專利名稱：乙型肝炎病毒前s1區(qū)多表位抗原的基因克隆及其編碼序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種乙型肝炎病毒前S1區(qū)(PreS1)多表位抗原的基因克隆pres1me及其編碼蛋白PRES1ME與它們在乙肝疫苗制備及乙型肝炎病毒前S1抗體或抗原診斷中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus，HBV)的感染是一個很嚴重的全球性的健康問題。在中國、東南亞及非洲等高發(fā)地區(qū)，約有10％人口感染或曾經(jīng)感染過HBV。HBV基因組包括4個互相具有不同程度重疊的開放閱讀框架(ORF)。ORF-S編碼乙肝表面抗原主蛋白、中蛋白和大蛋白，它們分別由同一閱讀框內(nèi)的3個不同部位的ATG起始編碼，因而具有相同的C末端。大蛋白在中蛋白起始密碼子上游開始翻譯，它比中蛋白分子的N端多一段長度為119或108個氨基酸序列的PreS1區(qū)域。
乙肝PreS1區(qū)域為乙型肝炎病毒(HBV)外膜蛋白的重要組成部分，主要存在于Dane顆粒和管型顆粒上，參與HBV的組裝、分泌和侵入肝細胞的機制，在HBV感染肝細胞和機體免疫應(yīng)答方面起重要作用[參見Ryu CJ.等人，JMed Virol，52(2)226-233(1997)]。有研究表明，PreS1抗體的產(chǎn)生對于乙肝急性感染的恢復(fù)和慢性乙肝患者病情的緩解具有重要意義[分別參見Wei J.等人，World J Gastroenterol，8(2)276-281(2002)；Wei J.等人，Clin ChimActa，317(1-2)159-169(2002)；Budkowska A.等人，Hepatology，6(3)360-383(1986)]。PreS1區(qū)域高度親水，不含Cys殘基，不存在二硫鍵，因此用PreS1部分序列的合成肽或基因表達產(chǎn)物來研究該區(qū)域表位及其相關(guān)抗體成為可能。PreS1(21～47aa)肽段是HBV特異性結(jié)合肝細胞的主要位點，同時，PreS1序列中含有豐富的T細胞與B細胞表位，其中相當一部分位于21～47aa區(qū)域，因而PreS1(21～47aa)區(qū)段具有良好的免疫原性，在HBV感染早期就能誘導(dǎo)產(chǎn)生相應(yīng)抗體[分別參見Neurath AR.等人，Cell，46(3)429-436(1986)；Hui J.等人，Vaccine，17(13-14)1711-1718(1999)]?？筆reS1(21～47aa)抗體參與病毒的清除和中和，具有保護作用，被認為是預(yù)示乙肝患者康復(fù)的重要標志，因此，抗PreS1(21～47aa)抗體的檢測具有重要的臨床診斷意義。
除此之外，眾多文獻也對PreS1中的抗原表位進行了報道，其中ad型PreS1中可能含B細胞表位的區(qū)段主要有preS1(16-27)，preS1(32-53)，preS1(41-53)，preS1(94-105)和preS1(106-117)[參見Milich DR.等人，JImmunol，138(12)4457-4465(1987)]，pres1(30-35)[參見Kuttner G.等人，Mol Immunol，36(10)669-683(1999)]，preS1(19-26)和preS1(37-45)[參見Maeng CY.等人，Virology，270(1)9-16(2000)]，preS1(37-43)[參見Pizarro JC.等人，F(xiàn)EBS Lett，509(3)463-468(2001)]，preS1(12-52)[參見Petre J.等人，Arch Virol Suppl，4137-141(1992)]，preS1(1-42)[參見Prange R.等人，J Gen Virol，76(Pt 9)2131-2140(1995)]，preS1(27-35)和preS1(72-78)[參見Kuroki K.等人，Virology，176(2)620-624(1990)]，preS1(34-59)[參見Hu WG.等人，Acta Biochimica et BiophysicaSinica，36(6)397-404(2004)]，ay型Pres1中可能含B細胞表位的區(qū)段主要有preS1(37-43)[參見Pizarro JC.等人，F(xiàn)EBS Lett，509(3)463-468(2001)]，這些表位均被嘗試用于新型乙肝疫苗的研制以及PreS1抗體的檢測等研究中。
抗PreS1抗體檢測的方法已有相關(guān)文獻報道[分別參見Theilmann L.等人，Hepatology，6(2)186-190(1986)；Alberti A.等人，Hepatology，12(2)199-203(1990)]，基本上是以人工合成PreS1肽段作為包被抗原的間接ELISA，但往往在靈敏度、穩(wěn)定性等方面尚有不足之處。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于克服上述不足之處，研究設(shè)計更有效的乙型肝炎病毒前S1區(qū)多表位抗原的基因克隆及其編碼序列。
本發(fā)明提供一種乙型肝炎病毒前S1區(qū)多表位抗原的基因克隆pres1me及其編碼序列PRES1ME。
本發(fā)明構(gòu)建的pres1me包含了HBV基因組Pres1區(qū)中B細胞表位基因4條。各表位的氨基酸序列見序列表1(SEQ ID NO.1)。
1.本發(fā)明將各表位之間以七個氨基酸的編碼序列為接頭，通過PCR方法合成由上述4條表位基因串聯(lián)而成的多表位抗原的基因克隆。但各表位抗原基因的設(shè)計，是采用大腸桿菌偏性密碼子并適當應(yīng)用畢赤酵母偏性密碼子，以便既可在原核細胞中表達，也可在真核細胞中表達。表位之間接頭的設(shè)計，采用各表位之間為甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-絲氨酸-絲氨酸-絲氨酸，以使各表位相對獨立。
pres1me的核苷酸序列如下atgccattaggtttcttcccagaccaccaattagacccagctttcggtgctaactctaacaacccagacttcaacttcggtgccggtgcctcttcctccccattaggtttcttcccagaccaccaattcgacccagctttcaaagctaactctgacaacccagactccgacttcaacttcggtgccggtgcctcttcctccggtggtttattaggttggtctggtgccggtgcctcttcctccttcggtgctaactctaacaacccagactgggacttcaacttcaacaaagaccactggccagaagctaaccaagttggttag。
本發(fā)明的另一目的是提供了乙型肝炎病毒前S1區(qū)多表位抗原基因克隆pres1me的構(gòu)建，采用混合PCR合成基因和酶切、連接相結(jié)合的方法，包括如下步驟1、合成相應(yīng)的9條寡核苷酸片段，這26條寡核苷酸片段中分別有相應(yīng)片段在5′端和3′端彼此互補。其中5′端互補的片段編號分別為2號和3號、4號和5號、6號和7號、8號和9號；3′端互補的片段編號分別1號和2號、3號和4號、5號和6號、7號和8號；9條寡核苷酸片段的核苷酸序列見序列表2(SEQ ID NO.2)，該9條寡核苷酸片段既是引物也是模板。
2、用混合PCR方法，將序列表2中9條寡核苷酸片段合成本發(fā)明全長基因克隆pres1me；將pres1me與原核或真核重組表達載體連接并轉(zhuǎn)化相應(yīng)菌株或細胞后，可表達pres1me編碼的蛋白PRES1ME。
PRES1ME的氨基酸序列如下METProLeuGlyPhePheProAspHisGlnLeuAspProAlaPheGlyAlaAsnSerAsnAsnProAspPheAsnPheGlyAlaGlyAlaSerSerSerProLeuGlyPhePheProAspHisGlnPheAspProAlaPheLysAlaAsnSerAspAsnProAspSerAspPheAsnPheGlyAlaGlyAlaSerSerSerGlyGlyLeuLeuGlyTrpSerGlyAlaGlyAlaSerSerSerPheGlyAlaAsnSerAsnAsnProAspTrpAspPheAsnPheAsnLysAspHisTrpProGluAlaAsnGlnValGly。
本發(fā)明的乙型肝炎病毒前S1區(qū)多表位抗原基因克隆pres1me及其編碼蛋白PRES1ME具有如下特點1、應(yīng)用大腸桿菌偏性密碼子并兼顧應(yīng)用畢赤酵母偏性密碼子來設(shè)計基因，使pres1me基因在原核和真核細胞中都能得到有效表達，為規(guī)模型生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。
2、各表位之間用甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-絲氨酸-絲氨酸-絲氨酸分開，為各表位都能被有效提呈提供了條件。
3、利用乙型肝炎病毒前S1區(qū)多表位抗原基因克隆，可以研制多種乙肝肝病毒前S1區(qū)抗體或抗原的檢測試劑，用于HBV患者的診斷，可以研制多種形式、兼有防治功能的乙型肝炎侯選疫苗，用于HBV感染的防治。


圖1.pMD-PRES1ME重組質(zhì)粒結(jié)構(gòu)示意2.pres1me基因合成示意3.重組質(zhì)粒pMD-PRES1ME的構(gòu)建流程4.原核融合表達質(zhì)粒pGEX-PRES1ME的構(gòu)建流程5.鼠抗GST-PRES1ME血清與4條Pres1區(qū)表位合成肽及基因工程表達的乙肝前S1蛋白的交叉反應(yīng)性圖具體實施方式
乙型肝炎病毒前S1區(qū)多表位抗原基因克隆(pres1me)的具體構(gòu)建方法如下一、合成pres1me基因所需的9條寡核苷酸片段(見SEQ ID NO.2，由上海申能博彩生物技術(shù)公司合成)。
二、9條寡核苷酸片段既是引物也是模板，經(jīng)PCR反應(yīng)合成乙型肝炎病毒前S1區(qū)多表位抗原基因，PCR合成和拼接反應(yīng)均應(yīng)用ExpandTM Long TemplatePCR系統(tǒng)。
pres1me基因的合成(圖2)1-9號寡核苷酸片段(30μM) 各0.5μldNTP(10mM) 2.0μl10×PCR buffer 5.0μlDNA聚合酶混合液(10單位/μl) 1.0μl滅菌重蒸水 35μl按下述條件進行PCR反應(yīng)94℃30秒、65℃30秒、74℃1分鐘，進行35個循環(huán)，然后74℃延伸10分鐘。
三、按常規(guī)將PCR合成后純化的pres1me基因與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，涂布Amp+瓊脂培養(yǎng)平板，37℃過夜，挑取8個克隆進行小量質(zhì)粒抽提，所得質(zhì)粒經(jīng)酶切及1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定，確認獲得陽性克隆。重組質(zhì)粒命名為pMD-PRES1ME。(圖3)四、取pMD-PRES1ME質(zhì)粒進行核苷酸序列測定。結(jié)果表明，pres1me基因全長324bp，其核苷酸序列及相應(yīng)的氨基酸序列分別見序列表3和序列表4(SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4)，與所設(shè)計的序列相同。
乙型肝炎病毒前S1區(qū)多表位抗原基因(pres1me)同gst基因融合表達一、構(gòu)建原核融合表達質(zhì)粒pGEX-PRES1ME重組質(zhì)粒pMD-PRES1ME經(jīng)BamHI/SalI雙酶切后，回收目的片段。原核融合表達載體pGEX-4T-1經(jīng)BamHI/SalI雙酶切后，回收載體片段。兩個片段在DNA連接酶作用下于16℃連接過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，涂布Amp+瓊脂培養(yǎng)平板，37℃過夜，挑取16個克隆進行小量質(zhì)粒抽提，用BamHI/SaI酶切及1％瓊脂糖凝膠電泳，鑒定出陽性克隆。重組質(zhì)粒命名為pGEX-PRES1ME。(圖4)二、篩選高效表達克隆從上述鑒定出的pGEX-PRES1ME陽性克隆中挑取6株菌，用轉(zhuǎn)入空白載體pGEX-4T-1的2株菌作對照，分別在3mL的LB培養(yǎng)基中37℃擴增12h，加入IPTG(異丙基硫代半乳糖苷)至終濃度為0.1mmol/L誘導(dǎo)3h。誘導(dǎo)結(jié)束后各取1mL菌液，常規(guī)處理及7.5％PAGE電泳檢測，根據(jù)肉眼觀察電泳條帶中目的蛋白條帶濃度來篩選高效表達克隆。
三、優(yōu)化誘導(dǎo)表達條件用上述篩選獲得的高效表達株進一步實驗優(yōu)化誘導(dǎo)表達條件。首先，確定誘導(dǎo)的菌液濃度，在3mL的LB培養(yǎng)基中，新鮮過夜培養(yǎng)菌液按1∶100接種，于37℃培養(yǎng)，高速振搖280rpm/min，取不同時間點測定OD600值，在不同OD600值下以0.1mmol/L IPTG誘導(dǎo)3h，收集菌液1mL，檢測蛋白表達情況。而后，確定IPTG誘導(dǎo)的溫度，以菌液OD600約為1.0時開始誘導(dǎo)，分別在20℃、25℃、28℃、30℃及37℃誘導(dǎo)3h，收集菌液1mL，檢測蛋白表達量。而后，在菌液OD600約為1.0，誘導(dǎo)溫度28℃，IPTG濃度0.1mmol/L條件下，確定誘導(dǎo)時間，取誘導(dǎo)1h、2h、3h及4h的菌液1mL，檢測蛋白表達量。最終確定菌液OD600＝1.0、溫度為28℃、IPTG濃度為0.1mmol/L、誘導(dǎo)時間為3h為最佳誘導(dǎo)表達條件。
四、融合蛋白GST-PRES1ME的大量表達和親和層析純化應(yīng)用上述確定的誘導(dǎo)表達條件，并優(yōu)化超聲破碎條件和洗脫條件來大量獲得融合蛋白GST-PRES1ME。具體步驟將重組菌劃Amp+瓊脂培養(yǎng)平板，37℃過夜。挑取單克隆菌落在10mL的LB培養(yǎng)基中37℃擴增12h，而后，按1∶100接種稀釋接種于預(yù)熱的LB培養(yǎng)基中，高速振搖2h，加入IPTG至終濃度為0.1mmol/L，于28℃誘導(dǎo)3h。用8000rpm/min×10min 4℃離心收集菌體，對應(yīng)1mL菌液用50μL冰預(yù)冷的1×PBS懸浮細菌，在冰浴中進行超聲破碎，取少量嘗試在破碎時分別加入溶菌酶或加入TritonX-100或加入DTT輔助破碎。而后，破碎液內(nèi)加入20％的TritonX-100至終濃度1％，室溫下低速振蕩30min，溶解蛋白。用12000rpm/min×10min 4℃離心后將上清轉(zhuǎn)移到干凈的器皿中，即為胞漿蛋白提取液。用1×PBS平衡10mL的Glutathione SepharoseTM 4B后，加入上述胞漿蛋白提取液，控制流速1mL/min，用10倍柱床體積的1×PBS洗至基線后，用10mmol/L的還原性谷胱甘肽(溶于50mmol/L Tris-HCl，pH8.0)，洗脫GST-PRES1ME蛋白。蛋白經(jīng)透析除鹽、冷凍干燥后，用純水溶解，用Bradford法測定濃度pres1me同gst基因融合表達產(chǎn)物GST-PRES1ME的免疫原性研究一、GST-PRES1ME與乙肝前S1抗原ELISA檢測試劑盒的反應(yīng)性所用乙肝前S1抗原ELISA檢測試劑盒為上海復(fù)星長征醫(yī)學(xué)科學(xué)有限公司產(chǎn)品。將GST-PRES1ME蛋白用PBS稀釋為1mg/ml、0.1mg/ml、0.01mg/ml三種不同濃度，用乙肝前S1抗原ELISA檢測試劑盒進行檢測，同時選用1mg/ml、0.1mg/ml、0.01mg/ml三種不同濃度的GST蛋白為對照。具體操作步驟見試劑盒說明書。
結(jié)果見表1表1、GST-PRES1ME與乙肝前S1抗原ELISA檢測試劑盒的反應(yīng)結(jié)果

二、GST-PRES1ME與乙肝患者血清的反應(yīng)性用ELISA方法檢測。方法是以純化的GST-PRES1ME包被酶標板，檢測160例臨床血清標本。具體步驟如下1、包被純化的GST-PRES1ME用包被液稀釋為0.5mg/ml，加100μg/孔，于4℃包被過夜。
2、封閉棄掉包被液，拍干，加封閉液200μl/孔，4℃封閉過夜。
3、準備棄掉封閉液，將板條置于室溫干燥過夜。
4、加樣用樣品稀釋液按1∶10稀釋待測血清，按100μl/孔加入檢測孔中，以樣品稀釋液作為空白對照，所有檢測均設(shè)復(fù)孔。
5、孵育粘上封板紙，置37℃恒溫反應(yīng)30分鐘。
6、洗板用洗板機洗板五次，拍干。
7、酶標每孔加酶標二抗工作液(HRP-羊抗人IgG 1∶1000稀釋)100μl，粘上封板紙，置37℃恒溫反應(yīng)30分鐘。
8、洗板同前(6)。
9、顯色每孔加TMB顯色劑A、B各50μl，37℃避光顯色10-15分鐘。
10、終止每孔中加終止液50μl，輕輕混勻，終止反應(yīng)。
11、比色測雙波長OD450nm/630nm，空白孔校零，酶標檢測儀測光吸收值。
12、結(jié)果判定OD待測樣本≥0.105時為陽性；反之為陰性。
結(jié)果見表2表2、GST-PRES1ME與乙肝患者血清的反應(yīng)性

由表2數(shù)據(jù)計算可知用GST-PRES1ME進行血清中前S1抗體檢測時，在乙肝患者血清(以乙肝兩對半五項指標出現(xiàn)任何一項陽性為標準)中的檢出率為41.1％，在非乙肝患者(以乙肝兩對半五項指標全陰為標準)中的檢出率為0，具有良好的靈敏度和特異性。
三、抗GST-PRES1ME與4條Pres1區(qū)表位合成肽及基因工程表達的Pres1蛋白的反應(yīng)性1、動物免疫及免疫血清的收集①制備GST-PRES1ME乳化液將純化的GST-PRES1ME經(jīng)干燥后用純水溶解，調(diào)整蛋白濃度為0.2μg/μ1，加入等體積的完全弗氏佐劑(首次接種時)和不完全弗氏佐劑(加強免疫時)后，用超聲破菌器在100w功率下，冰水浴中多次乳化(一次乳化2mL，共需10次左右)，取乳化后液體5～10μl滴入冷水中，油滴浮于水面而不分散者為乳化完全。
②免疫動物免疫用BALB/c小鼠購于上海第二軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心，雄性，健康6周齡。將小鼠背部皮膚酒精消毒，選擇3～4個部位分別注射乳化液0.1～0.5ml/處，接種劑量為首次注射0.1mg/只·次，加強注射為0.04mg/只·次，0、3、6周各接種一次，同時設(shè)PBS免疫對照組，每組小鼠各為6只。分別于0、2、5、8、11、14、20、40周采血，血液置室溫中凝固約1h，然后置4℃過夜進一步收縮血塊，第2天4℃下10000rpm/min×10min，收集上清液即為血清，并及時分裝凍存。
2、鼠抗GST-PRES1ME血清與Pres1區(qū)表位合成肽及基因工程表達的Pres1蛋白的反應(yīng)性以4條不同的Pres1區(qū)合成肽[氨基酸序列見(SEQ ID NO.4)]及原核表達的Pres1蛋白分別包被Immunuoplate Maxisorp檢測板，應(yīng)用ELISA方法檢測免疫小鼠血清中是否含有特異識別4條Pres1區(qū)表位合成肽及Pres1蛋白的特異性抗體(結(jié)果見圖5)。由圖可以看出，4條肽及Pres1蛋白均可被鼠抗GST-PRES1ME血清識別。此結(jié)果提示，GST-PRES1ME中所包含的4條表位均能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，此抗體能特異識別前S1抗原，預(yù)示其作為疫苗應(yīng)用時，可能具有誘導(dǎo)保護性抗體的能力。
由以上結(jié)果表明，本發(fā)明乙型肝炎病毒多表位抗原的基因克隆pres1me及其編碼的蛋白PRES1ME，可用于制備HBV前S1抗體或抗原的檢測試劑，也可用于制備HBV核酸疫苗及多肽疫苗。
SEQUENCE LISTING<110>上海復(fù)星長征醫(yī)學(xué)科學(xué)有限公司<120>SEQ ID NO.1<130>專利說明書<160>4<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>27<212>PRT<213>Hepatitis B virus<400>1Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp Pro Ala Phe Gly Ala1 5 10 15Asn Ser Asn Asn Pro Asp Trp Asp Phe Asn Pro20 25<210>2<211>27<212>PRT<213>Hepatitis B virus<400>2
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<110>上海復(fù)星長征醫(yī)學(xué)科學(xué)有限公司<120>SEQ ID NO.2<130>專利說明書<160>9<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>51<212>DNA<213>Hepatitis B virus<400>1cggatccgaa ttcatgccat taggtttctt cccagaccac caattagacc c51<210>2<211>60<212>DNA<213>Hepatitis B virus<400>2aagttgaagt ctgggttgtt agagttagca ccgaaagctg ggtctaattg gtggtctggg60<210>3<211>59<212>DNA<213>Hepatitis B virus
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<110>上海復(fù)星長征醫(yī)學(xué)科學(xué)有限公司<120>SEQ ID NO.3<130>專利說明書<160>1<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>324<212>DNA<213>Hepatitis B virus<400>1atgccattag gtttcttccc agaccaccaa ttagacccag ctttcggtgc taactctaac60aacccagact tcaacttcgg tgccggtgcc tcttcctccc cattaggttt cttcccagac120caccaattcg acccagcttt caaagctaac tctgacaacc cagactccga cttcaacttc180ggtgccggtg cctcttcctc cggtggttta ttaggttggt ctggtgccgg tgcctcttcc240tccttcggtg ctaactctaa caacccagac tgggacttca acttcaacaa agaccactgg300ccagaagctaaccaagttggttag324
<110>上海復(fù)星長征醫(yī)學(xué)科學(xué)有限公司<120>SEQ ID NO.4<130>專利說明書<160>1<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>107<212>PRT<213>Hepatitis B virus<400>1Met Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp Pro Ala Phe Gly1 5 10 15Ala Asn Ser Asn Asn Pro Asp Phe Asn Phe Gly Ala Gly Ala Ser Ser20 25 30Ser Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Phe Asp Pro Ala Phe Lys35 40 45Ala Asn Ser Asp Asn Pro Asp Ser Asp Phe Asn Phe Gly Ala Gly Ala50 55 60
Ser Ser Ser Gly Gly Leu Leu Gly Trp Ser Gly Ala Gly Ala Ser Ser65 70 75 80Ser Phe Gly Ala Asn Ser Asn Asn Pro Asp Trp Asp Phe Asn Phe Asn85 90 95Lys Asp His Trp Pro Glu Ala Asn Gln Val Gly100 10權(quán)利要求
1.一種乙型肝炎病毒前S1區(qū)多表位抗原的基因克隆pres1me，其特征在于它包含了HBV基因組前S1區(qū)中B細胞表位區(qū)段4段，各表位區(qū)段基因之間以甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-絲氨酸-絲氨酸-絲氨酸的編碼序列為接頭串聯(lián)而成，pres1me的核苷酸序列如下atgccattaggtttcttcccagaccaccaattagacccagctttcggtgctaactctaacaacccagacttcaacttcggtgccggtgcctcttcctccccattaggtttcttcccagaccaccaattcgacccagctttcaaagctaactctgacaacccagactccgacttcaacttcggtgccggtgcctcttcctccggtggtttattaggttggtctggtgccggtgcctcttcctccttcggtgctaactctaacaacccagactgggacttcaacttcaacaaagaccactggccagaagctaaccaagttggttag。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種乙型肝炎病毒前S1區(qū)多表位抗原的基因克隆pres1me，其特征在于其編碼蛋白PRES1ME的氨基酸序列如下METProLeuGlyPhePheProAspHisGlnLeuAspProAlaPheGlyAlaAsnSerAsnAsnProAspPheAsnPheGlyAlaGlyAlaSerSerSerProLeuGlyPhePheProAspHisGlnPheAspProAlaPheLysAlaAsnSerAspAsnProAspSerAspPheAsnPheGlyAlaGlyAlaSerSerSerGlyGlyLeuLeuGlyTrpSerGlyAlaGlyAlaSerSerSerPheGlyAlaAsnSerAsnAsnProAspTrpAspPheAsnPheAsnLysAspHisTrpProGluAlaAsnGlnValGly。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種乙型肝炎病毒前S1區(qū)多表位抗原的基因克隆pres1me在制備HBV核酸疫苗或多肽疫苗中的應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種乙型肝炎病毒前S1區(qū)多表位抗原的基因克隆pres1me的編碼蛋白在制備HBV前S1抗體或抗原的檢測試劑中的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種乙型肝炎病毒前S1區(qū)多表位抗原的基因克隆pres1me的編碼蛋白在制備HBV多肽疫苗中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，本發(fā)明公開了乙型肝炎病毒前S1區(qū)(PreS1)多表位抗原的基因克隆pres1me及其編碼序列PRES1ME。pres1me包含了HBV基因組前S1區(qū)中B細胞表位區(qū)段4段，經(jīng)研究表明，它與gst基因的原核融合表達產(chǎn)物GST－PRES1ME與乙肝前S1抗原ELISA檢測試劑盒的反應(yīng)結(jié)果為陽性，用其制備ELISA板后可在乙肝血清中檢測出乙肝前S1抗體，GST－PRES1ME免疫小鼠后的血清能特異識別四條Pres1表位合成肽及前S1全長蛋白。因此，pres1me及其表達產(chǎn)物PRES1ME可用于制備HBV前S1抗體或抗原的檢測試劑及乙肝疫苗。
文檔編號A61P31/00GK1990874SQ20051011238
公開日2007年7月4日 申請日期2005年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月30日
發(fā)明者龔育平 申請人:上海復(fù)星長征醫(yī)學(xué)科學(xué)有限公司