專利名稱：包含vegf受體片段的優(yōu)化融合蛋白質(zhì)及其醫(yī)療應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程和蛋白質(zhì)工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及編碼包含VEGF受體片段的優(yōu)化重組融合蛋白的DNA序列、其所編碼的融合蛋白、該融合蛋白的藥物用途、含有該融合蛋白的藥物及其制劑、及運(yùn)載和表達(dá)該融合蛋白的基因治療方法。
背景技術(shù)：
腫瘤快速生長的一個(gè)重要條件是血管新生(angiogenesis)(Hanahan et al，Cell，1996，86353-364)。大量的動(dòng)物模型和人體臨床試驗(yàn)已經(jīng)證明，阻斷腫瘤內(nèi)新生血管的形成可以有效地阻止腫瘤的生長和引發(fā)腫瘤細(xì)胞的死亡，從而達(dá)到對腫瘤的治療效果。因此，抑制血管新生(anti-angiogenesis)是目前抗腫瘤新藥研究的熱點(diǎn)和最有前途的領(lǐng)域，此類生物新藥中已經(jīng)有一個(gè)獲得了美國FDA的上市批準(zhǔn)，同時(shí)還有十幾種正在進(jìn)行多種臨床試驗(yàn)。另外，對于老年性視網(wǎng)膜血管病變(Age-related macular degeneration，簡稱為AMD、糖尿病視網(wǎng)膜病變、關(guān)節(jié)炎等多種與血管新生相關(guān)的疾病，抑制血管新生治療新藥也有廣泛和重要的作用(Folkman，Nature Medicine，1995，127-31；Ferrara，Seminars in Oncology，2002，29(6sumppl)10-14)。
血管新生是一個(gè)有多種活性生物因子進(jìn)行調(diào)控的復(fù)雜過程，其中一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)是內(nèi)皮細(xì)胞表面受體由多種生長因子相結(jié)合從而被激活，然后經(jīng)細(xì)胞內(nèi)酪氨酸磷酸化的信號傳遞系統(tǒng)控制內(nèi)皮細(xì)胞活動(dòng)，從而促使血管新生。多種生長因子中，血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(Vascular endothelial cell growth factor，簡稱為VEGF)是控制血管新生最重要的因子(Ferrara，Endocrine Reviews，2004，25(4)581-611)，其在幾乎所有的人體腫瘤中都過量表達(dá)，是抗癌研究的一個(gè)重要分子靶標(biāo)。VEGF在血管內(nèi)皮細(xì)胞表面上有多種受體，其中包括VEGFR-1(又稱為Flt-1)和VEGFR-2(又稱為KDR或Flk-1)，它們的細(xì)胞外部分均由七個(gè)可與VEGF相結(jié)合的免疫球蛋白樣區(qū)域(D1-D7)組成，細(xì)胞內(nèi)部分均包括酪氨酸激酶基團(tuán)。當(dāng)受體被VEGF激活后，細(xì)胞內(nèi)的酪氨酸激酶基團(tuán)發(fā)生磷酸化，并導(dǎo)致一系列的信號傳遞，最終引發(fā)血管新生。
由于VEGF信號傳遞對血管新生的重要性，阻斷VEGF或VEGF受體從而達(dá)到抑制血管新生具有重要的抗癌作用，同時(shí)也對其他包括視網(wǎng)膜血管病變等與血管新生相關(guān)的疾病有著重要的治療作用。目前唯一被美國FDA批準(zhǔn)的針對血管新生的抗癌藥物就是特異性結(jié)合VEGF-A的單克隆抗體，其機(jī)理就是通過結(jié)合VEGF達(dá)到阻斷VEGF與其受體結(jié)合的目的(Ferrara et al，Nature ReviewsDrug Discovery，2004，3391-400)。另一類可能效果更好的VEGF阻斷劑是VEGF受體的細(xì)胞外片段，其具有天然的針對VEGF的高特異性(Kuo et al，Proceedings of the National Academy of Sciences，2001，984605-4610)。為了增加在血清中的半衰期和血清濃度，VEGF受體的細(xì)胞外片段往往和免疫球蛋白的Fc部分相連成融合蛋白，該融合蛋白可在體內(nèi)二聚化，并具有和免疫球蛋白類似的優(yōu)異藥動(dòng)學(xué)特性。研究表明，這種融合蛋白在體外可以中和VEGF，從而阻斷VEGF信號傳遞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的增生，但是在動(dòng)物試驗(yàn)中的抑制血管新生效果不夠理想(Ferrar et al，Nature Medicine，1998，4336-340；Gerberet al，Nature Medicine，1999，5623-628；Gerber et al，Cancer Reserch，2000，606253-6258)，其原因可能是該種融合蛋白的結(jié)構(gòu)不夠穩(wěn)定，從而影響它們的血清濃度及其對VEGF的親和性，導(dǎo)致對VEGF的不完全阻斷。
為了改進(jìn)上述的VEGF受體的細(xì)胞外片段和Fc的融合蛋白，本發(fā)明提供了一個(gè)優(yōu)化融合蛋白的方法，大大提高了融合蛋白的穩(wěn)定性和生物活性，使得其在體外和動(dòng)物內(nèi)都可以更有效地結(jié)合和中和VEGF，阻斷血管新生，抑制腫瘤發(fā)展。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的之一是提供優(yōu)化的包含VEGF受體細(xì)胞外片段和人免疫球蛋白Fc的融合蛋白，其在體內(nèi)外都具有優(yōu)良的穩(wěn)定性和生物活性，并能阻斷VEGF信號傳遞，從而抑制血管新生和腫瘤發(fā)展。
本發(fā)明目的之二是提供編碼所述融合蛋白的核苷酸序列。
本發(fā)明目的之三是提供含有編碼所述融合蛋白的核苷酸序列，其表達(dá)載體和由該載體轉(zhuǎn)化的重組體，以及表達(dá)細(xì)胞。
本發(fā)明的目的之四是提供該融合蛋白作為阻斷血管新生的藥物在治療腫瘤和視網(wǎng)膜血管病變等相關(guān)疾病中的應(yīng)用，還有包含上述融合蛋白及可藥用載體的藥物組合物及其在治療相關(guān)疾病，特別是抗腫瘤的應(yīng)用。
本發(fā)明的要點(diǎn)在于根據(jù)前人所嘗試的VEGF受體細(xì)胞外片段和Fc的融合蛋白結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)并建造了一系列優(yōu)化了的肽連接段(peptide linker)插于VEGF受體的細(xì)胞外片段和Fc之間，使得VEGF受體的細(xì)胞外片段和Fc之間具有足夠高的結(jié)構(gòu)彈性和可塑性，從而大大增加了融合蛋白的穩(wěn)定性，更重要的是，顯著提高了與多種VEGF結(jié)合的親和力。這種包含肽連接段的優(yōu)化融合蛋白，和沒有包含該肽連接段的融合蛋白相比，具有更高的生物活性和更長的血清半衰期，從而能夠更有效地中和VEGF，抑制血管新生和腫瘤發(fā)展。
研究表明，VEGFR-1的N端第二個(gè)免疫球蛋白樣區(qū)域D2對于VEGF的親和性具有特別重要的作用，不包含D2的多種VEGF受體融合蛋白損失了絕大部分的VEGF親和力，而包含D2的多種VEGF受體融合蛋白則保存了對VEGF的親和力，因此，D2被認(rèn)為對于結(jié)合VEGF起著決定性的作用。自然，D2和Fc的融合蛋白是作為VEGF阻斷劑的首選，但是這種嘗試失敗了，單獨(dú)的D2片段和Fc的融合蛋白喪失了大部分結(jié)合VEGF的活性(Davis-Smyth et al，United States Patent Application 0030092604)。在此失敗的D2-Fc融合蛋白中，只有一個(gè)包含二個(gè)氨基酸(FE)的連接段位于D2片段和Fc之間，這可能就是其失敗的原因。D2和Fc是二個(gè)獨(dú)立的具有不同功能的區(qū)域，均必須形成各自穩(wěn)定有活性的三維空間結(jié)構(gòu)，特別是在二個(gè)Fc區(qū)域二聚化后，二個(gè)D2區(qū)域必須保持其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和生物活性，從而保證其對VEGF的親和力。而在此失敗的D2-Fc融合蛋白中，D2和Fc間的二個(gè)氨基酸很可能不足以提供足夠的結(jié)構(gòu)空間來滿足D2和Fc穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的需要，使得D2、或Fc、或二者均不能形成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，最終大大影響D2-Fc融合蛋白對VEGF的親和力。本發(fā)明則提供了一系列彈性結(jié)構(gòu)的優(yōu)化肽連接段以連接D2和Fc，使得D2和Fc都有足夠的空間來形成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，從而保證了此優(yōu)化的D2-Fc融合蛋白對VEGF的親和力和生物活性，比原有的D2-Fc融合蛋白提高了約千倍的VEGF親和力。
此彈性結(jié)構(gòu)肽連接段的優(yōu)化設(shè)計(jì)也可用于其他的VEGF受體細(xì)胞外片段和Fc的融合蛋白，以提高它們的穩(wěn)定性和生物活性。一種已知的優(yōu)良VEGF阻斷劑是VEGFR-1的第二個(gè)免疫球蛋白樣區(qū)域D2、VEGFR-2的第三個(gè)免疫球蛋白樣區(qū)域D3、和Fc的融合蛋白，其對VEGF在體外的親和力高達(dá)～1pM(Holashet al，Proceedings of the National Academy of Sciences，2002，99(17)11393-11398)。本發(fā)明利用了同樣的優(yōu)化設(shè)計(jì)，在此融合蛋白中的D2、D3和Fc之間插入了彈性結(jié)構(gòu)的優(yōu)化肽連接段以取代原有的三個(gè)氨基酸(GPG)后，發(fā)現(xiàn)其對VEGF的親和力比原來的融合蛋白提高了10倍。
本發(fā)明描述的VEGF受體細(xì)胞外片段和Fc的優(yōu)化融合蛋白是通過常規(guī)的基因重組技術(shù)所建造，具體實(shí)驗(yàn)步驟如《分子克隆》第三版(Joseph Sambrook，科學(xué)出版社)及類似的實(shí)驗(yàn)手冊所記載。所用的VEGF受體細(xì)胞外片段和Fc是1. VEGFR-1的的第2免疫球蛋白樣區(qū)域，表示為D2，氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所述。
2. VEGFR-2的的第3免疫球蛋白樣區(qū)域，表示為D3，氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所述。
3.人免疫球蛋白Fc來自于IgG1，表示為Fc，氨基酸序列如序列表中SEQ IDNO.3所述。
本發(fā)明優(yōu)化的融合蛋白中所用的肽連接段是1. G9，氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.4所述。
2. G12，氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.5所述。
3. GS，氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.6所述。
如圖1所示，YY-001和YY-005是文獻(xiàn)已記載過的融合蛋白。YY-001由VEGFR-1的的第2免疫球蛋白樣區(qū)域和人免疫球蛋白Fc所構(gòu)成，表示為D2-Fc。YY-005由VEGFR-1的的第2免疫球蛋白樣區(qū)域、VEGFR-2的的第3免疫球蛋白樣區(qū)域、和人免疫球蛋白Fc所構(gòu)成，表示為D2D3-Fc。本發(fā)明提供的優(yōu)化融合蛋白則是在YY-001和YY-005中的Fc前插入了增加結(jié)構(gòu)彈性的肽連接段1. YY-002D2-G9-Fc。
2. YY-003D2-G12-Fc。
3. YY-004D2-GS-Fc。
4. YY-006D2D3-G9-Fc。
5. YY-007D2D3-G12-Fc。
6. YY-008D2D3-GS-Fc。
其中YY-001到Y(jié)Y-008的編碼DNA序列見序列表中的SEQ ID NO.7-14。
上述的優(yōu)化融合蛋白及其編碼DNA可通過常規(guī)的基因重組技術(shù)獲得。所需編碼VEGFR-1、VEGFR-2、和Fc的DNA序列由NCBI(National Center forBiotechnology Information)的GenBank中獲得后，將編碼上述優(yōu)化融合蛋白的DNA序列由PCR合成后分別克隆到載體中，所用載體可以是分子生物學(xué)所常用的質(zhì)粒、病毒或DNA片段。在編碼上述優(yōu)化融合蛋白的DNA序列的末端前加上蛋白分泌信號序列，以保證蛋白質(zhì)從細(xì)胞中分泌出來。載體序列中包括用于驅(qū)動(dòng)基因表達(dá)的啟動(dòng)子、蛋白質(zhì)翻譯起始和終止信號、以及多聚腺苷酸(PolyA)序列。載體中有抗菌素抗性基因，以利于載體在宿主細(xì)胞，如細(xì)菌中繁殖。另外，載體中還包括真核細(xì)胞選擇性基因，用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞株的選擇。
由于VEGFR-1和VEGFR-2中各個(gè)免疫球蛋白樣區(qū)域的氨基酸序列之間并沒有絕對的分界，因此各免疫球蛋白樣區(qū)域的氨基酸序列的長度可以有一定的變化。所以，本發(fā)明所涉及的優(yōu)化融合蛋白質(zhì)的氨基酸序列也可以有一定的變化，它們都屬于本發(fā)明的范圍。
上述優(yōu)化融合蛋白中的Fc來自人免疫球蛋白IgG1，也可以是亞型IgG2、IgG3、IgG4、或者人免疫球蛋白IgM和IgA，該免疫球蛋白Fc片段可以為Fc全長或部分Fc序列，如選自CH2片斷、CH3片斷或絞合區(qū)域片段，它們都屬于本發(fā)明的范圍。
上述優(yōu)化融合蛋白中的肽連接段目的在于提供更好的彈性和可塑性，因此其氨基酸序列和長度都可以有一定的變化，也可以由一個(gè)完全隨機(jī)的肽鏈文庫中篩選而得，它們都屬于本發(fā)明的范圍。
在完成含編碼上述優(yōu)化融合蛋白的DNA序列的質(zhì)粒構(gòu)建以后，即可用該重組載體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，表達(dá)相應(yīng)的融合蛋白質(zhì)。能夠用于表達(dá)這些融合蛋白的表達(dá)系統(tǒng)有多種，可以是真核細(xì)胞也可以是原核細(xì)胞，它們包括(但不限于)哺乳動(dòng)物細(xì)胞、細(xì)菌、酵母、昆蟲細(xì)胞等。由于本發(fā)明的優(yōu)化融合蛋白質(zhì)的氨基酸序列中包括可糖基化的氨基酸，因此，哺乳動(dòng)物細(xì)胞是表達(dá)這些蛋白質(zhì)的最佳系統(tǒng)?？捎糜诘鞍踪|(zhì)大規(guī)模表達(dá)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞有多種，例如293細(xì)胞、CHO細(xì)胞、SP20細(xì)胞、NS0細(xì)胞、COS細(xì)胞、BHK細(xì)胞或PerC6細(xì)胞等，許多其他細(xì)胞也可用于這些蛋白質(zhì)的表達(dá)和生產(chǎn)，因此都包括在本發(fā)明所能使用的細(xì)胞之列。含有編碼上述優(yōu)化融合蛋白的重組質(zhì)粒可經(jīng)轉(zhuǎn)染進(jìn)入宿主細(xì)胞，轉(zhuǎn)染細(xì)胞的方法有多種，其中包括但不限于電鉆孔法(electroporation)、脂質(zhì)體介導(dǎo)法、鈣介導(dǎo)法等。
一種較佳的表達(dá)方法是在已穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞中對重組載體進(jìn)行基因擴(kuò)增，以提高相應(yīng)重組融合蛋白的表達(dá)量，例如用含有二氫葉酸還原酶(DHFR)的重組載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染缺乏DHFR的宿主細(xì)胞后，可在細(xì)胞培養(yǎng)液中增加氨甲喋呤(MTX)的濃度以擴(kuò)增重組載體在宿主細(xì)胞中的拷貝數(shù)量；又例如對表達(dá)谷氨酰胺合成酶(GS)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，利用增加培養(yǎng)液中甲硫氨酸亞砜(MSX)的濃度可擴(kuò)增重組載體的拷貝數(shù)量。
哺乳動(dòng)物細(xì)胞以外的其他表達(dá)系統(tǒng)，例如細(xì)菌、酵母或昆蟲細(xì)胞等也能用于表達(dá)這些優(yōu)化融合蛋白，它們也包括在本發(fā)明所能使用的細(xì)胞之列。這些表達(dá)系統(tǒng)的蛋白質(zhì)產(chǎn)量比哺乳動(dòng)物細(xì)胞的為高，但是，所表達(dá)的蛋白質(zhì)缺乏糖基化或者所形成的糖鏈與哺乳動(dòng)物細(xì)胞不同。
優(yōu)化融合蛋白質(zhì)表達(dá)后，可用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)或其他方法測定細(xì)胞培養(yǎng)液中融合蛋白質(zhì)的濃度。由于這些優(yōu)化融合蛋白質(zhì)包含免疫球蛋白Fc，因此可用蛋白A親和層析法來提純所表達(dá)的優(yōu)化融合蛋白質(zhì)。
從重組體培養(yǎng)液中獲得相應(yīng)的優(yōu)化融合蛋白質(zhì)后，可利用VEGF體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)來檢測和比較各種蛋白質(zhì)對VEGF的親和力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，與現(xiàn)有技術(shù)公開的YY-001和YY-005融合蛋白相比，本發(fā)明所構(gòu)建的優(yōu)化融合蛋白質(zhì)大大提高了對VEGF的親和力(見圖2)。因此，本發(fā)明所構(gòu)建的優(yōu)化融合蛋白對VEGF具有更好的阻斷作用，從而可以更有效地抑制血管新生，治療與血管新生或者VEGF相關(guān)的疾病，它們包括但不限于各種腫瘤、視網(wǎng)膜血管病變AMD、糖尿病視網(wǎng)膜病變、關(guān)節(jié)炎、貧血或子宮內(nèi)膜增殖癥等。
本發(fā)明還提供了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)以證明本發(fā)明提供的優(yōu)化融合蛋白質(zhì)在活體內(nèi)的抗血管新生作用。實(shí)驗(yàn)證明，在HCC Hep3B肝癌和Lovo大腸癌的小鼠模型中，本發(fā)明提供的融合蛋白都充分抑制了腫瘤的生長，而且效果明顯好于現(xiàn)有技術(shù)的YY-001和YY-005融合蛋白，因此，本發(fā)明所構(gòu)建的融合蛋白具有高效的抗癌能力。另外，在激光誘發(fā)脈絡(luò)膜新生血管(choroidal neovascularization，簡稱為CNV)小鼠模型中，本發(fā)明提供的優(yōu)化融合蛋白YY-007通過腺相關(guān)病毒AAV2載體的表達(dá)，有效地抑制和預(yù)防了CNV的生成，因此，對視網(wǎng)膜血管病變擁有良好的醫(yī)療前景。
本發(fā)明還提供了以病毒載體來運(yùn)載和表達(dá)這些優(yōu)化融合蛋白的方法。這些載體包括腺相關(guān)病毒AAV，其中包括但不限于血清型AAV1、AAV2、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、和AAV9，和其他的病毒載體，包括但不限于腺病毒載體(adenoviral vectors)、反轉(zhuǎn)錄病毒載體(retroviral vectors)、單純皰疹病毒載體(herpes simplex virus-based vectors，HSV)、和慢病毒載體(lentiviralvectors)。
本發(fā)明還提供了含有本發(fā)明融合蛋白和藥用載體的藥物組合物。該藥物組合物可以按照制劑學(xué)常規(guī)技術(shù)制成各種形式的藥物制劑，優(yōu)選的是注射劑，最優(yōu)選的是冷凍干燥注射劑。
本發(fā)明的藥物組合物，其中還包括任何一種或幾種其他的具有協(xié)同作用的抑制血管新生的藥物，所述組合物可以和其他治療方法一起治療血管新生相關(guān)疾病，所述其他治療方法選自化學(xué)療法、反射療法、基因療法。
附表說明表1列舉了多種優(yōu)化融合蛋白體外結(jié)合VEGF的親和力。
表2顯示了腺相關(guān)病毒AAV2表達(dá)的YY-007在激光誘發(fā)CNV小鼠模型中預(yù)防CNV的明顯效果。
表1.各融合蛋白的VEGF親合力

表2.腺相關(guān)病毒AAV2表達(dá)的YY-007在小鼠眼內(nèi)能夠預(yù)防CNV的生成



圖1為融合蛋白示意圖VEGFR-1的第2免疫球蛋白樣區(qū)域表示為D2，VEGFR-2的第3免疫球蛋白樣區(qū)域表示為D3，人免疫球蛋白Fc區(qū)域表示為Fc，三種優(yōu)化肽連接段表示為G9、G12、和GS。
圖1描述了文獻(xiàn)已記載過的VEGF受體細(xì)胞外片段和Fc的融合蛋白YY-001和YY-005的蛋白組成結(jié)構(gòu)，及相應(yīng)的包含肽連接段的優(yōu)化融合蛋白的組成結(jié)構(gòu)。
圖2為各種融合蛋白在體外結(jié)合VEGF的比較圖2-A.YY-002、YY-003、和YY-004的VEGF親和力比YY-001提高了至少千倍。
圖2-B.YY-006，YY-007、和YY-008的VEGF親和力高達(dá)0.1pM，比YY-005提高了約10倍，其中YY-007和YY-008比YY-006的親和力更稍高10％。
圖2顯示了在本發(fā)明一較佳實(shí)施例中多種VEGF受體細(xì)胞外片段和Fc的融合蛋白與VEGF在體外結(jié)合的試驗(yàn)結(jié)果，其中X軸代表融合蛋白的濃度(pM)，Y軸代表自由的VEGF的濃度(pM)。結(jié)果表明三種包含肽連接段的優(yōu)化融合蛋白均大大提高了其對VEGF的親和力，而三種不同肽連接段的優(yōu)化融合蛋白之間則沒有明顯區(qū)別。其中YY-002，YY-003，YY-004比YY-001的VEGF親和力提高了至少千倍，而YY-006，YY-007，YY-008比YY-005提高了10倍左右。
圖3為優(yōu)化融合蛋白有效地抑制HCC Hep3B肝癌在小鼠體內(nèi)的生長YY-001和Fc對HCC Hep3B肝癌細(xì)胞的生長沒有影響，YY-003和YY-005的效果相近，對肝癌細(xì)胞的生長有著顯著的抑制作用，而YY-007的抗癌作用最佳，完全遏制了肝癌細(xì)胞的生長。
圖3顯示了包含肽連接段的優(yōu)化融合蛋白能夠更有效地抑制HCC Hep3B肝癌在小鼠體內(nèi)的生長。
圖4為優(yōu)化融合蛋白有效地抑制Lovo大腸癌在小鼠體內(nèi)的生長YY-001和Fc對Lovo大腸癌細(xì)胞的生長沒有影響，YY-003和YY-005對肝癌細(xì)胞的生長有明顯的抑制作用，而YY-007的抗癌作用最佳，完全遏制了Lovo大腸癌細(xì)胞的生長。
圖4顯示了包含肽連接段的優(yōu)化融合蛋白能夠更有效地抑制Lovo大腸癌在小鼠體內(nèi)的生長。
圖5為腺相關(guān)病毒AAV2表達(dá)的YY-007在小鼠眼內(nèi)抑制CNV的生成CNV的面積由所有的激光灼燒點(diǎn)平均而得，各列中的數(shù)字代表檢測過的眼睛總數(shù)。
圖5顯示了腺相關(guān)病毒AAV2表達(dá)的YY-007在激光誘發(fā)脈絡(luò)膜新生血管CNV小鼠模型中能抑制CNV的生成。
具體實(shí)施例方式
以下實(shí)施例對本發(fā)明所涉及的優(yōu)化融合蛋白構(gòu)建、試驗(yàn)和應(yīng)用作了詳細(xì)說明。但是本發(fā)明的內(nèi)容及用途并不限制于實(shí)例的范圍。
實(shí)施例1克隆編碼優(yōu)化融合蛋白的DNA序列及構(gòu)建重組載體本發(fā)明中多種優(yōu)化融合蛋白的編碼DNA是通過聚合酶酶鏈反應(yīng)(PCR)由VEGFR-1、VEGFR-2、和免疫球蛋白IgG1Fc的cDNA以不同的引物擴(kuò)增而得。
本優(yōu)選實(shí)施例所構(gòu)建的八種融合蛋白的結(jié)構(gòu)見附圖1。
例1構(gòu)建YY-001基因及重組載體YY-001由VEGFR-1的的第2免疫球蛋白樣區(qū)域(D2)和人免疫球蛋白Fc融合而成，其N端加上了VEGFR-1的信號肽以保證其細(xì)胞外的分泌，在D2和Fc之間有一包含二個(gè)氨基酸(FE)的連接段。
其中信號肽的PCR片段(140bp)是以質(zhì)粒pBLAST-hFLT-1(Invivogen公司)為模板和如下引物擴(kuò)增而得引物15’-GAGCTCGAATTCGCAACCACCATGGTCAGCTACTGGGAC-3’引物25’-ATAAATATATAGATAGTCAGATCTGGATCTTTTAATTTTGATCCGGAACTAGATCCTGTG-3’其中D2的PCR片段(340bp)是以質(zhì)粒pBLAST-hFLT-1(Invivogen公司)為模板和如下引物擴(kuò)增而得引物35’-CTGACTATCTATATATTTATTAGTGATACCGGTAGACCTTTTGTAGAGATGTAC-3’引物45’-GTGGGCATGTGTGAGTTTTGTCTTCGAATTGTCGATGTGTGAGATAG-3’
其中Fc的PCR片段(724bp)是從人淋巴結(jié)cDNA(BD Clontech公司)為模板和如下引物擴(kuò)增而得引物55’-CTATCTCACACATCGACAATTCGAAGACAAAACTCACACATGCCCAC-3’引物65’-AAGGGAATCTAGAGCGGCCGCTCATTTACCCGGAGACAGGGAG-3’然后D2-Fc的融合片段(1017bp)是以上述D2和Fc的PCR片段為模板，由引物3和引物6拼接PCR擴(kuò)增所得。最后包括信號肽的D2-Fc的融合片段(1137bp)則是以上述信號肽的PCR片段和D2-Fc的融合片段為模板，由引物1和引物6拼接PCR擴(kuò)增所得。
編碼YY-001的DNA克隆由上述包括信號肽的D2-Fc融合片段的EcoRI和NotI酶切產(chǎn)物(1117bp)插入到載體質(zhì)粒pCI-neo(Promega公司)的EcoRI和NotI酶切點(diǎn)所得。該重組質(zhì)粒利用CMV啟動(dòng)子來表達(dá)YY-001，并包含SV40的多聚腺苷酸(PolyA)序列以保證其最佳的表達(dá)量。該重組質(zhì)粒還包含氨芐青霉素(Ampicillin)抗性基因以利于在細(xì)菌中的繁殖，和新霉素(Neomycin)抗性基因以用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染哺乳細(xì)胞的選擇。將編碼YY-001的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染E.coli(DH5α)后加入LB培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜，由Qiagen質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒后進(jìn)行酶切及測序鑒定，所獲得的編碼YY-001的DNA序列如SEQ ID NO.7所述。
例2構(gòu)建YY-002，YY-003，和YY-004基因及重組載體YY-002、YY-003、和YY-004類似于YY-001，也是由VEGFR-1第2免疫球蛋白樣區(qū)域(D2)和人免疫球蛋白Fc融合而來，但是它們是在Fc前分別包含了G9、G12、和GS肽連接段的優(yōu)化融合蛋白。它們的建造是以YY-001質(zhì)粒為模板，通過拼接PCR(Bridge PCR)的方法構(gòu)造而得。
YY-002編碼DNA的建造首先以引物1和7，及引物8和9分別PCR擴(kuò)增YY-001質(zhì)粒得到二個(gè)PCR產(chǎn)物(460bp和244bp)，然后以它們?yōu)槟０?，以引?和9進(jìn)行拼接PCR所得(682bp)。
引物75’-CTCCACCTCCGCCACCTCCGCCTCCACCTTGTCGATGTGTGAGATAG-3’引物85’-GGCGGAGGTGGCGGAGGTGGAGACAAAACTCACACATGCC-3’
引物95’-GCTCCTCCCGCGGCTTTGTCTTGGC-3’隨后AccIII和SacII酶切后(579bp)插入到Y(jié)Y-001質(zhì)粒的AccIII和SacII酶切點(diǎn)，得到編碼YY-002的重組質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染E.coli(DH5α)后獲得編碼YY-002的重組質(zhì)粒，所獲得的編碼YY-002的DNA序列如SEQ ID NO.8所述。
YY-003的建造與YY-002類似，只是以引物1和7，及引物10和9分別PCR擴(kuò)增YY-005質(zhì)粒后(460bp和253bp)，再以它們?yōu)槟０?，以引?和9進(jìn)行拼接PCR所得(691bp)。
引物105’-GGCGGAGGTGGCGGAGGTGGAGGCGGTGGTGACAAAACTCACACATGCC-3’AccIII和SacII酶切后(588bp)插入到Y(jié)Y-001質(zhì)粒的AccIII和SacII酶切點(diǎn)，得到編碼YY-003的重組質(zhì)粒，所獲得的編碼YY-003的DNA序列如SEQ ID NO.9所述。
YY-004的建造與YY-002類似，只是以引物1和11，及引物12和9分別PCR擴(kuò)增YY-005質(zhì)粒后(464bp和256bp)，再以它們?yōu)槟０?，以引?和9進(jìn)行拼接PCR所得(700bp)。
引物115’-CCGCTGCCACCGCCACCGGAGCCACCTCCACCTTGTCGATGTGTGAGATAG-3’引物125’-TCCGGTGGCGGTGGCAGCGGCGGTGGCGGATCTGACAAAACTCACACATGCC-3’AccIII和SacII酶切后(597bp)插入到Y(jié)Y-001質(zhì)粒的AccIII和SacII酶切點(diǎn)，得到編碼YY-004的重組質(zhì)粒，所獲得的編碼YY-004的DNA序列如SEQ ID NO.10所述。
例3構(gòu)建YY-005基因及重組載體YY-005由VEGFR-1的第2免疫球蛋白樣區(qū)域(D2)、VEGFR-2的的第3免疫球蛋白樣區(qū)域(D3)、和人免疫球蛋白Fc融合而成，其N端加上了VEGFR-1的信號肽以保證其細(xì)胞外的分泌，在D2D3和Fc之間有一包含三個(gè)氨基酸(GPG)的連接段。編碼YY-005的DNA是以D2、D3、和Fc的單獨(dú)PCR片段為模板，通過拼接PCR(Bridge PCR)的方法構(gòu)造而得。
其中D2的PCR片段(325bp)是以質(zhì)粒pBLAST-hFLT-1(Invivogen公司)為模板和如下引物擴(kuò)增而得引物135’-CTCGAGAATTCGCAACCTCCGGAGGTAGACCTTTCGTAGAGATG-3’引物145’-ACATCTATGATTGTATTGGTTTGTCGATGTGTGAGATAG-3’其中D3的PCR片段(340bp)是以質(zhì)粒pBLAST-hFlk-1(Invivogen公司)為模板和如下引物擴(kuò)增而得引物155’-ACCAATACAATCATAGATGTGGTTCTGAGTCCGTCTCATG-3’引物165’-TTTTGTCGCCCGGGCCCTTTTCATGGACCCTGACAAATG-3’其中Fc的PCR片段(712bp)是從人淋巴結(jié)cDNA(BD Clontech公司)以引物17和6擴(kuò)增而得引物175’-AAAGGGCCCGGGCGACAAAACTCACACATGCCCACTGTGC-3’然后D2D3的融合片段(645bp)是以上述D2和D3的PCR片段為模板，由引物13和引物16拼接PCR擴(kuò)增所得。D2D3-Fc的融合片段(1337bp)則是以上述D2D3的融合片段和Fc的PCR片段為模板，由引物13和引物6拼接PCR擴(kuò)增所得。
編碼YY-005的DNA克隆由上述D2D3-Fc融合片段的EcoRI和NotI酶切產(chǎn)物(1318bp)插入到載體質(zhì)粒pCI-neo(Promega公司)的EcoRI和NotI酶切點(diǎn)所得。最后把以下的合成寡核苷酸直接插入到EcoRI和AccIII酶切點(diǎn)以加入VEGFR-1的信號肽正向鏈5’-AATTCGCAACCACCATGGTCAGCTACTGGGACACCGGGGTCCTGCTGTGCGCGCTGCTCAGCTGTCTGCTTCTCACAGGATCTAGTT-3’反向鏈5’-CCGGAACTAGATCCTGTGAGAAGCAGACAGCTGAGCAGCGCGCACAGCAGGACCCCGGTGTCCCAGTAGCTGACCATGGTGGTTGCG-3’將編碼YY-005的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染E.coli(DH5α)后加入LB培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜，由Qiagen質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒后進(jìn)行酶切及測序鑒定，所獲得的編碼YY-005的DNA序列如SEQ ID NO.11所述。
例4構(gòu)建YY-006，YY-007，和YY-008基因及重組載體YY-006、YY-007、和YY-008類似于YY--005，也是由VEGFR-1第2免疫球蛋白樣區(qū)域(D2)、VEGFR-2的第3免疫球蛋白樣區(qū)域(D3)、和人免疫球蛋白Fc融合而來，但是它們是在Fc前分別包含了G9、G12、和GS肽連接段的優(yōu)化融合蛋白。它們的建造是以YY-005質(zhì)粒為模板，通過拼接PCR(BridgePCR)的方法構(gòu)造而得。
YY-006編碼DNA的建造首先以引物13和18，及引物8和9分別PCR擴(kuò)增YY-001質(zhì)粒得到二個(gè)PCR產(chǎn)物(657bp和244bp)，然后以它們?yōu)槟０澹砸?3和9進(jìn)行拼接PCR所得(879bp)。隨后AccIII和SacII酶切后(852bp)插入到Y(jié)Y-005質(zhì)粒的AccIII和SacII酶切點(diǎn)，得到編碼YY-006的重組質(zhì)粒，所獲得的編碼YY-006的DNA序列如SEQ ID NO.12所述。
引物185’-CTCCACCTCCGCCACCTCCGCCTCCACCCTTTTCATGGACCCTGAC-3’YY-007的建造與YY-006類似，只是以引物13和18，及引物10和9分別PCR擴(kuò)增YY-001質(zhì)粒后(657bp和253bp)，再以它們?yōu)槟０?，以引?3和9進(jìn)行拼接PCR所得(888bp)。AccIII和SacII酶切后(861bp)插入到Y(jié)Y-005質(zhì)粒的AccIII和SacII酶切點(diǎn)，得到編碼YY-007的重組質(zhì)粒，所獲得的編碼YY-007的DNA序列如SEQ ID NO.13所述。
YY-008的建造與YY-006類似，只是以引物13和19，及引物12和9分別PCR擴(kuò)增YY-001質(zhì)粒后(661bp和256bp)，再以它們?yōu)槟０?，以引?3和9進(jìn)行拼接PCR所得(897bp)。AccIII和SacII酶切后(870bp)插入到Y(jié)Y-005質(zhì)粒的AccIII和SacII酶切點(diǎn)，得到編碼YY-008的重組質(zhì)粒，所獲得的編碼YY-008的DNA序列如SEQ ID NO.14所述。
引物195’-CCGCTGCCACCGCCACCGGAGCCACCTCCACCCTTTTCATGGACCCTGAC-3’
實(shí)施例2優(yōu)化融合蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)和提純本發(fā)明中多種優(yōu)化融合蛋白是在293細(xì)胞和CHOS細(xì)胞中表達(dá)并分泌到培養(yǎng)液中的，并利用葡萄球菌A蛋白親和層析的方法純化所得。
例5融合蛋白在293T細(xì)胞中的瞬時(shí)表達(dá)本發(fā)明中的YY-001到Y(jié)Y-008重組質(zhì)粒建造后，通過用質(zhì)粒DNA提純藥盒(QIAGEN公司)提取高純度質(zhì)粒DNA，然后利用Lipofectamine 2000質(zhì)粒轉(zhuǎn)染藥盒(INVITROGEN公司)將該重組質(zhì)粒DNA導(dǎo)入293細(xì)胞(ATCC機(jī)構(gòu))中，在無血清培養(yǎng)液293SFMII(INVITROGEN公司)中培養(yǎng)三天后收集包含表達(dá)了優(yōu)化融合蛋白的上清液。此方法可用于獲取少量的優(yōu)化融合蛋白，其濃度可用ELISA法定量確定。
例6融合蛋白在CHOS細(xì)胞中的穩(wěn)定表達(dá)將編碼YY-001到Y(jié)Y-008的重組高純度質(zhì)粒利用Lipofectamine 2000質(zhì)粒轉(zhuǎn)染藥盒(Invitrogen公司)導(dǎo)入CHOS細(xì)胞(Invitrogen公司)中，在無血清培養(yǎng)液CHOS SFMII(Invitrogen公司)中培養(yǎng)二天后加入新酶素，用有限密度稀釋法進(jìn)行克隆培養(yǎng)，大約14天后挑取新酶素抗性克隆進(jìn)行細(xì)胞的擴(kuò)大培養(yǎng)并在液氮中冷凍收藏。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后的CHOS細(xì)胞可在轉(zhuǎn)鼓培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)生產(chǎn)優(yōu)化融合蛋白，此方法可用于獲取大量的優(yōu)化融合蛋白，其濃度可用ELISA法定量確定。
例7融合蛋白的純化包含融合蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)液可采取葡萄球菌A蛋白親和層析的方法進(jìn)行純化。將蛋白A-Sepharose層析柱以PBS緩沖液洗以平衡后，以2毫升/分鐘的速度將超濾器濃縮過的培養(yǎng)液上樣，用PBS緩沖液洗直至未結(jié)合的蛋白全被洗脫(以A280進(jìn)行監(jiān)測)，然后用100mM的檸檬酸(PH 3)洗脫結(jié)合蛋白，立刻以足夠多的2MIris進(jìn)行中和。純化后的融合蛋白可用ELISA法或A280吸收法確定濃度，并可置-20℃儲存。
實(shí)施例3融合蛋白與VEGF的體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)本發(fā)明利用高特異性和高靈敏度的VEGF檢測藥盒(R&D Systems公司)來確定各融合蛋白和VEGF的親和力。實(shí)驗(yàn)中，將不同濃度(0到1000pM)的YY-001到Y(jié)Y-008融合蛋白和10pM的人VEGF165(Sigma公司)在室溫下相混合，培養(yǎng)過夜后用VEGF檢測藥盒來檢測沒有被融合蛋白結(jié)合的自由VEGF濃度。原始實(shí)驗(yàn)結(jié)果在圖2顯示，經(jīng)Prism4軟件(GraphPad公司)Sigmoidal非線性擬合后所得到的親和力及其標(biāo)準(zhǔn)偏差在表1中顯示。
其中現(xiàn)有技術(shù)公開的融合蛋白YY-001在這個(gè)實(shí)驗(yàn)條件下沒有可檢測到的親和力，而包含肽連接段G9、G12、和GS的優(yōu)化融合蛋白YY-002、YY-003、YY-004都顯示了優(yōu)良的VEGF親和力，大約為1pM，比YY-001提高了至少千倍以上。另外，現(xiàn)有技術(shù)公開的融合蛋白YY-005的親和力也是1pM左右，與之類似的包含肽連接段G9、G12、和GS的優(yōu)化融合蛋白YY-006、YY-007、YY-008的VEGF親和力則提高了約十倍，高達(dá)0.1pM，其中YY-007和YY-008比YY-006的VEGF親和力更是高大約10％。
實(shí)施例4優(yōu)化融合蛋白能有效地抑制小鼠腫瘤的生長人類腫瘤細(xì)胞在BALB/C裸鼠(Simonsen Labratories公司)體內(nèi)生長的異種移植(Xenograft)模型是與人體腫瘤最為接近的動(dòng)物腫瘤模型。本發(fā)明利用了二種人類腫瘤細(xì)胞，HCC Hep3B肝癌和Lovo大腸癌細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)建立了腫瘤模型，并以本發(fā)明中的優(yōu)化融合蛋白作為VEGF阻斷劑用來抑制腫瘤的生長。
例8制備含融合蛋白的注射劑優(yōu)化融合蛋白的注射劑可由多種配方制備而成，通常該融合蛋白的濃度為0.1mg/ml到100mg/ml，另外的成分包括但不限于各種載體蛋白、緩沖劑、電解質(zhì)離子、和緩釋劑。其中一種較佳的配方為20mg/ml的優(yōu)化融合蛋白、5mM Phosphate、5mM Citrate、100mM NaCl、0.1％Tween 20、20％Sucrose、pH6.0，按照注射劑的常規(guī)制備方法制成。
例9優(yōu)化融合蛋白能有效地抑制HCC Hep3B肝癌在裸鼠內(nèi)的生長本實(shí)驗(yàn)中挑選生長良好的BALB/C裸鼠，每只在背部皮下注射2×106HCC Hep3B肝癌細(xì)胞，0.05ml，在尾靜脈注射提各種融合蛋白，用量為2mg/kg，每周兩次一直到第七周，對照組注射相同劑量的人免疫球蛋白Fc。腫瘤的體積每周按W×(L)2/2的方法測量一次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示?，F(xiàn)有技術(shù)公開的YY-001和Fc對照組一樣對腫瘤的生長沒有抑制作用，此結(jié)果和YY-001沒有可觀察到的VEGF親和力一致。而類似于YY-001的優(yōu)化融合蛋白YY-003則表現(xiàn)出了顯著的抗癌作用，同時(shí)，現(xiàn)有技術(shù)公開的，和YY-003具有相近VEGF親和力的YY-005也表現(xiàn)出了類似的抗癌功能，進(jìn)一步證明了這些融合蛋白對腫瘤細(xì)胞生長的抑制作用與它們對VEGF的親和力成正比。同時(shí)，本發(fā)明所提供的VEGF親和力最高的優(yōu)化融合蛋白YY-007顯示了卓越的抗癌作用，七周內(nèi)注射它們的小鼠中幾乎觀察不到腫瘤的生長。
例10優(yōu)化融合蛋白能有效地抑制Lovo大腸癌在裸鼠內(nèi)的生長本實(shí)驗(yàn)過程如同上例，只是在每只裸鼠皮下注射了5×106Lovo大腸癌細(xì)胞。同樣在尾靜脈注射提各種融合蛋白，用量為2mg/kg，每周兩次一直到第七周，對照組注射相同劑量的人免疫球蛋白Fc。腫瘤的體積每周測量一次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。同上例的結(jié)果類似，這些融合蛋白對腫瘤細(xì)胞生長的抑制作用與它們對VEGF的親和力成正比。YY-001和Fc對照組沒有抗癌作用，YY-003和YY-005都顯示了良好的抗癌效果，而YY-007則顯示了最優(yōu)的抗癌效果，完全抑制了腫瘤細(xì)胞在小鼠體內(nèi)的生長。
實(shí)施例5以腺相關(guān)病毒AAV表達(dá)優(yōu)化融合蛋白及其醫(yī)療應(yīng)用腺相關(guān)病毒AAV在體內(nèi)本身不能復(fù)制、可以感染多中人體細(xì)胞、并能在體內(nèi)長期表達(dá)重組蛋白，因此在基因治療上有著廣泛的用途。本發(fā)明應(yīng)用表達(dá)優(yōu)化融合蛋白的腺相關(guān)病毒在視網(wǎng)膜血管病變AMD的小鼠模型CNV中取得了良好的治療效果。
例11重組AAV載體的構(gòu)造表達(dá)優(yōu)化融合蛋白YY-007的腺相關(guān)病毒AAV2是利用AAV Helper-free藥盒(Invitrogen公司)建造而得，此藥盒包括三種質(zhì)粒，pAAV-MCS、pAAV-RC、和pHelper，以及AAV-293細(xì)胞，它通過同時(shí)轉(zhuǎn)染這三種質(zhì)粒到AAV-293細(xì)胞中的方法來獲得重組AAV2病毒。需要表達(dá)的重組蛋白必須克隆到pAAV-MCS中的CMV啟動(dòng)子和hGH的多聚腺苷酸(PolyA)序列之間以保證其最佳的表達(dá)。
本發(fā)明中以EcoRI和XbaI酶切表達(dá)YY-007的重組質(zhì)粒后，將得到的～1.4kb DNA片段克隆到pAAV-MCS的EcoRI和XbaI酶切位點(diǎn)，以獲得重組質(zhì)粒pAAV-YY-007，然后將其和pAAV-RC、pHelper一起轉(zhuǎn)染到AAV-293細(xì)胞中獲得了表達(dá)YY-007的重組AAV2病毒。
例12重組AAV2表達(dá)的YY-007在小鼠中能夠抑制CNV的生成本實(shí)驗(yàn)在小鼠通過激光誘發(fā)脈絡(luò)膜新生血管CNV以建立視網(wǎng)膜血管病變AMD的動(dòng)物模型。小鼠被鹽酸氯胺酮(100mg/kg)麻醉后，以1％托品酰胺散瞳，然后如文獻(xiàn)(Tobe et al，American Journal of Pathology，1998，1531641-1646)所述，在每只眼睛的三個(gè)不同位置激光光凝破壞Bruch膜。激光光凝(激光功率120mW，曝光時(shí)間0.1s，光斑直徑75μm)通過裂隙燈和手提聚焦鏡灼燒到距離視神經(jīng)2-3個(gè)視盤直徑的9點(diǎn)、12點(diǎn)、和3點(diǎn)鐘位置。Bruch膜破裂產(chǎn)生的氣泡是一個(gè)誘發(fā)脈絡(luò)膜新生血管的重要指標(biāo)，因此本實(shí)驗(yàn)僅包括了產(chǎn)生氣泡的灼燒點(diǎn)。激光光凝后，小鼠的右眼由玻璃體腔注射5微升共5×109個(gè)AAV2-YY-007病毒體，左眼作為對照組不接受任何處理。二個(gè)星期后，小鼠被處死并如文獻(xiàn)(Mori et al，Investigative Ophthalomology & Visual Science，2002，43(6)1994-2000)所述方法檢測脈絡(luò)膜新生血管的程度，結(jié)果如圖5所顯示，YY-007能夠抑制激光誘發(fā)CNV的生成。
例13重組AAV2表達(dá)的YY-007在小鼠中能夠預(yù)防CNV的生成本實(shí)驗(yàn)中通過重組AAV2在小鼠眼睛內(nèi)表達(dá)YY-007后，再接受激光誘發(fā)脈絡(luò)膜新生血管CNV，以檢測YY-007對CNV的預(yù)防效果。小鼠的右眼由玻璃體腔注射5微升共5×109個(gè)AAV2-YY-007病毒體，左眼作為對照組不接受任何處理。二個(gè)月后，如同例12，激光光凝破壞Bruch膜二個(gè)星期后檢測CNV的生成。結(jié)果如表2所顯示，YY-007具有明顯的預(yù)防CNV的效果。
綜上所述，本發(fā)明所提供的包含肽連接段的優(yōu)化融合蛋白質(zhì)大大提高了結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和對VEGF的親和性，并能在體內(nèi)阻斷血管新生。在動(dòng)物模型中，這些優(yōu)化融合蛋白能夠高效地抑制腫瘤的生長，可用于多種腫瘤的治療，也可以有效的治療視網(wǎng)膜血管病變AMD，是可能用于治療多種與VEGF相關(guān)疾病的高校血管新生抑制劑。
序列表<110>余波、童麗琴<120>包含VEGF受體片段的優(yōu)化融合蛋白質(zhì)及其醫(yī)療應(yīng)用<160>14<210>1<211>93<212>PRT<213>人工序列<400>1Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile His Met Thr1 5 10 15Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro Asn Ile20 25 30Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro Asp Gly35 40 45Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser Asn Ala50 55 60Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly65 70 75 80His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg Gln Thr85 90 93<210>2<211>102<212>PRT<213>人工序列<400>2Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys1 5 10 15Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp20 25 30Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His Lys Lys Leu Val35 40 45Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu50 55 60
Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr65 70 75 80Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe85 90 95Val Arg Val His Glu Lys100 102<210>3<211>227<212>PRT<213>人工序列<400>3Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Leu Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly1 5 10 15Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met20 25 30Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His35 40 45Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val50 55 60His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr65 70 75 80Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly85 90 95Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile100 105 110Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val115 120 125Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser130 135 140Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu145 150 155 160Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Ala Thr Pro Pro165 170 175Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val180 185 190Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met195 200 205His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser2l0 215 220Pro Gly Lys225 227
<210>4<211>9<212>PRT<213>人工序列<400>4Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly1 5 9<210>5<211>12<212>PRT<213>人工序列<400>5Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly1 5 10 12<210>6<211>15<212>PRT<213>人工序列<400>6Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser1 5 10 15<210>7<211>1029<212>DNA<213>人工序列<400>71 tccggatcaa aattaaaaga tccagatctg actatctata tatttattag tgataccggt61 agaccttttg tagagatgta cagtgaaatc cccgaaatta tacacatgac tgaaggaagg121 gagctcgtca ttccctgccg ggttacgtca cctaacatca ctgttacttt aaaaaagttt181 ccacttgaca ctttgatccc tgatggaaaa cgcataatct gggacagtag aaagggcttc241 atcatatcaa atgcaacgta caaagaaata gggcttctga cctgtgaagc aacagtcaat301 gggcatttgt ataagacaaa ctatctcaca catcgacaat tcgaagacaa aactcacaca361 tgcccactgt gcccagcacc tgaactcctg gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca
421 aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac481 gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat541 aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc601 ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac661 aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa721 ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg781 acctgcctag tcaaaggctt ctatcccagc gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg841 cagccggaga acaactacaa ggccacgcct cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc901 ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc961 tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg1021 ggtaaatga<210>8<211>1050<212>DNA<213>人工序列<400>81 tccggatcaa aattaaaaga tccagatctg actatctata tatttattag tgataccggt61 agaccttttg tagagatgta cagtgaaatc cccgaaatta tacacatgac tgaaggaagg121 gagctcgtca ttccctgccg ggttacgtca cctaacatca ctgttacttt aaaaaagttt181 ccacttgaca ctttgatccc tgatggaaaa cgcataatct gggacagtag aaagggcttc241 atcatatcaa atgcaacgta caaagaaata gggcttctga cctgtgaagc aacagtcaat301 gggcatttgt ataagacaaa ctatctcaca catcgacaag gtggaggcgg aggtggcgga361 ggtggagaca aaactcacac atgcccactg tgcccagcac ctgaactcct ggggggaccg421 tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag481 gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac541 gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc601 acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag661 tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa721 gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatcccg ggatgagctg781 accaagaacc aggtcagcct gacctgccta gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc841 gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca aggccacgcc tcccgtgctg901 gactccgacg gctccttctt cctctacagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag961 caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag1021 aagagcctct ccctgtctcc gggtaaatga<210>9<211>1059<212>DNA<213>人工序列<400>9
1 tccggatcaa aattaaaaga tccagatctg actatctata tatttattag tgataccggt61 agaccttttg tagagatgta cagtgaaatc cccgaaatta tacacatgac tgaaggaagg121 gagctcgtca ttccctgccg ggttacgtca cctaacatca ctgttacttt aaaaaagttt181 ccacttgaca ctttgatccc tgatggaaaa cgcataatct gggacagtag aaagggcttc241 atcatatcaa atgcaacgta caaagaaata gggcttctga cctgtgaagc aacagtcaat301 gggcatttgt ataagacaaa ctatctcaca catcgacaag gtggaggcgg aggtggcgga361 ggtggaggcg gtggtgacaa aactcacaca tgcccactgt gcccagcacc tgaactcctg421 gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg481 acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc541 aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag601 tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat661 ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc721 atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg781 gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctag tcaaaggctt ctatcccagc841 gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa ggccacgcct901 cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc961 aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac1021 tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaatga<210>10<211>1068<212>DNA<213>人工序列<400>101 tccggatcaa aattaaaaga tccagatctg actatctata tatttattag tgataccggt61 agaccttttg tagagatgta cagtgaaatc cccgaaatta tacacatgac tgaaggaagg121 gagctcgtca ttccctgccg ggttacgtca cctaacatca ctgttacttt aaaaaagttt181 ccacttgaca ctttgatccc tgatggaaaa cgcataatct gggacagtag aaagggcttc241 atcatatcaa atgcaacgta caaagaaata gggcttctga cctgtgaagc aacagtcaat301 gggcatttgt ataagacaaa ctatctcaca catcgacaag gtggaggtgg ctccggtggc361 ggtggcagcg gcggtggcgg atctgacaaa actcacacat gcccactgtg cccagcacct421 gaactcctgg ggggaccgtc agtcttcctc ttccccccaa aacccaagga caccctcatg481 atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg gtggtggacg tgagccacga agaccctgag541 gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg601 gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac661 tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag gtctccaaca aagccctccc agcccccatc721 gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc781 ccatcccggg atgagctgac caagaaccag gtcagcctga cctgcctagt caaaggcttc841 tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag agcaatgggc agccggagaa caactacaag901 gccacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc tccttcttcc tctacagcaa gctcaccgtg961 gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg1021 cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc ctgtctccgg gtaaatga
<210>11<211>1305<212>DNA<213>人工序列<400>111 tccggaggta gacctttcgt agagatgtac agtgaaatcc ccgaaattat acacatgact61 gaaggaaggg agctcgtcat tccctgccgg gttacgtcac ctaacatcac tgttacttta121 aaaaagtttc cacttgacac tttgatccct gatggaaaac gcataatctg ggacagtaga181 aagggcttca tcatatcaaa tgcaacgtac aaagaaatag ggcttctgac ctgtgaagca241 acagtcaatg ggcatttgta taagacaaac tatctcacac atcgacaaac caatacaatc301 atagatgtgg ttctgagtcc gtctcatgga attgaactat ctgttggaga aaagcttgtc361 ttaaattgta cagcaagaac tgaactaaat gtggggattg acttcaactg ggaataccct421 tcttcgaagc atcagcataa gaaacttgta aaccgagacc taaaaaccca gtctgggagt481 gagatgaaga aatttttgag caccttaact atagatggtg taacccggag tgaccaagga541 ttgtacacct gtgcagcatc cagtgggctg atgaccaaga agaacagcac atttgtcagg601 gtccatgaaa agggcccggg cgacaaaact cacacatgcc cactgtgccc agcacctgaa661 ctcctggggg gaccgtcagt cttcctcttc cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc721 tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc781 aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag841 gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtc agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg901 ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc tccaacaaag ccctcccagc ccccatcgag961 aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca1021 tcccgggatg agctgaccaa gaaccaggtc agcctgacct gcctagtcaa aggcttctat1081 cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc aatgggcagc cggagaacaa ctacaaggcc1141 acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc ttcttcctct acagcaagct caccgtggac1201 aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac1261 aaccactaca cgcagaagag cctctccctg tctccgggta aatga<210>12<211>1321<212>DNA<213>人工序列<400>121 tccggaggta gacctttcgt agagatgtac agtgaaatcc ccgaaattat acacatgact61 gaaggaaggg agctcgtcat tccctgccgg gttacgtcac ctaacatcac tgttacttta121 aaaaagtttc cacttgacac tttgatccct gatggaaaac gcataatctg ggacagtaga181 aagggcttca tcatatcaaa tgcaacgtac aaagaaatag ggcttctgac ctgtgaagca241 acagtcaatg ggcatttgta taagacaaac tatctcacac atcgacaaac caatacaatc301 atagatgtgg ttctgagtcc gtctcatgga attgaactat ctgttggaga aaagcttgtc361 ttaaattgta cagcaagaac tgaactaaat gtggggattg acttcaactg ggaataccct
421 tcttcgaagc atcagcataa gaaacttgta aaccgagacc taaaaaccca gtctgggagt481 gagatgaaga aatttttgag caccttaact atagatggtg taacccggag tgaccaagga541 ttgtacacct gtgcagcatc cagtgggctg atgaccaaga agaacagcac atttgtcagg601 gtccatgaaa agggtggagg cggaggtggc ggaggtggag acaaaactca cacatgccca661 ctgtgcccag cacctgaact cctgggggga ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc721 aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc781 cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc841 aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc901 gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc961 ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag1021 gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc1081 ctagtcaaag gcttctatcc cagcgacatc gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg1141 gagaacaact acaaggccac gcctcccgtg ctggactccg acggctcctt cttcctctac1201 agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg1261 atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa1321 tga<210>13<211>1332<212>DNA<213>人工序列<400>131 tccggaggta gacctttcgt agagatgtac agtgaaatcc ccgaaattat acacatgact61 gaaggaaggg agctcgtcat tccctgccgg gttacgtcac ctaacatcac tgttacttta121 aaaaagtttc cacttgacac tttgatccct gatggaaaac gcataatctg ggacagtaga181 aagggcttca tcatatcaaa tgcaacgtac aaagaaatag ggcttctgac ctgtgaagca241 acagtcaatg ggcatttgta taagacaaac tatctcacac atcgacaaac caatacaatc301 atagatgtgg ttctgagtcc gtctcatgga attgaactat ctgttggaga aaagcttgtc361 ttaaattgta cagcaagaac tgaactaaat gtggggattg acttcaactg ggaataccct421 tcttcgaagc atcagcataa gaaacttgta aaccgagacc taaaaaccca gtctgggagt481 gagatgaaga aatttttgag caccttaact atagatggtg taacccggag tgaccaagga541 ttgtacacct gtgcagcatc cagtgggctg atgaccaaga agaacagcac atttgtcagg601 gtccatgaaa agggtggagg cggaggtggc ggaggtggag gcggtggtga caaaactcac661 acatgcccac tgtgcccagc acctgaactc ctggggggac cgtcagtctt cctcttcccc721 ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg781 gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg841 cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc901 gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc961 aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga1021 gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc1081 ctgacctgcc tagtcaaagg cttctatccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat1141 gggcagccgg agaacaacta caaggccacg cctcccgtgc tggactccga cggctccttc1201 ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca
1261 tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct1321 ccgggtaaat ga<210>14<211>1341<212>DNA<213>人工序列<400>141 tccggaggta gacctttcgt agagatgtac agtgaaatcc ccgaaattat acacatgact61 gaaggaaggg agctcgtcat tccctgccgg gttacgtcac ctaacatcac tgttacttta121 aaaaagtttc cacttgacac tttgatccct gatggaaaac gcataatctg ggacagtaga181 aagggcttca tcatatcaaa tgcaacgtac aaagaaatag ggcttctgac ctgtgaagca241 acagtcaatg ggcatttgta taagacaaac tatctcacac atcgacaaac caatacaatc301 atagatgtgg ttctgagtcc gtctcatgga attgaactat ctgttggaga aaagcttgtc361 ttaaattgta cagcaagaac tgaactaaat gtggggattg acttcaactg ggaataccct421 tcttcgaagc atcagcataa gaaacttgta aaccgagacc taaaaaccca gtctgggagt481 gagatgaaga aatttttgag caccttaact atagatggtg taacccggag tgaccaagga541 ttgtacacct gtgcagcatc cagtgggctg atgaccaaga agaacagcac atttgtcagg601 gtccatgaaa agggtggagg tggctccggt ggcggtggca gcggcggtgg cggatctgac661 aaaactcaca catgcccact gtgcccagca cctgaactcc tggggggacc gtcagtcttc721 ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc781 gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc841 gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt901 gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga atggcaagga gtacaagtgc961 aaggtctcca acaaagccct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg1021 cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggatgagct gaccaagaac1081 caggtcagcc tgacctgcct agtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg1141 gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aaggccacgc ctcccgtgct ggactccgac1201 ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac1261 gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc1321 tccctgtctc cgggtaaatg a
權(quán)利要求
1.一種融合蛋白質(zhì)，由來自VEGF受體的不同片段與人免疫球蛋白Fc構(gòu)成，其特征在于，受體片段和Fc之間由一個(gè)優(yōu)化肽連接段相連，該肽連接段選自以下組a.Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly，表示為G9；b.Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly，表示為G12；c.Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser，表示為GS；d.任何一個(gè)長度為4到30的氨基酸序列，其具有彈性結(jié)構(gòu)并能增加融合蛋白的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和生物活性。
2.如權(quán)利要求1所述的融合蛋白質(zhì)，其中VEGF的受體片段選自以下組a.VEGFR-1的的第2免疫球蛋白樣區(qū)域，表示為D2，氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所述；b.VEGFR-2的的第3免疫球蛋白樣區(qū)域，表示為D3，氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所述；c.包括VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3、和VEGFR-4的所有VEGF受體的細(xì)胞外免疫球蛋白樣區(qū)域。
3.如權(quán)利要求1所述的融合蛋白質(zhì)，其中人免疫球蛋白Fc來自于IgG1，氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.3所述。
4.如權(quán)利要求1所述的融合蛋白質(zhì)，表示為YY-002D2-G9-FcYY-003D2-G12-FcYY-004D2-GS-FcYY-006D2D3-G9-FcYY-007D2D3-G12-FcYY-008D2D3-GS-Fc其中D2的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所述；D3的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所述；Fc的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.3所述；G9，G12，GS的氨基酸序列如權(quán)利要求1所述。
5.如權(quán)利要求3所述的融合蛋白質(zhì)，其中該免疫球蛋白Fc片段是編碼Fc全長序列或部分Fc序列。
6.編碼權(quán)利要求1-5的融合蛋白質(zhì)的重組DNA，其DNA序列見序列表中的SEQID NO.8，9，10，12，13，14。
7.包含權(quán)利要求6所述重組DNA的重組載體，該載體選自質(zhì)粒、病毒或DNA片段。
8.如權(quán)利要求7中的重組載體，其中所述病毒是腺相關(guān)病毒，包括血清型1、2、5、6、7、和8。
9.含權(quán)利要求7所述重組載體的重組體，其中宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞或原核細(xì)胞，包括應(yīng)用了DHFR/MTX或GS/MSX基因擴(kuò)增系統(tǒng)的宿主細(xì)胞。
10.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述融合蛋白質(zhì)在制備抑制血管新生的藥物中的應(yīng)用。
11.如權(quán)利要求10的應(yīng)用，其中所述抑制血管新生的藥物是治療血管新生相關(guān)疾病的藥物，所述血管新生相關(guān)疾病包括腫瘤、視網(wǎng)膜血管病變、糖尿病視網(wǎng)膜病變、關(guān)節(jié)炎、貧血或子宮內(nèi)膜增殖癥。
12.一種藥物組合物，包括如權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述融合蛋白質(zhì)及藥學(xué)上可接受的載體，所述組合物是注射劑、粉針劑、冷凍干燥劑或鼻腔噴霧劑。
13.如權(quán)利要求12所述的藥物組合物，其特征在于，還包括任何一種或幾種其他的具有協(xié)同作用的抑制血管新生的藥物，所述組合物可以和其他治療方法一起治療血管新生相關(guān)疾病，所述其他治療方法選自化學(xué)療法、反射療法、基因療法，所述血管新生疾病包括腫瘤、視網(wǎng)膜血管病變、糖尿病視網(wǎng)膜病變、關(guān)節(jié)炎、貧血或子宮內(nèi)膜增殖癥。
全文摘要
本發(fā)明提供了一系列全新的VEGF受體片段和人免疫球蛋白Fc的優(yōu)化融合蛋白，它們包含了一系列彈性結(jié)構(gòu)的肽連接段，大大提高了融合蛋白的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和生物活性，使得這些優(yōu)化融合蛋白具有更高的VEGF親和力，并能在體內(nèi)更有效地抑制血管新生，達(dá)到治療多種腫瘤和視網(wǎng)膜血管病變AMD等與VEGF相關(guān)疾病的效果。本發(fā)明包括這些能抑制血管新生的優(yōu)化融合蛋白、及其編碼重組DNA序列和表達(dá)載體、該重組蛋白的藥物用途、含有該重組蛋白的藥物及其制劑，及運(yùn)載和表達(dá)該重組蛋白的基因治療方法。
文檔編號A61K39/395GK1793179SQ200510115530
公開日2006年6月28日 申請日期2005年11月4日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月4日
發(fā)明者余波, 童麗琴 申請人:余波, 童麗琴