專利名稱：可用于治療艾滋病的重組表達(dá)載體、經(jīng)改造的造血干細(xì)胞和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因治療領(lǐng)域，特別是可用于治療艾滋病的重組表達(dá)載體、經(jīng)改造細(xì)胞(特別是造血干細(xì)胞)和方法。
背景技術(shù)：
當(dāng)前，對(duì)艾滋病毒(HIV)感染的治療手段主要是高強(qiáng)度的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療，該療法聯(lián)合使用針對(duì)病毒逆轉(zhuǎn)錄酶和蛋白酶的抑制劑。不幸的是，HIV具有很高的突變率及復(fù)雜的致病機(jī)理，因此能夠逃避治療。由于HIV-1可以整合入細(xì)胞的基因組，病毒的基因組可長期存在于細(xì)胞之中。HIV-1在藥物治療之后仍可在攜帶HIV-1基因組的CD4+細(xì)胞再次激活擴(kuò)增。因此，需要發(fā)展新的治療手段對(duì)付HIV的感染。
長期以來，將目的基因?qū)肴祟愒煅杉?xì)胞(HSC)以治療人類疾病是眾多科學(xué)家和醫(yī)生期待實(shí)現(xiàn)的目標(biāo)。然而，由于難于對(duì)足夠數(shù)量的造血干細(xì)胞進(jìn)行靶基因的轉(zhuǎn)導(dǎo)，基因治療至今無法在血細(xì)胞疾病治療中得到應(yīng)用。最近，出現(xiàn)了一種用P140K突變的O6-甲基鳥嘌呤-DNA-甲基轉(zhuǎn)移酶基因(P140K O6-methylguanine-DNA-methyltransferase，MGMT[P140K])作為抗性基因轉(zhuǎn)導(dǎo)入細(xì)胞，然后用六氧苯甲基鳥嘌呤/卡莫司汀(O6-benzylguanine/1，3-bis(2-chloroethyl)-1-nitrosourea，BG/BCNU)殺死未帶抗性基因的血液干細(xì)胞的篩選方法。化療藥物卡莫司汀(BCNU)是一種潛在的干細(xì)胞毒素，骨髓抑制是臨床上觀察到的BCDU治療相關(guān)的劑量限制性毒性反應(yīng)。六氧苯甲基鳥嘌呤(BG)本身并不殺傷干細(xì)胞，但能使干細(xì)胞對(duì)BCNU易感。聯(lián)合使用BG和BCNU進(jìn)行治療可有效地在體內(nèi)清除造血干細(xì)胞。表達(dá)MGMT(P140K)的造血干細(xì)胞在體內(nèi)和體外對(duì)BG/BCNU聯(lián)合治療手段均呈現(xiàn)出抗性。基于以上原理，人們可以在體外改造血液干細(xì)胞，同時(shí)使其攜帶MGMT(P140K)基因。在這些改造好的血液干細(xì)胞移入體內(nèi)之后，使用BG/BCNU。BG/BCNU將除去那些不帶有MGMT(P140K)基因的血液干細(xì)胞，而攜帶MGMT(P140K)基因的血液干細(xì)胞將生存、擴(kuò)增，最終取代原來的血液干細(xì)胞。此原理的可行性已在包括狗在內(nèi)的大動(dòng)物實(shí)驗(yàn)得以證實(shí)。(Neff T等，臨床研究雜志，2003年，112卷1581-1588頁)。運(yùn)用非肥胖型糖尿病/嚴(yán)重免疫缺陷型小鼠(NOD/SCID小鼠)模型，人們已經(jīng)證明攜帶MGMT(P140K)基因的人的血液干細(xì)胞可以在體內(nèi)抗BG/BCNU毒性，從而生存、擴(kuò)增(Zielske SP等，臨床研究雜志，2003年，112卷1561-1570頁)。該選擇系統(tǒng)也可能可用于人類疾病治療，使基因治療得以在自體或異體骨髓移植中實(shí)現(xiàn)。
RNA干擾(RNAi)是一種抑制基因表達(dá)機(jī)制，通過21～23個(gè)核苷酸長度的雙鏈短干擾RNA(siRNA)介導(dǎo)mRNA的序列特異性降解。已證明靶向HIV-1mRNA的siRNA可在組織培養(yǎng)細(xì)胞中有效抑制HIV-1(Martinez MA等，免疫學(xué)趨勢(shì)，2002年，23卷559-561頁)。但不幸的是，在長期實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)HIV-1可對(duì)單一種類的siRNA抑制產(chǎn)生抗性(Das AT等，病毒學(xué)雜志，2004年，78卷2601-2605頁)。這也是由于HIV的高突變率造成的?？朔@一困難的一個(gè)途徑是采取一種聯(lián)合治療辦法，即將多個(gè)不同的抗HIV的 siRNA同時(shí)導(dǎo)入以避免抗性突變逃避。然而，目前尚沒有一種方法可以有效地同時(shí)向細(xì)胞中導(dǎo)入并表達(dá)多個(gè)siRNA。
因此，本領(lǐng)域需要改良的治療或改善HIV感染的方法。本發(fā)明滿足了這一需要，并提供了用于該目的和其它目的的重組表達(dá)載體、改造的細(xì)胞如造血干細(xì)胞等。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明一方面提供可表達(dá)多個(gè)siRNA和/或miRNAs和/或核酶和/或反義寡核苷酸的表達(dá)盒，其包含由共同的啟動(dòng)子(例如一個(gè)或幾個(gè)啟動(dòng)子)控制的、多個(gè)(特別是靶向HIV的)siRNA和/或 miRNAs和/或核酶和/或反義寡核苷酸的編碼核酸序列。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的表達(dá)盒中所述編碼核酸序列是通過在一個(gè)miRNA基因簇中將多個(gè)miRNA序列(例如miRNA17，18，19a，20，和19b-1)的編碼序列替換為多個(gè)siRNA和/或miRNAs和/或核酶和/或反義寡核苷酸的編碼核酸序列而獲得的。
另一方面，本發(fā)明提供重組表達(dá)載體，其可表達(dá)(1)MGMT(P140K)基因；和(2)多個(gè)(特別是靶向HIV的)siRNA和/或miRNAs和/或核酶和/或反義寡核苷酸。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明重組表達(dá)載體包含(1)MGMT(P140K)基因，該基因與表達(dá)控制序列可操作地連接，使得該基因可在動(dòng)物細(xì)胞(特別是哺乳動(dòng)物細(xì)胞，如人細(xì)胞，如哺乳動(dòng)物干細(xì)胞，優(yōu)選造血干細(xì)胞)中表達(dá)；和(2)多個(gè)(特別是靶向HIV的)siRNA和/或miRNAs和/或核酶和/或反義寡核苷酸的編碼核酸序列，這些編碼核酸序列與表達(dá)控制序列可操作地連接，使得可在動(dòng)物細(xì)胞(特別是哺乳動(dòng)物細(xì)胞，如人細(xì)胞，如哺乳動(dòng)物干細(xì)胞，優(yōu)選造血干細(xì)胞)中表達(dá)所述多個(gè)(特別是靶向HIV的)siRNA和/或miRNAs和/或核酶和/或反義寡核苷酸。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，重組表達(dá)載體中所述多個(gè)(特別是靶向HIV的)siRNA和/或miRNAs和/或核酶和/或反義寡核苷酸的編碼核酸序列由共同的啟動(dòng)子控制表達(dá)。
在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，上述重組表達(dá)載體中所述多個(gè)(特別是靶向HIV的)siRNA和/或miRNAs和/或核酶和/或反義寡核苷酸的編碼核酸序列是通過在一個(gè)miRNA基因簇中將多個(gè)miRNA序列(例如miRNA 17，18，19a，20，和19b-1)的編碼序列替換為多個(gè)siRNA和/或miRNAs和/或核酶和/或反義寡核苷酸的編碼核酸序列而獲得的。
本發(fā)明的重組表達(dá)載體可以是質(zhì)粒載體或病毒載體，例如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，包括慢病毒載體。優(yōu)選地，所述重組表達(dá)載體是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，更優(yōu)選慢病毒載體(如慢病毒Xiada-1)。
在再一個(gè)相關(guān)方面，本發(fā)明提供改造后的用于生產(chǎn)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(例如慢病毒載體，如慢病毒Xiada-1)的包裝載體(如包裝質(zhì)粒)，其含有突變后的POL和GAG基因，特別地，POL和GAG基因可相互獨(dú)立地具有如下突變GAG --------GAUUGUACUGAGAGACAGGCU------------突變?yōu)?-------GACTGCACAGAACGTCAAGCA------------POL ---------GGGGCAGUAGUAAUACAAGAU-----------突變?yōu)?--------GGCGCTGTTGTTATCCAGGAC-----------本發(fā)明還涉及轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)了本發(fā)明重組表達(dá)載體的分離的細(xì)胞，包括原核細(xì)胞(如細(xì)菌細(xì)胞，如大腸桿菌細(xì)胞)和真核細(xì)胞(如真菌細(xì)胞，昆蟲細(xì)胞，植物細(xì)胞，動(dòng)物細(xì)胞，優(yōu)選哺乳動(dòng)物如人的細(xì)胞)。
本發(fā)明還涉及包含上述細(xì)胞的組織和生物，如動(dòng)物，優(yōu)選非人哺乳動(dòng)物。本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的細(xì)胞的藥物組合物。
本發(fā)明還涉及轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)了本發(fā)明的包裝載體(如包裝質(zhì)粒)的分離的細(xì)胞。本發(fā)明還涉及包含上述細(xì)胞的組織和生物，如動(dòng)物，優(yōu)選非人哺乳動(dòng)物。
另一方面，本發(fā)明還涉及一種經(jīng)改造的細(xì)胞(包括動(dòng)物例如哺乳動(dòng)物優(yōu)選人的細(xì)胞，優(yōu)選干細(xì)胞，特別是造血干細(xì)胞，如CD34+細(xì)胞)，其可表達(dá)(1)MGMT(P140K)基因；和(2)多個(gè)(特別是靶向HIV的)siRNA和/或miRNAs和/或核酶和/或反義寡核苷酸。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的改造的細(xì)胞(包括動(dòng)物例如哺乳動(dòng)物優(yōu)選人的細(xì)胞，優(yōu)選干細(xì)胞，特別是造血干細(xì)胞，如CD34+細(xì)胞)在基因組中或者基因組外攜帶(1)MGMT(P140K)基因，該基因與表達(dá)控制序列可操作地連接，使得該基因可在該細(xì)胞中表達(dá)；和(2)多個(gè)(特別是靶向HIV的)siRNA和/或miRNAs和/或核酶和/或反義寡核苷酸的編碼核酸序列，這些編碼核酸序列與表達(dá)控制序列可操作地連接，使得可在該細(xì)胞中表達(dá)所述多個(gè)(特別是靶向HIV的)siRNA和/或miRNAs和/或核酶和/或反義寡核苷酸。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述改造細(xì)胞中所述多個(gè)(特別是靶向HIV的)siRNA和/或miRNAs和/或核酶和/或反義寡核苷酸的編碼核酸序列由共同的啟動(dòng)子控制表達(dá)。
在另一個(gè)獨(dú)立的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述改造細(xì)胞中所述多個(gè)(特別是靶向HIV的)siRNA和/或miRNAs和/或核酶和/或反義寡核苷酸的編碼核酸序列是通過在一個(gè)miRNA基因簇中將多個(gè)miRNA序列(例如miRNA17，18，19a，20，和19b-1)替換為多個(gè)siRNA和/或miRNAs和/或核酶和/或反義寡核苷酸的編碼核酸序列而獲得的。
本發(fā)明的改造細(xì)胞包括但不限于，動(dòng)物例如哺乳動(dòng)物優(yōu)選人的細(xì)胞，優(yōu)選干細(xì)胞，特別是造血干細(xì)胞，如CD34+細(xì)胞；優(yōu)選哺乳動(dòng)物優(yōu)選人的干細(xì)胞，特別是造血干細(xì)胞，如CD34+細(xì)胞。
本發(fā)明還涉及包含上述細(xì)胞的生物，如動(dòng)物，優(yōu)選非人哺乳動(dòng)物。
另一方面，本發(fā)明還涉及制備本發(fā)明改造細(xì)胞的方法，包括用本發(fā)明的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞(包括動(dòng)物例如哺乳動(dòng)物優(yōu)選人的細(xì)胞，優(yōu)選干細(xì)胞，特別是造血干細(xì)胞，如CD34+細(xì)胞)。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述方法包括用本發(fā)明重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(例如慢病毒載體，如慢病毒Xiada-1)轉(zhuǎn)導(dǎo)哺乳動(dòng)物優(yōu)選人的干細(xì)胞，特別是造血干細(xì)胞，如CD34+細(xì)胞。
在上述方法，所述細(xì)胞可以是分離的(或離體的)，例如從感染HIV的患者或者正常個(gè)體分離的，或者是在體的。
在另一方面，本發(fā)明提供治療HIV感染或者HIV患者的方法，包括(1)按照本發(fā)明的方法制備本發(fā)明的哺乳動(dòng)物優(yōu)選人的經(jīng)改造的細(xì)胞(優(yōu)選干細(xì)胞，最優(yōu)選造血干細(xì)胞，如CD34+細(xì)胞)，然后將其移植到HIV感染患者體內(nèi)；和(2)進(jìn)行適當(dāng)?shù)腂G/BCNU治療。
本發(fā)明還涉及本發(fā)明的經(jīng)改造的細(xì)胞(包括動(dòng)物例如哺乳動(dòng)物優(yōu)選人的細(xì)胞，優(yōu)選干細(xì)胞，特別是造血干細(xì)胞，如CD34+細(xì)胞)在制備治療HIV感染或者HIV患者中的藥物中的用途。
本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的經(jīng)改造的細(xì)胞的藥物組合物。
本發(fā)明還涉及本發(fā)明載體在制備本發(fā)明細(xì)胞中的用途。
本發(fā)明還涉及本發(fā)明載體和細(xì)胞用于治療HIV感染或者HIV患者的用途。
本發(fā)明還涉及(1)MGMT(P140K)基因和(2)多個(gè)(特別是靶向HIV的)siRNA和/或miRNAs和/或核酶和/或反義寡核苷酸的組合以及該組合在制備本發(fā)明載體、本發(fā)明細(xì)胞和用于治療HIV感染的細(xì)胞中的用途。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，如果適用的話，在本發(fā)明所有方面，所述MGMT(P140K)具有SEQ ID NO1所示的序列或與之具有至少70％(優(yōu)選至少80％、85％、90％、95％、98％或更高)一致性的序列。
在另外的優(yōu)選的實(shí)施方案中，如果適用的話，在本發(fā)明所有方面，所述siRNA是靶向HIV的，并包含如下序列或與其具有至少70％(優(yōu)選至少80％、85％、90％、95％、98％或更高)一致性的序列中的任何一個(gè)或幾個(gè)序列SEQ ID NO2-6和8-44。
優(yōu)選地，所述siRNA包括從上述序列中選擇的至少2個(gè)序列，優(yōu)選3個(gè)、4個(gè)序列，更優(yōu)選5個(gè)序列，或者5個(gè)以上的序列，或者由從上述序列中選擇的至少2個(gè)序列，優(yōu)選3個(gè)、4個(gè)序列，更優(yōu)選5個(gè)序列，或者5個(gè)以上的序列組成。
在另外的優(yōu)選的實(shí)施方案中，如果適用的話，在本發(fā)明所有方面，所述多個(gè)(特別是靶向HIV的)siRNA和/或miRNAs和/或核酶和/或反義寡核苷酸的編碼核酸序列包含或由SEQ ID NO7所示的序列或者與SEQ ID NO7具有至少70％(優(yōu)選至少80％、85％、90％、95％、98％或更高)一致性的序列組成。
在另一方面，本發(fā)明還涉及核酸分子，其包含或具有(1)SEQ ID NO1-44中任何一個(gè)所示的序列，或者(2)與(1)中序列具有至少70％(優(yōu)選至少80％、85％、90％、95％、98％或更高)一致性的序列，或者(3)在嚴(yán)緊條件下或者高度嚴(yán)緊條件與(1)中序列能夠雜交的核苷酸序列，或者(4)上述序列的片段或者互補(bǔ)序列。
下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)的說明。從下文的詳細(xì)描述中，本發(fā)明的上述方面和本發(fā)明的其他方面將是明顯的。
圖1.五種HIV-siRNAs獲得同時(shí)表達(dá).Xiada-1或一個(gè)對(duì)照載體分別轉(zhuǎn)染293細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染后24小時(shí)收獲細(xì)胞總RNA。Xiada-1編碼的siRNAs的表達(dá)通過引物延伸進(jìn)行檢測(cè)。Control對(duì)照。FreeProbes游離探針。
圖2顯示了不同siRNA靶點(diǎn)在與HIV感染性克隆質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)對(duì)HIV p24蛋白表達(dá)的抑制效果。結(jié)果顯示，這些siRNA靶點(diǎn)可用于有效抑制HIV。
圖3顯示，LV-GFP轉(zhuǎn)導(dǎo)MT-4細(xì)胞后GFP基因的表達(dá)效率大于90％。左圖為普通光，右圖為藍(lán)色光激發(fā)。
圖4顯示了在HIV體外感染細(xì)胞模型中驗(yàn)證Xiada-1的抑制效果。
圖5是從臍帶血中分離人CD34+細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果，顯示純度高于95％。
圖6顯示，LV-GFP轉(zhuǎn)導(dǎo)人CD34+細(xì)胞后GFP基因的表達(dá)效率高于40％。左圖為普通光，右圖為藍(lán)色光激發(fā)。
圖7顯示了在移植了經(jīng)Xiada-1轉(zhuǎn)導(dǎo)的人造血干細(xì)胞的NOD/SCID小鼠中分離的人T細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞中的五種siRNA的同時(shí)表達(dá)。Xiada-1編碼的siRNAs的表達(dá)通過引物延伸進(jìn)行檢測(cè)。
T cells from control mouse 1對(duì)照小鼠1的T細(xì)胞；T cells from control mouse 2對(duì)照小鼠2的T細(xì)胞；T cellsT細(xì)胞；B cellsB細(xì)胞；Macrophasges巨噬細(xì)胞；
Free Probes游離探針。
具體實(shí)施例方式
除非特別說明，本發(fā)明的術(shù)語具有本領(lǐng)域通常使用的含義。
在本發(fā)明中，“多個(gè)siRNA和/或miRNAs和/或核酶和/或反義寡核苷酸”是指siRNA和/或miRNAs和/或核酶和/或反義寡核苷酸的任何組合，例如，這包括一個(gè)或多個(gè)siRNA和一個(gè)或者多個(gè)miRNAs和/或核酶和/或反義寡核苷酸的組合，也可以是單獨(dú)的多個(gè)siRNA、miRNAs、核酶或反義寡核苷酸，如單獨(dú)的多個(gè)siRNA?！岸鄠€(gè)”的含義是至少兩個(gè)，并可多達(dá)10個(gè)、20個(gè)或更多，優(yōu)選2-10個(gè)，3-8個(gè)，例如3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)、6個(gè)、7個(gè)、8個(gè)、9個(gè)、10個(gè)、15個(gè)。
“siRNA和/或miRNAs和/或核酶和/或反義寡核苷酸”通常設(shè)計(jì)成靶向目的基因或者調(diào)節(jié)序列，例如需要抑制其表達(dá)的基因或其調(diào)控序列，以便抑制或降低其表達(dá)。所針對(duì)的基因或其調(diào)控序列可以是需要抑制或降低其表達(dá)的任何基因或其調(diào)控序列，例如來自病原體的、或者參與癌癥形成和發(fā)展的那些。特別是靶向HIV。本發(fā)明的siRNA、miRNAs、核酶和反義寡核苷酸可按照常規(guī)方法設(shè)計(jì)。
本發(fā)明使用的啟動(dòng)子可以是任何適于在目的宿主細(xì)胞中表達(dá)目的基因的啟動(dòng)子?？梢允墙M成型的，也可以是誘導(dǎo)型的。還可以是復(fù)合啟動(dòng)子，如雙啟動(dòng)子。
“可操作地連接”是指所連接的分子的連接方式使得能夠?qū)崿F(xiàn)預(yù)期的功能。例如，表達(dá)控制序列與基因編碼序列的可操作的連接可實(shí)現(xiàn)表達(dá)控制序列對(duì)基因編碼序列的表達(dá)控制作用。
“表達(dá)控制序列”是實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)所需要的控制序列，是本領(lǐng)域熟知的。通常必須包括啟動(dòng)子，常常也包括轉(zhuǎn)錄終止序列，也可以包含其他序列，如增強(qiáng)子序列?；虮磉_(dá)對(duì)于siRNA、miRNAs、核酶和反義寡核苷酸等是指轉(zhuǎn)錄，也可以包括轉(zhuǎn)錄后加工；對(duì)于蛋白質(zhì)編碼序列如MGMT(P140K)而言通常是指轉(zhuǎn)錄和翻譯，產(chǎn)生成熟的蛋白質(zhì)。
在本發(fā)明重組表達(dá)載體的一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明重組表達(dá)載體包含(1)MGMT(P140K)基因，該基因與表達(dá)控制序列可操作地連接，使得該基因可在動(dòng)物細(xì)胞(特別是哺乳動(dòng)物細(xì)胞，如人細(xì)胞，優(yōu)選造血干細(xì)胞)中表達(dá)；和(2)多個(gè)(特別是靶向HIV的)siRNA和/或miRNAs和/或核酶和/或反義寡核苷酸的編碼核酸序列，這些編碼核酸序列與表達(dá)控制序列可操作地連接，使得可在動(dòng)物細(xì)胞(特別是哺乳動(dòng)物細(xì)胞，如人細(xì)胞，如哺乳動(dòng)物干細(xì)胞，優(yōu)選造血干細(xì)胞)中表達(dá)所述多個(gè)(特別是靶向HIV的)siRNA和/或miRNAs和/或核酶和/或反義寡核苷酸。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，MGMT(P140K)基因和多個(gè)siRNA和/或miRNAs和/或核酶和/或反義寡核苷酸的編碼核酸序列可以存在于分開的兩個(gè)或更多個(gè)表達(dá)載體上。
類似地，在制備本發(fā)明改造細(xì)胞的方法中，可以通過用分別包含MGMT(P140K)基因和多個(gè)siRNA和/或miRNAs和/或核酶和/或反義寡核苷酸的編碼核酸序列的分開的兩個(gè)或更多個(gè)表達(dá)載體轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞(包括動(dòng)物例如哺乳動(dòng)物優(yōu)選人的細(xì)胞，優(yōu)選干細(xì)胞，特別是造血干細(xì)胞，如CD34+細(xì)胞)來獲得本發(fā)明改造細(xì)胞，只要最終得到的細(xì)胞包含并表達(dá)MGMT(P140K)基因和多個(gè)siRNA和/或miRNAs和/或核酶和/或反義寡核苷酸的編碼核酸序列即可。然而，優(yōu)選的是，MGMT(P140K)基因和多個(gè)siRNA和/或miRNAs和/或核酶和/或反義寡核苷酸的編碼核酸序列存在于一個(gè)表達(dá)載體上。
本發(fā)明的重組表達(dá)載體可以是質(zhì)粒載體或病毒載體，例如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，包括慢病毒載體。優(yōu)選地，所述重組表達(dá)載體是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，更優(yōu)選慢病毒載體(如慢病毒Xiada-1)。
本發(fā)明的改造的細(xì)胞優(yōu)選是哺乳動(dòng)物(優(yōu)選人)的細(xì)胞，優(yōu)選干細(xì)胞，特別是造血干細(xì)胞，如CD34+細(xì)胞。所述細(xì)胞優(yōu)選在基因組中攜帶(1)MGMT(P140K)基因，該基因與表達(dá)控制序列可操作地連接，使得該基因可在該細(xì)胞中表達(dá)；和(2)多個(gè)(特別是靶向HIV的)siRNA和/或miRNAs和/或核酶和/或反義寡核苷酸的編碼核酸序列，這些編碼核酸序列與表達(dá)控制序列可操作地連接，使得可在該細(xì)胞中表達(dá)所述多個(gè)siRNA和/或miRNAs和/或核酶和/或反義寡核苷酸。
本發(fā)明提供治療HIV感染或者HIV患者的方法，包括(1)按照本發(fā)明的方法制備本發(fā)明的哺乳動(dòng)物優(yōu)選人的經(jīng)改造的細(xì)胞(優(yōu)選干細(xì)胞，最優(yōu)選造血干細(xì)胞，如CD34+細(xì)胞)，然后將其移植到HIV感染患者體內(nèi)；和(2)進(jìn)行適當(dāng)?shù)腂G/BCNU治療。優(yōu)選的，該方法包括(1)按照本發(fā)明的方法制備本發(fā)明的經(jīng)改造的人類造血干細(xì)胞，如CD34+細(xì)胞，然后將其移植到HIV感染患者體內(nèi)；和(2)進(jìn)行適當(dāng)?shù)腂G/BCNU治療。
本發(fā)明還涉及本發(fā)明的經(jīng)改造的細(xì)胞(包括動(dòng)物例如哺乳動(dòng)物優(yōu)選人的細(xì)胞，優(yōu)選干細(xì)胞，特別是造血干細(xì)胞，如CD34+細(xì)胞)在制備治療HIV感染或者HIV患者中的藥物中的用途。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，如果適用的話，在本發(fā)明所有方面，所述MGMT(P140K)具有SEQ ID NO1所示的序列或與之具有至少70％(優(yōu)選至少80％、85％、90％、95％、98％或更高)一致性的序列。
一致性(identity)可以按照本領(lǐng)域公知的方法計(jì)算。適合于確定序列一致性和序列相似性百分?jǐn)?shù)的算法的一個(gè)優(yōu)選例子是BLAST和BLAST 2.0算法，它們分別描述在Altschul等(1977)Nucl.Acid.Res.253389-3402和Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215403-410。采用例如本文所述參數(shù)，BLAST和BLAST 2.0可以用于確定本發(fā)明的多核苷酸和多肽的序列一致性百分?jǐn)?shù)。執(zhí)行BLAST分析的軟件可以通過國立生物技術(shù)信息中心為公眾所獲得。
在其它實(shí)施方案中，所述MGMT(P140K)具有在嚴(yán)緊條件下或者高度嚴(yán)緊條件與本文提供的多核苷酸、或其片段、或其互補(bǔ)序列能夠雜交的多核苷酸序列。在分子生物學(xué)領(lǐng)域中雜交技術(shù)是熟知的。為了舉例說明的目的，所述雜交的條件是嚴(yán)緊條件，例如與濾膜結(jié)合的DNA在6×氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中約45℃下雜交，之后在0.2×SSC/0.1％SDS中于約50-65℃下作一或多次洗滌；高度嚴(yán)緊條件，例如與濾膜結(jié)合的核酸在6×SSC中約45℃下雜交，之后在0.1×SSC/0.2％SDS中于約68℃下作一或多次洗滌；或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它嚴(yán)緊雜交條件(參見例如Ausubel，F(xiàn).M.等編，1989，Current Protocols inMolecular Biology，第1卷，Green Publishing Associates，Inc.，和John Wiley&Sons，Inc.，紐約，第6.3.1-6.3.6和2.10.3頁)。
在另外的優(yōu)選的實(shí)施方案中，如果適用的話，在本發(fā)明所有方面，所述siRNA是靶向HIV的，并包含如下序列或與其具有至少70％(優(yōu)選至少80％、85％、90％、95％、98％或更高)一致性的序列中的任何一個(gè)或幾個(gè)序列SEQ ID NO2-6和8-44。
優(yōu)選地，所述siRNA包括從上述序列中選擇的至少2個(gè)序列，優(yōu)選3個(gè)、4個(gè)序列，更優(yōu)選5個(gè)序列，或者5個(gè)以上的序列，或者由從上述序列中選擇的至少2個(gè)序列，優(yōu)選3個(gè)、4個(gè)序列，更優(yōu)選5個(gè)序列，或者5個(gè)以上的序列組成。
在一方面，本發(fā)明還涉及如下序列或與其具有至少70％(優(yōu)選至少80％、85％、90％、95％、98％或更高)一致性的序列SEQ ID NO2-6。
本發(fā)明還涉及在嚴(yán)緊條件下或者高度嚴(yán)緊條件與SEQ ID NO2-6的任一序列、或其片段、或其互補(bǔ)序列能夠雜交的核苷酸序列。
本發(fā)明還涉及在嚴(yán)緊條件下或者高度嚴(yán)緊條件與SEQ ID NO7的序列、或其片段、或其互補(bǔ)序列能夠雜交的核苷酸序列。
本發(fā)明的重組載體和改造細(xì)胞可以用于HIV感染的治療，還可以用于治療其他疾病，例如癌癥。
本發(fā)明治療方法的其他用途本發(fā)明治療方法還可用于治療某些類型的造血系統(tǒng)疾病或淋巴系統(tǒng)腫瘤，如由于病毒性原因(如HTLV)或基因表達(dá)異常所引發(fā)的白血病或淋巴腫瘤或?qū)嶓w瘤。在患者缺乏合適的正常造血干細(xì)胞來源(如合適配型的供體骨髓，臍帶血)情況下，可動(dòng)員收集自身的造血干細(xì)胞，通過合適的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)載體將治療性RNAi元件(用于抑制異?；蚧虿《净虻谋磉_(dá))和耐化療藥篩選基因MGMT導(dǎo)入造血干細(xì)胞，輸回經(jīng)預(yù)處理的患者體內(nèi)，在化療藥BCNU/BG聯(lián)合作用下篩選經(jīng)改造后的造血干細(xì)胞，在患者體內(nèi)重建正常的造血和免疫系統(tǒng)。
因此，本發(fā)明還涉及用于治療造血系統(tǒng)疾病或淋巴系統(tǒng)疾病、或者用于重建正常的造血或免疫系統(tǒng)的方法，該方法包括通過合適的(基因轉(zhuǎn)導(dǎo))載體將治療性RNAi元件(用于抑制異?；蚧虿《净虻谋磉_(dá))和耐化療藥篩選基因MGMT導(dǎo)入造血干細(xì)胞(可從自體或者同種異體分離)，輸回(優(yōu)選經(jīng)預(yù)處理的)患者體內(nèi)，在化療藥BCNU/BG聯(lián)合作用下篩選經(jīng)改造后的造血干細(xì)胞，在患者體內(nèi)重建正常的造血和免疫系統(tǒng)。造血系統(tǒng)疾病或淋巴系統(tǒng)疾病的例子是，如需要重建造血和/或免疫系統(tǒng)的疾病，或者造血和/或免疫系統(tǒng)受損的疾病，包括造血系統(tǒng)疾病或淋巴系統(tǒng)腫瘤，如由于病毒性原因(如HTLV)或基因表達(dá)異常所引發(fā)的白血病或淋巴腫瘤或?qū)嶓w瘤。
在另一方面，本發(fā)明還涉及治療性RNAi元件和耐化療藥篩選基因MGMT聯(lián)合用于治療造血系統(tǒng)疾病或淋巴系統(tǒng)疾病的用途。本發(fā)明還涉及治療性RNAi元件和耐化療藥篩選基因MGMT聯(lián)合在制備用于治療造血系統(tǒng)疾病或淋巴系統(tǒng)疾病的藥物中的用途。優(yōu)選的造血系統(tǒng)疾病或淋巴系統(tǒng)疾病是上文舉例說明的那些。
作為舉例，我們已發(fā)展了一種可以通過一個(gè)啟動(dòng)子同時(shí)表達(dá)幾個(gè)siRNA的方法。我們已構(gòu)建了一個(gè)慢病毒載體，命名為Xiada-1，其可同時(shí)表達(dá)MGMT(P140K)和五個(gè)HIV特異性的siRNA。已知MGMT(P140K)可在體內(nèi)驅(qū)動(dòng)一種潛在的藥物介導(dǎo)的篩選，因此被病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的造血干細(xì)胞能夠重新長期存活。我們的實(shí)驗(yàn)顯示在體外被這種慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)后的T細(xì)胞可用BG/BCNU進(jìn)行篩選，而且篩選后的T細(xì)胞不支持HIV的復(fù)制。這表明BG/BCNU篩選了Xiada-1轉(zhuǎn)導(dǎo)后的細(xì)胞，抗HIV的siRNA在這些細(xì)胞中進(jìn)行了表達(dá)，從而導(dǎo)致對(duì)HIV的感染產(chǎn)生抗性。在進(jìn)行了4個(gè)月的培養(yǎng)后，我們沒有發(fā)現(xiàn)任何可逃避siRNA的病毒變種，說明進(jìn)行多種siRNA的聯(lián)合治療的確可防止變種抗性病毒的產(chǎn)生。我們已使用Xiada-1轉(zhuǎn)導(dǎo)了外周血來源的人原代CD34+祖細(xì)胞并將其移植入帶有BG/BCNU處理的NOD/SCID小鼠。利用BG/BCNU進(jìn)行幾輪篩選后，在小鼠的T細(xì)胞、B細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中均檢測(cè)到了五種HIV-siRNAs的表達(dá)，表明基因修飾過的造血干細(xì)胞在體內(nèi)獲得了成功擴(kuò)增。
艾滋病毒感染者的臨床癥狀的發(fā)生主要是由于患者體內(nèi)被HIV感染的CD4+細(xì)胞不斷被殺死，而新生CD4+細(xì)胞又不斷被感染，最終導(dǎo)致體內(nèi)CD4+細(xì)胞的嚴(yán)重不足而引起機(jī)體免疫機(jī)能缺陷。
本發(fā)明通過分離患者自身的造血干細(xì)胞，在體外用Xiada-1處理細(xì)胞，使Xiada-1攜帶的抗性基因MGMT(P140K)以及針對(duì)HIV的siRNAs進(jìn)入細(xì)胞。將處理后的造血干細(xì)胞回輸入患者體內(nèi)后，對(duì)病人給予化療藥物BG/BCNU，BG/BCNU會(huì)引起體內(nèi)原有造血干細(xì)胞的死亡，而回輸?shù)母脑旌蟮脑煅杉?xì)胞仍能存活并復(fù)制分化出各種子代細(xì)胞。由改造后的干細(xì)胞分化出的子代細(xì)胞具有對(duì)藥物BG/BCNU的抗性以及對(duì)細(xì)胞內(nèi)的HIV的專一性降解能力，因此能長期存活，并不受HIV的感染，從而維持機(jī)體免疫系統(tǒng)功能的正常發(fā)揮。由于失去HIV賴以繁殖的宿主細(xì)胞，HIV在體內(nèi)會(huì)逐漸減少直至消失，病人獲得康復(fù)。
在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及以下內(nèi)容1.一種改造的造血干細(xì)胞，其攜帶(1)MGMT(P140K)基因；和(2)多個(gè)siRNAs，和/或miRNAs，和/或靶向HIV的核酶.MGMT(P140K)的序列是ATGGACAAGGATTGTGAAATGAAACGCACCACACTGGACAGCCCTTTGGGGAAGCTGGAGCTGTCTGGTTGTGAGCAGGGTCTGCACGAAATAAAGCTCCTGGGCAAGGGGACGTCTGCAGCTGATGCCGTGGAGGTCCCAGCCCCCGCTGCGGTTCTCGGAGGTCCGGAGCCCCTGATGCAGTGCACAGCCTGGCTGAATGCCTATTTCCACCAGCCCGAGGCTATCGAAGAGTTCCCCGTGCCGGCTCTTCACCATCCCGTTTTCCAGCAAGAGTCGTTCACCAGACAGGTGTTATGGAAGCTGCTGAAGGTTGTGAAATTCGGAGAAGTGATTTCTTACCAGCAATTAGCA
GCCCTGGCAGGCAACCCCAAAGCCGCGCGAGCAGTGGGAGGAGCAATGAGAGGCAATCCTGTCAAAATCCTCATCCCGTGCCACAGAGTGGTCTGCAGCAGCGGAGCCGTGGGCAACTACTCCGGAGGACTGGCCGTGAAGGAATGGCTTCTGGCCCATGAAGGCCACCGGTTGGGGAAGCCAGGCTTGGGAGGGAGCTCAGGTCTGGCAGGGGCCTGGCTCAAGGGAGCGGGAGCTACCTCGGGCTCCCCGCCTGCTGGCCGAAACTGA(SEQ ID NO1)靶向HIV基因的五種siRNA序列siP24AGCCTGTCTCTCAGTACAATC(SEQ ID NO2)siPOLATCTTGTATTACTACTGCCCC(SEQ ID NO3)siVIF1CAGGGTCTACTTGTGTGCT(SEQ ID NO4)siVIF2TAATGCTGCTAGTGCCAAG(SEQ ID NO5)siTATTGTTCTGATGAGCTCTTCGTC(SEQ ID NO6)2.改造后的造血干細(xì)胞的制備方法，該細(xì)胞其攜帶(1)MGMT(P140K)基因；和(2)多個(gè)siRNAs，和/或miRNAs，和/或靶向HIV的核酶.
A.MGMT(P140K)的序列(SEQ ID NO1)B.五種siRNA的序列(SEQ ID NO2-6)制備方法A.利用Ficoll-Paque密度離心從HIV患者或一個(gè)健康供體的血液中獲得粗提的血液干細(xì)胞。使用CD34+細(xì)胞分離試劑盒(MiltenyiMiniMACS，德國Miltenyi Biotec GmbH公司)富集CD34+細(xì)胞。
B.分離一天后，細(xì)胞在含有10％熱滅活胎牛血清、2mM谷氨酰胺、8μg/ml Polybrene(S igma-Aldrich公司)、100ng/ml干細(xì)胞因子(SCF)，100ng/ml Flt-3L，和50ng/ml血栓形成素(TPO)的DMEM培養(yǎng)基中用慢病毒載體Xiada-1進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)。細(xì)胞密度為4×105/mL，感染復(fù)數(shù)(MOI)為2。細(xì)胞在移入37℃5％CO2培養(yǎng)箱進(jìn)行孵育前先在室溫下600g離心30分鐘。
C.進(jìn)行一天的轉(zhuǎn)導(dǎo)后，用無血清培養(yǎng)基洗細(xì)胞；然后再將細(xì)胞移植回HI V病人的體內(nèi)。
3.慢病毒載體，Xiada-1，用于改造造血干細(xì)胞.
A.一個(gè)可表達(dá)(1)MGMT(P140K)基因；和(2)多個(gè)siRNAs、和/或miRNAs、和/或靶向HIV的核酶的重組慢病毒載體B.一個(gè)改造后的用于生產(chǎn)慢病毒載體的包裝載體(如包裝質(zhì)粒)，其含有突變后的POL和GAG基因.
改造序列的兩個(gè)例子為GAG --------GAUUGUACUGAGAGACAGGCU------------突變?yōu)?-------GACTGCACAGAACGTCAAGCA------------POL ---------GGGGCAGUAGUAAUACAAGAU-----------突變?yōu)?--------GGCGCTGTTGTTATCCAGGAC-----------4.慢病毒Xiada-1在造血干細(xì)胞上的應(yīng)用.
A.慢病毒Xiada-1用于穩(wěn)定表達(dá)抗HIV的分子，如可在造血干細(xì)胞中特異阻斷HIV復(fù)制的siRNA。
B.慢病毒Xiada-1用于防止造血干細(xì)胞被BG/BCNU殺死。
5.造血干細(xì)胞用于HIV患者的治療A.含有MGMT(P140K)基因的表達(dá)產(chǎn)物
B.含有多個(gè)siRNAs，和/或miRNAs，和/或靶向HIV的核酶6.HIV感染的治療過程(1)體外改造病人的造血干細(xì)胞，然后將其移植回病人體內(nèi)。改造后的造血干細(xì)胞攜帶(A)MGMT(P140K)基因和(B)多個(gè)siRNAs，和/或miRNAs，和/或靶向HIV的核酶.
(2)依據(jù)病人的具體條件進(jìn)行2到5個(gè)周期的BG/BCNU治療。治療具有3到5周的間隔。治療中使用的藥物劑量依據(jù)制造商的推薦而定。
實(shí)施例實(shí)施例1.與HIV感染性克隆共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)篩選合適的RNAi靶點(diǎn)(1)pNL4-3質(zhì)粒是I型HIV的感染性克隆質(zhì)粒，該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染合適的哺乳細(xì)胞后會(huì)分泌具有感染能力的完整病毒顆粒。p24是HIV病毒的殼蛋白，通過檢測(cè)培養(yǎng)上清中的p24蛋白的含量可以反映病毒顆粒的分泌表達(dá)水平；(2)設(shè)計(jì)的不同siRNA序列分別構(gòu)建于pSUPER載體(oligoengine公司Cat.No VEC-PBS-0001/0002)，具體的構(gòu)建過程參見該公司的pSUPER實(shí)驗(yàn)指南(www.oligoengine.com)；(3)實(shí)驗(yàn)中的陰性對(duì)照是將不與HIV和人類基因相匹配的RNAi序列構(gòu)建到pSUPER載體上，命名為pSUPER(-)，具體序列是5’-TGCATCGGAAAATAGATGT-3’；(4)將293T細(xì)胞培養(yǎng)于于24孔板中，匯合率約70％時(shí)。12h后每孔細(xì)胞轉(zhuǎn)染0.1μg pNL4-3和1μg的含HIV抑制元件的質(zhì)粒(pSUPER-RNAi)，轉(zhuǎn)染試劑為Lipofectamine 2000(InvitrogenCat.No 11668-027)，方法參見該試劑盒的操作指南；(5)轉(zhuǎn)染48h后，收集細(xì)胞上清，用Murex HIV Antigen Mab(Cat.No.8E77-02)檢測(cè)細(xì)胞中p24蛋白的含量。
我們目前初步獲得以下s iRNA靶點(diǎn)可用于有效抑制HIVsiP24AGCCTGTCTCTCAGTACAATC(SEQ ID NO2)siPOLATCTTGTATTACTACTGCCCC(SEQ ID NO3)siVIF1CAGGGTCTACTTGTGTGCT(SEQ ID NO4)siVIF2TAATGCTGCTAGTGCCAAG(SEQ ID NO5)siTATTGTTCTGATGAGCTCTTCGTC(SEQ ID NO6)siGAG5GTGCGAGAGCGTCGGTATT(SEQ ID NO8)siGAG120GCTAGAACGATTCGCAGTT(SEQ ID NO9)siGAG1117CCAGCTACCATAATGATAC(SEQ ID NO10)siGAG1438GGAGCCGATAGACAAGGAA(SEQ ID NO11)siGAG161CAGAAGGCTGTAGACAAAT(SEQ ID NO12)siGAG207GACAGGATCAGAAGAACTT(SEQ ID NO13)siGAG263TGCATCAAAGGATAGATGT(SEQ ID NO14)siGAG240TACAATAGCAGTCCTCTAT(SEQ ID NO15)siGAG289ACCAAGGAAGCCTTAGATA(SEQ ID NO16)siGAG290CCAAGGAAGCCTTAGATAA(SEQ ID NO17)siGAG424ATGGTACATCAGGCCATAT(SEQ ID NO18)siGAG586AGCAGCCATGCAAATGTTA(SEQ ID NO19)siGAG768CCCAGTAGGAGAAATCTAT(SEQ ID NO20)siGAG888TGTAGACCGATTCTATAAA(SEQ ID NO21)siGAG816AATAGTAAGAATGTATAGCCC(SEQ ID NO22)siGAG906AACTCTAAGAGCCGAGCAA(SEQ ID NO23)siGAG1108GTAACAAATCCAGCTACCA(SEQ ID NO24)siGAG1114AATCCAGCTACCATAATGA(SEQ ID NO25)siGAG1115ATCCAGCTACCATAATGAT(SEQ ID NO26)siGAG1031AAGAAATGATGACAGCATGTC(SEQ ID NO27)siGAG1162AAGACTGTTAAGTGTTTCA(SEQ ID NO28)siGAG1420CAGAAGCAGGAGCCGATAG(SEQ ID NO29)
siGAG1443GGAACTGTATCCTTTAGCT(SEQ ID NO30)siPOL360AGAAATCTGCGGACATAAA(SEQ ID NO31)siPOL2379TGTAGCCAGTGGATATATA(SEQ ID NO32)siPOL401GACCTACACCTGTCAACAT(SEQ ID NO33)siPOL1799CAGCCAATAGGGAAACTAA(SEQ ID NO34)siPOL992CAGACATAGTCATCTATCA(SEQ ID NO35)siPOL1072GAGGAACTGAGACAACATC(SEQ ID NO36)siPOL2010AGAGTTAGTCAGTCAAATA(SEQ ID NO37)siPOL195CCTCGTCACAATAAAGATA(SEQ ID NO38)siPOL838AGGAAGTATACTGCATTTA(SEQ ID NO39)siPOL1547ACACTAATGATGTGAAACA(SEQ ID NO40)siPOL638CTCCAGTATTTGCCATAAA(SEQ ID NO41)siPOL442CAGATTGGCTGCACTTTAA(SEQ ID NO42)siPOL1871TAACGGACACAACAAATCA(SEQ ID NO43)siPOL2736GGAAAGAATAGTAGACATA(SEQ ID NO44)圖2顯示了上述不同siRNA靶點(diǎn)在與HIV感染性克隆質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)對(duì)HIV p24蛋白表達(dá)的抑制效果。結(jié)果顯示，這些siRNA靶點(diǎn)可用于有效抑制HIV。
優(yōu)選的具體例子是如下可特異靶向HIV的siRNA的序列(命名為HIV-siRNA)siP24AGCCTGTCTCTCAGTACAATC(SEQ ID NO2)siPOLATCTTGTATTACTACTGCCCC(SEQ ID NO3)siVIF1CAGGGTCTACTTGTGTGCT(SEQ ID NO4)siVIF2TAATGCTGCTAGTGCCAAG(SEQ ID NO5)siTATTGTTCTGATGAGCTCTTCGTC(SEQ ID NO6)這些siRNA不會(huì)靶向任何人類的mRNA，且其與HIV mRNA的互補(bǔ)性為100％。在以下的實(shí)驗(yàn)中，我們以5個(gè)RNAi靶點(diǎn)(siP24、siPOL、siVIF1、siVIF2、siTAT)為例，用于構(gòu)建慢病毒Xiada-1，構(gòu)建方法見實(shí)施例2和實(shí)施例3。
實(shí)施例2.五種HIV-siRNA的同時(shí)表達(dá)miRNA是一類長度約為22核苷酸的調(diào)控小RNA。miRNA與mRNA的結(jié)合可導(dǎo)致蛋白編碼基因的翻譯抑制或mRNA的剪切。不同的miRNA基因通常集合成簇。因此我們?cè)谝粋€(gè)miRNA基因簇中將五個(gè)miRNA序列(miRNA17，18，19a，20，和19b-1)替換為HIV-siRNA序列以同時(shí)表達(dá)多個(gè)siRNA。我們?nèi)L合成了修改過的miRNA基因簇并將其插入慢病毒載體中。編碼五個(gè)miRNA的合成基因的序列如下GCTGAAGATTGTGACCAGTCAGAATAATGTCGATTGTACTGAGAGATAGGTTAGTGATATGTGCATCTAGCCTGTCTCTCAGTACAATCAGCATTATGGTGACAGCTGCCTCGGGAAGCCAAGTTGGGCTTTAAAGTGCAGGGCCTGCTGATGTTGAGTGCTTTTTGTTCATCTTGTATTACTACTGCCCCGTGAAGTAGATTAGCATCGGGGCAGTAGTAATATAAGATCTGGCATAAGAAGCTTATGTATTCATCCAATAATTCAAGCCAAGCAAGTATATAGGTGTTTTAATAGTTTTTGTTTGCAGTCCTCTGAGCACACAAGTAGACCTTGTACAAGAAGAATGTAGTCAGGGTCTACTTGTGTGCTTGGTGGCCTGCTATTTCCTTCAAATGAATGATTTTTACTAATTTTGTGTACTTTTATTGTGTCGATGTAGAATCTGCCTGGTCTATCTCGAGTGACAGCTTCTGTAGCACTAATGCTGCTAGTGCCAAGGTGTTTAGTTATCCTTGGCACTAGCAGTATTAGTACTGCTAGCTGTAGAACTCCAGCTTCGGCCTGTCGCCCAATCAAACTGTCCTGTTACTGAACACTGTTCTATGGGACGAAGAGCTCATTAGAATAGCTGTGTGATATTCTGCTGTTCTGATGAGCTCTTCGTCCTGTGGTAGTGAAAAGTCTGTAGAAAAG(SEQ ID NO7)包含了上述序列的慢病毒載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293細(xì)胞。通過引物延伸的方法檢測(cè)五種HIV-siRNAs的表達(dá)。結(jié)果如圖1所示。所有五種siRNA的表達(dá)都被檢測(cè)到。因此，我們能夠利用miRNA的基因結(jié)構(gòu)在細(xì)胞中同時(shí)表達(dá)多個(gè)siRNA。
這里應(yīng)該指出的是，其他的miRNA的骨架也可用于表達(dá)多個(gè)siRNA。
實(shí)施例3.慢病毒載體Xiada-1.
A.包裝載體慢病毒載體來源于HIV-1.慢病毒載體的體外包裝需要幾種HIV蛋白如HIV POL和GAG基因的產(chǎn)物。為了有效地抑制HIV-1的復(fù)制，分別設(shè)計(jì)了靶向HIV POL和GAG基因的siP24和siPOL。為了正常獲得重組慢病毒Xiada-1，我們對(duì)包裝載體上的POL和GAG基因進(jìn)行了突變。因此，包裝細(xì)胞中的POL和GAG基mRNA不會(huì)被siP24和siPOL所降解。序列突變情況如下所示。
GAG --------GAUUGUACUGAGAGACAGGCU------------突變?yōu)?-------GACTGCACAGAACGTCAAGCA------------POL ---------GGGGCAGUAGUAAUACAAGAU-----------突變?yōu)?--------GGCGCTGTTGTTATCCAGGAC-----------B.克隆載體Xiada-1慢病毒包含了由mPGK啟動(dòng)子控制的MGMT(P140K)基因及一個(gè)由H1啟動(dòng)子控制的可表達(dá)五個(gè)HIV-siRNAs的表達(dá)框。也可以使用其他啟動(dòng)子。
C.慢病毒Xiada-1的構(gòu)建和病毒原液制備過程慢病毒系統(tǒng)從Invitrogen公司購買，品名為pLenti4/V5-DESTGateway Vector Kit，貨號(hào)V469-10。該系統(tǒng)共包含四個(gè)質(zhì)粒分別為VSVG、pLP1、pLP2、pLenti4/V5-DEST，其中pLenti4/V5-DEST質(zhì)粒用于克隆靶基因。
(A).構(gòu)建轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒我們對(duì)質(zhì)粒pLenti4/V5-DEST進(jìn)行了如下的改造得到構(gòu)建重組慢病毒Xiada-1用轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒pDEST-MR
(1)根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中的基因信息合成以下四個(gè)基因片斷，并克隆到pMD18-T載體上第一段為mPGK啟動(dòng)子(GI 57864178)，5’端添加Cla I位點(diǎn)，3’端添加EcoR I位點(diǎn)；第二段為MGMT-P140K基因(GI 30584784)，5’端添加EcoR I位點(diǎn)，3’端添加Sma I位點(diǎn)；第三段為H1啟動(dòng)子(GI56119188)，5’端添加EcoR V位點(diǎn)，3’端添加Age I位點(diǎn)；第四段為microRNA基因(這里是實(shí)施例2所示的序列(SEQ ID NO7)，但是也可以是其他本發(fā)明的microRNA基因)，5’端添加Age I位點(diǎn)，3’端添加Sma I位點(diǎn)。
(2)H1啟動(dòng)子經(jīng)EcoR V、Age I酶切后回收，以T4DNA連接酶將該片段與經(jīng)同樣酶切的pLenti4/V5-DES質(zhì)粒連接，構(gòu)建得到pDEST-H；(3)microRNA基因經(jīng)Sma I、Age I酶切后回收，以T4 DNA連接酶將該片段與經(jīng)同樣酶切的pDEST-H質(zhì)粒連接，構(gòu)建得到pDEST-HR；(4)MGMT-P140K基因經(jīng)EcoR I、Sma I酶切后回收，以T4 DNA連接酶將該片段與經(jīng)EcoR I、EcoR V酶切的pDEST-HR質(zhì)粒連接，構(gòu)建得到pDEST-HRM；(5)mPGK啟動(dòng)子基因經(jīng)EcoR I、Cla I酶切后回收，以T4DNA連接酶將該片段與經(jīng)同樣酶切的pDEST-HRM質(zhì)粒連接，構(gòu)建得到pDEST-MR。
(B).重組病毒Xiada-1的制備(1)用氯化銫-溴化乙錠密度梯度離心法大量提取四種質(zhì)粒VSVG、pLP1、pLP2、pDEST-MR(方法參見《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》，J.薩姆布魯克D.W.拉塞爾著，科學(xué)出版社，2002)；(2)293T細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基中(添加10％FBS，2mM L-glutamine，0.1mM MEM Non-Essential Amino Acids及1％penicillin-streptomycin)；(3)將293T細(xì)胞培養(yǎng)于直徑9cm的細(xì)胞培養(yǎng)板上，匯合率約60％。12h后用磷酸鈣轉(zhuǎn)染方法介導(dǎo)10μg pLP1、10μg pLP2、10μg VSVG、20μg pDEST-MR共4種質(zhì)粒進(jìn)行共轉(zhuǎn)染(方法參見《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》，J.薩姆布魯克D.W.拉塞爾著，科學(xué)出版社，2002)；
(4)轉(zhuǎn)染48h后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，0.45μm的濾膜過濾；用SW28轉(zhuǎn)頭(BECKMAN公司)以25,000rpm在4℃離心90mi n；(5)棄去上清，加500μL PBS溶解沉淀；(6)分裝病毒溶液，貯存于-80℃?zhèn)溆谩?br>
實(shí)施例4.多種siRNA的聯(lián)合治療可防止變種抗性病毒的產(chǎn)生用Xiada-1轉(zhuǎn)導(dǎo)T細(xì)胞，并測(cè)試轉(zhuǎn)導(dǎo)后的T細(xì)胞對(duì)HIV的抗性。
(1)MT-4為人T淋巴細(xì)胞株，在體外能夠支持HIV-1的感染和復(fù)制，可用于HIV-1體外培養(yǎng)。
(2)慢病毒Xiada-1以moi＝10轉(zhuǎn)導(dǎo)MT-4細(xì)胞，600g離心60min后換液；對(duì)照病毒LV-GFP(可表達(dá)EGFP報(bào)告基因，無MGMT-P140K基因和RNAi元件)以moi＝10轉(zhuǎn)導(dǎo)MT-4細(xì)胞，600g離心60min后換液；(3)轉(zhuǎn)導(dǎo)后的MT-4細(xì)胞在37℃培養(yǎng)48h后，分別以HIV-1病毒(moi＝1，0.1)進(jìn)行感染實(shí)驗(yàn)，感染12h后換液培養(yǎng)；(5)培養(yǎng)48h后用Murex HIV Antigen Mab(Cat.No.8E77-02)檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中p24蛋白的含量。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3和圖4。圖3顯示，LV-GFP轉(zhuǎn)導(dǎo)MT-4細(xì)胞后GFP基因的表達(dá)效率大于90％。圖4顯示了在HIV體外感染細(xì)胞模型中驗(yàn)證Xiada-1的抑制效果。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，我們使用的這種慢病毒載體可有效轉(zhuǎn)導(dǎo)MT-4細(xì)胞(以同樣病毒復(fù)數(shù)的LV-GFP對(duì)MT-4的細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)效率經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)高于90％)；在體外被這種慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)后的T細(xì)胞具有了抑制HIV病毒復(fù)制的能力，不支持HIV的復(fù)制。這表明在Xiada-1轉(zhuǎn)導(dǎo)后的細(xì)胞中，抗HIV的siRNA在這些細(xì)胞中進(jìn)行了表達(dá)，從而導(dǎo)致對(duì)HIV的感染產(chǎn)生抗性。在進(jìn)行了4個(gè)月的培養(yǎng)后，我們沒有發(fā)現(xiàn)任何可逃避siRNA的病毒變種，說明進(jìn)行多種siRNA的聯(lián)合治療的確可防止變種抗性病毒的產(chǎn)生。
實(shí)施例5.Xiada-1改造后人造血干細(xì)胞在NOD/SICD小鼠重建耐BG/BCNU篩選的人造血/免疫細(xì)胞(1)Xiada-1轉(zhuǎn)導(dǎo)T細(xì)胞株Jurkat。BG/BCNU篩選顯示約20％的轉(zhuǎn)導(dǎo)后細(xì)胞在BG/BCNU處理后可存活下來。以不帶MGMT(P140K)的對(duì)照慢病毒感染后的細(xì)胞則不能在BG/BCNU篩選中存活。這說明由Xiada-1導(dǎo)入的MGMT P140K可給靶細(xì)胞提供對(duì)BG/BCNU的抗性；(2)用Ficoll-Paque密度離心從臍帶血中獲得粗提的造血干細(xì)胞，使用CD34+細(xì)胞分離試劑盒(Miltenyi MiniMACs，德國Miltenyi BiotecGmbH公司)富集CD34+細(xì)胞；(3)Xiada-1轉(zhuǎn)導(dǎo)CD34+細(xì)胞(以LV-GFP為對(duì)照慢病毒，LV-GFP可表達(dá)GFP基因，無MGMT-P140K基因和RNAi元件)，細(xì)胞密度為4×105/mL，感染復(fù)數(shù)(MOI)為2。細(xì)胞在移入37℃5％CO2培養(yǎng)箱進(jìn)行孵育前先在室溫下600g離心30分鐘；(4)轉(zhuǎn)導(dǎo)后造血干細(xì)胞通過靜脈注射移植至NOD/SICD小鼠；(5)分別在回輸后第一天、第3周和第6周給予化療藥治療，劑量BG 15μg/g體重，BCNU 5μg/g體重。
(6)在第9周采集小鼠骨髓和血樣提取PBMC對(duì)體內(nèi)人造血干細(xì)胞分化的人造血/免疫細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。
結(jié)果表明慢病毒載體可有效轉(zhuǎn)導(dǎo)人CD34+細(xì)胞(以同樣病毒復(fù)數(shù)的LV-GFP對(duì)人CD34+細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)高于40％)；MGMTP140K可給靶細(xì)胞在體外和體內(nèi)提供對(duì)BG/BCNU的抗性；Xiada-1改造后的人造血干細(xì)胞可在NOD/SCID小鼠體內(nèi)重建出耐化療藥物BG/BCNU篩選的人造血和免疫組織細(xì)胞。
圖5顯示，從臍帶血中分離人CD34+細(xì)胞，純度高于95％。
圖6顯示，LV-GFP轉(zhuǎn)導(dǎo)人CD34+細(xì)胞后GFP基因的表達(dá)效率高于40％。
表1顯示了anti-mouse CD8、anti-human CD45和anti-human CD4聯(lián)合檢測(cè)移植9周后NOD/SCID小鼠PBMC。結(jié)果表明，Xiada-1改造后的人造血干細(xì)胞可在NOD/SCID小鼠體內(nèi)重建出耐化療藥物篩選的人造血組織細(xì)胞和免疫組織細(xì)胞。
表1.anti-mouse CD8、anti-human CD45和anti-human CD4聯(lián)合檢測(cè)移植8周后NOD/SCID小鼠PBMC。Xiada-1改造后的人造血干細(xì)胞可在NOD/SCID小鼠體內(nèi)重建出耐化療藥物篩選的人造血組織細(xì)胞和免疫組織細(xì)胞。
實(shí)施例6.在體內(nèi)同時(shí)表達(dá)多個(gè)HIV-siRNA在NOD/SCID小鼠體內(nèi)移植入被Xiada-1或一個(gè)對(duì)照慢病毒(其與Xiada-1相似但不表達(dá)HIV-siRNA)轉(zhuǎn)導(dǎo)后的人類原代CD34+祖細(xì)胞。經(jīng)過三輪BG/BCNU篩選后，從小鼠中分離出T細(xì)胞、B細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，分析細(xì)胞中五種HIV-siRNAs的表達(dá)情況。我們?cè)谝浦擦薠iada-1轉(zhuǎn)導(dǎo)后的人CD34+細(xì)胞的小鼠中檢測(cè)到了五種siRNA的表達(dá)，而在移植了對(duì)照病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞的小鼠中未能檢測(cè)到。通過引物延伸的方法檢測(cè)siRNA的結(jié)果見圖7。
圖7顯示了在移植了經(jīng)Xiada-1轉(zhuǎn)導(dǎo)的人造血干細(xì)胞的NOD/SCID小鼠中分離的人T細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞中的五種siRNA的同時(shí)表達(dá)。Xiada-1編碼的siRNAs的表達(dá)通過引物延伸進(jìn)行檢測(cè)。
實(shí)施例7.HIV患者的治療A.外周血造血干細(xì)胞經(jīng)改造后自體移植治療1.治療前準(zhǔn)備(1)患者接受全面體檢并檢查詳細(xì)病史，參照臨床移植病例入選標(biāo)準(zhǔn)確定是否可進(jìn)行移植治療，例如年齡＜65歲，體力狀況ECOG I級(jí)或Karnofsky評(píng)分≥80分，無心肺肝腎等重要臟器功能損害，骨髓造血功能正常，無嚴(yán)重的藥物過敏史，無嚴(yán)重的精神病史。
(2)可提取測(cè)定患者體內(nèi)所感染HIV毒株的關(guān)鍵區(qū)段，用于治療參考。
(3)患者可接受合適的抗HIV藥物治療，在短期內(nèi)降低外周血中的病毒載量。(檢測(cè)外周血中的HIV RNA量和p24蛋白的活性)2.外周血造血干細(xì)胞經(jīng)改造后自體移植治療(1)外周血造血干細(xì)胞動(dòng)員、采集方案方案1患者接受重組人粒細(xì)胞集落刺激因子(rhG-CSF)皮下注射，劑量5μg/kg，動(dòng)員5天后分別在0d和+1d用血細(xì)胞分離機(jī)采集供者外周血單核細(xì)胞(PBMC)。
方案2患者采用MD-Ara-c(中劑量阿糖胞苷)動(dòng)員，劑量為1.0～1.2g·m-2·d-1×3d，待患者外周血WRC＜1.0×109/L并開始回升時(shí)用粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)皮下注射，劑量為5μg·kg-1·d-1。使用5～8d，當(dāng)WBC＞5.0×109/L時(shí)采集，每天1次，連續(xù)2d，每次處理血量為12000mL以上，采集的PBMC懸液加入肝素鈉1250μ后，直接放4℃冰箱保存。
方案3患者給予粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)300μg/q 12h，皮下注射，連用5～6d。第5天開始用血細(xì)胞分離儀進(jìn)行單采，平均2(1～3)次。
(2)造血干細(xì)胞富集和體外改造使用CD34+細(xì)胞分離試劑盒(Miltenyi MiniMACs，德國MiltenyiBiotec GmbH公司)從PBMC中富集CD34+細(xì)胞。用帶有MGMT-P140K基因表達(dá)元件和microRNA表達(dá)元件的慢病毒載體(如Xiada-1)轉(zhuǎn)導(dǎo)CD34+細(xì)胞，細(xì)胞密度為4×105/mL，感染復(fù)數(shù)(MOI)為2。細(xì)胞在移入37℃5％CO2培養(yǎng)箱進(jìn)行孵育前先在室溫下600g離心30分鐘。
(3)患者的預(yù)處理方案和改造后造血干細(xì)胞移植MAC方案1馬法蘭(Melphalan)180mg·m-2，一次頓服(-5天)，阿糖胞苷(Ara-c)2g·(-5天)；阿糖胞苷1.5g·(-4天)；環(huán)磷酰胺(Cy)60mg·kg-1·d-1·(-4天，-3天)；預(yù)處理結(jié)束后72小時(shí)輸注改造后的造血干細(xì)胞。
MAC方案2馬法蘭100mg·m-2一次頓服(-2天)，阿糖胞苷1.5g·m-21次(-2天)，環(huán)磷酰胺50mg·kg-1·d-1(-2天，-1天)，兩次環(huán)磷酰胺之間間隔12～16小時(shí)，預(yù)處理結(jié)束后24小時(shí)，回輸改造后的造血干細(xì)胞。
非清髓方案單用Bu(白消安)劑量4mg/(kg·d)×4d。
Bu為主，加用阿糖胞苷和(或)HHT(高三尖杉酯堿)如Bu 3mg/(kg·d)×3d加HHT 5mg/d×3d加Ara-c 1g/(m2·d)×3d；或Bu 4mg/(kg·d)×3d加Ara-c 2g/(m2·d)×3d。
聯(lián)合化療三尖杉酯堿+阿糖胞苷(HA方案)、阿克拉霉素+阿糖胞苷(AA方案)等標(biāo)準(zhǔn)聯(lián)合化療方案。
清髓性方案TBI(全身照射)加化療TBI劑量9～10Gy，化療藥包括環(huán)磷酰胺20mg/kg等，可依據(jù)臨床情況在此基礎(chǔ)上加用Ara-C1～4g/m2或VP16(依托泊甘)300mg。
Bu/Cy為主，或加用去甲氧柔紅霉素、Ara-C其中Bu 4mg/(kg·d)×4d，去甲氧柔紅霉素20mg/m2，Cy及Ara-C劑量同TBI加化療方案。
(4)移植后并發(fā)癥防治住層流病房，無菌飲食，口服腸道不吸收的抗生素，用美斯鈉(劑量為環(huán)磷酰胺量的120％～160％)；堿化尿液，強(qiáng)迫性利尿預(yù)防出血性膀胱炎；預(yù)防VOD(肝靜脈阻塞綜合癥)用肝素鈉2500u，每天2次，靜滴，從化療開始直到血小板計(jì)數(shù)(BPC)＜40×109/L；預(yù)防霉菌感染，伊曲康唑100～200mg/d，服用到造血恢復(fù)；當(dāng)外周血WBC＜1.0×109/L，或體溫＞37.5℃時(shí)，預(yù)防性使用抗生素；當(dāng)患者WBC＜1.0×109/L時(shí)，開始皮下注射G-CSF，劑量為5μg·kg-1·d-1，或加用GM-CSF 2.5g·kg-1·d-1，直到造血恢復(fù)。
(5)移植后治療患者移植后2～4周內(nèi)，當(dāng)WBC＞3.0×109/L，PBC＞50×109/L時(shí)，采用IL-2治療，IL-2劑量200萬u·d-1×5d，靜脈點(diǎn)滴，休息一周后繼續(xù)用IL-250萬u·d-1×10d，靜脈點(diǎn)滴，用IL-2前后均檢查CD4、CD8及兩者比值。
移植后3個(gè)月內(nèi)進(jìn)行一次BCNU(7～10mg/Kg)結(jié)合O6-BG(六氧苯甲基鳥嘌呤)(20～30mg/kg)的化療，以后每2～3個(gè)月維持BCNU(7～10mg/Kg)結(jié)合O6-BG(20～30mg/Kg)的化療一次。
3.移植治療后療效檢測(cè)全面檢查患者的血象指標(biāo)，觀察造血恢復(fù)情況；定期檢查患者的骨髓象；定期對(duì)患者進(jìn)行體檢；分離外周血PBMC，檢測(cè)MGMT和RNAi元件的表達(dá)；檢測(cè)外周血中HIV檢測(cè)指標(biāo)(HIV RNA量和p24蛋白的活性)。
B.外周血造血干細(xì)胞經(jīng)改造后異體移植治療1.治療前準(zhǔn)備(1)根據(jù)配型情況，選擇合適的供體或造血干細(xì)胞來源(如骨髓庫、臍血庫等)；(2)其余情況參照前面自體移植方案。
2.外周血造血干細(xì)胞經(jīng)改造后異體移植治療(1)供體外周血造血干細(xì)胞動(dòng)員/采集方案方法基本參照前面自體移植方案。
(2)造血干細(xì)胞純化和體外改造方法基本參照前面自體移植方案。
(3)患者(受體)的預(yù)處理方案和改造后造血干細(xì)胞移植方法基本參照前面自體移植方案。
(4)移植后并發(fā)癥防治GVHD(移植物抗宿主病)的預(yù)防。非清髓預(yù)處理類型可采用單用環(huán)孢菌素A(CsA)方案即-1d開始應(yīng)用CsA 2mg/(kg·d)靜脈滴注，可進(jìn)食后改為5～8mg/kg口服，+100d后每兩周減5％。若出現(xiàn)II度以上GVHD則加量或加用甲潑尼龍80mg/d，癥狀減輕后改為潑尼松30～60mg/d，至癥狀消失再減量，或維持原量并加用MMF(霉酚酸酯)1.5～2.0g/d；部分患者后期可以他可莫司(FK506)替代CsA。清髓性PBSCT類型可采用CsA加短程甲氨蝶呤(MTX)方案，CsA用法同上，MTX15mg/m2·(+1d)，10mg/m2·(+3，+6，+11d)。
其余情況參照前面自體移植方案。
(5)移植后治療方法基本參照前面自體移植方案。
3.移植治療后療效檢測(cè)方法基本參照前面自體移植方案。
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縮寫HSCs造血干細(xì)胞.
MGMTO6-甲基鳥嘌呤-DNA-甲基轉(zhuǎn)移酶基因MGMT(P140K)MGMT突變體，其140位的脯氨酸被賴氨酸取代BG六氧苯甲基鳥嘌呤BCNU卡莫司汀siRNA小干擾RNAmiRNA微小RNA本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)明了，盡管為了舉例說明的目的本文中描述了本發(fā)明的具體實(shí)施方案，但可以對(duì)其進(jìn)行各種修改而不偏離本發(fā)明的精神和范圍。因此，本發(fā)明的具體實(shí)施方案和實(shí)施例不應(yīng)當(dāng)視為限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明僅受所附權(quán)利要求的限制。本申請(qǐng)中引用的所有文獻(xiàn)均完整地并入本文作為參考。
權(quán)利要求
1.可表達(dá)多個(gè)siRNA和/或miRNAs和/或核酶和/或反義寡核苷酸的表達(dá)盒，其包含由共同的啟動(dòng)子(例如一個(gè)或幾個(gè)啟動(dòng)子)控制的、多個(gè)(特別是靶向HIV的)siRNA和/或miRNAs和/或核酶和/或反義寡核苷酸的編碼核酸序列。
2.權(quán)利要求1的表達(dá)盒，其中所述編碼核酸序列是通過在一個(gè)miRNA基因簇中將多個(gè)miRNA序列(例如miRNA17，18，19a，20，和19b-1)替換為多個(gè)siRNA和/或miRNAs和/或核酶和/或反義寡核苷酸的編碼核酸序列而獲得的。
3.一種重組表達(dá)載體，其可表達(dá)(1)MGMT(P140K)基因；和(2)多個(gè)(特別是靶向HIV的)siRNA和/或miRNAs和/或核酶和/或反義寡核苷酸。
4.權(quán)利要求3的重組表達(dá)載體，其包含(1)MGMT(P140K)基因，該基因與表達(dá)控制序列可操作地連接，使得該基因可在動(dòng)物細(xì)胞(特別是哺乳動(dòng)物細(xì)胞，如人細(xì)胞，優(yōu)選造血干細(xì)胞)中表達(dá)；和(2)多個(gè)(特別是靶向HIV的)siRNA和/或miRNAs和/或核酶和/或反義寡核苷酸的編碼核酸序列，這些編碼核酸序列與表達(dá)控制序列可操作地連接，使得可在動(dòng)物細(xì)胞(特別是哺乳動(dòng)物細(xì)胞，如人細(xì)胞，如哺乳動(dòng)物干細(xì)胞，優(yōu)選造血干細(xì)胞)中表達(dá)所述多個(gè)(特別是靶向HIV的)siRNA和/或miRNAs和/或核酶和/或反義寡核苷酸。
5.權(quán)利要求4的重組表達(dá)載體，其中所述多個(gè)(特別是靶向HIV的)siRNA和/或miRNAs和/或核酶和/或反義寡核苷酸的編碼核酸序列由共同的啟動(dòng)子控制表達(dá)。
6.權(quán)利要求4或5的重組表達(dá)載體，其中所述多個(gè)(特別是靶向HIV的)siRNA和/或miRNAs和/或核酶和/或反義寡核苷酸的編碼核酸序列是通過在一個(gè)miRNA基因簇中將多個(gè)miRNA序列(例如miRNA17，18，19a，20，和19b-1)替換為多個(gè)siRNA和/或miRNAs和/或核酶和/或反義寡核苷酸的編碼核酸序列而獲得的。
7.權(quán)利要求3-6任一項(xiàng)的重組表達(dá)載體，其是質(zhì)粒載體或病毒載體，例如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，包括慢病毒載體。
8.權(quán)利要求7的重組表達(dá)載體，其是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，例如慢病毒載體(如慢病毒Xiada-1)。
9.一個(gè)改造后的用于生產(chǎn)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(例如慢病毒載體，如慢病毒Xiada-1)的包裝載體(如包裝質(zhì)粒)，其含有突變后的POL和GAG基因，特別地，POL和GAG基因可分別具有如下突變GAG --------GAUUGUACUGAGAGACAGGCU------------突變?yōu)?-------GACTGCACAGAACGTCAAGCA------------POL ---------GGGGCAGUAGUAAUACAAGAU-----------突變?yōu)?--------GGCGCTGTTGTTATCCAGGAC-----------
10.轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)了權(quán)利要求3-8任一項(xiàng)的重組表達(dá)載體的分離的細(xì)胞。
11.轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)了權(quán)利要求9的包裝載體(如包裝質(zhì)粒)的分離的細(xì)胞。
12.一種改造的細(xì)胞(包括動(dòng)物例如哺乳動(dòng)物優(yōu)選人的細(xì)胞，優(yōu)選干細(xì)胞，特別是造血干細(xì)胞，如CD34+細(xì)胞)，其可表達(dá)(1)MGMT(P140K)基因；和(2)多個(gè)(特別是靶向HIV的)siRNA和/或miRNAs和/或核酶和/或反義寡核苷酸。
13.權(quán)利要求12的改造的細(xì)胞(包括動(dòng)物例如哺乳動(dòng)物優(yōu)選人的細(xì)胞，優(yōu)選干細(xì)胞，特別是造血干細(xì)胞，如CD34+細(xì)胞)，其在基因組中或者基因組外攜帶(1)MGMT(P140K)基因，該基因與表達(dá)控制序列可操作地連接，使得該基因可在該細(xì)胞(包括動(dòng)物例如哺乳動(dòng)物優(yōu)選人的細(xì)胞，優(yōu)選干細(xì)胞，特別是造血干細(xì)胞，如CD34+細(xì)胞)中表達(dá)；和(2)多個(gè)(特別是靶向HIV的)siRNA和/或miRNAs和/或核酶和/或反義寡核苷酸的編碼核酸序列，這些編碼核酸序列與表達(dá)控制序列可操作地連接，使得可在該細(xì)胞(包括動(dòng)物例如哺乳動(dòng)物優(yōu)選人的細(xì)胞，優(yōu)選干細(xì)胞，特別是造血干細(xì)胞，如CD34+細(xì)胞)中表達(dá)所述多個(gè)(特別是靶向HIV的)siRNA和/或miRNAs和/或核酶和/或反義寡核苷酸。
14.權(quán)利要求13的細(xì)胞，其中所述多個(gè)(特別是靶向HIV的)siRNA和/或miRNAs和/或核酶和/或反義寡核苷酸的編碼核酸序列由共同的啟動(dòng)子控制表達(dá)。
15.權(quán)利要求13或14的細(xì)胞，其中所述多個(gè)(特別是靶向HIV的)siRNA和/或miRNAs和/或核酶和/或反義寡核苷酸的編碼核酸序列是通過在一個(gè)miRNA基因簇中將多個(gè)miRNA序列(例如miRNA17，18，19a，20，和19b-1)替換為多個(gè)siRNA和/或miRNAs和/或核酶和/或反義寡核苷酸的編碼核酸序列而獲得的。
16.制備權(quán)利要求12-15任一項(xiàng)的細(xì)胞的方法，包括用權(quán)利要求3-6的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞(包括動(dòng)物例如哺乳動(dòng)物優(yōu)選人的細(xì)胞，優(yōu)選干細(xì)胞，特別是造血干細(xì)胞，如CD34+細(xì)胞)。
17.權(quán)利要求16的方法，包括用權(quán)利要求8的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)導(dǎo)哺乳動(dòng)物優(yōu)選人的干細(xì)胞，特別是造血干細(xì)胞，如CD34+細(xì)胞。
18.權(quán)利要求16或17的方法，其中細(xì)胞是分離的，例如從感染HIV的患者或者正常個(gè)體分離的，或者是在體的。
19.治療HIV感染或者HIV患者的方法，包括(1)按照權(quán)利要求16-18任一項(xiàng)的方法制備權(quán)利要求12-15任一項(xiàng)的哺乳動(dòng)物優(yōu)選人的細(xì)胞(優(yōu)選干細(xì)胞，最優(yōu)選造血干細(xì)胞，如CD34+細(xì)胞)，然后將其移植到HIV感染患者體內(nèi)；和(2)進(jìn)行適當(dāng)?shù)腂G/BCNU治療。
20.權(quán)利要求12-15任一項(xiàng)的細(xì)胞(包括動(dòng)物例如哺乳動(dòng)物優(yōu)選人的細(xì)胞，優(yōu)選干細(xì)胞，特別是造血干細(xì)胞，如CD34+細(xì)胞)在制備治療HIV感染或者HIV患者中的藥物中的用途。
21.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求，其中所述MGMT(P140K)具有SEQ IDNO1所示的序列或與之具有至少70％(優(yōu)選至少80％、85％、90％、95％、98％或更高)一致性的序列；與MGMT(P140K)相互獨(dú)立地，所述siRNA是靶向HIV的，并包含如下序列或與其具有至少70％(優(yōu)選至少80％、85％、90％、95％、98％或更高)一致性的序列中的任何一個(gè)或幾個(gè)序列SEQ ID NO2-6和8-44；優(yōu)選地，所述siRNA包括從上述序列中選擇的至少2個(gè)序列，優(yōu)選3個(gè)、4個(gè)序列，更優(yōu)選5個(gè)序列，或者5個(gè)以上的序列，或者由從上述序列中選擇的至少2個(gè)序列，優(yōu)選3個(gè)、4個(gè)序列，更優(yōu)選5個(gè)序列，或者5個(gè)以上的序列組成；特別優(yōu)選的是，所述多個(gè)(特別是靶向HIV的)siRNA和/或miRNAs和/或核酶和/或反義寡核苷酸的編碼核酸序列包含或由SEQ ID NO7所示的序列或者與SEQ ID NO7具有至少70％(優(yōu)選至少80％、85％、90％、95％、98％或更高)一致性的序列組成。
22.核酸分子，其特征在于(1)SEQ ID NO1-44中任何一個(gè)所示的序列，或者(2)與(1)中序列具有至少70％(優(yōu)選至少80％、85％、90％、95％、98％或更高)一致性的序列，或者(3)在嚴(yán)緊條件下或者高度嚴(yán)緊條件與(1)中序列能夠雜交的核苷酸序列，或者(4)上述序列的片段或者互補(bǔ)序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及新的可用于治療艾滋病的重組表達(dá)載體、經(jīng)改造細(xì)胞(特別是造血干細(xì)胞)和方法。本發(fā)明提供重組表達(dá)載體和經(jīng)改造細(xì)胞(特別是造血干細(xì)胞)，其可表達(dá)(1)MGMT(P140K)基因；和(2)多個(gè)(特別是靶向HIV的)siRNA和/或miRNAs和/或核酶和/或反義寡核苷酸。本發(fā)明還提供治療HIV感染的方法，包括(1)制備本發(fā)明的細(xì)胞，然后將其移植到HIV感染患者體內(nèi)；和(2)進(jìn)行適當(dāng)?shù)腂G/BCNU治療。
文檔編號(hào)A61K35/12GK1948475SQ20051011291
公開日2007年4月18日 申請(qǐng)日期2005年10月13日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月13日
發(fā)明者夏寧邵, 史長平, 林圣彩 申請(qǐng)人:廈門大學(xué)