量使溶解并定至刻度，搖勻，即得(每1ml中含D-無水葡萄糖0.05mg)。
2.3測定法 取裝量差異項下本品，取內(nèi)容物，混勻，從中取約0.3g，置具塞錐形瓶中，加80％乙醇20ml超聲處理使溶散，離心，取沉淀，加蒸餾水適量使溶解并定量轉(zhuǎn)移至25ml量瓶中，加蒸餾水定至刻度，搖勻，精密量取1ml，至10ml具塞試管中，加蒸餾水至2ml，分別精密加4％苯酚溶液1ml，混勻，迅速加入硫酸7ml，搖勻，40℃水浴30分鐘，取出，立即以冰水浴冷卻5分鐘，取出，以隨行溶劑為空白，照分光光度法(中國藥典2000年版一部附錄V A)，在488nm的波長處測定吸收度。以外標(biāo)一點法計算，即得。
3線性關(guān)系的考察 精密稱取在105℃干燥至恒重的D-無水葡萄糖4.26mg，置100ml量瓶中，加水適量使溶解并定至刻度，搖勻，精密量取0.6、0.8、1.2、1.6、2.0ml，分置10ml具塞試管中，加水至2ml，分別精密加入4％苯酚溶液1ml，搖勻，迅速加入硫酸7ml，搖勻，于40℃水浴中保溫30分鐘，取出，在冰水浴中冷卻5分鐘，搖勻，搖勻，以隨行溶劑為空白，照分光光度法(中國藥典2000年版一部附錄V A)，在488nm的波長處測定吸收度。以吸收度為縱坐標(biāo)，D-無水葡萄糖濃度(μg/ml)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
D-無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線測定數(shù)據(jù) 回歸方程Y＝0.0492X+0.0104；r＝0.998 D-無水葡萄糖在2.556～8.520μg/ml范圍線性良好。
4精密度試驗 精密稱取在105℃干燥至恒重的D-無水葡萄糖4.26mg，置100ml量瓶中，加水適量使溶解并定至刻度，搖勻，精密量取1.2ml，置10ml具塞試管中，加水至2ml，精密加入4％苯酚溶液1ml，搖勻，迅速加入硫酸7ml，搖勻，于40℃水浴中保溫30分鐘，取出，在冰水浴中冷卻5分鐘，搖勻，以隨行溶劑為空白，按正文測定法項下操作，連續(xù)測定5次。
精密度實驗 5穩(wěn)定性試驗 5.1對照品溶液的穩(wěn)定性試驗 精密稱取在105℃干燥至恒重的D-無水葡萄糖4.42mg，置100ml量瓶中，加水適量使溶解并定至刻度，搖勻，精密量取1.2ml，置10ml具塞試管中，加水至2ml，精密加入4％苯酚溶液1ml，搖勻，迅速加入硫酸7ml，搖勻，于40℃水浴中保溫30分鐘，取出，在冰水浴中冷卻5分鐘，搖勻，以隨行溶劑為空白，按正文測定法項下操作，分別在0、10、20、40、60分鐘時測定。
對照品穩(wěn)定性實驗 5.2供試品溶液的穩(wěn)定性實驗 取本品裝量差異項下粉針，取內(nèi)容物，研細(xì)，從中取約0.3g，精密稱定，按正文測定法項下進(jìn)行操作，分別在0、10、20、40、60分鐘時測定。
供試品穩(wěn)定性實驗 6重復(fù)性試驗 取本品裝量差異項下粉針，取內(nèi)容物，研細(xì)，從中取約0.3g(共6份)，按測定法項下進(jìn)行操作。
總多糖重復(fù)性實驗 7回收率試驗 采用加樣回收法，取裝量差異項下本品，取內(nèi)容物，混勻，從中取約0.15g(共5份)，分置具塞錐形瓶中；精密量取D-無水葡萄糖對照品溶液(0.828mg/ml)1ml(共5份)，分置上述具塞錐形瓶中，加80％乙醇20ml超聲處理使溶散，離心，取沉淀，加蒸餾水適量使溶解并定量轉(zhuǎn)移至25ml量瓶中，加蒸餾水定至刻度，搖勻，精密量取1ml，至10ml具塞試管中，加蒸餾水至2ml，分別精密加4％苯酚溶液1ml，混勻，迅速加入硫酸7ml，搖勻，40℃水浴30分鐘，取出，立即以冰水浴冷卻5分鐘，取出，以隨行溶劑為空白，照分光光度法(中國藥典2000年版一部附錄V A)，在488nm的波長處測定吸收度。以外標(biāo)一點法計算，即得。
藥物組合物中總多糖的含量5.091mg/g 加樣回收率實驗 平均回收率＝97.15％ RSD＝0.69％ 8三批中試樣品含量測定 取本品樣品三批，按正文所述方法處理。
三批樣品含量測定結(jié)果 實驗例17 藥物組合物中芒柄花素、毛蕊芒柄花素含量測定 1儀器與試藥 1.1主要儀器 高效液相色譜儀 LC-2010AHT SHIMADZU 紫外/可見分光光度儀 TU-1810SPC 北京普析通用儀器有限公司 電子分析天平 BP211D SARTORIUS 超聲波清洗機(jī) KQ250DB 昆山市超聲儀器有限公司 1.2試藥 甲醇 分析純 北京化工廠 乙腈 色譜純 迪馬公司 磷酸 分析純 北京化學(xué)試劑公司 2芒柄花素、毛蕊芒柄花素 由中國藥品生物制品檢定所提供芒柄花素、毛蕊芒柄花素，經(jīng)高效液相色譜法(歸一化法)測定純度均大于98％，符合含量測定用對照品要求。
3檢測波長的選擇 取芒柄花素、毛蕊芒柄花素對照品適量，精密稱定，分加甲醇制成每1ml各含約0.05mg的溶液，在190～400nm波長范圍內(nèi)掃描。結(jié)果表明，芒柄花素、毛蕊芒柄花素均在250nm處有最大吸收，選擇250nm作為芒柄花素、毛蕊芒柄花素含量測定的檢測波長。
4色譜條件 色譜儀SHIMADZU LC-2010AHT； 色譜柱Diamonsil ODS 250mm×4.6mm 5μm； 流動相甲醇-水為流動相，梯度洗脫，溶劑比例為從0分鐘至10分鐘，水的比例為從40％升至50％，從10分鐘至30分鐘，水的比例為從50％升至60％，從30分鐘至50分鐘，水的比例為60％； 流速1.0ml/min； 柱溫30℃； 進(jìn)樣量10μl； 檢測波長250nm。
對照品溶液的制備 精密稱取芒柄花素、毛蕊芒柄花素對照品適量，加甲醇制成每1ml含0.005mg的溶液，即得。
供試品溶液的制備 取裝量差異項下本品，取內(nèi)容物，混勻，從中取約0.5g，精密稱定，置5ml量瓶中，加甲醇適量超聲處理(功率250W，頻率33KHz)5min，取出，放至室溫，加甲醇定至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0.45μm)濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。
測定法 分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10μl，注入液相色譜儀，測定，即得。
根據(jù)上述色譜條件得到芒柄花素、毛蕊芒柄花素對照品、供試品色譜圖，其理論板數(shù)n均大于2000，芒柄花素、毛蕊芒柄花素色譜峰與相近峰分離清晰完全，分離度均大于1.5，溶劑無干擾。
5線性關(guān)系考察 精密量取芒柄花素、毛蕊芒柄花素對照品混合溶液(每1ml分別含芒柄花素0.04808mg、毛蕊芒柄花素0.04912mg)0.4、0.8、1.2、1.6、2.0ml，分置10ml量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，分別從中精密吸取10μl，注入液相色譜儀，照高效液相色譜法(中國藥典2000年版一部附錄VI D)測定。分別以峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
芒柄花素標(biāo)準(zhǔn)曲線測定結(jié)果 回歸方程Y＝6249485.23x+73.50 相關(guān)系數(shù)γ＝0.9999 結(jié)果表明芒柄花素在0.019232μg～0.09616μg范圍內(nèi)線性良好。
毛蕊芒柄花素標(biāo)準(zhǔn)曲線測定結(jié)果 回歸方程Y＝5184777.08x-37.30 相關(guān)系數(shù)γ＝0.9999 結(jié)果表明毛蕊芒柄花素在0.019648μg～0.09824μg范圍內(nèi)線性良好。
經(jīng)計算，芒柄花素、毛蕊芒柄花素的標(biāo)準(zhǔn)曲線均過原點，因此選用外標(biāo)一點法測定芒柄花素、毛蕊芒柄花素的含量。
6精密度實驗 精密吸取芒柄花素、毛蕊芒柄花素對照品混合溶液(每1ml分別含芒柄花素0.004808mg、毛蕊芒柄花素0.004912mg)10μl，注入液相色譜儀，測定5次，考察對照品溶液精密度，測定結(jié)果見下表。
精密度試驗 結(jié)果表明，對照品溶液精密度良好。
7穩(wěn)定性實驗 7.1對照品溶液的穩(wěn)定性實驗 精密吸取芒柄花素、毛蕊芒柄花素對照品混合溶液(每1ml分別含芒柄花素0.004808mg、毛蕊芒柄花素0.004912mg)10μl，注入液相色譜儀，注入液相色譜儀，分別在0、2、4、8、24小時進(jìn)樣測定。
對照品溶液穩(wěn)定性試驗 結(jié)果表明，對照品溶液24小時內(nèi)穩(wěn)定性良好。
7.2供試品溶液的穩(wěn)定性實驗 精密吸取供試品溶液10μl，注入液相色譜儀，分別在0、2、4、8、24小時進(jìn)樣測定。
供試品溶液穩(wěn)定性實驗 結(jié)果表明，供試品溶液24小時內(nèi)穩(wěn)定性良好。
8重復(fù)性實驗 取本品，按正文供試品溶液的制備和測定法項下進(jìn)行操作。
重復(fù)性實驗 9加樣回收率實驗 采用加樣回收法，取裝量差異項下本品，取內(nèi)容物，混勻，從中取約0.25g，精密稱定，置5ml量瓶中；精密量取芒柄花素、毛蕊芒柄花素對照品混合溶液(每1ml分別含芒柄花素0.01024mg、毛蕊芒柄花素0.01088mg)1ml(共5份)，分置上述5ml量瓶中，加甲醇適量超聲處理(功率250W，頻率33KHz)5min，取出，放至室溫，加甲醇定至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0.45μm)濾過，精密吸取續(xù)濾液10μl，注入液相色譜儀，測定，即得。
藥物組合物中芒柄花素的含量為0.05019mg/g；毛蕊芒柄花素的含量為0.05039mg/g 芒柄花素加樣回收率實驗 平均回收率＝97.74％，RSD＝0.91％ 毛蕊芒柄花素加樣回收率實驗 平均回收率＝98.21％，RSD＝1.18％ 10樣品含量測定 取本品三批樣品，按照正文供試品溶液的制備和測定法項下的操作。
含量測定
具體實施例方式 實施例1采用液相色譜法測試以黃芪黃酮類成分特征為主的指紋圖譜 (1)供試品溶液的制備精密稱取待測凍干粉針適量，加水制成每1ml含1mg的溶液，搖勻，即得； (2)參照物溶液的制備取芒柄花素，用甲醇溶解并稀釋至合適濃度，作為參照物溶液； (3)色譜條件色譜柱采用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料流動相為乙腈-水，梯度洗脫，溶劑比例為從0分鐘至20分鐘，乙腈的比例為從4％升至25％，從20分鐘至40分鐘，乙腈的比例為從25％升至45％，從40分鐘至60分鐘，乙腈的比例為從45％升至70％，從60分鐘至70分鐘，乙腈的比例為從70％升至80％，從70分鐘至80分鐘，乙腈的比例為從80％升至100％，流速為1ml/min、檢測波長為254±2nm，柱溫25℃； (4)標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的制定以上述方法作為制定以黃芪黃酮類成分特征為主的指紋圖譜的測試手段；依據(jù)10批供試品所測得的圖譜，制定標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，以確定的參照物色譜峰的保留時間為基準(zhǔn)，計算其它共有色譜峰的相對保留時間，所述標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜中，共有峰有21個； (5)以(1)～(3)所述方法作為待測凍干粉針中以黃芪黃酮類成分特征為主的指紋圖譜的測試手段，制備待測凍干粉針的指紋圖譜； (6)將待測凍干粉針的指紋圖譜與上述標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜對比，符合下列要求 I.計算待測凍干粉針的指紋圖譜與標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的相似度，應(yīng)為0.90～1.00； II.待測凍干粉針指紋圖譜中，非共有峰面積不得超過總峰面積的5％； III.除參照物色譜峰之外的其他共有色譜峰與參照物色譜峰的相對保留時間與標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜比較，相對偏差不得超過±10％。
實施例2采用液相色譜法測試以黃芪皂苷類、三七皂苷類成分特征為主的指紋圖譜 (1)供試品溶液的制備精密稱取待測凍干粉針適量，加甲醇制成每1ml含50mg的溶液，搖勻，即得； (2)參照物溶液的制備精密稱取人參皂苷Rg1適量，加甲醇制成每1ml含0.3mg的溶液，作為參照物溶液； (3)色譜條件色譜柱采用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料流動相為乙腈-水，梯度洗脫，溶劑比例為從0分鐘至14分鐘，乙腈的比例為15％，從14分鐘至45分鐘，乙腈的比例為從15％升至30％，從45分鐘至60分鐘，乙腈的比例為從30％升至80％，流速為1ml/min、檢測波長203±2nm，柱溫30℃； (4)標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的制定以上述方法作為制定以黃芪皂苷類、三七皂苷類成分特征為主的指紋圖譜的測試手段；依據(jù)10批供試品所測得的圖譜，制定標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，以確定的參照物色譜峰的保留時間為基準(zhǔn)，計算其它共有色譜峰的相對保留時間，所述標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜中，共有峰有14個； (5)以(1)～(3)所述方法作為待測凍干粉針中以黃芪皂苷類、三七皂苷類成分特征為主的指紋圖譜的測試手段，制備待測凍干粉針的指紋圖譜； (6)將待測凍干粉針的指紋圖譜與上述標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜對比，符合下列要求 I.計算待測凍干粉針的指紋圖譜與標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的相似度，應(yīng)為0.90～1.00； II.待測凍干粉針指紋圖譜中，非共有峰面積不得超過總峰面積的5％； III.除參照物色譜峰之外的其他共有色譜峰與參照物色譜峰的相對保留時間與標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜比較，相對偏差不得超過±10％。
實施例3采用液相色譜法測試以黃芪黃酮類成分特征為主的指紋圖譜 (1)供試品溶液的制備精密稱取待測凍干粉針適量，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，搖勻，即得； (2)參照物溶液的制備取芒柄花素，用甲醇溶解并稀釋至合適濃度，作為參照物溶液； (3)色譜條件色譜柱采用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料流動相為乙腈-1％冰醋酸，梯度洗脫，溶劑比例為從0分鐘至20分鐘，乙腈的比例為從3％升至22％，從20分鐘至45分鐘，乙腈的比例為從22％升至46％，從45分鐘至65分鐘，乙腈的比例為從46％升至73％，從65分鐘至75分鐘，乙腈的比例為從73％升至81％，從75分鐘至80分鐘，乙腈的比例為從81％升至100％，流速為1ml/min、檢測波長為254±2nm，柱溫25℃； (4)標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的制定以上述方法作為制定以黃芪黃酮類成分特征為主的指紋圖譜的測試手段；依據(jù)10批供試品所測得的圖譜，制定標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，以確定的參照物色譜峰的保留時間為基準(zhǔn)，計算其它共有色譜峰的相對保留時間，所述標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜中，共有峰有22個； (5)以(1)～(3)所述方法作為待測凍干粉針中以黃芪黃酮類成分特征為主的指紋圖譜的測試手段，制備待測凍干粉針的指紋圖譜； (6)將待測凍干粉針的指紋圖譜與上述標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜對比，符合下列要求 I.計算待測凍干粉針的指紋圖譜與標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的相似度，應(yīng)為0.90～1.00； II.待測凍干粉針指紋圖譜中，非共有峰面積不得超過總峰面積的5％； III.除參照物色譜峰之外的其他共有色譜峰與參照物色譜峰的相對保留時間與標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜比較，相對偏差不得超過±10％。
實施例4采用液相色譜法測試以黃芪皂苷類、三七皂苷類成分特征為主的指紋圖譜 (1)供試品溶液的制備精密稱取待測凍干粉針適量，加乙醇制成每1ml含50mg的溶液，搖勻，即得； (2)參照物溶液的制備精密稱取人參皂苷Rg1適量，加乙醇制成每1ml含0.3mg的溶液，作為參照物溶液； (3)色譜條件色譜柱采用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料流動相為乙腈-1％冰醋酸，梯度洗脫，溶劑比例為從0分鐘至14分鐘，乙腈的比例為15％，從14分鐘至45分鐘，乙腈的比例為從15％升至30％，從45分鐘至60分鐘，乙腈的比例為從30％升至80％，流速為1ml/min、檢測波長203±2nm，柱溫30℃； (4)標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的制定以上述方法作為制定以黃芪皂苷類、三七皂苷類成分特征為主的指紋圖譜的測試手段；依據(jù)10批供試品所測得的圖譜，制定標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，以確定的參照物色譜峰的保留時間為基準(zhǔn)，計算其它共有色譜峰的相對保留時間，所述標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜中，共有峰有12個； (5)以(1)～(3)所述方法作為待測凍干粉針中以黃芪皂苷類、三七皂苷類成分特征為主的指紋圖譜的測試手段，制備待測凍干粉針的指紋圖譜； (6)將待測凍干粉針的指紋圖譜與上述標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜對比，符合下列要求 I.計算待測凍干粉針的指紋圖譜與標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的相似度，應(yīng)為0.90～1.00； II.待測凍干粉針指紋圖譜中，非共有峰面積不得超過總峰面積的5％； III.除參照物色譜峰之外的其他共有色譜峰與參照物色譜峰的相對保留時間與標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜比較，相對偏差不得超過±10％。
實施例5采用液相色譜法測試以黃芪黃酮類成分特征為主的指紋圖譜 (1)供試品溶液的制備取待測注射液1ml，置50ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得； (2)參照物溶液的制備取芒柄花素，用甲醇溶解并稀釋至合適濃度，作為參照物溶液； (3)色譜條件色譜柱采用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料流動相為甲醇-水，梯度洗脫，溶劑比例為從0分鐘至15分鐘，甲醇的比例為從7％升至40％，從15分鐘至30分鐘，甲醇的比例為從40％升至55％，從30分鐘至45分鐘，甲醇的比例為從55％升至75％，從45分鐘至60分鐘，乙腈的比例為從75％升至85％，從60分鐘至40分鐘，甲醇的比例為從85％升至100％，流速為1ml/min、檢測波長為254±2nm，柱溫25℃； (4)標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的制定以上述方法作為制定以黃芪黃酮類成分特征為主的指紋圖譜的測試手段；依據(jù)10批供試品所測得的圖譜，制定標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，以確定的參照物色譜峰的保留時間為基準(zhǔn)，計算其它共有色譜峰的相對保留時間，所述標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜中，共有峰有20個； (5)以(1)～(3)所述方法作為待測注射液中以黃芪黃酮類成分特征為主的指紋圖譜的測試手段，制備待測注射液的指紋圖譜； (6)將待測注射液的指紋圖譜與上述標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜對比，符合下列要求中 I.計算待測注射液的指紋圖譜與標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的相似度，應(yīng)為0.90～1.00； II.待測注射液指紋圖譜中，非共有峰面積不得超過總峰面積的5％； III.除參照物色譜峰之外的其他共有色譜峰與參照物色譜峰的相對保留時間與標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜比較，相對偏差不得超過±10％。
實施例6采用液相色譜法測試以黃芪皂苷類、三七皂苷類成分特征為主的指紋圖譜 (1)供試品溶液的制備取注射液作為供試品溶液； (2)參照物溶液的制備精密稱取人參皂苷Rg1適量，加甲醇制成每1ml含0.3mg的溶液，作為參照物溶液； (3)色譜條件色譜柱采用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料流動相為甲醇-0.1％磷酸，梯度洗脫，溶劑比例為從0分鐘至10分鐘，甲醇的比例為20％，從10分鐘至40分鐘，甲醇的比例為從20％升至40％，從45分鐘至60分鐘，甲醇的比例為從400％升至80％，流速為1ml/min、檢測波長203±2nm，柱溫40℃； (4)標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的制定以上述方法作為制定以黃芪皂苷類、三七皂苷類成分特征為主的指紋圖譜的測試手段；依據(jù)10批或10批以上供試品所測得的圖譜，制定標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，以確定的參照物色譜峰的保留時間為基準(zhǔn)，計算其它共有色譜峰的相對保留時間，所述標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜中，共有峰有13個； (5)以(1)～(3)所述方法作為待測注射液中以黃芪皂苷類、三七皂苷類成分特征為主的指紋圖譜的測試手段，制備待測注射液的指紋圖譜； (6)將待測注射液的指紋圖譜與上述標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜對比，符合下列要求I.計算待測注射液的指紋圖譜與標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的相似度，應(yīng)為0.90～1.00；II.待測注射液指紋圖譜中，非共有峰面積不得超過總峰面積的5％；III.除參照物色譜峰之外的其他共有色譜峰與參照物色譜峰的相對保留時間與標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜比較，相對偏差不得超過±10％。
實施例7凍干粉針中野黃芩苷的薄層色譜鑒別方法 取待測凍干粉針1g，加甲醇10ml提取，離心，取上清液作為供試品溶液；另取野黃芩苷對照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液；采用中國藥典附錄公開的薄層色譜法試驗，吸取上述溶液各3μl，分別以條狀帶點于同一聚酰胺膜上，以甲醇-醋酸乙酯-甲酸7∶2∶1為展開劑，展開，取出，晾干，噴以2％三氯化鐵乙醇溶液，供試品色譜中，在與對照藥材色譜及對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的條斑。
實施例8凍干粉針中野黃芩苷的液相色譜鑒別方法 取待測凍干粉針0.25g，精密稱定，置25ml量瓶中，加甲醇適量超聲處理(功率250W，頻率33KHz)5min，取出，放至室溫，加甲醇定至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0.45μm)濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液；以野黃芩苷對照品的甲醇或乙醇溶液為對照，采用液相色譜法，色譜柱用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，甲醇-0.1％磷酸水溶液50％∶50％為流動相，檢測波長為335nm；供試品色譜中，具與對照品色譜有保留時間一致的色譜峰。
實施例9凍干粉針中三七、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、三七皂苷R1的薄層色譜鑒別方法 取待測凍干粉針5g，用正丁醇20ml提取，濾過，濾液揮干，殘渣加甲醇5ml溶解，作為供試品溶液；三七對照藥材溶液的制備取三七對照藥材適量，加三氯甲烷回流提取，棄去三氯甲烷液，殘渣加水飽和正丁醇提取，提取液加氨試液，分取上層，蒸干，殘渣用甲醇溶解，作為對照藥材溶液；對照品溶液的制備取人參皂苷Rg1對照品、人參皂苷Rb1對照品、三七皂苷R1對照品，分別加甲醇制成每1ml含2mg的溶液，作為對照品溶液；采用中國藥典附錄公開的薄層色譜法試驗，吸取上述溶液各5μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-醋酸乙酯-甲醇-水15∶40∶22∶10在10℃以下放置的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10％硫酸乙醇試劑，105℃烘至斑點顯色清晰，分別置日光及紫外光燈365nm下檢視，供試品色譜中，在與對照藥材色譜及對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點。
實施例10凍干粉針中人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、三七皂苷R1的液相色譜鑒別 取待測凍干粉針2.5g，置50ml量瓶中，加甲醇40ml，超聲處理(功率250W，頻率33KHz)使溶解，取出，放至室溫，加甲醇至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0.45μm)濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液；以人參皂苷Rg1對照品、人參皂苷Rb1對照品、三七皂苷R1對照品的甲醇溶液為對照，采用液相色譜法，色譜柱用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，乙腈-水為流動相，梯度洗脫，溶劑比例為從0分鐘至15分鐘，乙腈的比例為20％，從15分鐘至21分鐘，乙腈的比例由20％上升至40％，從21分鐘至25分鐘，乙腈的比例為20％；流速為1.0ml/min，檢測波長203nm，柱溫在30℃；供試品色譜中，具與對照品色譜有保留時間一致的色譜峰。
實施例11凍干粉針中黃芪的薄層色譜鑒別方法 取待測凍干粉針5g，加乙醇20ml提取，濾過，濾液蒸干，殘渣加0.3％氫氧化鈉溶液10ml溶解，濾過，濾液用鹽酸條件pH值至5～6，用醋酸乙酯20ml提取，濾過，濾液蒸干，殘渣加醋酸乙酯1ml溶解，作為供試品溶液；另取黃芪對照藥材、同法制成對照藥材溶液；采用中國藥典附錄公開的薄層色譜法試驗，吸取上述溶液各10μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇10∶1為展開劑，展開，取出，晾干，置氨蒸汽中熏后置紫外光燈365nm下檢視，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色斑點。
實施例12凍干粉針中黃芪甲苷的薄層色譜鑒別方法 取待測凍干粉針5g，加甲醇10ml溶解后加于中性氧化鋁柱，用40％甲醇40ml洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣加水10ml溶解后加水飽和正丁醇提取3次，每次10ml，合并正丁醇液，用水洗滌，棄去水液，正丁醇液蒸干，殘渣用甲醇2ml溶解，作為供試品溶液；另取黃芪甲苷對照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作為對照品溶液；采用中國藥典附錄公開的薄層色譜法試驗，吸取上述溶液各2μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水13∶7∶2的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10％硫酸乙醇溶液，105℃加熱至斑點顯色清晰，置日光下及紫外光燈365nm下檢視，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，應(yīng)顯相同顏色斑點。
實施例13凍干粉針中黃芪甲苷的液相色譜鑒別方法 取待測凍干粉針5g，加水20ml溶解后用水飽和正丁醇提取，每次40ml，合并正丁醇液，用氨試液充分洗滌2次，每次40ml，棄去氨液，正丁醇液蒸干，殘渣加水5ml溶解后通過D101大孔吸附樹脂柱(內(nèi)徑1.5cm，長12cm)，依次用水50ml、40％乙醇30ml、70％乙醇80ml洗脫，收集70％乙醇洗脫部分，蒸干，殘渣用甲醇5ml溶解，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液；以黃芪甲苷對照品的甲醇或乙醇溶液為對照，采用液相色譜法，色譜柱用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，32％∶68％乙腈-水為流動相，蒸發(fā)光散射檢測器檢測，柱溫30℃；供試品色譜中，具與對照品色譜有保留時間一致的色譜峰。
實施例14凍干粉針中芒柄花素、毛蕊芒柄花素的薄層色譜鑒別方法 取待測凍干粉針3g，加甲醇10ml提取，提取液作為供試品溶液；另取芒柄花素、毛蕊芒柄花素，加甲醇制成每1ml各含1mg的溶液，作為對照品溶液；采用中國藥典附錄公開的薄層色譜法試驗，吸取上述溶液各5μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-醋酸乙酯-水2.5∶3∶4∶0.5為展開劑，展開，展距5cm，取出，晾干，置紫外光燈365nm下檢視，供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色斑點。
實施例15凍干粉針中芒柄花素、毛蕊芒柄花素的液相色譜鑒別方法 取待測凍干粉針0.5g，精密稱定，置5ml量瓶中，加甲醇適量超聲處理(功率250W，頻率33KHz)5min，取出，放至室溫，加甲醇定至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0.45μm)濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液；以芒柄花素、毛蕊芒柄花素對照品的甲醇溶液為對照，采用液相色譜法，色譜柱用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，流動相A為甲醇，流動相B為水，梯度洗脫，溶劑比例為從0分鐘至10分鐘，水的比例為從40％升至50％，從10分鐘至20分鐘，水的比例為從50％升至60％，從30分鐘至50分鐘，水的比例為60％，檢測波長為250nm，柱溫30℃；供試品色譜中，具與對照品色譜有保留時間一致的色譜峰。
實施例16凍干粉針中野黃芩苷的含量測定 取待測凍干粉針0.25g，精密稱定，置25ml量瓶中，加甲醇適量超聲處理(功率250W，頻率33KHz)5min，取出，放至室溫，加甲醇定至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0.45μm)濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液；以野黃芩苷對照品的甲醇或乙醇溶液為對照，采用液相色譜法，色譜柱用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，甲醇-0.1％磷酸水溶液50％∶50％為流動相，檢測波長為335nm；以外標(biāo)一點進(jìn)行計算，凍干粉針制劑以相當(dāng)于每日用成品量為單位量，每單位量含野黃芩苷的限度不得少于4mg。
實施例17凍干粉針中人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、三七皂苷R1的含量測定 取待測凍干粉針2.5g，置50ml量瓶中，加甲醇40ml，超聲處理(功率250W，頻率33KHz)使溶解，取出，放至室溫，加甲醇至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0.45μm)濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液；以人參皂苷Rg1對照品、人參皂苷Rb1對照品、三七皂苷R1對照品的甲醇溶液為對照，采用液相色譜法，色譜柱用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，乙腈-水為流動相，梯度洗脫，溶劑比例為從0分鐘至15分鐘，乙腈的比例為20％，從15分鐘至21分鐘，乙腈的比例由20％上升至40％，從21分鐘至25分鐘，乙腈的比例為20％；流速為1.0ml/min，檢測波長203nm，柱溫為30℃；以外標(biāo)法或標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行計算，待測凍干粉針以相當(dāng)于每日用成品量為單位量，含量限度應(yīng)為以下幾項 (1)每單位量含人參皂苷Rg1的限度不得少于5mg； (2)每單位量含人參皂苷Rb1的限度不得少于7mg； (3)每單位量含三七皂苷R1的限度不得少于0.5mg； (4)每單位量含人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、三七皂苷R1的總和的限度不得少于12mg。
實施例18凍干粉針中總皂苷的含量測定 取待測凍干粉針50mg，精密稱定，置25ml量瓶中，加甲醇適量超聲處理(功率250W，頻率33KHZ)使溶解，取出，放至室溫，加甲醇至刻度，搖勻，精密量取1ml，置25ml量瓶中，水浴蒸干，立即取出，精密加5％香草醛-冰醋酸溶液0.5ml，高氯酸2.0ml，搖勻，60℃水浴上加熱15分鐘，取出，立即以冰水浴或流水冷卻，精密加冰醋酸至刻度，搖勻，作為供試品溶液，以人參皂苷Rg1為對照品，同法制得對照品溶液。以隨行溶劑為空白，采用中國藥典附錄公開的分光光度法，在547nm的波長處測定吸收度，以外標(biāo)一點法進(jìn)行計算，待測凍干粉針以相當(dāng)于每日用成品量為單位量，每單位量含總皂苷以人參皂苷Rg1計，不得少于20mg。
實施例19凍干粉針中黃芪甲苷的含量測定 取待測凍干粉針5g，加水20ml溶解后用水飽和正丁醇提取，每次40ml，合并正丁醇液，用氨試液充分洗滌2次，每次40ml，棄去氨液，正丁醇液蒸干，殘渣加水5ml溶解后通過D101大孔吸附樹脂柱(內(nèi)徑1.5cm，長12cm)，依次用水50ml、40％乙醇30ml、70％乙醇80ml洗脫，收集70％乙醇洗脫部分，蒸干，殘渣用甲醇5ml溶解，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液；以黃芪甲苷對照品的甲醇或乙醇溶液為對照，采用液相色譜法，色譜柱用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，32％∶68％乙腈-水為流動相，蒸發(fā)光散射檢測器檢測，柱溫30℃；以外標(biāo)一點法進(jìn)行計算，待測凍干粉針以相當(dāng)于每日用成品量為單位量，每單位量含黃芪甲苷的限度不得少于0.04mg。
實施例20凍干粉針中總多糖的含量測定 取待測凍干粉針0.3g，置具塞錐形瓶中，加80％乙醇20ml超聲處理使溶散，離心，取沉淀，加蒸餾水適量使溶解并定量轉(zhuǎn)移至25ml量瓶中，加蒸餾水定至刻度，搖勻，精密量取1ml，至10ml具塞試管中，加蒸餾水至2ml，精密加4％苯酚溶液1ml，混勻，迅速加入硫酸7ml，搖勻，40℃水浴30分鐘，取出，立即以冰水浴冷卻5分鐘，取出，以隨行溶劑為空白，采用中國藥典附錄公開的分光光度法，在488nm的波長處測定吸收度，以外標(biāo)一點法進(jìn)行計算，待測凍干粉針以相當(dāng)于每日用成品量為單位量，每單位量含總多糖以無水葡萄糖計，不得少于3.2mg。
實施例21凍干粉針中芒柄花素、毛蕊芒柄花素的含量測定 取待測凍干粉針0.5g，精密稱定，置5ml量瓶中，加甲醇適量超聲處理(功率250W，頻率33KHz)5min，取出，放至室溫，加甲醇定至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0.45μm)濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液；以芒柄花素、毛蕊芒柄花素對照品的甲醇溶液為對照，采用液相色譜法，色譜柱用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，流動相A為甲醇，流動相B為水，梯度洗脫，溶劑比例為從0分鐘至10分鐘，水的比例為從40％升至50％，從10分鐘至30分鐘，水的比例為從50％升至60％，從30分鐘至50分鐘，水的比例為60％，檢測波長為250nm，柱溫30℃；以外標(biāo)一點法進(jìn)行計算，待測凍干粉針以相當(dāng)于每日用成品量為單位量，含量限度應(yīng)為以下兩項 (1)每單位量含芒柄花素的限度不得少于0.02mg； (2)每單位量含人毛蕊芒柄花素的限度不得少于0.02mg。
實施例22注射液中野黃芩苷的薄層色譜鑒別方法 取待測注射液10ml，蒸干，殘渣加甲醇1ml溶解，作為供試品溶液；另取野黃芩苷對照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液；采用中國藥典附錄公開的薄層色譜法試驗，吸取上述溶液各3μl，分別以點于同一硅膠G薄層板上，以苯-醋酸乙酯-甲酸-水7∶2∶1∶0.2為展開劑，展開，取出，晾干，噴以1％三氯化鋁乙醇溶液，供試品色譜中，在與對照藥材色譜及對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點。
實施例23注射液中野黃芩苷的液相色譜鑒別方法 取待測注射液5ml，置25ml量瓶中，加水定至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0.45μm)濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液；以野黃芩苷對照品的甲醇或乙醇溶液為對照，采用液相色譜法，色譜柱用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，乙腈-1％冰醋酸水溶液45％∶55％為流動相，檢測波長為335nm；供試品色譜中，具與對照品色譜有保留時間一致的色譜峰。
實施例24注射液中三七、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、三七皂苷R1的薄層色譜鑒別方法 取待測注射液20ml，蒸干，殘渣用甲醇5ml，作為供試品溶液；取三七對照藥材適量，加二氯甲烷回流提取，棄去二氯甲烷液，殘渣加水飽和正丁醇提取，提取液加氨試液，分取上層，蒸干，殘渣用甲醇溶解，作為對照藥材溶液；對照品溶液的制備取人參皂苷Rg1對照品、人參皂苷Rb1對照品、三七皂苷R1對照品，分別加甲醇制成每1ml含2mg的溶液，作為對照品溶液；采用中國藥典附錄公開的薄層色譜法試驗，吸取上述溶液各5μl，分別點于同一硅膠H薄層板上，以正丁醇-醋酸乙酯-水5∶1∶33的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10％硫酸乙醇試劑，105℃烘至斑點顯色清晰，分別置日光及紫外光燈365nm下檢視，供試品色譜中，在與對照藥材色譜及對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點。
實施例25注射液中人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、三七皂苷R1的液相色譜鑒別 取待測注射液25ml，置50ml量瓶中，加水至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0.45μm)濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液；以人參皂苷Rg1對照品、人參皂苷Rb1對照品、三七皂苷R1對照品的甲醇溶液為對照，采用液相色譜法，色譜柱用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，乙腈-1％冰醋酸水溶液為流動相，梯度洗脫，溶劑比例為從0分鐘至15分鐘，乙腈的比例為20％，從15分鐘至21分鐘，乙腈的比例由20％上升至40％，從21分鐘至25分鐘，乙腈的比例為20％；流速為1.0ml/min，檢測波長203nm，柱溫在35℃；供試品色譜中，具與對照品色譜有保留時間一致的色譜峰。
實施例26注射液中黃芪的薄層色譜鑒別方法 取待測注射液20ml，蒸干，殘渣加0.3％氫氧化鈉溶液10ml溶解，濾過，濾液用鹽酸條件pH值至5～6，用正丁醇20ml提取，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇1ml溶解，作為供試品溶液；另取黃芪對照藥材、同法制成對照藥材溶液；采用中國藥典附錄公開的薄層色譜法試驗，吸取上述溶液各10μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以二氯甲烷-甲醇5∶0.8為展開劑，展開，取出，晾干，置氨蒸汽中熏后置紫外光燈365nm下檢視，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色斑點。
實施例27注射液中黃芪甲苷的薄層色譜鑒別方法 取待測注射液20ml，蒸干，殘渣加甲醇5ml溶解后加于中性氧化鋁柱，用40％甲醇40ml洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣加水10ml溶解后加水飽和正丁醇提取3次，每次10ml，合并正丁醇液，用水洗滌，棄去水液，正丁醇液蒸干，殘渣用甲醇2ml溶解，作為供試品溶液；另取黃芪甲苷對照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作為對照品溶液；采用中國藥典附錄公開的薄層色譜法試驗，吸取上述溶液各2μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以二氯甲烷-乙醇-水13∶7∶2的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10％硫酸乙醇溶液，105℃加熱至斑點顯色清晰，置日光下及紫外光燈365nm下檢視，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，應(yīng)顯相同顏色斑點。
實施例28.注射液中黃芪甲苷的液相色譜鑒別方法 取待測注射液20ml，加水20ml溶解后用水飽和正丁醇提取，每次40ml，合并正丁醇液，用氨試液充分洗滌2次，每次40ml，棄去氨液，正丁醇液蒸干，殘渣加水5ml溶解后通過D101大孔吸附樹脂柱(內(nèi)徑1.5cm，長12cm)，依次用水50ml、30％甲醇30ml、65％甲醇80ml洗脫，收集65％甲醇洗脫部分，蒸干，殘渣用甲醇5ml溶解，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液；以黃芪甲苷對照品的甲醇或乙醇溶液為對照，采用液相色譜法，色譜柱用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，30％∶70％乙腈-0.5％冰醋酸為流動相，蒸發(fā)光散射檢測器檢測，柱溫30℃；供試品色譜中，具與對照品色譜有保留時間一致的色譜峰。
實施例29注射液中芒柄花素、毛蕊芒柄花素的薄層色譜鑒別方法 取待測注射液30ml，蒸干，殘渣加甲醇10ml提取，提取液作為供試品溶液；另取芒柄花素、毛蕊芒柄花素，加甲醇制成每1ml各含1mg的溶液，作為對照品溶液；采用中國藥典附錄公開的薄層色譜法試驗，吸取上述溶液各5μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以二氯甲烷-乙醇-醋酸乙酯-水3∶4∶3∶0.5為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈365nm下檢視，供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色斑點。
實施例30注射液中芒柄花素、毛蕊芒柄花素的液相色譜鑒別方法 取待測注射液10ml，蒸干，殘渣用甲醇適量使溶解并定量轉(zhuǎn)移至5ml量瓶中，加甲醇定至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0.45μm)濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液；以芒柄花素、毛蕊芒柄花素對照品的甲醇溶液為對照，采用液相色譜法，色譜柱用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，流動相A為乙腈，流動相B為水，梯度洗脫，溶劑比例為從0分鐘至10分鐘，水的比例為從45％升至55％，從10分鐘至20分鐘，水的比例為從55％升至65％，從30分鐘至50分鐘，水的比例為65％，檢測波長為250nm，柱溫40℃；供試品色譜中，具與對照品色譜有保留時間一致的色譜峰。
實施例31注射液中野黃芩苷的含量測定 取待測注射液30ml，蒸干，殘渣加甲醇適量使溶解并定量轉(zhuǎn)移至10ml量瓶中，加甲醇定至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0.45μm)濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液；以野黃芩苷對照品的甲醇或乙醇溶液為對照，采用液相色譜法，色譜柱用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，已經(jīng)-1％冰醋酸水溶液40％∶60％為流動相，檢測波長為335nm；以外標(biāo)一點進(jìn)行計算，該制劑以相當(dāng)于每日用成品量為單位量，每單位量含野黃芩苷的限度不得少于4mg。
實施例32注射液中人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、三七皂苷R1的含量測定 取待測注射液25ml，置50ml量瓶中，加水至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0.45μm)濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液；以人參皂苷Rg1對照品、人參皂苷Rb1對照品、三七皂苷R1對照品的甲醇溶液為對照，采用液相色譜法，色譜柱用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，乙腈-1％冰醋酸水溶液為流動相，梯度洗脫，溶劑比例為從0分鐘至15分鐘，乙腈的比例為20％，從15分鐘至21分鐘，乙腈的比例由20％上升至40％，從21分鐘至25分鐘，乙腈的比例為20％；流速為1.0ml/min，檢測波長203nm，柱溫為30℃；以外標(biāo)法或標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行計算，該注射液以相當(dāng)于每日用成品量為單位量，含量限度應(yīng)為以下幾項 (1)每單位量含人參皂苷Rg1的限度不得少于5mg； (2)每單位量含人參皂苷Rb1的限度不得少于7mg； (3)每單位量含三七皂苷R1的限度不得少于0.5mg； (4)每單位量含人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、三七皂苷R1的總和的限度不得少于12mg。
實施例33注射液中總皂苷的含量測定 精密量取待測注射液0.8ml，置25ml量瓶中，水浴蒸干，立即取出，精密加5％香草醛-冰醋酸溶液1ml，高氯酸4ml，搖勻，60℃水浴上加熱7分鐘，取出，立即以冰水浴或流水冷卻，精密加冰醋酸至刻度，搖勻，作為供試品溶液，以人參皂苷Rg1為對照品，同法制得對照品溶液。以隨行溶劑為空白，采用中國藥典附錄公開的分光光度法，在547nm的波長處測定吸收度，以外標(biāo)一點法進(jìn)行計算，待測注射液以相當(dāng)于每日用成品量為單位量，每單位量含總皂苷以人參皂苷Rg1計，不得少于20mg。
實施例34注射液中黃芪甲苷的含量測定 取待測注射液20ml，加水20ml溶解后用水飽和正丁醇提取，每次40ml，合并正丁醇液，用氨試液充分洗滌2次，每次40ml，棄去氨液，正丁醇液蒸干，殘渣加水5ml溶解后通過D101大孔吸附樹脂柱(內(nèi)徑1.5cm，長12cm)，依次用水50ml、30％甲醇30ml、65％甲醇80ml洗脫，收集65％甲醇洗脫部分，蒸干，殘渣用甲醇5ml溶解，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液；以黃芪甲苷對照品的甲醇或乙醇溶液為對照，采用液相色譜法，色譜柱用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，30％∶70％乙腈-0.5％冰醋酸為流動相，蒸發(fā)光散射檢測器檢測，柱溫30℃；以外標(biāo)一點法進(jìn)行計算，該制劑以相當(dāng)于每日用成品量為單位量，每單位量含黃芪甲苷的限度不得少于0.04mg。
實施例35注射液中總多糖的含量測定 精密量取待測注射液1ml，至10ml具塞試管中，加蒸餾水至2ml，精密加4％苯酚溶液2ml，混勻，迅速加入硫酸6ml，搖勻，45℃水浴40分鐘，取出，立即以冰水浴冷卻5分鐘，取出，以隨行溶劑為空白，采用中國藥典附錄公開的分光光度法，在488nm的波長處測定吸收度，以外標(biāo)一點法進(jìn)行計算，該注射液以相當(dāng)于每日用成品量為單位量，每單位量含總多糖以無水葡萄糖計，不得少于3.2mg。
實施例36注射液中芒柄花素、毛蕊芒柄花素的含量測定 取待測注射液10ml，蒸干，殘渣用甲醇適量使溶解并定量轉(zhuǎn)移至5ml量瓶中，加甲醇定至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0.45μm)濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液；以芒柄花素、毛蕊芒柄花素對照品的甲醇溶液為對照，采用液相色譜法，色譜柱用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，流動相A為乙腈，流動相B為水，梯度洗脫，溶劑比例為從0分鐘至10分鐘，水的比例為從45％升至55％，從10分鐘至20分鐘，水的比例為從55％升至65％，從30分鐘至50分鐘，水的比例為65％，檢測波長為250nm，柱溫30℃；以外標(biāo)一點法進(jìn)行計算，該注射液以相當(dāng)于每日用成品量為單位量，含量限度應(yīng)為以下兩項 (1)每單位量含芒柄花素的限度不得少于0.02mg； (2)每單位量含人毛蕊芒柄花素的限度不得少于0.02mg。
實施例37片劑中野黃芩苷的薄層色譜鑒別方 取待測片劑，粉碎，從中取約1g，加醋酸乙酯10ml提取，離心，上清液蒸干，殘渣加甲醇5ml溶解作為供試品溶液；另取野黃芩苷對照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液；采用中國藥典附錄公開的薄層色譜法試驗，吸取上述溶液各3μl，分別以點于同一硅膠H薄層板上，以甲苯-醋酸乙酯-甲酸-水7∶2∶1∶∶0.5為展開劑，展開，取出，晾干，噴以1％三氯化鋁乙醇溶液，供試品色譜中，在與對照藥材色譜及對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點。
實施例38片劑中野黃芩苷的液相色譜鑒別方法 取本品0.5g，精密稱定，置25ml量瓶中，加流動相適量超聲處理(功率250W，頻率33KHz)5min，取出，放至室溫，加流動相定至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0.45μm)濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液；以野黃芩苷對照品的甲醇或乙醇溶液為對照，采用液相色譜法，色譜柱用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，乙腈-0.5％甲酸水溶液45％∶55％為流動相，檢測波長為335nm；供試品色譜中，具與對照品色譜有保留時間一致的色譜峰。
實施例39片劑中三七、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、三七皂苷R1的薄層色譜鑒別方法 取本品10g，用水溶解，濾過，濾液用水飽和正丁醇20ml提取，濾過，濾液揮干，殘渣加乙醇5ml溶解，作為供試品溶液；三七對照藥材溶液的制備取三七對照藥材適量，加乙醚回流提取，棄去乙醚液，殘渣加水飽和正丁醇提取，提取液加氨試液，分取上層，蒸干，殘渣用甲醇溶解，作為對照藥材溶液；對照品溶液的制備取人參皂苷Rg1對照品、人參皂苷Rb1對照品、三七皂苷R1對照品，分別加甲醇制成每1ml含2mg的溶液，作為對照品溶液；采用中國藥典附錄公開的薄層色譜法試驗，吸取上述溶液各5μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲酸乙酯-甲醇-水10∶35∶20∶8在10℃以下放置的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10％硫酸乙醇試劑，105℃烘至斑點顯色清晰，分別置日光及紫外光燈365nm下檢視，供試品色譜中，在與對照藥材色譜及對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點。
實施例40片劑中人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、三七皂苷R1的液相色譜鑒別 取本品10g，置50ml量瓶中，加流動相40ml，超聲處理(功率250W，頻率33KHz)使溶解，取出，放至室溫，加流動相至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0.45μm)濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液；以人參皂苷Rg1對照品、人參皂苷Rb1對照品、三七皂苷R1對照品的甲醇溶液為對照，采用液相色譜法，色譜柱用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，已經(jīng)-0.5％甲酸為流動相，梯度洗脫，溶劑比例為從0分鐘至13分鐘，乙腈的比例為18％，從13分鐘至20分鐘，乙腈的比例由18％上升至42％，從20分鐘至25分鐘，乙腈的比例為42％；流速為1.0ml/min，檢測波長203nm，柱溫在40℃；供試品色譜中，具與對照品色譜有保留時間一致的色譜峰。
實施例41片劑中黃芪的薄層色譜鑒別方法 取本品10g，加正丁醇20ml提取，濾過，濾液蒸干，殘渣加0.3％氫氧化鈉溶液10ml溶解，濾過，濾液用鹽酸條件pH值至5～6，用醋酸乙酯20ml提取，濾過，濾液蒸干，殘渣加醋酸乙酯1ml溶解，作為供試品溶液；另取黃芪對照藥材、同法制成對照藥材溶液；采用中國藥典附錄公開的薄層色譜法試驗，吸取上述溶液各10μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙醇9∶0.5為展開劑，展開，取出，晾干，置氨蒸汽中熏后置紫外光燈365nm下檢視，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色斑點。
實施例42片劑中黃芪甲苷的薄層色譜鑒別方法 取本品10g，加乙醇40ml超聲處理使溶解，取出，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇5ml溶解后加于中性氧化鋁柱，用50％乙醇50ml洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣加水10ml溶解后加水飽和正丁醇提取3次，每次10ml，合并正丁醇液，用水洗滌，棄去水液，正丁醇液蒸干，殘渣用甲醇2ml溶解，作為供試品溶液；另取黃芪甲苷對照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作為對照品溶液；采用中國藥典附錄公開的薄層色譜法試驗，吸取上述溶液各2μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以二氯甲烷-甲醇-水15∶5∶5的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10％硫酸乙醇溶液，105℃加熱至斑點顯色清晰，置日光下及紫外光燈365nm下檢視，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，應(yīng)顯相同顏色斑點。
實施例43片劑中黃芪甲苷的液相色譜鑒別方法 取本品10g，加水20ml溶解后用醋酸乙酯提取，每次40ml，合并醋酸乙酯液，用氨試液充分洗滌2次，每次40ml，棄去氨液，醋酸乙酯液蒸干，殘渣加水5ml溶解后通過D101大孔吸附樹脂柱(內(nèi)徑1.5cm，長12cm)，依次用水50ml、35％乙醇50ml、65％乙醇50ml洗脫，收集65％乙醇洗脫部分，蒸干，殘渣用甲醇5ml溶解，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液；以黃芪甲苷對照品的甲醇或乙醇溶液為對照，采用液相色譜法，色譜柱用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，45％∶55％甲醇-0.5％甲酸為流動相，蒸發(fā)光散射檢測器檢測，柱溫30℃；供試品色譜中，具與對照品色譜有保留時間一致的色譜峰。
實施例44片劑中芒柄花素、毛蕊芒柄花素的薄層色譜鑒別方法 取本品6g，加甲醇10ml提取，提取液作為供試品溶液；另取芒柄花素、毛蕊芒柄花素，加甲醇制成每1ml各含1mg的溶液，作為對照品溶液；采用中國藥典附錄公開的薄層色譜法試驗，吸取上述溶液各5μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以二氯甲烷-甲醇-醋酸乙酯-水3∶2∶5∶1為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈365nm下檢視，供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色斑點。
實施例45片劑中芒柄花素、毛蕊芒柄花素的液相色譜鑒別方法 取本品1g，精密稱定，置5ml量瓶中，加流動相適量超聲處理(功率250W，頻率33KHz)5min，取出，放至室溫，加流動相定至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0.45μm)濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液；以芒柄花素、毛蕊芒柄花素對照品的甲醇溶液為對照，采用液相色譜法，色譜柱用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，流動相A為乙腈，流動相B為0.05％磷酸水溶液，梯度洗脫，溶劑比例為從0分鐘至10分鐘，流動相B的比例為從45％升至55％，從10分鐘至20分鐘，流動相B的比例為從55％升至65％，從30分鐘至50分鐘，流動相B的比例為65％，檢測波長為250nm，柱溫35℃；供試品色譜中，具與對照品色譜有保留時間一致的色譜峰。
實施例46片劑中野黃芩苷的含量測定 取本品0.5g，精密稱定，置25ml量瓶中，加流動相適量超聲處理(功率250W，頻率33KHz)5min，取出，放至室溫，加流動相定至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0.45μm)濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液；以野黃芩苷對照品的甲醇或乙醇溶液為對照，采用液相色譜法，色譜柱用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，乙腈-0.5％甲酸水溶液45％∶55％為流動相，檢測波長為335nm；以外標(biāo)一點進(jìn)行計算，該制劑以相當(dāng)于每日用成品量為單位量，每單位量含野黃芩苷的限度不得少于4mg。
實施例47片劑中人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、三七皂苷R1的含量測定 取本品10g，置50ml量瓶中，加流動相40ml，超聲處理(功率250W，頻率33KHz)使溶解，取出，放至室溫，加流動相至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0.45μm)濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液；以人參皂苷Rg1對照品、人參皂苷Rb1對照品、三七皂苷R1對照品的甲醇溶液為對照，采用液相色譜法，色譜柱用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，已經(jīng)-0.5％甲酸為流動相，梯度洗脫，溶劑比例為從0分鐘至13分鐘，乙腈的比例為18％，從1 3分鐘至20分鐘，乙腈的比例由18％上升至42％，從20分鐘至25分鐘，乙腈的比例為42％；流速為1.0ml/min，檢測波長203nm，柱溫在40℃；以外標(biāo)法或標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行計算，待測藥物組合物以相當(dāng)于每日用成品量為單位量，含量限度應(yīng)為以下幾項 (1)每單位量含人參皂苷Rg1的限度不得少于5mg； (2)每單位量含人參皂苷Rb1的限度不得少于7mg； (3)每單位量含三七皂苷R1的限度不得少于0.5mg； (4)每單位量含人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、三七皂苷R1的總和的限度不得少于12mg。
實施例48片劑中總皂苷的含量測定 取本品0.1g，精密稱定，置25ml量瓶中，加乙醇適量超聲處理(功率250W，頻率33KHZ)使溶解，取出，放至室溫，加乙醇至刻度，搖勻，精密量取1ml，置25ml量瓶中，水浴蒸干，立即取出，精密加3％香草醛-冰醋酸溶液1ml，高氯酸2.0ml，搖勻，70℃水浴上加熱10分鐘，取出，立即以冰水浴或流水冷卻，精密加冰醋酸至刻度，搖勻，作為供試品溶液，以人參皂苷Rg1為對照品，同法制得對照品溶液。以隨行溶劑為空白，采用中國藥典附錄公開的分光光度法，在547nm的波長處測定吸收度，以外標(biāo)一點法進(jìn)行計算，該制劑以相當(dāng)于每日用成品量為單位量，每單位量含總皂苷以人參皂苷Rg1計，不得少于20mg。
實施例49片劑中黃芪甲苷的含量測定 取本品10g，加水20ml溶解后用醋酸乙酯提取，每次40ml，合并醋酸乙酯液，用氨試液充分洗滌2次，每次40ml，棄去氨液，醋酸乙酯液蒸干，殘渣加水5ml溶解后通過D101大孔吸附樹脂柱(內(nèi)徑1.5cm，長12cm)，依次用水50ml、35％乙醇50ml、65％乙醇50ml洗脫，收集65％乙醇洗脫部分，蒸干，殘渣用甲醇5ml溶解，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液；以黃芪甲苷對照品的甲醇或乙醇溶液為對照，采用液相色譜法，色譜柱用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，45％∶55％甲醇-0.5％甲酸為流動相，蒸發(fā)光散射檢測器檢測，柱溫30℃；以外標(biāo)一點法進(jìn)行計算，該制劑以相當(dāng)于每日用成品量為單位量，每單位量含黃芪甲苷的限度不得少于0.04mg。
實施例50片劑中總多糖的含量測定 取本品0.5g，置具塞錐形瓶中，加75％乙醇20ml超聲處理使溶散，離心，取沉淀，加蒸餾水適量使溶解并定量轉(zhuǎn)移至25ml量瓶中，加蒸餾水定至刻度，搖勻，精密量取1ml，至10ml具塞試管中，加蒸餾水至2ml，精密加8％苯酚溶液1ml，混勻，迅速加入硫酸7ml，搖勻，50℃水浴20分鐘，取出，立即以冰水浴冷卻5分鐘，取出，以隨行溶劑為空白，采用中國藥典附錄公開的分光光度法，在488nm的波長處測定吸收度，以外標(biāo)一點法進(jìn)行計算，該制劑以相當(dāng)于每日用成品量為單位量，每單位量含總多糖以無水葡萄糖計，不得少于3.2mg。
實施例51凍干粉針中芒柄花素、毛蕊芒柄花素的含量測定 取本品粉針1g，精密稱定，置5ml量瓶中，加流動相適量超聲處理(功率250W，頻率33KHz)5min，取出，放至室溫，加流動相定至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0.45μm)濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液；以芒柄花素、毛蕊芒柄花素對照品的甲醇溶液為對照，采用液相色譜法，色譜柱用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，流動相A為乙腈，流動相B為0.05％磷酸水溶液，梯度洗脫，溶劑比例為從0分鐘至10分鐘，流動相B的比例為從45％升至55％，從10分鐘至20分鐘，流動相B的比例為從55％升至65％，從30分鐘至50分鐘，流動相B的比例為65％，檢測波長為250nm，柱溫35℃；以外標(biāo)一點法進(jìn)行計算，該制劑以相當(dāng)于每日用成品量為單位量，含量限度應(yīng)為以下兩項 (1)每單位量含芒柄花素的限度不得少于0.02mg； (2)每單位量含人毛蕊芒柄花素的限度不得少于0.02mg。
權(quán)利要求
1、一種以燈盞花素、三七、黃芪制成的藥物組合物的質(zhì)量控制方法，其特征在于該方法包括以下全部或部分內(nèi)容
(1)指紋圖譜測試，包括以黃芪黃酮類成分特征為主的指紋圖譜和以黃芪皂苷類、三七皂苷類成分特征為主的指紋圖譜中的一種或兩種；
(2)黃芪對照藥材、三七對照藥材、野黃芩苷、黃芪甲苷、芒柄花素、毛蕊異黃酮、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1中全部或部分成分的鑒別測試方法；
(3)野黃芩苷、黃芪甲苷、芒柄花素、毛蕊異黃酮、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、總皂苷、總多糖中全部或部分成分的含量測試方法。
2、按照權(quán)利要求1所述的以燈盞花素、三七、黃芪制成的藥物組合物的質(zhì)量控制方法，其特征在于該方法采用液相色譜法測試以黃芪黃酮類成分特征為主的指紋圖譜和以黃芪皂苷類、三七皂苷類成分特征為主的指紋圖譜中的一種或兩種
a、采用液相色譜法測試以黃芪黃酮類成分特征為主的指紋圖譜
(1)供試品溶液的制備供試品溶液的制備取待測藥物組合物適量，加水或甲醇或乙醇溶解或稀釋，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液；
(2)參照物溶液的制備取芒柄花素，用甲醇或乙醇溶解，定容至合適濃度，作為參照物溶液；
(3)色譜條件色譜柱采用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料流動相為乙腈或甲醇-水或0.1％～5％冰醋酸或0.1％～5％甲酸或0.005％～5％磷酸溶液，梯度洗脫，流速為0.5～2.0ml/min、檢測波長為190-400nm范圍內(nèi)的一個或幾個，柱溫在20～60℃范圍內(nèi)；
(4)標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的制定以上述方法作為制定以黃芪黃酮類成分特征為主的指紋圖譜的測試手段；依據(jù)10批或10批以上供試品所測得的圖譜，制定標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，以確定的參照物色譜峰的保留時間為基準(zhǔn)，計算其它共有色譜峰的相對保留時間，所述標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜中，共有峰有3～50個；
(5)以(1)～(3)所述方法作為待測藥物組合物中以黃芪黃酮類成分特征為主的指紋圖譜的測試手段，制備待測樣品的指紋圖譜；
(6)將待測藥物組合物的指紋圖譜與上述標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜對比，應(yīng)符合下列要求中的部分或全部
I.計算待測藥物組合物的指紋圖譜與標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的相似度，應(yīng)為0.80～1.00；
II.待測藥物組合物指紋圖譜中，非共有峰面積不得超過總峰面積的10％；
III.除參照物色譜峰之外的其他共有色譜峰與參照物色譜峰的相對保留時間與標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜比較，相對偏差不得超過±20％；
b、采用液相色譜法測試以黃芪皂苷類、三七皂苷類成分特征為主的指紋圖譜
(1)供試品溶液的制備取待測藥物組合物適量，加甲醇或乙醇或水稀釋至合適濃度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液；
(2)參照物溶液的制備取適量黃芪和三七藥材中的主要活性成分對照品，包括人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、三七皂苷R1、黃芪甲苷中的一種，用水或甲醇或乙醇溶解，定容至合適濃度，作為參照物溶液；
(3)色譜條件色譜柱采用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料流動相為乙腈或甲醇-水或0.1％～5％冰醋酸或0.1％～5％甲酸或0.005％～5％磷酸溶液，梯度洗脫，流速為0.5～2.0ml/min、檢測波長為190～400nm范圍內(nèi)的一個或幾個或蒸發(fā)光散射檢測器檢測，柱溫在20～60℃范圍內(nèi)；
(4)標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的制定以上述方法作為制定以黃芪皂苷類、三七皂苷類成分特征為主的指紋圖譜的測試手段；依據(jù)10批或10批以上供試品所測得的圖譜，制定標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，以確定的參照物色譜峰的保留時間為基準(zhǔn)，計算其它共有色譜峰的相對保留時間，所述標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜中，共有峰有3～40個；
(5)以(1)～(3)所述方法作為待測藥物組合物中以黃芪皂苷類、三七皂苷類成分特征為主的指紋圖譜的測試手段，制備待測樣品的指紋圖譜；
(6)將待測藥物組合物的指紋圖譜與上述標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜對比，應(yīng)符合下列要求中的部分或全部
I.計算待測藥物組合物的指紋圖譜與標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的相似度，應(yīng)為0.80～1.00；
II.待測藥物組合物指紋圖譜中，非共有峰面積不得超過總峰面積的10％；
III.除參照物色譜峰之外的其他共有色譜峰與參照物色譜峰的相對保留時間與標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜比較，相對偏差不得超過±20％。
3、按照權(quán)利要求2所述的以燈盞花素、三七、黃芪制成的藥物組合物的質(zhì)量控制方法，其特征在于該方法采用液相色譜法測試以黃芪黃酮類成分特征為主的指紋圖譜和以黃芪皂苷類、三七皂苷類成分特征為主的指紋圖譜中的一種或兩種
a、采用液相色譜法測試以黃芪黃酮類成分特征為主的指紋圖譜
(1)供試品溶液的制備精密稱取待測藥物組合物適量，加水制成每1ml含1mg的溶液，搖勻，即得；
(2)參照物溶液的制備取芒柄花素，用甲醇溶解并稀釋至合適濃度，作為參照物溶液；
(3)色譜條件色譜柱采用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料流動相為乙腈-水，梯度洗脫，溶劑比例為從0分鐘至20分鐘，乙腈的比例為從4％升至25％，從20分鐘至40分鐘，乙腈的比例為從25％升至45％，從40分鐘至60分鐘，乙腈的比例為從45％升至70％，從60分鐘至70分鐘，乙腈的比例為從70％升至80％，從70分鐘至80分鐘，乙腈的比例為從80％升至100％，流速為1ml/min、檢測波長為254±2nm，柱溫25℃；
(4)標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的制定以上述方法作為制定以黃芪黃酮類成分特征為主的指紋圖譜的測試手段；依據(jù)10批或10批以上供試品所測得的圖譜，制定標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，以確定的參照物色譜峰的保留時間為基準(zhǔn)，計算其它共有色譜峰的相對保留時間，所述標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜中，共有峰有3～30個；
(5)以(1)～(3)所述方法作為待測藥物組合物中以黃芪黃酮類成分特征為主的指紋圖譜的測試手段，制備待測樣品的指紋圖譜；
(6)將待測藥物組合物的指紋圖譜與上述標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜對比，應(yīng)符合下列要求中的部分或全部
I.計算待測藥物組合物的指紋圖譜與標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的相似度，應(yīng)為0.90～1.00；
II.待測藥物組合物指紋圖譜中，非共有峰面積不得超過總峰面積的5％；
III.除參照物色譜峰之外的其他共有色譜峰與參照物色譜峰的相對保留時間與標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜比較，相對偏差不得超過±10％；
b、采用液相色譜法測試以黃芪皂苷類、三七皂苷類成分特征為主的指紋圖譜
(1)供試品溶液的制備精密稱取待測藥物組合物適量，加甲醇制成每1ml含50mg的溶液，搖勻，即得；
(2)參照物溶液的制備精密稱取人參皂苷Rg1適量，加甲醇制成每1ml含0.3mg的溶液，作為參照物溶液；
(3)色譜條件色譜柱采用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料流動相為乙腈-水，梯度洗脫，溶劑比例為從0分鐘至14分鐘，乙腈的比例為15％，從14分鐘至45分鐘，乙腈的比例為從15％升至30％，從45分鐘至60分鐘，乙腈的比例為從30％升至80％，流速為1ml/min、檢測波長203±2nm，柱溫30℃；
(4)標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的制定以上述方法作為制定以黃芪皂苷類、三七皂苷類成分特征為主的指紋圖譜的測試手段；依據(jù)10批或10批以上供試品所測得的圖譜，制定標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，以確定的參照物色譜峰的保留時間為基準(zhǔn)，計算其它共有色譜峰的相對保留時間，所述標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜中，共有峰有3～20個；
(5)以(1)～(3)所述方法作為待測藥物組合物中以黃芪皂苷類、三七皂苷類成分特征為主的指紋圖譜的測試手段，制備待測樣品的指紋圖譜；
(6)將待測藥物組合物的指紋圖譜與上述標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜對比，應(yīng)符合下列要求中的部分或全部
I.計算待測藥物組合物的指紋圖譜與標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的相似度，應(yīng)為0.90～1.00；
II.待測藥物組合物指紋圖譜中，非共有峰面積不得超過總峰面積的5％；
III.除參照物色譜峰之外的其他共有色譜峰與參照物色譜峰的相對保留時間與標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜相比，相對偏差不得超過±10％。
4、按照權(quán)利要求1所述的以燈盞花素、三七、黃芪制成的藥物組合物的質(zhì)量控制方法，其特征在于所述藥物組合物的鑒別方法包括以下中的一種或幾種
a、藥物組合物中野黃芩苷的薄層色譜鑒別方法
取待測藥物組合物適量，加醋酸乙酯或乙醇或甲醇或正丁醇提取，濾過或離心，取濾液或上清液作為供試品溶液；另取野黃芩苷對照品，加甲醇或乙醇制成每1ml含1mg的溶液，作為對照品溶液；采用中國藥典附錄公開的薄層色譜法試驗，吸取上述溶液各1～30μl，分別點于同一硅膠G薄層板或硅膠H薄層板或硅膠GF254薄層板或聚酰胺薄膜上，以醋酸乙酯或甲酸乙酯-甲酸或乙酸-水或甲醇0.2～60∶0.2～10∶0.3～20或苯或甲苯-醋酸乙酯或甲酸乙酯-甲酸或乙酸-水1～30∶0.5～15∶0.05～5∶0.01～3為展開劑，展開，取出，晾干，噴以0.3％～10％三氯化鋁乙醇或0.3～10％三氯化鋁甲醇溶液或0.3～10％三氯化鐵乙醇溶液，置日光下或紫外光燈365nm或254nm下檢視或105℃烘1～15分鐘后置日光下或紫外光燈365nm或254nm下檢視，供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，應(yīng)顯相同顏色斑點；
b、藥物組合物中野黃芩苷的液相色譜鑒別方法
取待測藥物組合物適量，加甲醇或乙醇或流動相或水溶解或稀釋至合適濃度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液；以野黃芩苷對照品的甲醇或乙醇溶液為對照，采用液相色譜法，色譜柱用十八烷基硅烷鍵合硅膠或八烷基硅烷鍵合硅膠或二烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以甲醇或乙腈-水或0.05％～10％冰醋酸水溶液或0.05％～10％甲酸水溶液或0.01％～5％磷酸水溶液5％～95％∶95％～5％或甲醇或乙腈-四氫呋喃-0.01％～5％磷酸水溶液2％～30％∶2％～30％∶96％～40％或乙腈-0.005 moL/L～0.3moL/L磷酸二氫鈉(1～99％磷酸調(diào)pH＝2.0～5.0)梯度洗脫系統(tǒng)為流動相，檢測波長為200～410nm；供試品色譜中，應(yīng)具與對照品色譜有保留時間一致的色譜峰；
c、藥物組合物中三七、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、三七皂苷R1中一種或幾種的薄層色譜鑒別方法
取待測藥物組合物適量，用正丁醇或乙醇或甲醇或醋酸乙酯或三氯甲烷提取，濾過，濾液作為供試品溶液；另取三七對照藥材、人參皂苷Rg1對照品、人參皂苷Rb1對照品、三七皂苷R1對照品中的一種或幾種，制備對照溶液；三七對照藥材溶液的制備取三七對照藥材適量，加三氯甲烷或二氯甲烷或乙醚回流提取，棄去三氯甲烷或二氯甲烷或乙醚液，殘渣加水飽和正丁醇或醋酸乙酯提取，提取液加氨試液，分取上層，蒸干，殘渣用甲醇或乙醇溶解，作為對照藥材溶液；對照品溶液的制備取人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、三七皂苷R1中的一種或幾種對照品，分別加甲醇或乙醇制成每1ml含2mg的溶液，作為對照品溶液；采用中國藥典附錄公開的薄層色譜法試驗，吸取上述溶液各1～30μl，分別點于同一硅膠G薄層板或硅膠H薄層板或硅膠GF254薄層板上，以三氯甲烷-醋酸乙酯或甲酸乙酯-甲醇-水5～40∶10～100∶5～50∶0.2～30 10℃以下放置的下層溶液或正丁醇-醋酸乙酯或甲酸乙酯-水1～10∶0.2～2∶1～15的上層為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5～50％硫酸乙醇試劑或50％硫酸試劑，80℃～160℃烘至斑點顯色清晰，分別置日光及紫外光燈365nm下檢視，供試品色譜中，在與對照藥材色譜及對照品色譜相應(yīng)的位置上，應(yīng)顯相同顏色的斑點；
d、藥物組合物中人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、三七皂苷R1中一種或幾種的液相色譜鑒別
取待測藥物組合物適量，置量瓶中，加水或甲醇或流動相或乙醇至刻度，搖勻，用微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液；以人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、三七皂苷R1中的一種或幾種對照品的甲醇或乙醇溶液為對照，采用液相色譜法，色譜柱用十八烷基硅烷鍵合硅膠或八烷基硅烷鍵合硅膠或二烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，甲醇或乙腈-水或0.5％～5％冰醋酸水溶液或0.02％～5％磷酸水溶液或0.5％～5％甲酸溶液5％～40％∶95％～60％為流動相，梯度洗脫，流速為0.5～2.0ml/min，檢測波長為190～410nm范圍內(nèi)的一個或幾個或蒸發(fā)光檢測器檢測，柱溫在20～60℃范圍內(nèi)；供試品色譜中，應(yīng)具與對照品色譜有保留時間一致的色譜峰；
e、藥物組合物中黃芪的薄層色譜鑒別方法
取待測藥物組合物適量，加醋酸乙酯或乙醇或甲醇或正丁醇提取，濾過，濾液蒸干，殘渣加0.05％～5％氫氧化鈉溶液溶解，濾過，濾液用鹽酸條件pH值至3～6，用醋酸乙酯或正丁醇提取，濾過，濾液蒸干，殘渣加醋酸乙酯或甲醇或乙醇溶解，作為供試品溶液；另取黃芪對照藥材、同法制成對照藥材溶液；采用中國藥典附錄公開的薄層色譜法試驗，吸取上述溶液各1～30μl，分別點于同一硅膠G薄層板或硅膠H薄層板或硅膠GF254薄層板或聚酰胺薄膜上，以三氯甲烷或二氯甲烷-甲醇或乙醇1～30∶0.2～10為展開劑，展開，取出，晾干，置氨蒸汽中熏后置日光下或紫外光燈365nm或254nm下檢視，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，應(yīng)顯相同顏色斑點；
f、藥物組合物中黃芪甲苷的薄層色譜鑒別方法
取待測藥物組合物適量，加甲醇或乙醇溶解后加于中性氧化鋁柱，用10％～70％甲醇洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣加水溶解后加水飽和正丁醇提取，合并正丁醇液，用水洗滌，棄去水液，正丁醇液蒸干，殘渣用甲醇溶解，作為供試品溶液；另取黃芪甲苷對照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作為對照品溶液；采用中國藥典附錄公開的薄層色譜法試驗，吸取上述溶液各1～30μl，分別點于同一硅膠G薄層板或硅膠H薄層板或硅膠GF254薄層板或聚酰胺薄膜上，以三氯甲烷或二氯甲烷-甲醇或乙醇-水1～30∶1～20∶0.2～10的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以2％～50％硫酸乙醇溶液，80～160℃加熱至斑點顯色清晰，置日光下或紫外光燈365nm或254nm下檢視，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，應(yīng)顯相同顏色斑點；
g、藥物組合物中黃芪甲苷的液相色譜鑒別方法
取待測藥物組合物適量，加水溶解后用正丁醇或醋酸乙酯提取，合并提取液，用氨試液洗滌，棄去氨液，正丁醇液蒸干，殘渣加水溶解后通過D101大孔吸附樹脂柱，依次用水、40％乙醇或70％乙醇洗脫，收集70％乙醇洗脫部分，蒸干，殘渣用甲醇溶解或稀釋至合適濃度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液；以黃芪甲苷對照品的甲醇或乙醇溶液為對照，采用液相色譜法，色譜柱用十八烷基硅烷鍵合硅膠或八烷基硅烷鍵合硅膠或二烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，15％～85％∶85％～15％甲醇或乙腈-水或0.05％～10％冰醋酸水溶液或0.05％～10％甲酸水溶液或0.01％～5％磷酸水溶液為流動相，檢測波長為190～410nm或蒸發(fā)光散射檢測器檢測，柱溫在20～60℃范圍內(nèi)；供試品色譜中，應(yīng)具與對照品色譜有保留時間一致的色譜峰；
h、藥物組合物中芒柄花素、毛蕊芒柄花素的一種或兩種的薄層色譜鑒別方法
取待測藥物組合物適量，加甲醇或乙醇提取，提取液作為供試品溶液；另取芒柄花素、毛蕊芒柄花素對照品中的一種或兩種，加甲醇制成每1ml各含1mg的溶液，作為對照品溶液；采用中國藥典附錄公開的薄層色譜法試驗，吸取上述溶液各1～30μl，分別點于同一硅膠G薄層板或硅膠H薄層板或硅膠GF254薄層板上，以三氯甲烷或二氯甲烷-甲醇或乙醇-醋酸乙酯或甲酸乙酯-水0.5～10∶1～15∶1～20∶0.1～3為展開劑，展開，取出，晾干，置日光下或紫外光燈365nm或254nm下檢視，供試品色譜中，在與對照品色譜與對照藥材相應(yīng)的位置上，應(yīng)顯相同顏色斑點；
i、藥物組合物中芒柄花素、毛蕊芒柄花素的一種或兩種的液相色譜鑒別方法
取待測藥物組合物適量，加甲醇或乙醇提取，提取液作為供試品溶液；以芒柄花素、毛蕊芒柄花素對照品的甲醇或乙醇溶液為對照，采用液相色譜法，色譜柱用十八烷基硅烷鍵合硅膠或八烷基硅烷鍵合硅膠或二烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，流動相A為甲醇或乙腈，流動相B為水或0.05％～10％冰醋酸水溶液或0.05％～10％甲酸水溶液或0.01％～5％磷酸水溶液為流動相，梯度洗脫，檢測波長為190～410nm，柱溫在20～60℃范圍內(nèi)；供試品色譜中，應(yīng)具與對照品色譜有保留時間一致的色譜峰。
5、按照權(quán)利要求4所述的以燈盞花素、三七、黃芪制成的藥物組合物的質(zhì)量控制方法，其特征在于所述藥物組合物的鑒別方法包括以下中的一種或幾種
a、藥物組合物中野黃芩苷的薄層色譜鑒別方法
取待測藥物組合物適量，加甲醇提取，離心，取上清液作為供試品溶液；另取野黃芩苷對照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作為對照品溶液；采用中國藥典附錄公開的薄層色譜法試驗，吸取上述溶液各3μl，分別以條狀帶點于同一聚酰胺膜上，以甲醇-醋酸乙酯-甲酸7∶2∶1為展開劑，展開，取出，晾干，噴以2％三氯化鐵乙醇溶液，供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的條斑；
b、藥物組合物中野黃芩苷的液相色譜鑒別方法
取待測藥物組合物適量，加甲醇溶解或稀釋至合適濃度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液；以野黃芩苷對照品的甲醇或乙醇溶液為對照，采用液相色譜法，色譜柱用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，甲醇-0.1％磷酸水溶液50％∶50％為流動相，檢測波長為335nm；供試品色譜中，具與對照品色譜有保留時間一致的色譜峰；
c、藥物組合物中三七、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、三七皂苷R1中一種或幾種的薄層色譜鑒別方法
取待測藥物組合物適量，用正丁醇提取，濾過，濾液作為供試品溶液；另取三七對照藥材、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、三七皂苷R1中的一種或幾種，制備對照溶液；三七對照藥材溶液的制備取三七對照藥材適量，加三氯甲烷回流提取，棄去三氯甲烷液，殘渣加水飽和正丁醇提取，提取液加氨試液，分取上層，蒸干，殘渣用甲醇溶解，作為對照藥材溶液；對照品溶液的制備取人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、三七皂苷R1中的一種或幾種對照品，分別加甲醇制成每1ml含2mg的溶液，作為對照品溶液；采用中國藥典附錄公開的薄層色譜法試驗，吸取上述溶液各5μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-醋酸乙酯-甲醇-水15∶40∶22∶10在10℃以下放置的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10％硫酸乙醇試劑，105℃烘至斑點顯色清晰，分別置日光及紫外光燈365nm下檢視，供試品色譜中，在與對照藥材色譜及對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點；
d、藥物組合物中人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、三七皂苷R1中一種或幾種的液相色譜鑒別
取待測藥物組合物適量，置量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，用微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液；以人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、三七皂苷R1中的一種或幾種對照品的甲醇溶液為對照，采用液相色譜法，色譜柱用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，乙腈-水為流動相，梯度洗脫，溶劑比例為從0分鐘至15分鐘，乙腈的比例為20％，從15分鐘至21分鐘，乙腈的比例由20％上升至40％，從21分鐘至25分鐘，乙腈的比例為20％；流速為1.0ml/min，檢測波長203nm，柱溫在30℃；供試品色譜中，具與對照品色譜有保留時間一致的色譜峰；
e、藥物組合物中黃芪的薄層色譜鑒別方法
取待測藥物組合物適量，加乙醇提取，濾過，濾液蒸干，殘渣加0.3％氫氧化鈉溶液溶解，濾過，濾液用鹽酸條件pH值至5～6，用醋酸乙酯提取，濾過，濾液蒸干，殘渣加醋酸乙酯溶解，作為供試品溶液；另取黃芪對照藥材、同法制成對照藥材溶液；采用中國藥典附錄公開的薄層色譜法試驗，吸取上述溶液各10μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇10∶1為展開劑，展開，取出，晾干，置氨蒸汽中熏后置紫外光燈365nm下檢視，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色斑點；
f、藥物組合物中黃芪甲苷的薄層色譜鑒別方法
取待測藥物組合物適量，加甲醇溶解后加于中性氧化鋁柱，用40％甲醇洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣加水溶解后加水飽和正丁醇提取，合并正丁醇液，用水洗滌，棄去水液，正丁醇液蒸干，殘渣用甲醇溶解，作為供試品溶液；另取黃芪甲苷對照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作為對照品溶液；采用中國藥典附錄公開的薄層色譜法試驗，吸取上述溶液各2μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水13∶7∶2的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10％硫酸乙醇溶液，105℃加熱至斑點顯色清晰，置日光下及紫外光燈365nm下檢視，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，應(yīng)顯相同顏色斑點；
g、藥物組合物中黃芪甲苷的液相色譜鑒別方法
取待測藥物組合物適量，加水溶解后用水飽和正丁醇提取，合并提取液，用氨試液洗滌，棄去氨液，正丁醇液蒸干，殘渣加水溶解后通過D101大孔吸附樹脂柱，依次用水、40％乙醇或70％乙醇洗脫，收集70％乙醇洗脫部分，蒸干，殘渣用甲醇溶解或稀釋至合適濃度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液；以黃芪甲苷對照品的甲醇或乙醇溶液為對照，采用液相色譜法，色譜柱用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，32％∶68％乙腈-水為流動相，蒸發(fā)光散射檢測器檢測，柱溫30℃；供試品色譜中，具與對照品色譜有保留時間一致的色譜峰；
h、藥物組合物中芒柄花素、毛蕊芒柄花素的一種或兩種的薄層色譜鑒別方法
取待測藥物組合物適量，加甲醇提取，提取液作為供試品溶液；另取芒柄花素、毛蕊芒柄花素中的一種或兩種，加甲醇制成每1ml各含1mg的溶液，作為對照品溶液；采用中國藥典附錄公開的薄層色譜法試驗，吸取上述溶液各5μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-醋酸乙酯-水2.5∶3∶4∶0.5為展開劑，展開，展距5cm，取出，晾干，置紫外光燈365nm下檢視，供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色斑點；
i、藥物組合物中芒柄花素、毛蕊芒柄花素的一種或兩種的液相色譜鑒別方法
取待測藥物組合物適量，加甲醇提取，提取液作為供試品溶液；以芒柄花素、毛蕊芒柄花素對照品的甲醇溶液為對照，采用液相色譜法，色譜柱用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，流動相A為甲醇，流動相B為水，梯度洗脫，溶劑比例為從0分鐘至10分鐘，水的比例為從40％升至50％，從10分鐘至20分鐘，水的比例為從50％升至60％，從30分鐘至50分鐘，水的比例為60％，檢測波長為250nm，柱溫30℃；供試品色譜中，具與對照品色譜有保留時間一致的色譜峰。
6、按照權(quán)利要求1所述的以燈盞花素、三七、黃芪制成的藥物組合物的質(zhì)量控制方法，其特征在于所述藥物組合物含量的測試方法應(yīng)包括以下中的一種或幾種
a、藥物組合物中野黃芩苷的含量測定
取待測藥物組合物適量，加甲醇或乙醇或流動相或水溶解或稀釋至合適濃度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液；以野黃芩苷對照品的甲醇或乙醇溶液為對照，采用液相色譜法，色譜柱用十八烷基硅烷鍵合硅膠或八烷基硅烷鍵合硅膠或二烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以甲醇或乙腈-水或0.05％～10％冰醋酸水溶液或0.05％～10％甲酸水溶液或0.01％～5％磷酸水溶液5％～95％∶95％～5％或甲醇或乙腈-四氫呋喃-0.01％～5％磷酸水溶液2％～30％∶2％～30％∶96％～40％或乙腈-0.005moL/L～0.3moL/L磷酸二氫鈉(1～99％磷酸調(diào)pH＝2.0～5.0)梯度洗脫系統(tǒng)為流動相，檢測波長為200～410nm；以外標(biāo)一點法或標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行計算，各制劑以相當(dāng)于每日用成品量為單位量，每單位量含野黃芩苷的限度不得少于2mg；
b、藥物組合物中人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、三七皂苷R1中一種或幾種的含量測定
取待測藥物組合物適量，置量瓶中，加水或甲醇或流動相或乙醇至刻度，搖勻，用微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液；以人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、三七皂苷R1中的一種或幾種對照品的甲醇或乙醇溶液為對照，采用液相色譜法，色譜柱用十八烷基硅烷鍵合硅膠或八烷基硅烷鍵合硅膠或二烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，甲醇或乙腈-水或0.5％～5％冰醋酸水溶液或0.02％～5％磷酸水溶液或0.5％～5％甲酸溶液為流動相，梯度洗脫，流速為0.5～2.0ml/min，檢測波長為190～410nm范圍內(nèi)的一個或幾個或蒸發(fā)光檢測器檢測，柱溫在20～60℃范圍內(nèi)；以外標(biāo)法或標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行計算，待測藥物組合物以相當(dāng)于每日用成品量為單位量，含量限度應(yīng)為以下一項或幾項
每單位量含人參皂苷Rg1的限度不得少于2.5mg；
每單位量含人參皂苷Rb1的限度不得少于3.5mg；
每單位量含三七皂苷R1的限度不得少于0.25mg；
每單位量含人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、三七皂苷R1的總和的限度不得少于6mg；
c、藥物組合物中總皂苷的含量測定
取待測藥物組合物適量，置量瓶中，加蒸餾水適量使溶解并定至刻度，搖勻，精密量取適量，置量瓶中，水浴蒸干，立即取出，精密加1％～50％香草醛-冰醋酸溶液0.1～10ml，高氯酸0.1～15ml，搖勻，30～80℃水浴上加熱3～50分鐘，取出，立即以冰水浴或流水冷卻，精密加冰醋酸至刻度，搖勻，作為供試品溶液，以黃芪甲苷或人參皂苷Rg1或人參皂苷Rb1或三七皂苷R1為對照品，同法制得對照品溶液。以隨行溶劑為空白，采用中國藥典附錄公開的分光光度法，在547±10nm的波長處測定吸收度，以外標(biāo)一點法或標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行計算，待測藥物組合物以相當(dāng)于每日用成品量為單位量，每單位量含總皂苷以黃芪甲苷或人參皂苷Rg1或人參皂苷Rb1或三七皂苷R1計，不得少于10mg；
d、藥物組合物中黃芪甲苷的含量測定
取待測藥物組合物適量，加水溶解后用正丁醇或醋酸乙酯提取，合并提取液，用氨試液洗滌，棄去氨液，正丁醇液蒸干，殘渣加水溶解后通過D101大孔吸附樹脂柱，依次用水、40％乙醇、70％乙醇洗脫，收集70％乙醇洗脫部分，蒸干，殘渣用甲醇溶解或稀釋至合適濃度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液；以黃芪甲苷對照品的甲醇或乙醇溶液為對照，采用液相色譜法，色譜柱用十八烷基硅烷鍵合硅膠或八烷基硅烷鍵合硅膠或二烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，15％～85％∶85％～15％甲醇或乙腈-水或0.05％～10％冰醋酸水溶液或0.05％～10％甲酸水溶液或0.01％～5％磷酸水溶液為流動相，檢測波長為190～410nm或蒸發(fā)光散射檢測器檢測，柱溫在20～60℃范圍內(nèi)；以外標(biāo)一點法或標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行計算，各制劑以相當(dāng)于每日用成品量為單位量，每單位量含黃芪甲苷的限度不得少于0.02mg；
e、藥物組合物中總多糖的含量測定
取待測藥物組合物適量，加60％～無水乙醇適量，超聲處理使溶散，離心，取沉淀，加蒸餾水適量使溶解并稀釋至合適濃度，搖勻，精密量取適量，至具塞試管中，加蒸餾水適量，精密加1％～10％苯酚溶液適量，混勻，迅速加入硫酸適量，搖勻，30℃～60℃水浴5～60分鐘，取出，立即以冰水浴冷卻1～30分鐘，取出，以隨行溶劑為空白，采用中國藥典附錄公開的分光光度法，在488nm±10的波長處測定吸收度，以外標(biāo)一點法或標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行計算，待測藥物組合物以相當(dāng)于每日用成品量為單位量，每單位量含總多糖以無水葡萄糖計，不得少于1.6mg；
f、藥物組合物中芒柄花素、毛蕊芒柄花素的一種或兩種的含量測定
取待測藥物組合物適量，加甲醇或乙醇提取，提取液作為供試品溶液；以芒柄花素、毛蕊芒柄花素對照品的甲醇或乙醇溶液為對照，采用液相色譜法，色譜柱用十八烷基硅烷鍵合硅膠或八烷基硅烷鍵合硅膠或二烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，流動相A為甲醇或乙腈，流動相B為水或0.05％～10％冰醋酸水溶液或0.05％～10％甲酸水溶液或0.01％～5％磷酸水溶液為流動相，梯度洗脫，檢測波長為190～410nm，柱溫在20～60℃范圍內(nèi)；以外標(biāo)一點法或標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行計算，待測藥物組合物以相當(dāng)于每日用成品量為單位量，含量限度應(yīng)為以下一項或兩項
(1)每單位量含芒柄花素的限度不得少于0.01mg；
(2)每單位量含人毛蕊芒柄花素的限度不得少于0.01mg。
7、按照權(quán)利要求6所述的以燈盞花素、三七、黃芪制成的藥物組合物的質(zhì)量控制方法，其特征在于所述藥物組合物含量的測試方法是以下一種或幾種方法
a、藥物組合物中野黃芩苷的含量測定
取待測藥物組合物適量，加甲醇溶解或稀釋至合適濃度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液；以野黃芩苷對照品的甲醇或乙醇溶液為對照，采用液相色譜法，色譜柱用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，甲醇-0.1％磷酸水溶液50％∶50％為流動相，檢測波長為335nm；以外標(biāo)一點進(jìn)行計算，各制劑以相當(dāng)于每日用成品量為單位量，每單位量含野黃芩苷的限度不得少于4mg；
b、藥物組合物中人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、三七皂苷R1中一種或幾種的含量測定
取待測藥物組合物適量，置量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，用微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液；以人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、三七皂苷R1中的一種或幾種對照品的甲醇溶液為對照，采用液相色譜法，色譜柱用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，乙腈-水為流動相，梯度洗脫，溶劑比例為從0分鐘至15分鐘，乙腈的比例為20％，從15分鐘至21分鐘，乙腈的比例由20％上升至40％，從21分鐘至25分鐘，乙腈的比例為20％；流速為1.0ml/min，檢測波長203nm，柱溫為30℃；以外標(biāo)法或標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行計算，待測藥物組合物以相當(dāng)于每日用成品量為單位量，含量限度應(yīng)為以下一項或幾項
(1)每單位量含人參皂苷Rg1的限度不得少于5mg；
(2)每單位量含人參皂苷Rb1的限度不得少于7mg；
(3)每單位量含三七皂苷R1的限度不得少于0.5mg；
(4)每單位量含人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、三七皂苷R1的總和的限度不得少于12mg；
c、藥物組合物中總皂苷的含量測定
取待測藥物適量，置10ml量瓶中，加蒸餾水適量使溶解并定至刻度，搖勻，精密量取0.6，置25ml量瓶中，水浴蒸干，立即取出，精密加5％香草醛-冰醋酸溶液0.5ml，高氯酸2.0ml，搖勻，60℃水浴上加熱15分鐘，取出，立即以冰水浴或流水冷卻，精密加冰醋酸至刻度，搖勻，作為供試品溶液，以人參皂苷Rg1為對照品，同法制得對照品溶液。以隨行溶劑為空白，采用中國藥典附錄公開的分光光度法，在547nm的波長處測定吸收度，以外標(biāo)一點法進(jìn)行計算，待測藥物組合物以相當(dāng)于每日用成品量為單位量，每單位量含總皂苷以人參皂苷Rg1計，不得少于20mg；
d、藥物組合物中黃芪甲苷的含量測定
取待測藥物組合物適量，加水溶解后用水飽和正丁醇提取，合并提取液，用氨試液洗滌，棄去氨液，正丁醇液蒸干，殘渣加水溶解后通過D101大孔吸附樹脂柱，依次用水、40％乙醇、70％乙醇洗脫，收集70％乙醇洗脫部分，蒸干，殘渣用甲醇溶解或稀釋至合適濃度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液；以黃芪甲苷對照品的甲醇或乙醇溶液為對照，采用液相色譜法，色譜柱用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，32％∶68％乙腈-水為流動相，蒸發(fā)光散射檢測器檢測，柱溫30℃；以外標(biāo)一點法進(jìn)行計算，各制劑以相當(dāng)于每日用成品量為單位量，每單位量含黃芪甲苷的限度不得少于0.04mg；
e、藥物組合物中總多糖的含量測定
取待測藥物組合物適量，加80％乙醇20ml，超聲處理使溶散，離心，取沉淀，加蒸餾水適量使溶解并稀釋至合適濃度，搖勻，精密量取適量，至10ml具塞試管中，加蒸餾水至2ml，精密加4％苯酚溶液1ml，混勻，迅速加入硫酸7ml，搖勻，40℃水浴30分鐘，取出，立即以冰水浴冷卻5分鐘，取出，以隨行溶劑為空白，采用中國藥典附錄公開的分光光度法，在488nm的波長處測定吸收度，以外標(biāo)一點法進(jìn)行計算，待測藥物組合物以相當(dāng)于每日用成品量為單位量，每單位量含總多糖以無水葡萄糖計，不得少于3.2mg；
f、藥物組合物中芒柄花素、毛蕊芒柄花素的一種或兩種的含量測定
取待測藥物組合物適量，加甲醇提取，提取液作為供試品溶液；以芒柄花素、毛蕊芒柄花素對照品的甲醇溶液為對照，采用液相色譜法，色譜柱用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，流動相A為甲醇，流動相B為水，梯度洗脫，溶劑比例為從0分鐘至10分鐘，水的比例為從40％升至50％，從10分鐘至30分鐘，水的比例為從50％升至60％，從30分鐘至50分鐘，水的比例為60％，檢測波長為250nm，柱溫30℃；以外標(biāo)一點法進(jìn)行計算，待測藥物組合物以相當(dāng)于每日用成品量為單位量，含量限度應(yīng)為以下一項或兩項
(1)每單位量含芒柄花素的限度不得少于0.02mg；
(2)每單位量含人毛蕊芒柄花素的限度不得少于0.02mg。
8、按照權(quán)利要求6或7所述的以燈盞花素、三七、黃芪制成的藥物組合物的質(zhì)量控制方法，其特征在于所述藥物組合物制成的注射制劑的含量測定結(jié)果，按照重量百分比計算，野黃芩苷、黃芪甲苷、芒柄花素、毛蕊異黃酮、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、三七皂苷R1、總皂苷、總多糖中的全部或部分物質(zhì)的總含量占制劑中扣除輔料和水分外的總固體量的25％以上。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種由燈盞花素與三七、黃芪或二者的提取物、有效部位制成的含有多糖類成分的藥物組合物的質(zhì)量控制方法，該質(zhì)量控制方法包括以黃芪黃酮類成分特征為主和以黃芪皂苷類、三七皂苷類成分特征為主的指紋圖譜測試方法和/或燈盞花素、黃芪、三七的鑒別測試方法和/或含量測試方法。本發(fā)明為該組方制劑的質(zhì)量控制提供了一種可靠、穩(wěn)定、全新的方法，使該制劑的工藝控制更加嚴(yán)格合理，質(zhì)量更加穩(wěn)定，同時為大生產(chǎn)提供了可靠穩(wěn)定的檢測方法，為確?；颊哂盟幍挠行浴踩蕴峁┝藬?shù)字化的說明。
文檔編號A61P7/00GK1951427SQ20051010939
公開日2007年4月25日 申請日期2005年10月19日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月19日
發(fā)明者于文風(fēng) 申請人:北京奇源益德藥物研究所