專利名稱：毛萼乙素在制藥中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及毛萼乙素的用途，尤其涉及在制藥領(lǐng)域中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
急性髓系白血病(AML)是一組起源于髓系祖細胞的異常增殖，分化和存活的造血系統(tǒng)惡性疾病。特異的染色體易位經(jīng)常出現(xiàn)在AML中，并且在白血病的發(fā)生中扮演了重要的角色。在AML中，t(8；21)(q22；q22)代表了最常見的染色體易位，該易位生成了AML1-ETO融合蛋白。AML1-ETO阻斷髓系細胞分化和凋亡，參與白血病生成。臨床上，40％-50％的t(8；21)AML患者接受化療后仍然復(fù)發(fā)，并且產(chǎn)生耐藥性。而且，高劑量化療藥物不適合于老年患者。因此，發(fā)展一種能夠直接針對該類白血病遺傳學(xué)改變的可替代藥物，是非常需要的。
在過去三十年里，天然產(chǎn)物在癌癥治療中已經(jīng)顯示出很有希望的結(jié)果。天然產(chǎn)物可以提供許多先導(dǎo)化合物，它們可以用作設(shè)計具有更強生物活性新藥的模板。紫杉醇是一種來源于太平洋紫杉Taxus brevifolia樹皮的一種天然產(chǎn)物。紫杉醇對耐藥的乳腺癌和卵巢癌有效，并且上百種紫杉醇的類似物已經(jīng)被合成出來應(yīng)用于臨床。在造血系統(tǒng)疾病中，無機砷化合物，例如最初來源于雄黃的三氧化二砷，在治療急性早幼粒細胞白血病中非常有效。冬凌草甲素是一種從中藥植物Isodon rubescens中提取出的一種二萜化合物，它有很強的抗腫瘤活性。毛萼乙素簡稱EriB(見圖1A)是冬凌草甲素的類似物，它是一種從分布于我國西南部的常綠植物Isodon eriocalyx var.laxiflora(疏花毛萼香茶菜)中純化出的對映貝殼杉烷類化合物。Isodon eriocalyx var.laxiflora在民間用于抗炎和抗細菌的藥物。在中國申請?zhí)朇N02134163.X，公開了一種預(yù)防或治療癌癥的藥物，其中含有預(yù)防或治療癌癥有效量的式I化合物毛萼乙素及可藥用載體和/或賦形劑，同時提供了式I化合物在制備預(yù)防或治療癌癥藥物中的應(yīng)用。但該藥物不能治療急性白血病以及伯基特淋巴瘤等疾病。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于(1)提供毛萼乙素在制備治療急性白血病藥物中的應(yīng)用；(2)提供毛萼乙素在制備治療伯基特淋巴瘤藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方法來實現(xiàn)的(一)試劑毛萼乙素(購自中科院昆明植物所)溶解于DMSO中，儲存液濃度為100mM，-20℃保存。MTT，碘化丙啶，DCFH-DA，腫瘤壞死因子-α，二硫蘇糖醇，蛋白酶抑制劑和Hochest 33258購自Sigma公司。Z-DEVD-fmk購自BD公司?？筆ARP，caspase-3，Bcl2，Bcl-XL，Bax，P65，Lamin B，羧基端IκBα，氨基端IκBα，ERK1/2，ERK1/2磷酸化形式，c-Jun，c-Jun磷酸化形式和抗ETO抗體，過氧化物酶偶聯(lián)的羊抗鼠二抗，羊抗兔二抗和鼠抗羊二抗均購自Santa Cruz公司。抗β-actin和c-Fos抗體購自Abcam公司。抗剪切的caspase-3，IκBα和化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒購自CellSignaling公司。驢抗鼠熒光標(biāo)記二抗購自Molecular Probes公司。
(二)細胞培養(yǎng)，細胞存活和細胞形態(tài)學(xué)本研究應(yīng)用了以下幾種人的細胞株帶有t(8；21)染色體易位的AML白血病Kasumi-1細胞株，該白血病又稱為含有AML1-ETO融合基因的急性髓系白血??；急性早幼粒細胞白血病NB4，NB4/R1和NB4/R2細胞株；急性髓系白血病U937細胞株；Burkitt’s淋巴瘤Raji和Daudi細胞株，該病又稱為伯基特淋巴瘤；T細胞急性淋巴母細胞白血病Jurkat細胞株。本研究收集了來自五位帶有t(8；21)AML患者的原代白血病細胞。對患者的診斷建立于形態(tài)學(xué)檢測，細胞遺傳學(xué)檢測到t(8；21)染色體易位以及RT-PCR檢測到AML1-ETO融合蛋白的基礎(chǔ)上。白血病細胞用淋巴細胞分離液分離得到，在5％CO2-95％空氣，飽和濕度以及37℃的條件下，培養(yǎng)于RPMI-1640培養(yǎng)液中(Gibco/BRL)，并加入10％FBS(PAA)。在每次實驗中，細胞接種密度為2×105/ml。細胞的存活率采用臺盼蘭染色排斥實驗檢測。細胞形態(tài)學(xué)觀察采用瑞氏染色法。
(三)MTT實驗在96孔板中，用0.1，0.25，0.5，1，2，4，6，8和10μM的毛萼乙素處理細胞。72小時后，向每孔中加入0.1mg MTT，在37℃下孵育4小時后，在分光光度計570nm處測量標(biāo)本吸光度值。
(四)流式細胞儀檢測annexin-V，細胞周期，線粒體跨膜電位和過氧化物(ROS)生成
細胞凋亡用ApoAlert Annexin V-FITC Apoptosis kit(BD)進行分析。在分析細胞周期過程中，細胞在-20℃下用甲醇固定過夜，接著用含有1％RNase的Tris-HCl緩沖液(pH 7.4)處理，50μg/ml PI染色。在檢測線粒體跨膜電位中，細胞用PBS洗后，在37℃下與10mg/ml Rh123孵育30分鐘，然后再用50μg/ml PI染色。DCFH-DA用于檢測ROS水平，細胞用PBS洗后，在37℃下與20mM DCFH-DA孵育30分鐘。熒光強度用流式細胞儀進行測量。
(五)掃描電鏡細胞在4℃用2％glutaraldehyde固定過夜，再3000×g離心15分鐘，用0.1Mcacodylate緩沖液洗后，用1％osmium tetroxide在4℃固定1小時，脫水后用Epon 812包埋。用超薄切片機制備樣品，染色后，在電鏡下進行觀察。
(六)免疫熒光細胞在-20℃用甲醇固定5分鐘，PBS洗后，用0.5％Triton-X透化，1％BSA封閉，與抗P65抗體在室溫孵育1小時，PBS洗后，再與熒光標(biāo)記二抗在室溫孵育30分鐘。細胞再與Hochest 33258孵育5分鐘后，在熒光顯微鏡下進行觀察。
(七)免疫印跡分析用200μl Laemmli裂解緩沖液(0.5MTris-HCl，pH 6.8，2mM EDTA，10％glycerol，2％SDS and 5％β-mercaptoethanol)裂解5×106細胞。蛋白裂解物(20μg)用于10％聚丙烯酰胺凝膠電泳，再轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。硝酸纖維素膜在溶于TBS/0.05％Tween 20的5％脫脂牛奶中封閉，之后與一抗在室溫孵育2小時，與辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育1小時。免疫復(fù)合物用辣根過氧化物酶化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒檢測。條帶的信號強度用Quantity One version 4.1.1 software軟件分析。
(八)核蛋白與漿蛋白分離1×107細胞與400μl含有0.2％Nonidet P-40和蛋白酶抑制劑的蛋白酶裂解緩沖液(10mM HEPES，10mM KCl，1.5mM MgCl2，0.5mM DTT，pH7.9)在冰上孵育1分鐘。2500×g離心1分鐘后，收集上清即為漿蛋白。沉淀用不含NP-40的裂解緩沖液洗后，重懸于提取緩沖液(20mM HEPES，pH7.9，420mM NaCl，0.5mM DTT，0.2mM EDTA and 25％甘油)中，冰上孵育20分鐘。12000×g離心10分鐘后，上清即為核蛋白。
(九)半定量RT-PCR總的RNA用Trizol(Invitrogen)提取，用隨機引物和Superscript II(Invitrogen)逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。本研究中所用到的引物為GAPDH，5’-TCACCAGGGCTGCTTTTA-3’和5’-AAGGTCATCCCTGAGCTGAA-3’；Bcl-2，5’-GCAGGCATGTTGACTTCACTT-3’和5’-GGAGGATTGTGGCCTTCTTTG-3’；Bcl-XL5’-CATGGCAGCAGTAAAGCAAGC-3’和5’-TGCGATCCGACTCACCAATAC-3’；Bax，5’-TTCTGACGGCAACTTCAACTGGG-和5’TTCTTCCAGATGGTGAGCGAGG.-3’。循環(huán)參數(shù)94℃5分鐘；94℃1分鐘，58℃1分鐘，72℃1分鐘，共28個循環(huán)；72℃5分鐘。
(十)熒光素酶報告實驗將Kasumi-1細胞重懸于培養(yǎng)液中，再加入報告基因質(zhì)粒〔10μg，NF-κB介導(dǎo)的熒光素酶報告質(zhì)粒或者pAP1-luc(Clontech)〕以及2μg用于校正細胞轉(zhuǎn)染效率的CMV介導(dǎo)的β-半乳糖苷酶表達質(zhì)粒。細胞轉(zhuǎn)染條件為1000V，25μF，電轉(zhuǎn)儀為Biorad公司。轉(zhuǎn)染后36小時，用毛萼乙素和/或TNFα處理細胞，再將細胞裂解。熒光素酶活性用lumat LB 9507tube luminometer(EG&G Berthold)測量。細胞裂解液與2×β-半乳糖苷酶反應(yīng)試劑混合，在37℃孵育1小時后，加入1M Na2CO3終止反應(yīng)。β-半乳糖苷酶用分光光度計測量420nm吸光度值。
(十一)膠電泳轉(zhuǎn)移檢測實驗Kasumi-1細胞核蛋白提取物用考馬斯亮藍試劑(Pierce)定量。核蛋白(10μg)與32P標(biāo)記的雙鏈NF-κB(5’-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3’)共有序列孵育，然后用4％非變性PAGE凝膠分離，用放射自顯影檢測被標(biāo)記的條帶。
(十二)統(tǒng)計分析實驗結(jié)果用三次獨立實驗的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差表示，用t檢驗來比較差異。P值小于0.05則認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)差異。所有的統(tǒng)計采用SAS8.2軟件。
二萜類化合物對固體腫瘤細胞和造血系統(tǒng)惡性腫瘤有顯著的細胞毒效應(yīng)。在本實驗中，我們顯示一種從Isodon eriocalyx var.laxiflora中提取出的二萜化合物EriB，對白血病和淋巴瘤細胞有一種抗增殖作用，特別是對t(8；21)白血病。EriB不僅對Kasumi-1細胞株有效，而且對來自患者的新鮮白血病細胞也非常有效，這提示EriB對t(8；21)白血病是有效的。EriB能夠直接針對AML1-ETO融合蛋白，主要通過誘導(dǎo)細胞凋亡減少細胞存活率。這些都已經(jīng)被形態(tài)學(xué)特征，sub-G1期細胞和annexinV+/PI-細胞增長的結(jié)果所證明。而且，超顯微結(jié)構(gòu)研究結(jié)果，線粒體跨膜電位以及EriB誘導(dǎo)的細胞凋亡都與線粒體通路緊密相關(guān)。Bcl-2和Bcl-XL，作為Bcl-2家族主要的抗凋亡蛋白，能夠通過阻止線粒體孔的形成或者通道的開放抑制線粒體去極化，它們通過破壞線粒體來阻斷促凋亡蛋白。已有研究報道，冬凌草甲素，一種從Rabdosia rubescens中分離得到的二萜類化合物，能夠通過下調(diào)Bcl-2導(dǎo)致線粒體跨膜電位的崩潰，誘導(dǎo)NB4細胞和K562細胞凋亡。在成年人的T-細胞白血病細胞中，冬凌草甲素能夠通過下調(diào)Bcl-XL誘導(dǎo)細胞凋亡。在本研究中，EriB能夠顯著的減少Bcl-2和Bcl-XL的mRNA和蛋白水平，這進一步提示內(nèi)源性的凋亡通路參與了EriB誘導(dǎo)的細胞凋亡。
在AML細胞中NF-κB是組成型活化的，NF-κB在AML細胞中能夠調(diào)控許多對凋亡和存活很重要的基因的表達，其中包括Bcl-2和Bcl-XL。NF-κB轉(zhuǎn)錄因子能夠形成同二聚體和異二聚體，能夠結(jié)合許多因子包括TNF-α，并有DNA結(jié)合位點特異性，。IκBα降解能夠使NF-κB從無活性的細胞漿定位轉(zhuǎn)移至細胞核內(nèi)，起始靶基因的轉(zhuǎn)錄活化。最近研究顯示冬凌草甲素的作用機制與阻斷NF-κB信號通路相關(guān)。冬凌草甲素能夠通過直接干擾NF-κB與DNA的結(jié)合能力，另外還通過影響IκBα磷酸化和降解來阻斷NF-κB進核。在本研究中，我們證明有兩個不同的信號通路參與了EriB介導(dǎo)的NF-κB活性的抑制。EriB通過直接破壞NF-κB與DNA的結(jié)合能力而不是影響其核漿定位來抑制內(nèi)源性的NF-κB活性。當(dāng)TNF-α存在時，EriB通過阻斷IκBα磷酸化和降解來抑制TNF-α介導(dǎo)的NF-κB活性。因此，EriB能夠負(fù)性調(diào)控兩個NF-κB活化過程中的重要環(huán)節(jié)。由于NF-κB在白血病細胞中表達而在正常的原始細胞中，因此抑制NF-κB會誘導(dǎo)白血病特異的凋亡。
NF-κB是一個氧化還原敏感的轉(zhuǎn)錄因子，在細胞核中它與靶基因的結(jié)合需要一個還原的環(huán)境。在NF-κB與DNA的結(jié)合區(qū)域中氧化還原敏感的半胱氨酸可能會被氧化，導(dǎo)致NF-κB無法與靶基因結(jié)合。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)在Kasumi-1細胞中EriB在早期能夠誘導(dǎo)細胞內(nèi)ROS水平的上升，接著就觀察到EriB誘導(dǎo)的NF-κB活性抑制以及細胞凋亡?？寡趸瘎〥TT能夠完全抑制EriB所誘導(dǎo)的一系列改變，這一結(jié)果表明在EriB誘導(dǎo)NF-κB活性抑制過程中，氧化還原的平衡是非常重要的。另一方面，EriB被認(rèn)為能夠與蛋白的巰基相結(jié)合。EriB誘導(dǎo)的NF-κB活性抑制也可能由于EriB與NF-κB的DNA結(jié)合區(qū)域的半胱氨酸上的巰基相結(jié)合。當(dāng)半胱氨酸上這些巰基形成二硫鍵，半胱氨酸即被氧化，這就會使得NF-κB不能與其靶基因結(jié)合。DTT能夠減少二硫鍵的形成，使得半胱氨酸殘基轉(zhuǎn)變?yōu)檫€原狀態(tài)，恢復(fù)NF-κB的活性。
Caspase-3的活化對白血病細胞的凋亡是非常重要的。Caspase-3除了能夠在凋亡級聯(lián)反應(yīng)中起到作用外，它還可以切割I(lǐng)κBα氨基末端的ser32，導(dǎo)致IκBα泛素化位點的丟失，生成IκBα的非降解形式(ΔIκBα)。后者在與NF-κB二聚體相結(jié)合的過程中作為一個超級抑制物，它通過將NF-κB聚集在細胞漿中下調(diào)NF-κB的活性。EriB能夠激活caspase-3，接著PARP被切割。在本研究中，我們檢測到一個34kDa大小的IκBα剪切產(chǎn)物(ΔIκBα)，這一現(xiàn)象對應(yīng)著caspase-3活性的增高以及細胞核內(nèi)NF-κB蛋白水平的減少。Caspase-3的活化似乎也與EriB誘導(dǎo)的AML1-ETO降解相關(guān)。用Z-DEVD-fmk抑制caspase-3的活性能夠完全阻斷AML1-ETO降解，但僅能部分減少EriB誘導(dǎo)的凋亡，這提示在EriB誘導(dǎo)細胞凋亡過程中還存在著caspase-3非依賴的機制。
Raf/MEK/ERK級聯(lián)反應(yīng)的激活一般能夠促進細胞存活，特別是在惡性血液細胞中。干擾ERK1/2可能會降低EriB誘導(dǎo)凋亡的門檻。AP-1活化能夠促進細胞死亡，在哺乳動物細胞中主要的AP-1復(fù)合物成員是c-Jun和c-Fos。有研究表明，當(dāng)細胞面對DNA遭受破壞時；c-Jun能夠通過誘導(dǎo)CD95-L作為一個促凋亡調(diào)節(jié)子，而c-Fos既有促凋亡功能也有抗凋亡功能，這與細胞類型以及細胞外刺激因素相關(guān)。冬凌草甲素是從Isodonrubescen中分離出的二萜類化合物，它能夠通過激活ERK1/2依賴的MAPK通路增加L929細胞的死亡率。在本研究中，我們證明在Kasumi-1細胞中，EriB快速的抑制ERK1/2磷酸化，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子AP-1的活化。這表明EriB能夠抑制促存活信號調(diào)節(jié)子(例如ERK1/2)，然而激活凋亡的陽性調(diào)節(jié)子(例如AP-1)。在EriB誘導(dǎo)的凋亡過程中，這可能是caspase-3非依賴的機制。
綜上所述，目前的研究證明EriB能夠通過抑制NF-κB和MAPK信號通路誘導(dǎo)t(8；21)白血病細胞凋亡。EriB是一個潛在的治療t(8；21)白血病的凋亡誘導(dǎo)者和治療藥物。
本發(fā)明所公開毛萼乙素在制藥中的應(yīng)用，其優(yōu)點表現(xiàn)在(1)本發(fā)明對毛萼乙素發(fā)掘了新的醫(yī)療用途，開拓了一個新的應(yīng)用領(lǐng)域。
(2)本發(fā)明的毛萼乙素安全無毒，藥理作用強，預(yù)示著很好的藥用前景。
(3)毛萼乙素能夠提高過氧化物(ROS)的水平，影響IκBα的磷酸化和降解，以及阻止NF-κB進核，從而抑制NF-κB信號通路。毛萼乙素還能夠下調(diào)ERK1/2的磷酸化水平，抑制MAPKA信號通路。


圖1A顯示EriB的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
圖1B顯示MTT實驗中EriB處理各種白血病和淋巴瘤細胞株IC50結(jié)果，在Kasumi-1，NB4，NB4/R1和NB4/R2細胞中，IC50值低于1μM。
圖1C顯示用各種濃度EriB處理Kasumi-1細胞24和48小時后，細胞生長抑制和存活結(jié)果。柱形圖代表在三次非依賴性實驗中的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，在0.25μM EriB處理過的Kasumi-1細胞中觀察到顯著的細胞抑制效應(yīng)和細胞生存率的下降。
圖1D顯示0.5或1μM EriB處理Kasumi-1，NB4和NB4/R2細胞48小時后的細胞形態(tài)，該圖顯示了典型的凋亡細胞。
圖1E顯示EriB處理Kasumi-1，NB4和NB4/R2細胞24和48小時后Annexin V的分析結(jié)果，EriB能夠增高Annexin-V+/PI(右下方)和annexin-V+/PI+(右上方)細胞的百分比。
圖2A顯示0.25μM EriB處理過的Kasumi-1細胞中核內(nèi)DNA含量的分布，顯示了EriB處理后Kasumi-1細胞中sub-G1期細胞顯著增多。
圖2B顯示Kasumi-1細胞的超微結(jié)構(gòu)，與未處理對照細胞相比較(上方，7400×)，EriB處理過的Kasumi-1細胞(下方，7400×)顯示線粒體損傷以及溶酶體數(shù)量的增多(箭頭所指處)。
圖2C顯示經(jīng)EriB處理24和48小時的Kasumi-1細胞線粒體跨膜電位下降，散點圖下方的數(shù)字代表Rh123弱信號的細胞比例。
圖2D顯示Caspase-3，active(Δ)caspase-3和PARP蛋白的western blot分析，其中β-actin作為上樣量的參照，在用EriB處理過的Kasumi-1，NB4和NB4/R2細胞中，caspase-3被激活，PARP被降解。
圖3A顯示用western blot檢測Bcl-2，Bcl-XL和Bax蛋白的表達水平，用0.25和0.5μM EriB處理Kasumi-1細胞24和48小時后，Bcl-2和Bcl-XL的蛋白水平都在下降，而Bax則沒有變化。
圖3B顯示用RT-PCR檢測Bcl-2，Bcl-XL和Bax mRNA水平，用0.25和0.5μM EriB處理Kasumi-1細胞24和48小時后，Bcl-2和Bcl-XL的mRNA水平都在下降，而Bax則沒有變化。
圖3C顯示EriB能夠誘導(dǎo)下調(diào)Bcl-2/Bax的比率，條帶的強度用密度儀定量。
圖3D顯示EriB能夠誘導(dǎo)下調(diào)Bcl-XL/Bax的比率，條帶的強度用密度儀定量。
圖4A顯示在熒光素酶報告實驗中EriB下調(diào)NF-κB依賴的轉(zhuǎn)錄。用NF-κB介導(dǎo)的熒光素酶報告質(zhì)粒和β-gal質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染Kasumi-1細胞。在用0.25和0.5μM EriB處理細胞1小時后，再加入TNF-α孵育4小時。柱形圖代表在三次非依賴性實驗中的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(上方)。Westernblot檢測NF-κB(P65)(下方)。
圖4B顯示EriB抑制NF-κB的DNA結(jié)合能力。Kasumi-1細胞的處理方法用NF-κB介導(dǎo)的熒光素酶報告質(zhì)粒和β-gal質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)柒Kasumi-1細胞(左方)，用0.2mM DTT，0.25和0.5μM EriB以及EriB聯(lián)合0.2mMDTT分別處理4小時(右方)。核蛋白提取物被制備出來，應(yīng)用EMSA實驗檢測NF-κB的DNA結(jié)合能力。
圖4C顯示在Kasumi-1細胞中用免疫熒光方法檢測細胞內(nèi)的P65轉(zhuǎn)移。在未處理的Kasumi-1細胞中，NF-κB(P65)主要定位在細胞漿中，100ng/ml TNF-α處理細胞4小時后，在細胞核中檢測到顯著的NF-κB(P65)染色。用EriB預(yù)處理1小時則能抑制TNF-α誘導(dǎo)的NF-κB(P65)的轉(zhuǎn)移。
圖4D顯示當(dāng)TNF-α存在時，EriB能夠誘導(dǎo)IκBα磷酸化和降解。在用100ng/ml TNF-α處理Kasumi-1細胞前，有EriB預(yù)先處理1小時。細胞核和細胞漿內(nèi)的蛋白被制備出來用于western blot檢測P65蛋白。LaminB用作核內(nèi)蛋白的對照。從全細胞裂解液中提取出的等量蛋白用于western blot檢測IκBα的磷酸化形式和總的IκBα。
圖4E顯示DTT抑制Kasumi-1細胞中EriB誘導(dǎo)的細胞凋亡和ROS產(chǎn)生。細胞與0.2mM DTT和0.5μM EriB孵育12小時。線粒體跨膜電位用流式細胞儀檢測。上方Rh123弱表達細胞比例。細胞用0.2mM DTT和0.5μM EriB處理2小時。下方細胞熒光強度的增加。柱形圖代表在三次非依賴性實驗中的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。
圖4F顯示EriR誘導(dǎo)IκBα的切割。用0.25和0.5μM EriB處理Kasumi-1細胞24和48小時。提取核蛋白用于western blot檢測P65。全細胞裂解液中IκBα蛋白用抗羧基端IκBα抗體(C-IκBα)和抗-氨基端抗體(N-IκBα)。IκBα和ΔIκBα條帶的位置用箭頭指示。
圖5A顯示EriB誘導(dǎo)Kasumi-1細胞中AML1-ETO降解。用0.25和0.5μM EriB處理細胞24和48小時。全細胞裂解液中AML1-ETO的蛋白水平用抗ETO抗體檢測。
圖5B顯示western blot檢測caspase-3，caspase-3活性形式(Δcaspase-3)，PARP和AML1-ETO蛋白的表達。Kasumi-1細胞在用0.5μMEriB處理48小時前，與40μM Z-DEVD-fmk預(yù)先孵育1小時。Z-DEVD-fmk能夠完全抑制caspase-3活化，PARP切割和AML-ETO降解。
圖5C顯示Z-DEVD-fmk僅能部分減少EriB誘導(dǎo)的凋亡。Kasumi-1細胞的處理方式用0.5μM EriB處理48小時前，與40μM Z-DEVD-fmk預(yù)先孵育1小時。柱形圖代表在三次非依賴性實驗中的annexin V+細胞比例的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。
圖6A顯示EriB抑制ERK的磷酸化。用0.25和0.5μM EriB處理Kasumi-1細胞24和48小時后，用western blot分析方法檢測p42/44ERK蛋白的磷酸化形式(上方)。用0.5μM EriB處理Kasumi-1細胞0，0.5，1，2，4，6和12小時后，同樣方法檢測ERK1/2的磷酸化(下方)。
圖6B顯示EriB誘導(dǎo)c-Jun和c-Fos的表達。Kasumi-1細胞處理方式用0.25和0.5μM EriB處理Kasumi-1細胞24和48小時(下方)，對c-Jun的磷酸化形式(p-c-Jun)，c-Jun和c-Fos的表達進行了westernblot檢測。
圖6C顯示EriB誘導(dǎo)AP-1依賴性轉(zhuǎn)錄的增加。Kasumi-1細胞瞬時轉(zhuǎn)染AP-1介導(dǎo)的熒光素酶報告質(zhì)粒以及用作轉(zhuǎn)染效率對照的β-gal質(zhì)粒，接著用0.5μM EriB處理4小時。柱形圖代表在三次非依賴性實驗中的annexin V+細胞比例的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。
圖7A顯示EriB抑制來自t(8；21)AML患者的原代白血病細胞生長以及誘導(dǎo)其凋亡。臺盼藍排斥實驗用于檢測該效應(yīng)。
圖7B顯示EriB抑制來自t(8；21)AML患者的原代白血病細胞生長以及誘導(dǎo)其凋亡。形態(tài)學(xué)研究用于檢測該效應(yīng)。
圖7C顯示用0.1和0.25μM EriB處理來自一位t(8；21)AML患者的原代白血病細胞12和24小時后Bcl-XL和Bcl-2的表達減少。
具體實施例方式
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步描述。
實施例1EriB能夠抑制人的白血病細胞生長并誘導(dǎo)細胞凋亡用MTT法檢測EriB對人類惡性血液腫瘤細胞生長的影響。EriB對這些細胞的半數(shù)生長抑制量在0.2-2μM之間。不同濃度的EriB對所有被檢測細胞均有生長抑制作用。EriB對Kasumi-1細胞的半數(shù)生長抑制量為0.2μM，對NB4和NB4/R2細胞為0.5μM，對NB4R1，HL60和U937細胞為1μM。惡性淋巴細胞增殖疾病對毛萼乙素敏感性比髓系白血病細胞低，Raji，Daudi和Jurkat細胞的IC50值高于1.5μM(見圖1B)。
Kasumi-1細胞對EriB最敏感，EriB對細胞的生長抑制作用有時間和劑量的依賴性(見圖1C左)，細胞的存活率也對應(yīng)下降(見圖1C右)。在低于0.25μM的濃度下，也能觀察到抑制效應(yīng)。用0.25μM和0.75μMEriB處理Kasumi-1細胞48小時后，分別有42.7±6.5％和90.5±4.3％細胞死亡(見圖1C右)。
為了檢測EriB是否通過誘導(dǎo)細胞凋亡導(dǎo)致細胞生長抑制，對Kasumi-1細胞的形態(tài)和annexin V-FITC/PI進行了檢測。經(jīng)0.5μMeriB處理過的Kasumi-1細胞表現(xiàn)出特征性的凋亡形態(tài)學(xué)改變，例如收縮的細胞漿，固縮的染色質(zhì)，細胞核碎裂和完整的細胞膜，1μM EriB處理后的NB4和NB4/R2細胞也表現(xiàn)出類似的特征(見圖1D)。Kasumi-1細胞經(jīng)0.5μM EriB處理48小時后，annexin V-陽性細胞的比例增長至88.6％，這個比例高于1μM EriB處理48小時后的NB4和NB4/R2細胞(見圖1E)。用0.25μM EriB處理Kasumi-1細胞6，12，24和48小時，在細胞周期分析中顯示亞G1期比例升高提示毛萼乙素誘導(dǎo)細胞凋亡，但沒有細胞周期的改變(見圖2A)。
0.1和0.25μM EriB處理Kasumi-1細胞7天，沒有改變其髓系細胞和單核細胞分化相關(guān)抗原的表達，例如CD11b，CD13，CD14，CD33，CD34和CD64，也沒有誘導(dǎo)其分化。
實施例2毛萼乙素在凋亡誘導(dǎo)濃度下破壞線粒體，激活caspase-3為了研究Kasumi-1細胞在凋亡早期超微結(jié)構(gòu)的改變以及尋找參與凋亡機制的提示，我們進行了透射顯微鏡分析。正常的腫瘤細胞細胞核形狀不規(guī)則，含有大量的粗糙內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體(見圖2B)，用EriB處理6小時后的Kasumi-1細胞顯示出膨脹的細胞，溶酶體數(shù)量的增加，腫脹和衰弱的線粒體(見圖2B)，這提示細胞早期凋亡和線粒體損傷(見圖2B)。
經(jīng)EriB處理后的Kasumi-1細胞與Rh123孵育后用于流式細胞儀的檢測，結(jié)果顯示線粒體跨膜電位明顯下降，并且有時間和劑量的依賴性(見圖2C)。在Kasumi-1，NB4和NB4/R2細胞中，與線粒體跨膜電位改變同步發(fā)生的還有caspase-3的剪切(見圖2D)。PARP是一種參與DNA修復(fù)的核酶，當(dāng)DNA收到損傷的時候，它會被特異的剪切成85-kDa的片段(ΔPARP)，在毛萼乙素處理的過程中PARP也被降解了(見圖2D)。這些結(jié)果提示毛萼乙素通過依賴于caspase活化的內(nèi)源性線粒體通路誘導(dǎo)細胞凋亡。
實施例3毛萼乙素通過下調(diào)Bcl-2和Bcl-XL作用于內(nèi)源性凋亡通路Bcl-2家族蛋白直接控制線粒體膜的通透性，它們是caspase活化的中心調(diào)節(jié)者。該家族抗凋亡和促凋亡的相對成員決定了細胞的生死命運。為了檢測EriB是否通過作用于Bcl-2家族成員破壞線粒體，我們用western blot和RT-PCR的方法檢測了經(jīng)EriB處理24和48小時后，Kasumi-1細胞中抗凋亡因子Bcl-2和Bcl-XL以及促凋亡因子Bax的表達情況。Bcl-2和Bcl-XL在蛋白和mRNA水平上均有減少，然而Bax的表達沒有顯著變化(見圖3A和圖3B)。最終，EriB誘導(dǎo)Bcl-2/Bax和Bcl-XL/Bax比率的負(fù)性調(diào)節(jié)(見圖3C和圖3D)，這與Kasumi-1細胞凋亡過程中線粒體穩(wěn)定性被破壞的結(jié)果相吻合。
實施例4EriB抑制Kasumi-1細胞內(nèi)源性和TNF-α誘導(dǎo)的NF-κB活化EriB能夠減少Bcl-2和Bcl-XL的mRNA水平，它們的轉(zhuǎn)錄都是直接受NF-κB調(diào)控的。為了研究EriB是否嫩能夠阻斷內(nèi)在的和TNF-α介導(dǎo)的NF-κB活化，我們進行了熒光素酶報告實驗。在Kasumi-1細胞中NF-κB顯示出基礎(chǔ)的轉(zhuǎn)錄活性，這提示NF-κB是組成型活化的，在加入TNF-α4小時后，熒光素酶活性大約增加4倍(見圖4A)。用EriB預(yù)處理細胞1小時后，基礎(chǔ)的熒光素酶活性和TNF-α誘導(dǎo)的NF-κB活性均被阻斷(見圖4A)。然而，EriB和TNF-α單獨或聯(lián)合均對P65的蛋白水平?jīng)]有影響(見圖4A)。EMSA實驗顯示經(jīng)TNF-α處理后的Kasumi-1細胞顯示出明顯的NF-κB活性上調(diào)，然而在加入TNF-α前用EriB處理1小時能夠阻斷NF-κB活化(見圖4B)。但是，一種能夠阻止二硫鍵形成的化合物DTT，能夠減少EriB的這種抑制效應(yīng)(見圖4B)。這提示EriB的抑制效應(yīng)是氧化還原敏感的。我們還分析了Kasumi-1細胞中特異的NF-κB復(fù)合物，遷移較慢的蛋白-DNA復(fù)合物對應(yīng)著P65-P50二聚體。這些結(jié)果提示NF-κB在Kasumi-1細胞中是組成型活化的，在EMSA實驗中，EriB能夠抑制內(nèi)源性的和TNF-α誘導(dǎo)的NF-κB活性。
實施例5毛萼乙素在Kasumi-1細胞中阻止NF-κB的核轉(zhuǎn)移以及IκB-α的降解為了進一步理解EriB介導(dǎo)的NF-κB失活的機制，我們進行了免疫熒光檢測和western blot分析。盡管在Kasumi-1細胞中EriB本身對P65核轉(zhuǎn)移沒有明顯的影響，但它能夠顯著的阻止TNF-α誘導(dǎo)的P65快速進核(見圖4C)。EriB處理Kasumi-1細胞后，細胞核中的NF-κB減少，而細胞漿中的則增加(見圖4D)。為了檢測EriB對細胞核內(nèi)NF-κB的作用，我們制備了Kasumi-1細胞的核蛋白提取物。EriB處理24和48小時后，Kasumi-1細胞中的核蛋白減少(見圖4F)。
IκBα通過將NF-κB隔離在細胞漿中來調(diào)節(jié)NF-κB的活性。IκBα經(jīng)泛素化后就會被蛋白酶體降解，這就會導(dǎo)致NF-κB的核轉(zhuǎn)運。在本研究中，TNF-α在4小時內(nèi)誘導(dǎo)IκBα磷酸化，然而EriB預(yù)處理后該蛋白的磷酸化反而受到抑制(見圖4D)。為了檢測在細胞核內(nèi)NF-κB水平減少的過程中IκBα所扮演的角色，我們對經(jīng)EriB處理的Kasumi-1細胞總蛋白進行了western blot分析。我們用抗IκBα羧基端的抗體能夠檢測到37和34kDa二種蛋白形式，然而用抗IκBα氨基端的抗體則不能檢測到34kDa大小的蛋白形式(見圖4F)。這些結(jié)果提示EriB誘導(dǎo)IκBα被切割成一個34kDa大小的產(chǎn)物(ΔIκBα)。ΔIκBα缺少泛素化位點，通過將NF-κB穩(wěn)定的隔離在細胞漿中產(chǎn)生對其的超級抑制物的作用。
綜上所述，EriB能夠通過直接抑制NF-κB與DNA的結(jié)合能力抑制內(nèi)源性的NF-κB活性，以及主要通過抑制IκBα的磷酸化和降解來阻斷TNF-α誘導(dǎo)的NF-κB活性。
實施例6DTT抑制EriB誘導(dǎo)的Kasumi-1細胞凋亡和過氧化物(ROS)水平升高有研究表明EriB通過與活性SH基相互作用來發(fā)揮它的毒性作用。為了證明這個作用機制是否參與了EriB誘導(dǎo)的細胞凋亡，我們用0.5μMEriB和0.2mM DTT持續(xù)處理Kasumi-1細胞。DTT單獨處理細胞對Rh123細胞的比例沒有產(chǎn)生影響(見圖4E)。然而，0.2mM DTT能夠完全抑制EriB誘導(dǎo)的凋亡(見圖4E)。為了研究ROS是否與EriB誘導(dǎo)的凋亡相關(guān)，我們用一種細胞通透性染料H2DCFDA進行流式細胞儀分析。在ROS存在的情況下，H2DCFDA會被特異的切割并發(fā)出一定波長的熒光。用0.5μM EriB單獨處理Kasumi-1細胞2小時，細胞內(nèi)ROS水平與未處理細胞相比大約升高2倍，然而當(dāng)0.2mM DTT與EriB共同孵育時，ROS水平卻沒有發(fā)生改變(見圖4E)。
實施例7EriB誘導(dǎo)AML-ETO融合蛋白發(fā)生降解，這一變化能夠被caspase-3抑制劑拮抗AML-ETO融合蛋白是由t(8；21)染色體易位產(chǎn)生的，AML-ETO被認(rèn)為在帶有這種融合蛋白的AML治療中是一個重要的治療靶點。我們用用抗ETO的抗體檢測發(fā)現(xiàn)用EriB處理24和48小時后的Kasumi-1細胞中AML1-ETO被降解(見圖5A)，這提示EriB直接這對該融合蛋白。AML1-ETO的降解與caspase-3活化的發(fā)生時間是一致的，因此我們進一步研究了在EriB誘導(dǎo)凋亡的過程中，caspase-3活化與AML1-ETO降解之間的關(guān)系。在EriB處理Kasumi-1細胞的過程中預(yù)先加入了caspase-3的抑制劑Z-DEVD-fmk(40μM)。Z-DEVD-fmk能夠完全阻斷EriB誘導(dǎo)的caspase-3活化，PARP降解以及AML-ETO降解(見圖5B)。然而，在0.5μM EriB處理Kasumi-1細胞的時候預(yù)先加入Z-DEVD-fmk孵育1小時，細胞凋亡率(annexin V陽性的細胞比例)僅部分減少(見圖5C)。這些結(jié)果提示，EriB誘導(dǎo)的AML1-ETO降解是一個伴隨caspase-3發(fā)生的事件。然而，在EriB誘導(dǎo)的凋亡過程中除了caspase-3活化之外還存在不依賴于caspase-3的機制。
實施例8
EriB在Kasumi-1細胞中抑制ERK通路以及激活A(yù)P-1通路Ras/Raf/MEK/ERK通路是一個參與控制造血細胞增殖的重要信號級聯(lián)反應(yīng)，破壞這條通路在AML中會使促凋亡信號占優(yōu)勢。為了檢測EriB對ERK活化的作用，我們用抗ERK1/2磷酸化形式(p-ERK1/2)的抗體進行了western blot分析。在Kasumi-1細胞中，EriB處理12和24小時后，ERK1/2的磷酸化水平快速降低(見圖6A)。事實上，從EriB處理Kasumi-1細胞30分鐘起，p-ERK1/2就已經(jīng)開始降低(見圖6A)。
早期的體外實驗表明，AP-1活性的提高能夠?qū)е绿禺惖娜四[瘤細胞凋亡。AP-1蛋白復(fù)合體在哺乳動物中的主要組分為c-Jun和c-Fos。在Kasumi-1細胞中，EriB能夠快速的誘導(dǎo)c-Jun，c-Fos和磷酸化的c-Jun表達(見圖6B)。C-Jun磷酸化形式的增加即c-Jun的活化提示這個轉(zhuǎn)錄因子在EriB誘導(dǎo)的凋亡中扮演了潛在的角色。為了進一步評估EriB對AP-1的活性的作用，我們進行了熒光素酶報告實驗。在Kasumi-1細胞中瞬時轉(zhuǎn)染pAP-1-Luc報告質(zhì)粒，加入EriB 4小時后熒光素酶活性升高約3倍(見圖6C)，這提示EriB在Kasumi-1細胞中通過誘導(dǎo)c-Jun，c-Fos和c-Jun磷酸化形式的表達來增強轉(zhuǎn)錄因子AP-1的活性。
實施例9毛萼乙素誘導(dǎo)來自t(8；21)患者的白血病細胞凋亡0.1和0.25μM EriB處理來自t(8；21)患者的白血病原代細胞，能夠顯著抑制細胞生長，在全部5例病人中達到超過60％的細胞抑制(見圖7A)。在用0.1μM EriB處理24小時后，我們觀察到典型的帶有凋亡特征的形態(tài)學(xué)改變(見圖7B)。EriB還能在處理12和24小時后降低Bcl-2和Bcl-XL的水平(見圖7C)。這些結(jié)果提示白血病原代細胞對EriB非常敏感。
權(quán)利要求
1.毛萼乙素在制備治療急性白血病藥物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，毛萼乙素在制備治療含有AML1-ETO融合基因的急性髓系白血病藥物中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，毛萼乙素在制備治療急性早幼粒細胞白血病藥物中的應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，毛萼乙素在制備治療急性髓系白血病藥物中的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，毛萼乙素在制備治療T細胞急性淋巴母細胞白血病藥物中的應(yīng)用。
6.毛萼乙素在制備治療伯基特淋巴瘤藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及毛萼乙素在制備治療急性白血病藥物中的應(yīng)用；和毛萼乙素在制備治療伯基特淋巴瘤藥物中的應(yīng)用。毛萼乙素毒性較小，藥理作用強，預(yù)示著很好的藥用前景。毛萼乙素能夠提高過氧化物(ROS)的水平，影響IκBα的磷酸化和降解，以及阻止NF－κB進核，從而抑制NF－κB信號通路。毛萼乙素還能夠下調(diào)ERK1/2的磷酸化水平，抑制MAPK信號通路。
文檔編號A61P35/00GK1868468SQ200510110089
公開日2006年11月29日 申請日期2005年11月7日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月7日
發(fā)明者陳賽娟, 陳竺, 王蘭, 趙維蒞, 孫漢董 申請人:上海第二醫(yī)科大學(xué)附屬瑞金醫(yī)院