專(zhuān)利名稱(chēng)：具有生物活性的人工生物瓣瓣膜的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種具有生物活性人工生物瓣瓣膜的制備方法，屬生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
心臟瓣膜病是危及人類(lèi)健康的一種嚴(yán)重疾病，目前對(duì)于心臟瓣膜病人主要采用人工心臟瓣膜置換手術(shù)治療[Julie R，Boris AN，Vacanti JP.Tissueengineeringa 21st century solution to surgical reconstruction.Annthorac surg，2001，72577-591.]。人工心臟瓣膜包括機(jī)械瓣和生物瓣兩類(lèi)，它們各有其成功和不足之處。機(jī)械瓣體內(nèi)植入壽命可達(dá)25年之久，因而是目前使用最多的人工瓣膜。但機(jī)械瓣存在難以克服的嚴(yán)重缺陷，如非生理性、對(duì)正常血液流動(dòng)狀態(tài)的阻礙、手術(shù)后必須終身服用抗凝藥物而引起的出血合并癥、每年高達(dá)5％的血栓率、不能隨青少年心臟發(fā)育長(zhǎng)大而長(zhǎng)大等。這些問(wèn)題使機(jī)械瓣的使用潛伏著多項(xiàng)危險(xiǎn)因素。也使國(guó)際上對(duì)人工心臟瓣膜的研究熱點(diǎn)轉(zhuǎn)向了生物瓣[Julie R，Boris AN，Vacanti JP.Tissue engineeringa 21st centurysolution to surgical reconstruction.Ann thorac surg，2001，72577-591.]。
生物瓣是用與人體結(jié)構(gòu)功能相近的動(dòng)物或人的心臟瓣膜或心包膜加工而成的瓣膜假體[Schmidt CE，Baier JM.Acellular vascular tissuenaturalbiomaterals for tissue repair and tissue engineering.Biomaterals，2000，21(2000)2215-2231.]。就生物瓣來(lái)說(shuō)，同種異體瓣臨床應(yīng)用成功率較高，但其來(lái)源有限；異種瓣雖來(lái)源廣泛，但有抗原性，必須經(jīng)過(guò)戊二醛交聯(lián)處理才能使用。經(jīng)戊二醛交聯(lián)的豬主動(dòng)脈瓣有一定的強(qiáng)度和韌性，基本保留了豬心臟瓣膜的膠原結(jié)構(gòu)，減少了免疫原性，很大程度上避免了機(jī)械瓣置換后需終身抗凝的缺點(diǎn)。然而將這種瓣膜直接植入體內(nèi)后，往往會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的鈣化，加之戊二醛處理后戊二醛本身的殘留毒性以及瓣膜組織殘留的免疫原性，極大地降低了其體內(nèi)工作壽命[Schmidt CE，Baier JM.Acellular vascular tissuenatural biomaterals for tissue repair and tissue engineering.Biomaterals，2000，21(2000)2215-2231.]。另外，不經(jīng)任何交聯(lián)固定的脫細(xì)胞人工瓣膜容易傳染某些病源菌或病毒病，如Creutzfeldt-Jakob氏病等缺點(diǎn)。Martin等和Walles等已檢測(cè)并證實(shí)了豬內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒可在人細(xì)胞內(nèi)表達(dá)[Neuenschwander S，Hoerstrup SP.Heart valve tissue engineering.Transplant immunology，2004，12(3-4)359-365.]。因而急需一種新型的無(wú)毒、抗菌、抗病毒和抗炎的交聯(lián)劑替代戊二醛交聯(lián)天然瓣膜材料。
以去垢劑、酶消化和超聲清洗等方法徹底抽提動(dòng)物瓣膜的細(xì)胞，保留由膠原蛋白、彈性蛋白、纖粘連蛋白(fibronectin)和層粘連蛋白(laminin)組成的天然三維支架結(jié)構(gòu)，這種支架結(jié)構(gòu)由于是細(xì)胞外基質(zhì)，含有糖蛋白和蛋白聚糖等多種功能性蛋白，有較好的生物相容性。另外，這種支架保持了瓣膜天然形態(tài)，不象高分子材料支架需要根據(jù)血流動(dòng)力學(xué)塑形[Schmidt CE，Baier JM.Acellular vascular tissuenatural biomaterals for tissue repair andtissue engineering.Biomaterals，2000，21(2000)2215-2231.]。但是，SYNERGRAFT公司采用這種不經(jīng)任何交聯(lián)固定工藝生產(chǎn)的人工瓣膜SYNERGRAFTTM，在應(yīng)用于臨床后，不但不能在體內(nèi)原位再生出瓣膜內(nèi)皮，反而引起強(qiáng)烈的免疫炎性反應(yīng)，造成多例病人手術(shù)后1-2年內(nèi)死亡的悲劇[Simon P.，Kasimir M.T.，Seebacher G.et al.Early failure of the tissue engineered porcine heartvalve SYNERGRAFTTMin pediatric patients.European Journal ofCardio-thoracic Surgery.23(2003)1002-1006.]?？磥?lái)，應(yīng)用天然脫細(xì)胞瓣膜材料也需要一種新型的無(wú)毒、抗菌、抗病毒和抗炎的交聯(lián)劑對(duì)其交聯(lián)處理。
為克服上述缺陷，交聯(lián)固定工藝是重要處理方法，人們已找到多種交聯(lián)劑可交聯(lián)處理動(dòng)物瓣膜支架，如多聚環(huán)氧化物(PC)、丙三醇、α-氨基油酸(AOA)、NO-ReactTM、cyanimide、碳二亞胺(1-ethyl-3(-3 dimethyl aminopropyl)carbodiimide hydrochloride，EDC)、adipyl dichlorid、環(huán)己二異氰酸鹽(hexamethylene diisocyanate，HMDC)、藻酸疊氮化物(alginate azide)和藻酸鈉(sodium alginate)等[Julie R，Boris AN，Vacanti JP.Tissueengineeringa 21st century solution to surgical reconstruction.Annthorac surg，2001，72577-591.，Schmidt CE，Baier JM.Acellular vasculartissuenatural biomaterals for tissue repair and tissue engineering.Biomaterals，2000，21(2000)2215-2231.]，但是由于其交聯(lián)效果、交聯(lián)劑本身的毒性等原因，使交聯(lián)所得生物瓣的性能仍不理想。所以仍須尋找到更加適合的交聯(lián)劑，使交聯(lián)處理的瓣膜具有適當(dāng)?shù)牧W(xué)特性、較強(qiáng)的穩(wěn)定性和耐久性、較低的毒性，利于瓣膜組成細(xì)胞的長(zhǎng)入，以及能夠抗菌、抗病毒、抗炎等。
原花青素是一類(lèi)廣泛存在于水果、蔬菜、花瓣、種子以及樹(shù)皮中的植物次生代謝產(chǎn)物，也是紅葡萄酒的重要成分，被用作食品、天然抗氧化物和藥品等，可清除自由基、保護(hù)心腦血管，具有抗菌、抗病毒、抗炎、抗癌等活性，其體內(nèi)代謝途徑清楚，而且沒(méi)有毒性[Packer L.，Rimbach，and Virgili F.Antioxidantactivity and biologic properties of a procyanidin-rich extract from pine(Pinus Maritima)bark，pycnogenol.Free Radical Biology &Medicine，27(5/6)704-724，1999.]。雖然Nimni等證明原花青素可用來(lái)交聯(lián)牛肌腱和心包膜等[Bo Han，Jason Jaurequi，Bao Wei Tang，Marcel E.Nimni.ProanthocyanidinA natural crosslinking reagent for stabilizingcollagen matrics.J Biomed Mater Res.65A118-124，2003.]，但運(yùn)用原花青素交聯(lián)脫細(xì)胞心臟瓣膜，制備生物瓣或制備組織工程心臟瓣膜支架材料的工藝技術(shù)尚未見(jiàn)報(bào)道。這構(gòu)成了本發(fā)明的創(chuàng)意。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種具有生物活性的人工生物瓣瓣膜的制備方法，本發(fā)明旨在通過(guò)采用原花青素作為新型交聯(lián)劑交聯(lián)脫細(xì)胞心臟瓣膜，提供一種具有生物活性的生物瓣膜，使之具有力學(xué)特性、穩(wěn)定性、耐久性和生物相容性?xún)?yōu)良，且沒(méi)有毒性等優(yōu)點(diǎn)，以滿(mǎn)足新一代生物瓣膜研制和生產(chǎn)的需要。
本發(fā)明是以動(dòng)物心臟瓣膜為原料，以化學(xué)方法脫去動(dòng)物或心臟瓣膜的細(xì)胞，得到瓣膜脫細(xì)胞的胞外基質(zhì)作為交聯(lián)對(duì)象，將瓣膜胞外基質(zhì)浸入不同濃度、不同比例的原花青素溶液中，在不同溫度條件下，搖動(dòng)交聯(lián)一定時(shí)間，可以得到最大抗拉強(qiáng)度在8.0Mpa以上、明顯高于新鮮豬瓣或戊二醛交聯(lián)處理的豬瓣抗拉強(qiáng)度的瓣膜材料，其穩(wěn)定性高、抗酶解能力強(qiáng)、交聯(lián)劑釋放沒(méi)有毒性。通過(guò)調(diào)節(jié)交聯(lián)劑原花青素的濃度、交聯(lián)溫度、搖動(dòng)速度、交聯(lián)時(shí)間和交聯(lián)后的保存方法，可調(diào)控瓣膜或支架的力學(xué)強(qiáng)度、抗酶解能力、交聯(lián)劑釋放速度、促進(jìn)組織再生能力等。本發(fā)明所使用的交聯(lián)劑原花青素，其交聯(lián)對(duì)象還可為一切含膠原蛋白成分的人工或天然材料。交聯(lián)所得脫細(xì)胞瓣膜材料，既可直接用作人工生物瓣瓣膜，也可用作組織工程心臟瓣膜支架，以便用于心臟瓣膜進(jìn)一步制備或構(gòu)建、臨床置換、修復(fù)和再生。原花青素本身不但有交聯(lián)作用，而且還具有清除自由基、抗氧化、抗癌、抗炎癥、心腦血管保護(hù)和促進(jìn)組織再生功效。采用本發(fā)明提供的方法，可以根據(jù)不同的組織損傷程度，在修復(fù)時(shí)對(duì)生物瓣瓣膜或組織工程心臟瓣膜支架的不同要求，制備出具有不同特性的產(chǎn)品，以滿(mǎn)足臨床應(yīng)用的需要。
本發(fā)明所述的具有生物活性的人工生物瓣膜的制備方法，包括交聯(lián)前處理\交聯(lián)過(guò)程以及交聯(lián)后處理和保存.現(xiàn)分述如下1交聯(lián)前處理工藝該工藝目的在于獲得充分清洗過(guò)的脫細(xì)胞心臟瓣膜，包括二步1)心臟瓣膜原材料收集和脫細(xì)胞處理本發(fā)明是以脫細(xì)胞豬心臟瓣膜或脫細(xì)胞人異體心臟瓣膜為交聯(lián)對(duì)象的。在屠宰場(chǎng)將剛宰殺的豬心臟內(nèi)主動(dòng)脈瓣膜或肺動(dòng)脈瓣膜連同周?chē)芗粝?，置于無(wú)Ca2+、Mg2+離子的磷酸緩沖溶液(即D-Hanks液，配方見(jiàn)表1)中于4℃下1小時(shí)內(nèi)帶回，立即小心剪取瓣膜葉片，用D-Hanks液清洗干凈，按下列方法脫細(xì)胞脫細(xì)胞液分A液和B液，都以D-Hanks液配制。瓣膜分兩步脫細(xì)胞，第一步用A液，第二步用B液。每一步均按每片瓣膜加入2-20ml的比例加入。A液和B液的配方如下脫細(xì)胞液A液可用以下三種溶液配方(1)、(2)、(3)中的任一種。
配方(1)含0.05％或0.1％胰蛋白酶、0.02％乙二胺四乙酸二鈉(Ethylenediamine tetraacetic acid disodium salt，EDTA)。
配方(2)含0.05％或0.1％胰蛋白酶、0.5％非離子去垢劑聚乙二醇辛基苯基醚(4-(1，1，3，3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol，商品名為T(mén)riton X-100)、0.5％脫氧膽酸鈉和0.02％EDTA。
配方(3)含0.5％Triton X-100、0.5％脫氧膽酸鈉和0.02％EDTA。
以上3個(gè)配方中所含的胰蛋白酶等均為質(zhì)量百分比，即每100ml中含有的質(zhì)量數(shù)。
脫細(xì)胞液B液配方為D-Hanks液配制的20μg/ml的核酸酶(RNase)和0.2mg/ml的脫氧核酸酶(DNase)混合液。
表1.無(wú)Ca2+、Mg2+離子的磷酸緩沖溶液配方(即D-Hanks溶液)。

用作制備人工生物瓣瓣膜的動(dòng)物或人異體心臟瓣膜脫細(xì)胞所需要的條件溫度為1-40℃，優(yōu)選為20-37℃；搖床搖動(dòng)速度為0-300rpm(包括不搖動(dòng))，優(yōu)選為120-240rpm；空氣濕度為30％-95％，優(yōu)選為50％-95％；CO2濃度為0.3％-5％，優(yōu)選為0.3％或5％；時(shí)間為10分鐘-100小時(shí)，優(yōu)選為1-48小時(shí)。
2)交聯(lián)前處理經(jīng)上述脫細(xì)胞處理后，再按以下方法作交聯(lián)前處理將每片瓣膜浸泡于5-10ml的D-Hanks液清洗。清洗所需要的條件搖床搖動(dòng)速度0-300rpm(包括不搖動(dòng))，優(yōu)選為120-240rpm；時(shí)間為0.5-480小時(shí)，為48-240小時(shí)；每天更換D-Hanks液。
2交聯(lián)過(guò)程將用上述方法充分清洗過(guò)的脫細(xì)胞心臟瓣膜，按每片瓣膜浸泡于1-20ml的0.01-20mg/ml(質(zhì)量-體積比)的比例配制的原花青素D-Hanks液溶液，作脫細(xì)胞心臟瓣膜交聯(lián)；優(yōu)選的比例為每片瓣膜浸泡于1-10ml的0.06-10mg/ml(質(zhì)量-體積比)原花青素的D-Hanks液的比例。交聯(lián)脫細(xì)胞心臟瓣膜的溫度1-40℃，優(yōu)選為20-37℃。交聯(lián)在搖床搖動(dòng)條件下完成，其搖動(dòng)速度優(yōu)選為10-300rpm，優(yōu)選為60-120rpm。交聯(lián)時(shí)間為1分鐘-240小時(shí)，優(yōu)選為0.5-48小時(shí)。
3交聯(lián)后處理和保存所交聯(lián)的脫細(xì)胞動(dòng)物心臟瓣膜，在交聯(lián)過(guò)后以每片瓣膜加2-20ml的比例加入D-Hanks溶液浸泡瓣膜，清洗0-480小時(shí)(包括不清洗)，優(yōu)選清洗時(shí)間為5分鐘-1小時(shí)。清洗在1-40℃、優(yōu)選溫度為20-37℃、搖床在0-300rpm(包括不搖動(dòng))搖動(dòng)條件下完成，其搖動(dòng)速度優(yōu)選60-120rpm。按此方法即可制得具有上述特征的人工生物瓣瓣膜材料或組織工程心臟瓣膜支架。保存在1-10℃的D-Hanks液中直至使用。最佳保存的溫度為4℃。
本發(fā)明所述的采用原花青素交聯(lián)方法制備具有生物活性人工生物瓣膜性能是用下述四種方法進(jìn)行評(píng)價(jià)的。
1掃描電鏡觀察按上述方法制備的脫細(xì)胞心臟瓣膜經(jīng)2.5％戊二醛固定后，再經(jīng)50％、80％、95％和100％乙醇脫水，以及6-甲基二硅烷(hexamethyldisilanzane，HMDS)干燥處理，掃描電鏡觀察脫細(xì)胞后的瓣膜胞外基質(zhì)形態(tài)和脫細(xì)胞是否全面。
2最大抗拉強(qiáng)度測(cè)定將本發(fā)明所制備的不同濃度原花青素交聯(lián)的瓣葉，沿纖維方向剪成4mm寬、25mm長(zhǎng)的條帶。每片瓣葉剪取一條，每個(gè)濃度6條。檢測(cè)在SHIMADZU萬(wàn)能力學(xué)測(cè)試機(jī)上進(jìn)行，拉伸速率為2mm/min。
3交聯(lián)穩(wěn)定性檢測(cè)3.1力學(xué)穩(wěn)定性檢測(cè)將本發(fā)明所制備的以10mg/ml濃度原花青素交聯(lián)的瓣葉，浸泡于D-Hanks液中，每天更換D-Hanks液。分別于不同浸泡時(shí)間后，取出瓣葉，按2.2中所述方法測(cè)定最大抗拉強(qiáng)度。
3.2抗酶解能力檢測(cè)將本發(fā)明所制備的不同濃度原花青素交聯(lián)的瓣葉，浸泡于以D-Hanks液配制的濃度為1000U/ml的2型膠原酶液中，于37℃、120rpm搖動(dòng)條件下，酶解消化1、3、7和24小時(shí)，測(cè)定各濃度原花青素交聯(lián)的瓣葉重量(Wt)，按下式計(jì)算各濃度原花青素交聯(lián)的瓣葉相對(duì)于原重(W0)減少的百分率(即酶解消化率，ΔW％)。
ΔW％＝(W0-Wt)/W0×100ΔW％值越大，則抗酶解能力越小。
3.3交聯(lián)后交聯(lián)劑釋放速率測(cè)定將本發(fā)明所制備的以10mg/ml濃度原花青素交聯(lián)的瓣葉，浸泡于D-Hanks液中，于37℃、5％CO2環(huán)境中保存，每天更換D-Hanks液，使交聯(lián)劑原花青素釋放。將更換的含有釋放出原花青素的D-Hanks液，用分光光度計(jì)測(cè)定吸光度，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出釋放濃度。具體方法取1ml待測(cè)原花青素式樣加入12％香蘭素的甲醇溶液3ml，再加入1.2M的HCl的甲醇溶液6ml混合，25分鐘后將混合液分4等份在波長(zhǎng)為500nm處測(cè)定吸光度。
4交聯(lián)劑對(duì)瓣膜間質(zhì)細(xì)胞增殖潛力和毒性的檢測(cè)4.1瓣膜間質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)取新鮮的出生不到24小時(shí)的小牛心臟主動(dòng)脈瓣膜葉片，刮去內(nèi)皮細(xì)胞，剪成1-2mm2的小塊，用以無(wú)血清的M199培養(yǎng)液配制的濃度為2mg/ml的II型膠原酶液，37℃、120rpm搖動(dòng)條件下消化1小時(shí)，所得細(xì)胞用含20％胎牛血清的M199培養(yǎng)液，在37℃、5％CO2環(huán)境中培養(yǎng)，每2-3天換液一次，以2-4代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。
4.2原花青素對(duì)細(xì)胞增殖潛力抑制和細(xì)胞毒性的檢測(cè)將瓣膜間質(zhì)細(xì)胞以每孔1000細(xì)胞的密度接種于96孔板，1天后換成含不同濃度原花青素的上述培養(yǎng)液培養(yǎng)6天，用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力。具體方法是，培養(yǎng)到期后，培養(yǎng)經(jīng)清洗，加入含0.5mg/ml的MTT無(wú)血清的細(xì)胞培養(yǎng)液100μl/孔，繼續(xù)在正常條件下培養(yǎng)4小時(shí)，棄去培養(yǎng)液，加入100μl二甲亞砜充分溶解紫色物質(zhì)，分光光度計(jì)上490nm波長(zhǎng)檢測(cè)吸光度值，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線推算出細(xì)胞數(shù)?；盍υ礁邉t細(xì)胞數(shù)越多，細(xì)胞增殖潛力抑制就越?。槐３衷?xì)胞數(shù)的原花青素濃度越高，則毒性越小。
本發(fā)明使用原花青素作為交聯(lián)劑交聯(lián)脫細(xì)胞心臟瓣膜，直接制備生物瓣或制備組織工程心臟瓣膜支架，與戊二醛交聯(lián)效果相比，具有力學(xué)特性、穩(wěn)定性、耐久性和生物相容性?xún)?yōu)良，且沒(méi)有毒性等優(yōu)點(diǎn)，加上原花青素本身的抗菌、抗病毒、抗炎、抗癌和心腦血管保護(hù)等活性，使得運(yùn)用本發(fā)明工藝技術(shù)直接制備的生物瓣材料具有極好的應(yīng)用前景。同時(shí)，本發(fā)明的工藝簡(jiǎn)單易行，而且容易實(shí)施和推廣。
綜上所述，本發(fā)明的具有力學(xué)強(qiáng)度、抗酶解能力、交聯(lián)劑釋放速度、促進(jìn)組織再生能力等可調(diào)控的生物瓣瓣膜，作為人體病損心臟瓣膜損傷修復(fù)材料或組織工程心臟瓣膜支架具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。


圖1為豬心臟主動(dòng)脈瓣膜在脫細(xì)胞后經(jīng)過(guò)本發(fā)明方法清洗后的掃描電鏡照片。
圖2為本發(fā)明所用交聯(lián)劑原花青素交聯(lián)的脫細(xì)胞瓣膜的光學(xué)顯微鏡照片。
圖3為本發(fā)明所用交聯(lián)劑原花青素所交聯(lián)的脫細(xì)胞瓣膜(濃度為2.5mg/ml、5mg/ml、10mg/ml到20mg/ml)與戊二醛(6.25mg/ml)交聯(lián)的脫細(xì)胞瓣膜、不交聯(lián)的脫細(xì)胞瓣膜(0mg/ml)以及新鮮瓣膜的最大抗拉強(qiáng)度比較。圖中“*”表示p＜0.05，組間有顯著差異圖4為本發(fā)明所用原花青素以10mg/ml濃度交聯(lián)的脫細(xì)胞瓣膜在D-Hanks液中浸泡不同天數(shù)后的最大抗拉強(qiáng)度變化。
圖5為本發(fā)明所用原花青素以不同濃度(2.5mg/ml、5mg/ml、10mg/ml和20mg/ml)交聯(lián)的脫細(xì)胞瓣膜和戊二醛交聯(lián)的脫細(xì)胞瓣膜(6.25mg/ml)、以及不交聯(lián)的脫細(xì)胞瓣膜(0mg/ml)在不同時(shí)間(1、2、4和24小時(shí))的抗膠原酶降解能力比較圖。
圖6為本發(fā)明所用原花青素交聯(lián)的脫細(xì)胞瓣膜在D-Hanks液中浸泡45天時(shí)，交聯(lián)劑原花青素釋放過(guò)程。圖中右上角是原花青素吸光度-濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。
圖7為本發(fā)明所使用的交聯(lián)劑原花青素對(duì)瓣膜間質(zhì)細(xì)胞的增殖潛力抑制和毒性試驗(yàn)結(jié)果。圖中“*”表示p＜0.05，組間有顯著差異。
圖8為本發(fā)明所用原花青素按每片瓣膜加入20ml、0.0625mg/ml濃度、4℃下、120rpm搖動(dòng)交聯(lián)240小時(shí)的脫細(xì)胞瓣膜圖9為本發(fā)明所用原花青素按5mg/ml濃度、每片瓣膜加入20ml、37℃、以120rpm搖動(dòng)條件下，分別交聯(lián)0.5、1、3和7小時(shí)的脫細(xì)胞瓣膜(依次為2、3、4、5，圖中瓣膜1為未交聯(lián)的脫細(xì)胞瓣膜)。
具體實(shí)施例方式
通過(guò)下面具體實(shí)施例介紹，以進(jìn)一步闡明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和顯著的進(jìn)步，但本發(fā)明決非僅局限于實(shí)施例。
實(shí)施例1
脫細(xì)胞豬心臟主動(dòng)脈瓣膜制備方法按前述方法制備，圖1顯示豬心臟主動(dòng)脈瓣膜細(xì)胞及其成分已經(jīng)脫洗干凈，胞外基質(zhì)保留完好。以每片瓣膜加2ml的比例加入D-Hanks溶液浸泡瓣膜，在37℃下、240rpm搖動(dòng)清洗0.5小時(shí)。然后以每片瓣膜加2ml的比例加入10mg/ml原花青素的D-Hanks溶液浸泡，120rpm的搖動(dòng)速度，37℃下交聯(lián)48小時(shí)。再以每片瓣膜加2ml的比例加入D-Hanks溶液浸泡瓣膜，在37℃下、120rpm搖動(dòng)清洗240小時(shí)，每24小時(shí)換液一次。這樣所制得的本發(fā)明的人工生物瓣瓣膜材料，作上述性能評(píng)價(jià)，圖2中1為6.25mg/ml戊二醛交聯(lián)的脫細(xì)胞瓣膜，有較明顯的皺縮，而圖中2、3、4和5為本發(fā)明所用交聯(lián)劑原花青素以2.5mg/ml、5mg/ml、10mg/ml到20mg/ml濃度交聯(lián)的脫細(xì)胞瓣膜，交聯(lián)后柔潤(rùn)而不皺縮。圖3顯示原花青素交聯(lián)的脫細(xì)胞瓣膜最大抗拉強(qiáng)度為11MPa，優(yōu)于戊二醛交聯(lián)的脫細(xì)胞瓣膜，也優(yōu)于不交聯(lián)的脫細(xì)胞瓣膜。圖4顯示原花青素交聯(lián)后的脫細(xì)胞瓣膜在D-Hanks液中浸泡45天時(shí)最大抗拉強(qiáng)度與剛交聯(lián)結(jié)束時(shí)的相近，沒(méi)有減小。表明本發(fā)明所用交聯(lián)劑原花青素對(duì)脫細(xì)胞瓣膜交聯(lián)的穩(wěn)定性良好。圖5顯示本發(fā)明的不同濃度原花青素交聯(lián)的脫細(xì)胞瓣膜和戊二醛交聯(lián)的脫細(xì)胞瓣膜，均有較強(qiáng)的抗酶解能力。相對(duì)于不交聯(lián)的脫細(xì)胞瓣膜，兩種交聯(lián)劑交聯(lián)的脫細(xì)胞瓣膜的降解率都很低，表明脫細(xì)胞瓣膜的組成分子分別被原花青素和戊二醛交聯(lián)修飾。原花青素酶降解率僅為6.94％，說(shuō)明原花青素具有良好的交聯(lián)作用，效果良好。圖6顯示原花青素交聯(lián)的脫細(xì)胞瓣膜在交聯(lián)后釋放原花青素主要集中在前期4天內(nèi)，濃度由234.6μg/ml下降為3.2μg/ml。這可能是由于交聯(lián)過(guò)程中剩余的過(guò)量原花青素在清洗后少量殘留引起的。4天之后釋放量極小，這可能是交聯(lián)后力學(xué)強(qiáng)度穩(wěn)定性良好的原因。圖7顯示本發(fā)明所使用的交聯(lián)劑原花青素在濃度為125μg/ml以下時(shí)對(duì)瓣膜間質(zhì)細(xì)胞的增殖潛力沒(méi)有抑制，甚至反有促進(jìn)，在濃度大于250μg/ml時(shí)細(xì)胞數(shù)量小于初時(shí)接種數(shù)，表現(xiàn)有毒性；而戊二醛直到濃度為0.0313μg/ml時(shí)才對(duì)瓣膜間質(zhì)細(xì)胞的增殖潛力沒(méi)有抑制，濃度為0.313μg/ml時(shí)已有明顯抑制，在濃度大于2.5μg/ml時(shí)細(xì)胞數(shù)量小于初時(shí)接種數(shù)，表現(xiàn)有毒性。該結(jié)果顯示原花青素對(duì)瓣膜間質(zhì)細(xì)胞的增殖潛力抑制較戊二醛小40000倍(125∶0.0313)，毒性小100倍(250∶2.5)。殘余交聯(lián)劑原花青素在4天內(nèi)的釋放量在其毒性范圍以下，無(wú)任何毒性。
實(shí)施例2脫細(xì)胞豬心臟主動(dòng)脈瓣膜制備方法按前述方法制備，以每片瓣膜加2ml的比例加入D-Hanks溶液浸泡瓣膜，在37℃下、以240rpm搖動(dòng)清洗0.5小時(shí)。然后以每片瓣膜加20ml的比例加入0.0625mg/ml原花青素的D-Hanks溶液浸泡，以120rpm的搖動(dòng)速度，4℃下交聯(lián)120小時(shí)。再以每片瓣膜加2ml的比例加入D-Hanks溶液浸泡瓣膜，在37℃下、以240rpm搖動(dòng)清洗24小?？梢灾频帽景l(fā)明的人工生物瓣瓣膜材料，其最大抗拉強(qiáng)度為8.8MPa，酶降解率為14.69％，交聯(lián)劑可在1天內(nèi)基本釋放且無(wú)任何毒性。圖8中瓣膜1和2顯示交聯(lián)完成后不皺縮，穩(wěn)定性良好，可保存在4℃下或37℃下D-Hanks溶液中至少45天。
實(shí)施例3脫細(xì)胞豬心臟主動(dòng)脈瓣膜制備方法按前述方法制備，以每片瓣膜加8ml的比例加入D-Hanks溶液浸泡瓣膜，在37℃下、靜止不搖動(dòng)(0rpm)狀態(tài)下清洗96小時(shí)。然后以每片瓣膜加10ml的比例加入0.625mg/ml原花青素的D-Hanks溶液浸泡，以120rpm的搖動(dòng)速度，4℃下交聯(lián)144小時(shí)。以每片瓣膜加8ml的比例加入D-Hanks溶液浸泡瓣膜，在4℃下、手工晃動(dòng)清洗10分鐘。這樣所制得的本發(fā)明的人工生物瓣瓣膜材料，作前述性能評(píng)價(jià)，其最大抗拉強(qiáng)度為11.6MPa，酶降解率為9.24％，交聯(lián)劑可在1天內(nèi)基本釋放且無(wú)任何毒性。圖8中瓣膜3和4顯示交聯(lián)完成后不皺縮，穩(wěn)定性良好，可保存在4℃下或37℃下D-Hanks溶液中至少45天。
實(shí)施例4脫細(xì)胞豬心臟主動(dòng)脈瓣膜制備方法按實(shí)施例3方法制備、清洗。然后以每片瓣膜加2ml的比例加入10mg/ml原花青素的D-Hanks溶液浸泡，以120rpm的搖動(dòng)速度，37℃下交聯(lián)3分鐘。再以每片瓣膜加2ml的比例加入D-Hanks溶液浸泡瓣膜，在37℃下、120rpm搖動(dòng)清洗1小時(shí)。也可制得本發(fā)明的人工生物瓣瓣膜材料，其最大抗拉強(qiáng)度為9.4Mpa，酶降解率為8.98％，交聯(lián)劑可在1天內(nèi)基本釋放且無(wú)任何毒性。圖8中瓣膜6顯示交聯(lián)完成后不皺縮，穩(wěn)定性良好，可保存在4℃下或37℃下D-Hanks溶液中至少45天。
實(shí)施例5脫細(xì)胞豬心臟主動(dòng)脈瓣膜制備方法按實(shí)施例3方法制備、清洗。然后以每片瓣膜加20ml的比例加入5mg/ml原花青素的D-Hanks溶液浸泡，以120rpm的搖動(dòng)速度，37℃下分別交聯(lián)0.5、1、3和7小時(shí)。再按實(shí)施例3方法作交聯(lián)后清洗。也可制得本發(fā)明的人工生物瓣瓣膜材料，其最大抗拉強(qiáng)度為9.4Mpa，酶降解率為8.89％，交聯(lián)劑可在1天內(nèi)基本釋放且無(wú)任何毒性。圖9顯示交聯(lián)完成后不皺縮，穩(wěn)定性良好，可保存在4℃下或37℃下D-Hanks溶液中至少45天。
權(quán)利要求
1.一種具有生物活性的人工生物瓣瓣膜的制備方法，包括交聯(lián)前處理、交聯(lián)和交聯(lián)后處理及保存，其特征在于采用原花青素作為聯(lián)劑交聯(lián)脫細(xì)胞心臟瓣膜，其方法是按每片瓣膜浸泡于1-20ml，含原花青素為0.01-20mg/ml的D-Hanks液溶液，作脫細(xì)胞心臟瓣膜交聯(lián)；交聯(lián)脫細(xì)胞心臟瓣膜的溫度1-40℃，交聯(lián)在搖床搖動(dòng)條件下完成，其搖動(dòng)速度為10-300rpm，交聯(lián)時(shí)間為1分鐘-240小時(shí)；所述的D-Hanks為無(wú)Ca+、Mg+的離子的磷酸緩沖溶液，其組成為KCl 0.4g/L，KH2PO440.06g/L，NaCl 8.00g/L，NaHCO30.35g/L，Na2HPO4·7H2O 0.09g/L，酚紅0或0.01g/L。
2.按權(quán)利要求1所述的具有生物活性的人工生物瓣瓣膜的制備方法，其特征在于按每片瓣膜浸泡于1-10ml的含原花青素為0.06-10mg/ml的無(wú)Ca+、Mg+的離子的磷酸緩沖溶液。
3.按權(quán)利要求1所述的具有生物活性的人工生物瓣瓣膜的制備方法，其特征在于交聯(lián)前處理包含心臟瓣膜原材料收集與脫細(xì)胞處理和前處理，步驟是(a)清洗在屠宰場(chǎng)將剛宰殺的豬心臟內(nèi)主動(dòng)脈瓣膜或肺動(dòng)脈瓣膜連同周?chē)芗粝?，置于無(wú)Ca2+、Mg2+離子的磷酸緩沖溶液中于4℃下1小時(shí)內(nèi)帶回，并剪取瓣膜葉片，用D-Hanks液清洗干凈；(b)脫細(xì)胞脫細(xì)胞液分A液和B液，都以D-Hanks液為基配制。瓣膜分兩步脫細(xì)胞，第一步用A液，第二步用B液；每一步均按每片瓣膜加入2-20ml的比例加入；脫細(xì)胞液A液從以下三種溶液配方中的任選一種配方1，含0.05％或0.1％胰蛋白酶、0.02％乙二胺四乙酸二鈉；配方2，含0.05％或0.1％胰蛋白酶、0.5％非離子去垢劑聚乙二醇辛基苯基醚、0.5％脫氧膽酸鈉和0.02％乙二胺四乙酸二鈉；配方3，含0.5％聚乙二醇辛基苯基醚、0.5％脫氧膽酸鈉和0.02％乙二胺四乙酸二鈉；配方1，2和3中百分?jǐn)?shù)為每100ml中所含的質(zhì)量數(shù)。脫細(xì)胞液B液配方為D-Hanks液配制的20μg/ml的核酸酶和0.2mg/ml的脫氧核酸酶混合液；脫細(xì)胞的工藝處理?xiàng)l件是溫度為1-40℃，搖床搖動(dòng)速度為0-300rpm，空氣濕度為30％-95％，CO2濃度為0.3％-5％，時(shí)間為10分鐘-100小時(shí)。
4.按權(quán)利要求1或3所述的具有生物活性的人工生物瓣瓣膜的制備方法，其特征在于脫細(xì)胞工藝處理溫度為20-37℃，搖床搖動(dòng)溫度120-240rpm，空氣溫度為50-95％，時(shí)間為1-48小時(shí)。
5.按權(quán)利要求1所述的具有生物活性的人工生物瓣瓣膜的制備方法，其特征在于交聯(lián)過(guò)后以每片瓣膜加2-20ml的比例加入D-Hanks的溶液浸泡瓣膜，清洗0-480小時(shí)，清洗是在0-40℃、搖床在0-300rpm搖動(dòng)條件下完成。
6.按權(quán)利要求1或5所述的具有生物活性的人工生物瓣瓣膜的制備方法，其特征在于交聯(lián)后清洗時(shí)間為5分鐘-1小時(shí)，清洗溫度20-37℃，搖床速度為60-120rpm。
7.按權(quán)利要求1所述的具有生物活性的人工生物瓣瓣膜的制備方法，其特征在于清洗后瓣膜保存在1-10℃的D-Hanks溶液中。
8.按權(quán)利要求1或7所述的具有生物活性的人工生物瓣瓣膜的制備方法，其特征在于清洗后瓣膜保存在4℃的D-Hanks溶液中。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種人工生物瓣瓣膜的制備方法，屬于生物材料領(lǐng)域。本發(fā)明以動(dòng)物或人異體心臟瓣膜為原料，以化學(xué)方法脫去動(dòng)物或人異體心臟瓣膜的細(xì)胞，得到脫細(xì)胞瓣膜的胞外基質(zhì)材料。將此材料浸入不同濃度、不同比例的原花青素溶液中，在適當(dāng)溫度條件下，搖動(dòng)交聯(lián)，從而得到無(wú)毒性、不皺縮的人工生物瓣瓣膜材料，用作制備臨床心臟瓣膜置換、修復(fù)和再生。本發(fā)明方法可通過(guò)調(diào)節(jié)交聯(lián)劑原花青素溶液的濃度、交聯(lián)的時(shí)間和清洗時(shí)間等，實(shí)現(xiàn)交聯(lián)的力學(xué)強(qiáng)度、抗酶解能力、交聯(lián)劑釋放、促進(jìn)組織再生能力等方面的可調(diào)控。本發(fā)明工藝簡(jiǎn)單易行，且便于推廣。
文檔編號(hào)A61F2/24GK1775304SQ20051011095
公開(kāi)日2006年5月24日 申請(qǐng)日期2005年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月30日
發(fā)明者常江, 翟萬(wàn)銀 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海硅酸鹽研究所