專利名稱：香豆素衍生物及其制法和其藥物組合物與用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明公開(kāi)了新結(jié)構(gòu)類型的香豆素及二氫喹啉酮衍生物及其藥用鹽、這類化合物的制備方法、含有這類化合物的藥物組合物，特別是用于制備治療慢性腎衰、糖尿病、高血壓和心腦血管疾患以及肝硬化和前列腺肥大藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
在以前的研究中合成了一系列香豆素衍生物(中國(guó)專利——徐世平等，申請(qǐng)?zhí)?2155525.7，申請(qǐng)日2002年12月5日；國(guó)際專利(PCT)——國(guó)際申請(qǐng)?zhí)朠CT/CN03/01046，國(guó)際申請(qǐng)日2003年12月5日，優(yōu)先權(quán)日2002年12月5日)，具有較好的抗腎衰和降壓作用，對(duì)某些器官的纖維化有治療作用?；谏鲜鼋Y(jié)果我們?cè)诶^續(xù)研究中證明，本發(fā)明合成的一系列新香豆素，和一系列二氫喹啉酮衍生物。本發(fā)明化合物具有顯著的抑制轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGFβ1)和降低血管緊張素II(AngII)及腎素的作用，因此本發(fā)明的化合物具有潛在的治療慢性腎衰、高血壓、糖尿病、肝硬化和前列腺肥大及肺纖維化的作用。
藥理試驗(yàn)表明，在我們研究的新一代的化合物中，部分化合物對(duì)順鉑(Cisplatin)引起體外培養(yǎng)的大鼠腎系膜細(xì)胞、人腎小管上皮細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用；在體內(nèi)可顯著地降低Cisplatin所致急性大鼠腎損傷血清尿素氮(BUN)和肌酐(Scr)水平及尿蛋白(UP)水平，減小Cisplatin引起的腎水腫；同時(shí)亦可降低5/6腎切除模型大鼠血清BUN水平、Scr水平及尿蛋白(UP)水平；降低鏈脲霉素所致大鼠糖尿病腎病尿蛋白水平。其腎保護(hù)、降壓以及降低糖尿病腎病尿蛋白水平可能不同于血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑(ACEI)及血管緊張素IIAT1型受體拮抗劑(AT1RA)。而與抑制TGF-β1和降低腎組織TGF-β1mRNA表達(dá)以及抑制細(xì)胞分泌的基質(zhì)金屬蛋白酶活性有關(guān)。從而抑制腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化。這些化合物將可能用于緩解Cisplatin腫瘤化療的腎臟毒性；用于治療由高血壓和糖尿病所導(dǎo)致的慢性腎功能不全；預(yù)防和治療各種原因引起的腎小球硬化和腎臟纖維化；用于II型糖尿病的治療以預(yù)防進(jìn)一步糖尿病腎病的發(fā)生。
為了活性測(cè)定方面的便利，在這里采用了，以藥物對(duì)順鉑所致的腎毒性的保護(hù)作用，來(lái)初步評(píng)價(jià)化合物的活性和療效。
為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)化合物的療效，也采用了5/6腎切除模型大鼠，作進(jìn)一步研究，以確定本發(fā)明化合物的療效。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一類新的香豆素及二氫喹啉酮衍生物其異構(gòu)體和其藥用鹽；本發(fā)明要解決的另一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供這類化合物的制備方法；本發(fā)明要解決的又一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供一類新的藥物組合物，其含有本發(fā)明的化合物及制藥領(lǐng)域常用的載體。
本發(fā)明要解決的再一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供這類新的化合物在制備治療慢性腎衰、糖尿病、高血壓和心腦血管疾患以及肝硬化和前列腺肥大藥物中的應(yīng)用。
為解決的上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用如下的技術(shù)方案本發(fā)明涉及如通式I所示的化合物 其中X選自O(shè)，NH，R選自C1-C6直鏈或分支烷基W選自CO，CH2，R3選自未取代或取代的N-吡咯基，(吡咯環(huán)上的取代基為R10，其中R10為羧基，C1-C4酮基，酯基，羰烷基，未取代或取代的羰基苯基，苯環(huán)上的取代基為H，鹵素，C1-C4甲氧基，NO2)；未取代單取代或多取代的咪唑基或吡唑基，(咪唑基或吡唑基上的取代基選自H，C1-C6烷基，CF3，CHO，CO2H，CO2C2H5)；取代的羰基-N-吲哚基，(吲哚環(huán)上的取代基為H，C1-C4烷羰基)；NHR13，其中R13選自-CH(CO2CH3)CH2C6H4-OH-4”，未取代、單或多取代的苯基，(苯環(huán)上的取代基為鹵素，OH，C1-C4烷氧基，羧基，C1-C4酯基，C1-C4羧基烷氧基，1”，2”，3”，4”-唑基，等)；R6選自H，C1-C4烷基，NO2，R7選自H，OH，C1-C4烷氧基；R8選自H，C1-C8烷基，烷氧基，NO2；為完成本發(fā)明的目的，優(yōu)選的化合物包括但不限定于如通式(Ia)所示的化合物
其中XR，R6，R7，R8所代表的基團(tuán)與通式(I)的各種情況下相同；R11選自C6H5-，p-HO-C6H4-，p-HO2C-C6H4-，p-EtO2C-C6H4-，m-HO2CCH2CH2-C6H4-，3’-HO-4’-HO2C-C6H3-，3’-HO2C-4’-HO-C6H3-，3’-Cl-4’-HO2C-C6H3-，-CH2CH2C6H4-OH-4’，-CH(CO2CH3)CH2C6H4-OH-4’， 為完成本發(fā)明的目的，優(yōu)選的化合物還包括但不限定于如通式(Ib)所示的化合物 其中XR，R6，R7，R8所代表的與通式(I)的各種情況下相同；R12選自N-(取代的吡咯基)即( 其中R10選自COCH3，CO2CH3，2’-COC6H5，3’-CO-C6H5，2’-CO-C6H4-Cl-4”，3’-CO-C6H4-Cl-4”，2’-CO-C6H4-OCH3-4”，3’-CO-C6H4-OCH3-4”，2’-CO-C6H4-NO2-4”，3’-CO-C6H4-NO2-4”)；N-(取代的咪唑基)即( 其中R10a或R10b選自CH3，CO2H，CO2C2H5，)；或吡唑基即( 其中R10c或R10d選自CH3，C3H7，CF3，CO2H，CO2C2H5)；N-(3’-取代的吲哚基)即
為完成本發(fā)明的目的，優(yōu)選的化合物包括但不限定于如通式(I)代表的下列表中的化合物，其中XR代表的基團(tuán)如標(biāo)出的，W-R1，R2-R4代表的基團(tuán)，除標(biāo)出者外，其它均為H；R2’-R6’代表的基團(tuán)，除標(biāo)出者外，其它均為H；除標(biāo)出 的R10者外，其它均為 的取代基。
表1


在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“鹵素″是指氟、氯、溴、碘。術(shù)語(yǔ)“低級(jí)烷基”“低級(jí)烷”是1-6碳原子的直鏈或支鏈的烷基。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明化合物可以異構(gòu)體的形式存在，而且通常所述的“本發(fā)明化合物”包括該化合物的異構(gòu)體。
本發(fā)明化合物可存在雙鍵的順?lè)串悩?gòu)體，不對(duì)稱中心具有S構(gòu)型或R構(gòu)型，本發(fā)明包括所有可能的立體異構(gòu)體以及兩種或多種異構(gòu)體的混合物。如果存在順/反異構(gòu)體，本發(fā)明涉及順式形式和反式形式以及這些形式的混合物，如果需要單一異物體可根據(jù)常規(guī)方法分離或通過(guò)立體選擇合成制備。
根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，所述的本發(fā)明化合物還包括其藥效學(xué)上可接受的鹽、鹽的水合物、酯或前體藥物。
根據(jù)本發(fā)明還涉及制備本發(fā)明化合物的方法，3-羧基的各種取代香豆素、與相應(yīng)的各種取代氨類化合物反應(yīng)制備。酰氨化反應(yīng)是在合適的反應(yīng)劑、催化劑及合適的溶劑條件下進(jìn)行的。另外一類化合物的制備是，用各種取代的苯胺類化合物與氯代乙酰氯進(jìn)行反應(yīng)，得部分本發(fā)明化合物的中間體。以這些中間體與三氯氧磷及二甲基甲酰胺反應(yīng)，生成取代的喹啉，然后與相應(yīng)的各種取代吡咯化合物反應(yīng)，所得產(chǎn)物水解后得各種目的化合物。這些化反應(yīng)是在合適的反應(yīng)劑、催化劑以及合適的溶劑條件下進(jìn)行的。這些反應(yīng)劑包括三氯化磷、三氯氧磷、五氯化磷、二氯亞砜、草酰氯、乙酸酐以及硫酸二甲酯、碘甲烷、1，3-二環(huán)己基亞胺(DCC)、二吡啶碳酸酯(2-DPC)、1，3-二異丙基碳酰亞胺(DIPC)、1-(3-二甲胺丙基)-3-乙基碳酰亞胺(EDCI)等。其中優(yōu)選的反應(yīng)劑為五氯化磷、三氯氧磷、N，N-二甲基甲酰胺、三氯化磷和二氯亞砜、草酰氯，更優(yōu)選五氯化磷、三氯氧磷、二氯亞砜。制備本發(fā)明化合物所使用的催化劑包括三級(jí)胺、吡啶、4-二甲氨基吡啶和4-吡咯烷基吡啶等。其中優(yōu)選為三級(jí)胺和吡啶。更優(yōu)選為吡啶。反應(yīng)在適宜的溶劑中或上述縮合劑中進(jìn)行，如二氯甲烷、1，2-二氯乙烷、乙二醇二甲醚、四氫呋喃和N，N-二甲基甲酰胺(DMF)等。其中優(yōu)選為甲苯、DMSO和DMF，更優(yōu)選甲苯和DMF。反應(yīng)溫度為10-110℃，優(yōu)選為20-90℃，更優(yōu)選為30-80℃，特別優(yōu)選為50-70℃。
下列反應(yīng)方程式具體說(shuō)明
本發(fā)明因此還涉及含有作為活性成份的本發(fā)明化合物和常規(guī)藥物賦形劑或輔劑的藥物組合物。通常本發(fā)明藥物組合物含有0.1-95重量％的本發(fā)明化合物。
本發(fā)明化合物的藥物組合物可根據(jù)本領(lǐng)域公知的方法制備。用于此目的時(shí)，如果需要，可將本發(fā)明化合物與一種或多種固體或液體藥物賦形劑和/或輔劑結(jié)合，制成可作為人藥或獸藥使用的適當(dāng)?shù)氖┯眯问交騽┝啃问健?br> 本發(fā)明化合物或含有它的藥物組合物可以單位劑量形式給藥，給藥途徑可為腸道或非腸道，如口服、肌肉、皮下、鼻腔、口腔粘膜、皮膚、腹膜或直腸等。
本發(fā)明化合物或含有它的藥物組合物的給藥途徑可為注射給藥。注射包括靜脈注射、肌肉注射、皮下注射、皮內(nèi)注射和穴位注射等。
給藥劑型可以是液體劑型、固體劑型。如液體劑型可以是真溶液類、膠體類、微粒劑型、乳劑劑型、混懸劑型。其他劑型例如片劑、膠囊、滴丸、氣霧劑、丸劑、粉劑、溶液劑、混懸劑、乳劑、顆粒劑、栓劑、凍干粉針劑等。
本發(fā)明化合物可以制成普通制劑、也可以是緩釋制劑、控釋制劑、靶向制劑及各種微粒給藥系統(tǒng)。
為了將單位給藥劑型制成片劑，可以廣泛使用本領(lǐng)域公知的各種載體。關(guān)于載體的例子是，例如稀釋劑與吸收劑，如淀粉、糊精、硫酸鈣、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化鈉、葡萄糖、尿素、碳酸鈣、白陶土、微晶纖維素、硅酸鋁等；濕潤(rùn)劑與粘合劑，如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉漿、糊精、糖漿、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯膠漿、明膠漿、羧甲基纖維素鈉、紫膠、甲基纖維素、磷酸鉀、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解劑，例如干燥淀粉、海藻酸鹽、瓊脂粉、褐藻淀粉、碳酸氫鈉與枸櫞酸、碳酸鈣、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸鈉、甲基纖維素、乙基纖維素等；崩解抑制劑，例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氫化油等；吸收促進(jìn)劑，例如季銨鹽、十二烷基硫酸鈉等；潤(rùn)滑劑，例如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸鹽、硼酸、液體石蠟、聚乙二醇等。還可以將片劑進(jìn)一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、腸溶包衣片，或雙層片和多層片。
例如為了將給藥單元制成丸劑，可以廣泛使用本領(lǐng)域公知的各種載體。關(guān)于載體的例子是，例如稀釋劑與吸收劑，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氫化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、Gelucire、高嶺土、滑石粉等；粘合劑，如阿拉伯膠、黃蓍膠、明膠、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等；崩解劑，如瓊脂粉、干燥淀粉、海藻酸鹽、十二烷基磺酸鈉、甲基纖維素、乙基纖維素等。
例如為了將給藥單元制成膠囊，將有效成分本發(fā)明化合物與上述的各種載體混合，并將由此得到的混合物置于硬的明膠膠囊或軟膠囊中。也可將有效成分本發(fā)明化合物制成微囊劑，混懸于水性介質(zhì)中形成混懸劑，亦可裝入硬膠囊中或制成注射劑應(yīng)用。
例如，將本發(fā)明化合物制成注射用制劑，如溶液劑、混懸劑溶液劑、乳劑、凍干粉針劑，這種制劑可以是含水或非水的，可含一種和/或多種藥效學(xué)上可接受的載體、稀釋劑、粘合劑、潤(rùn)滑劑、防腐劑、表面活性劑或分散劑。如稀釋劑可選自水、乙醇、聚乙二醇、1，3-丙二醇、乙氧基化的異硬脂醇、多氧化的異硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯等。另外，為了制備等滲注射液，可以向注射用制劑中添加適量的氯化鈉、葡萄糖或甘油，此外，還可以添加常規(guī)的助溶劑、緩沖劑、pH調(diào)節(jié)劑等。這些輔料是本領(lǐng)域常用的此外，如需要，也可以向藥物制劑中添加著色劑、防腐劑、香料、矯味劑、甜味劑或其它材料。
為達(dá)到用藥目的，增強(qiáng)治療效果，本發(fā)明的藥物或藥物組合物可用任何公知的給藥方法給藥。
本發(fā)明化合物藥物組合物的給藥劑量取決于許多因素，例如所要預(yù)防或治療疾病的性質(zhì)和嚴(yán)重程度，患者或動(dòng)物的性別、年齡、體重、性格及個(gè)體反應(yīng)，給藥途徑、給藥次數(shù)、治療目的，因此本發(fā)明的治療劑量可以有大范圍的變化。一般來(lái)講，本發(fā)明中藥學(xué)成分的使用劑量是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的?？梢愿鶕?jù)本發(fā)明化合物組合物中最后的制劑中所含有的實(shí)際藥物數(shù)量，加以適當(dāng)?shù)恼{(diào)整，以達(dá)到其治療有效量的要求，完成本發(fā)明的預(yù)防或治療目的。本發(fā)明化合物的每天的合適劑量范圍本發(fā)明的化合物的用量為0.001-150mg/Kg體重，優(yōu)選為0.1-100mg/Kg體重，更優(yōu)選為1-60mg/Kg體重，最優(yōu)選為5-45mg/Kg體重。上述劑量可以單一劑量形式或分成幾個(gè)，例如二、三或四個(gè)劑量形式給藥這受限于給藥醫(yī)生的臨床經(jīng)驗(yàn)以及包括運(yùn)用其它治療手段的給藥方案。
每一種治療所需總劑量可分成多次或按一次劑量給藥。本發(fā)明的化合物或組合物可單獨(dú)服用，或與其他治療藥物或?qū)ΠY藥物合并使用并調(diào)整劑量。
用已知體內(nèi)外試驗(yàn)方法測(cè)定本發(fā)明化合物和/或組合物的活性和效果，繼續(xù)合成的香豆素和二氫喹啉類化合物，具有明顯地腎保護(hù)作用，本發(fā)明化合物對(duì)順鉑(Cisplatin)引起體外培養(yǎng)的大鼠腎系膜細(xì)胞、人腎小管上皮細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用；在體內(nèi)可顯著地降低Cisplatin所致急性大鼠腎損傷血清尿素氮(BUN)和肌酐(Scr)水平及尿蛋白(UP)水平，減小Cisplatin引起的腎水腫；同時(shí)亦可降低5/6腎切除模型大鼠血清BUN水平、Scr水平及尿蛋白(UP)水平；降低鏈脲霉素所致大鼠糖尿病腎病尿蛋白水平。
初步作用機(jī)制研究表明，其腎保護(hù)、降壓以及降低糖尿病腎病尿蛋白水平不同于血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑(ACEI)及血管緊張素II AT1型受體拮抗劑(AT1RA)。而與抑制TGF-β1和降低腎組織TGF-β1 mRNA表達(dá)以及抑制細(xì)胞分泌的基質(zhì)金屬蛋白酶活性有關(guān)。其主要途徑可能歸結(jié)為對(duì)TGF-β1的抑制，從而抑制腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化。
本發(fā)明化合物31將可能用于緩解Cisplatin腫瘤化療的腎臟毒性；用于治療由高血壓和糖尿病所導(dǎo)致的慢性腎功能不全；預(yù)防和治療各種原因引起的腎小球硬化和腎臟纖維化；用于II型糖尿病的治療以預(yù)防進(jìn)一步糖尿病腎病的發(fā)生。


圖1本發(fā)明化合物31對(duì)cisplatin引起大鼠腎系膜細(xì)胞(rMC)損傷的保護(hù)作用。
圖2本發(fā)明化合物31對(duì)cisplatin引起人腎小管上皮細(xì)胞(HKC)損傷的保護(hù)作用圖3本發(fā)明化合物31對(duì)人腎小管上皮細(xì)胞(HKC)凋亡影響的形態(tài)學(xué)觀察A controlB cisplatin 2μmol/LC cisplatin 2μmol/L+31 2μmol/LD cisplatin 2μmol/L+31 10μmol/LE cisplatin 2μmol/L+31 50μmol/L圖4本發(fā)明化合物31對(duì)cisplatin誘導(dǎo)的HKC細(xì)胞染色體DNA斷裂的影響1 control2 cisplatin 10μmol/L+31 50μmol/L3 cisplatin 10μmol/L+31 10μmol/L4 cisplatin 10μmol/L+31 2μmol/L5 cisplatin 10μmol/L6 marker圖5.本發(fā)明化合物31對(duì)Fe2+-L-cys誘發(fā)肝微粒體脂質(zhì)過(guò)氧化的影響圖6.本發(fā)明化合物31對(duì)cisplatin所致急性腎損傷大鼠腎組織TGF-β1mRNA表達(dá)的影響Lane 1.ControlLane 2.Cisplatin+31 10mg/kgLane 3.Cisplatin+31 30mg/kgLane 4.Cisplatin+Benazapril 10mg/kgLane 5.Cisplatin modelLane 6.Marker圖7.本發(fā)明化合物31對(duì)cisplatin所致急性腎損傷大鼠腎組織TGF-β1mRNA表達(dá)的影響統(tǒng)計(jì)分析圖8.本發(fā)明化合物31對(duì)HT-1080細(xì)胞分泌基質(zhì)金屬蛋白酶能力的影響1 cisplatin 5μmol/L2 cisplatin 5μmol/L+31 3.12μmol/L3 cisplatin 5μmol/L+31 12.5μmol/L4 cisplatin 5μmol/L+31 50μmol/L5 control
圖9.本發(fā)明化合物31對(duì)大鼠腎系膜細(xì)胞(rMC)分泌基質(zhì)金屬蛋白酶能力的影響1 control2 cisplatin 5μmol/L3 31 3.12μmol/L4 31 12.5μmol/L5 31 50μmol/L具體實(shí)施方式
下面的實(shí)施例用來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但是這并不意味著對(duì)本發(fā)明的任何限制。
實(shí)施例實(shí)施例13-[4’-(1”，2”3”，4”-四唑-5”)苯氨羰基]-6-硝基-7-羥基-8-甲基香豆素(31)的制備將3-羧基-6-硝基-7-羥基-8-甲基香豆素10.6g(0.04Mol)與30ml二氯亞砜反應(yīng)完成后，除去多余的二氯亞砜，加入20ml二甲基甲酰胺(DMF)，40ml吡啶和7g(0.043Mol)4-氨基苯基(1’，2’，3’，4’-四唑-5’)攪拌均勻，在50℃加熱4小時(shí)。過(guò)濾，用乙醇、水洗滌、干燥1HNMR(300MHz，DMSO)，δ(ppm)10.78(s，1H，NH)，8.8(s，1H，NH)，8.6(b，2H，4，5-H)，8.0(d，2H，J＝8.7Hz，Ar’H)，7.9(d，2H，J＝8.7Hz，Ar’H)，2.23(s，3H，CH3)實(shí)施例23-[3’-(1”，2”3”，4”-四唑-5”)苯氨羰基]-6-硝基-7-羥基-8-甲基香豆素(32)的制備根據(jù)實(shí)施例化合物31的制備方法，化合物32的制備，不同點(diǎn)在于以3-氨基苯基(1’，2’，3’，4’-四唑-5’)進(jìn)行反應(yīng)得化合物321HNMR(300MHz，DMSO)，δ(ppm)10.70(s，1H，NH)，8.92(s，1H，5-H)，8.67(s，1H，4-H)，8.4(s，1H，Ar2’-H)，7.89(d，1H，J＝7.8Hz，Ar6’-H)，7.70(d，1H，J＝7.8Hz，Ar4’-H)，7.59(t，1H，J＝7.8Hz，Ar5’-H)，2.27(s，3H，CH3)實(shí)施例33-[3’-(1”，2”3”，4”-四唑-5”)苯氨羰基]-6-硝基-7-羥基-8-丁基香豆素(33)根據(jù)實(shí)施例化合物31的制備方法，化合物33的制備，不同點(diǎn)在于以3-羧基-6-硝基-7-羥基-8-丁基香豆素與3-氨基苯基(1’，2’，3’，4’-四唑-5’)進(jìn)行反應(yīng)得化合物331HNMR(300MHz，DMSO)，δ(ppm)8.914(s，1H，4-H)，8.708(s，1H，5-H)，8.483n(s，1H，Ar-H-2’)，7.833(m，2H，J＝7.5Hz，4’，6’-H)，7.615(t，1H，J＝7.8Hz，Ar-5’-H)，2.828(t，2H，J＝7.2，1”-CH2)，1.552(t，2H，J＝7.5Hz，2”-CH2)1.372(q，2HJ＝7.5Hz，3”-CH2)，0.929(t3H，J＝7.2Hz，4”-CH3)實(shí)施例43-[4’-(1”，2”3”，4”-四唑-5”)苯氨羰基]-6-硝基-7-羥基-8-丁基香豆素(34)根據(jù)實(shí)施例化合物31的制備方法，化合物34的制備，不同點(diǎn)在于以3-羧基-6-硝基-7-羥基-8-丁基香豆素與4-氨基苯基(1’，2’，3’，4’-四唑-5’)進(jìn)行反應(yīng)得化合物341HNMR(300MHz，DMSO)，δ(ppm)10.747(s，1H，-NH)，8.910(s，1H，4-H)，8.693(s1H，5-H)，8.051(d，2HJ＝8.7Hz，2’，6’-Ar-H)7.940(d，2H，J＝8.7Hz3’，5’-Ar-H)2.823(t，2H，7.2Hz，1”-CH2)，1.549(t，2H，J＝7.5Hz，2”-CH2)，1.373(q，2H，J＝7.2Hz，3”-CH2)，0.930(t，3H，J＝7.2Hz，4”-CH3)實(shí)施例53-[4’-(1”，2”3”，4”-四唑-5”)苯氨羰基]-7-甲氧基-8-丁基香豆素(35)根據(jù)實(shí)施例化合物31的制備方法，化合物35的制備，不同點(diǎn)在于以3-羧基-7-甲氧基-8-丁基香豆素與4-氨基苯基(1’，2’，3’，4’-四唑-5’)進(jìn)行反應(yīng)得化合物351HNMR(300MHz，DMSO)，δ(ppm)10.881(s，1H，NH)，8.890(s，1H，4-H)，8.051(d，2H，J＝8.7Hz，2”，6”-Ar-H)，7.946(d，2H，J＝8.7Hz，3”，5”-Ar-H)，7.908(d，1H，J＝8.7Hz，5-H)，7.218(d，1H，J＝8.7Hz，6-H)，3.957(s，3H，-OCH3)，2.760(q，2H，J＝7.5Hz，1”-CH2)，1.515(t，2H，J＝7.2Hz，2”-CH2)，1.334(q，2H，J＝7.5Hz，3”-CH2)，0.917(t3H，J＝7.5Hz，4”-CH3)實(shí)施例63-[3’-(1”，2”3”，4”-四唑-5”)苯氨羰基]-7-甲氧基-8-丁基香豆素(36)根據(jù)實(shí)施例化合物31的制備方法，化合物36的制備，不同點(diǎn)在于以3-羧基-7-甲氧基-8-丁基香豆素與3-氨基苯基(1’，2’，3’，4’-四唑-5’)進(jìn)行反應(yīng)得化合物361HNMR(300MHz，DMSO)，δ(ppm)10.842(s，1H，NH)，8.888(s，1H，4-H)，8.470(s，1H，2’-Ar-H)，7.922-7.871(m，2H，4’，6’-Ar-H)，7.789(d，1H，J＝7.8Hz，5-H)，7.610(t，1H，J＝7.8Hz，5-Ar-H)，7.216(d，1H，J＝9Hz，6-Ar-H)，3.995(s，3H，OCH3)，2.761(t，2H，J＝7.5Hz，1”-CH2)，1.502(t，2H，J＝7.2Hz，2”-CH2)，1.332(q，2H，J＝7.5，3”-CH2)，0.915(t，3H，J＝7.2，4”-CH3)實(shí)施例73-[4’-(1”，2”3”，4”-四唑-5”)苯氨羰基]-7，8-甲氧基香豆素(37)根據(jù)實(shí)施例化合物31的制備方法，化合物37的制備，不同點(diǎn)在于以3-羧基-7，8-二甲氧基香豆素與4-氨基苯基(1’，2’，3’，4’-四唑-5’)進(jìn)行反應(yīng)得化合物37NMR(300MHz，DMSO)，(ppm)10.83(s，1HNH)，8.80(s，1H，4-H)，8.00(d，2H，J＝8.4Hz，3’，5’-H)，7.90(d，2H，J＝8.4Hz，2’，6’-H)，7.70(d，1H，J＝9，5-H)，7.20(d，2H，J＝9Hz，6-H)，3.96(s，3H，OCH3)，3.87(s，3H，OCH3)
實(shí)施例83-苯氨羰基]-6-乙基-7-甲氧基香豆素(30)根據(jù)實(shí)施例化合物31的制備方法，化合物30的制備，不同點(diǎn)在于以3-羧基-6-乙基-7-甲氧基香豆素與苯氨進(jìn)行反應(yīng)得化合物301HNMR(300MHz，DMSO)，(ppm)10.67(br，1H，NH)，8.87(s，1H，4-H)，7.77(s，1H，5-H)，7.69(d，2H，J＝7.69Hz，3’，5’-H)，7.36(t，2H，J＝7.5Hz，2’，6’-H)，7.18(s，1H，8-H)，7.12(1H，J＝7.2Hz，5’-H)，3.93(t，3H，OCH3)，2.58(q，2H，J＝7.5Hz，CH2)，1.15(t，3H，J＝7.5，CH3)實(shí)施例93-(1’-甲氧羰基-2’-羥苯乙氨羰基)-6-硝基-7-羥基-8-甲基香豆素(38)根據(jù)實(shí)施例化合物31的制備方法，化合物38的制備，不同點(diǎn)在于以3-羧基-6-硝基-7-羥基-8-甲基香豆素與1’-甲氧羰基-2’-羥苯乙氨進(jìn)行反應(yīng)得化合物38HNMR(300MHz，DMSO)，(ppm)9.26(br，1H，NH)，8.80(br，1H，OH)，8.63(s，1H，4-H)，7.93(s，1H，5-H)，6.90(d，2H，J＝8.1Hz，Ar’H)，6.60(d，2H，J＝8.1Hz，ArH)，4.70(m，1H，CH)，3.66(s，3H，OCH3)，3.01(d，2H，J＝6.9Hz，CH2)，2.23(s，3H，CH3)實(shí)施例103-苯胺羰基-6-硝基-二氫喹啉酮-2(1)根據(jù)實(shí)施例化合物31的制備方法，化合物1的制備，不同點(diǎn)在于以3-羧基-6-硝基二氫喹啉酮-2與苯氨進(jìn)行反應(yīng)得化合物11HNMR(300MHz，DMSO)，(ppm)13.107(s，1HNH)，11.764(s，1HNH)，9.177(s，1H，4-H)，9.060(d，1H，J＝2.1Hz，5-H)，8.46(dd，1H，J1＝2.4Hz，J2＝9Hz，7-H)，7.73(d，2H，J＝8.1Hz2’，6’Ar-H)，7.601(d，1H，J＝9Hz，8-H)，7.39(t，2H，J＝7.5Hz，3’，5’Ar-H)，7.14(t，1H，J＝7.5Hz，4’-ArH)，實(shí)施例113-(3’-羥基-4’-羧基苯胺羰基)-6-硝基-二氫喹啉酮-2(3)根據(jù)實(shí)施例化合物31的制備方法，化合物3的制備，不同點(diǎn)在于以3-羧基-6-硝基二氫喹啉酮-2與4-氨基水楊酸進(jìn)行反應(yīng)得化合物31HNMR(300MHz，DMSO)，(ppm)13.127(s，1H，NH)，11.976(s，1H，NH)，9.155(s，1H，4-H)，9.04(d，1H，J＝2.7Hz，5-H)，8.46(dd，1H，J1＝2.4Hz，J2＝9.3Hz，7-H)，7.77(d，1H，J＝8.7Hz6’-H)，7.59(d1H，J＝9.3Hz，8-H)，7.56(d，1H，J＝2.1，2’-H)，7.06(dd，1H，J1＝2.1，J2＝8.7，5’-H)實(shí)施例123-(3’-羧基-4’-羥基苯胺羰基)-6-硝基二氫喹啉酮-2(2)根據(jù)實(shí)施例化合物31的制備方法，化合物2的制備，不同點(diǎn)在于以3-羧基-6-硝基二氫喹啉酮-2與5-氨基水楊酸進(jìn)行反應(yīng)得化合物2
1HNMR(300MHz，DMSO)，(ppm)13.063(s，1H，NH)，11.647(s，1H，NH)，9.005(s，1H，4-H)，9.092(s，1H，5-H)，8.431(d，1H，J＝9Hz，7-H)，8.193(s，1H，2’-H)，7.771(d，1H，J＝9Hz，8-H)，7.570(d，1H，J＝9.3Hz，6’-H)，6.957(d，1H，J＝9.3Hz，5’-H)實(shí)施例133-[4’-(1”，2”3”，4”-四唑-5”)苯氨羰基]-6-硝基-二氫喹啉酮-2(4)根據(jù)實(shí)施例化合物31的制備方法，化合物4的制備，不同點(diǎn)在于以3-羧基-6-硝基二氫喹啉酮-2與4-(1’，2’3’，4’-四唑-5’)苯氨進(jìn)行反應(yīng)得化合物41HNMR(300MHz，DMSO)，(ppm)13.161(s，1H，NH)＜12.033(s，1H，NH)，9.205(s，1H，4-H)，9.086(d，1H，J＝2.4Hz，5-H)，8.49(dd，1H，J1＝2.7Hz，J2＝9Hz，7-H)，8.07-7.94(m，4H，苯四唑-Ar-H)，7.61(d，1HJ＝9.3Hz，8-H)實(shí)施例143-[3’-(1”，2”3”，4”-四唑-5”)苯氨羰基]-6-硝基-二氫喹啉酮-2(5)根據(jù)實(shí)施例化合物31的制備方法，化合物5的制備，不同點(diǎn)在于以3-羧基-6-硝基二氫喹啉酮-2與3-(1’，2’3’，4’-四唑-5’)苯氨進(jìn)行反應(yīng)得化合物51HNMR(300MHz，DMSO)，(ppm)13.142(s，1H，NH)，11.99(s，1H，NH)，9.19(s，1H，4-H))，9.07(d，1H，J＝2.7，5-H)，8.47(dd，1H，J1＝2.7，J2＝9.3，7-H)，8.44(s，1H，2’-H)，7.97-7.59(m，4H，4’，5’，6’-ArH，8-H)實(shí)施例153-(3’-氯-4’-羧基苯胺羰基)-6-硝基-二氫喹啉酮-2(6)根據(jù)實(shí)施例化合物31的制備方法，化合物6的制備，不同點(diǎn)在于以3-羧基-6-硝基二氫喹啉酮-2與3-氯-4’-羧基苯胺進(jìn)行反應(yīng)得化合物61HNMR(300MHz，DMSO)，(ppm)13.13(s，1H，NH)，12.22(s，1H，NH)，9.15(s，1H，4-H)，9.06(d，1H，J＝2.7Hz，5-H)，8.46(dd，1H，J1＝2.1Hz，J2＝9Hz，7-H)，8.07(d，1H，J＝1.8Hz，2’-ArH)，7.87(d，1H，J＝8.7Hz，6’-H)，7.63(dd，1H，J1＝2.1Hz，J2＝8.7Hz，5’-ArH)，7.581(d，1H，J＝9，8-H)實(shí)施例163-苯胺羰基-二氫喹啉酮-2(11)根據(jù)實(shí)施例化合物31的制備方法，化合物11的制備，不同點(diǎn)在于以3-羧基二氫喹啉酮-2與苯胺進(jìn)行反應(yīng)得化合物111HNMR(300MHz，DMSO)，(ppm)12.628(s，1H，NH)，12.11(s，1H，NH)，8.97(s，1H，4-H)，7.99(d，1H，J＝8.1Hz，ArH)，7.71(d，2H，J＝8.1Hz，ArH)＜7.67(d，1H，J＝7.8Hz，ArH)，7.47(d，1H，J＝8.4Hz，ArH)，7.33(m，4H，ArH)，7.11(t1HJ＝7.5，ArH)實(shí)施例173-(4’-羧基苯胺羰基)-二氫喹啉酮-2(13)根據(jù)實(shí)施例化合物31的制備方法，化合物13的制備，不同點(diǎn)在于以3-羧基二氫喹啉酮-2與對(duì)氨基苯甲酸進(jìn)行反應(yīng)得化合物131HNMR(300MHz，DMSO)，(ppm)12.718(s，1H，NH)，12.423(d，1H，J＝3.6Hz，NH)，8.994(s，1H，4-H)，8.016(d，1H，J＝7.8Hz，5-H)，7.96(d，2H，J＝8.7Hz，3’，5’Ar-H)，7.838(d，2H，J＝8.7Hz，2’，6’Ar-H)，7.708(t，1H，J＝8.4Hz，7-H)，7.475(d，1H，J＝8.7Hz，8-H)，7.337(t，1H，J＝7.8Hz，6-H)實(shí)施例183-乙氧羰基苯胺羰基-二氫喹啉酮-2(12)根據(jù)實(shí)施例化合物31的制備方法，化合物12的制備，不同點(diǎn)在于以3-羧基二氫喹啉酮-2與對(duì)氨基苯甲酸乙酯進(jìn)行反應(yīng)得化合物121HNMR(300MHz，1DMSO)，(ppm)12.42(s，1H，NH)，8.975(s，1H，4-H)，8.012(d，1H，9.9Hz，5-H)，7.979(d，2H，J＝9.9Hz，Ar’H)，7.861(d，2H，J＝9Hz，Ar’H)，7.697(t，1H，J1＝7.8Hz，J2＝7.2Hz，7-H)，7.468(d，1H，J＝8.1Hz，8-H)，7.325(t，1H，J1＝7.8Hz，J2＝7.2Hz，6-H)，4.284(q，2H，OCH2)，1.305(t，3H，OC-CH3)實(shí)施例193-(3’-羧基-4’-羥基苯胺羰基)-二氫喹啉酮-2(15)根據(jù)實(shí)施例化合物31的制備方法，化合物15的制備，不同點(diǎn)在于以3-羧基二氫喹啉酮-2與5-氨基水楊酸進(jìn)行反應(yīng)得化合物151HNMR(300MHz，DMSO)，(ppm)12.658(d，1H，J＝2.4，Hz，OH)，12.042(d，1H，J＝3.3Hz，NH)，8.974(s，1H，4-H)，8.236(d，1H，J＝2.7Hz，2’-ArH)，7.989(d，1H，J＝8.1Hz，5-H)，7.786(dd，1H，J鄰＝8.7Hz，J間＝2.7Hz，Ar6’-H)，7.689(d，1H J＝7.5Hz，7-H)，7.465(d，1H，J＝8.1Hz，8-H)，7.323(t，1H，J＝7.5Hz，6-H)，6.984(d，1H，J＝8.7Hz，Ar5’-H)實(shí)施例203-(4’-羥基苯胺羰基)-二氫喹啉酮-2(16)根據(jù)實(shí)施例化合物31的制備方法，化合物16的制備，不同點(diǎn)在于以3-羧基二氫喹啉酮-2與4-氨基苯酚進(jìn)行反應(yīng)得化合物161HNMR(300MHz，DMSO)，(ppm)12.6(s，1H，NH)，11.88(s，1H，NH)，8.94(s，1H，4-H)，8.94(s，1H，4-H)，7.981(d，1H，J＝8.7Hz，ArH)，7.70(t，1H，J＝7.5Hz，ArH)，7.53(d，2H，J＝8.7Hz，ArH)，7.45(d，1H，J＝7.8Hz，ArH)，7.32(t，1HJ＝7.8Hz，ArH)實(shí)施例213-(3’-羥基-4’-羧基苯胺羰基)-二氫喹啉酮-2(14)根據(jù)實(shí)施例化合物31的制備方法，化合物14的制備，不同點(diǎn)在于以3-羧基二氫喹啉酮-2與4-氨基水楊酸進(jìn)行反應(yīng)得化合物141HNMR(300MHz，DMSO)，(ppm)11.894(s，1H，NH)，9.127(s，1H，4-H)，9.059(t，2H，J＝3.6Hz，ArH)，8.51(dd，1H，J1＝2.7Hz，J2＝9.9Hz，ArH)，7.88(d，1H，ArH)，7.74(d，1H，J＝8.7Hz，ArH)，7.52(d，1H，J＝21.8，ArH)，7.07(dd，1H，J1＝1.8Hz，J2＝8.7，ArH)實(shí)施例223-(4’-羥基苯乙胺羰基)-二氫喹啉酮-2(39)根據(jù)實(shí)施例化合物31的制備方法，化合物39的制備，不同點(diǎn)在于以3-羧基二氫喹啉酮-2與4-羥基苯乙氨進(jìn)行反應(yīng)得化合物391HNMR(300MHz，DMSO)，(ppm)12.426(s，1H，NH)，9.798(t，1H，J1＝5.4Hz，J＝5.4Hz，-NH-C-)，8.816(s，1H，4-H)，7.924(d，1H，J＝8.1Hz，8-H)，7.637(t，1H，J1＝8.4Hz，J2＝6.9Hz，7-H)，7.396(d，1H，J＝9Hz，5-H)，7.275(t，1H，J1＝7.2Hz，J2＝7.5Hz，6-H)，7.004(d，2H，J＝8.4Hz，2’，6’-H)，6.672(d，2H，J＝8.7Hz，3’，5’-H)，3.503(q，2H，J1＝13.2Hz，J2＝13.2Hz，N-CH2)，2.(t，2H，J1＝7.2Hz，J2＝7.2Hz，-CH2-)實(shí)施例233-[4’-(1”，2”3”，4”-四唑-5”)苯氨羰基]-7-甲氧基-8-硝基二氫喹啉酮-2(40)根據(jù)實(shí)施例化合物31的制備方法，化合物40的制備，不同點(diǎn)在于以3-羧基-7-甲氧基-8-硝基二氫喹啉酮-2與4-(1’，2’3’，4’-四唑-5’)苯氨進(jìn)行反應(yīng)得化合物401HNMR(300MHz，DMSO)，(ppm)9.801(s，1H，NH)，8.989(s，1H，4-H)，8.273(d，1H，J＝9.Hz，5-H)，8.055(d，2H，J＝9Hz，3’，5’-H)，7.953(d，2H，J＝9Hz，2’，6’-H)，7.378(d，1H，J＝9Hz，6-H)，4.015(s，3H，OCH3)實(shí)施例243-[3’-(1”，2”3”，4”-四唑-5”)苯氨羰基]-二氫喹啉酮-2(18)根據(jù)實(shí)施例化合物31的制備方法，化合物18的制備，不同點(diǎn)在于以3-羧基二氫喹啉酮-2與3-(1’，2’3’，4’-四唑-5’)苯氨進(jìn)行反應(yīng)得化合物181HNMR(300MHz，DMSO)，(ppm)12.689(s，1H，NH)，12.372(s，1H，NH)，9.005(s，1H，4-H)，8.429(s，1H，2’-H)，8.03-7.32(m7H，ArH)實(shí)施例253-[4’-(1”，2”3”，4”-四唑-5”)苯氨羰基]-二氫喹啉酮-2(17)根據(jù)實(shí)施例化合物31的制備方法，化合物17的制備，不同點(diǎn)在于以3-羧基二氫喹啉酮-2與4-(1’，2’3’，4’-四唑-5’)苯氨進(jìn)行反應(yīng)得化合物171HNMR(300MHz，DMSO)，(ppm)12.704(s，1H，NH)，12.414(s，1H，NH)，8.993(s，1H，4-H)，8.066-7.972(q，4H，J＝11.1Hz，Ar’H)，8.00(d，1H，J＝8.1Hz，8-H)，7.703(t，1H，J1＝7.8Hz，J2＝7.5Hz，7-H)，7.478(d，1H，J＝8.1Hz，5-H)，7.322(t，1H，J1＝7.5Hz，J2＝7.2Hz，6-H)實(shí)施例263-(3’-羧基亞甲氧基苯胺羰基)-二氫喹啉酮-2(10)根據(jù)實(shí)施例化合物31的制備方法，化合物10的制備，不同點(diǎn)在于以3-羧基二氫喹啉酮-2與3-(1’，2’3’，4’-四唑-5’)苯氨進(jìn)行反應(yīng)得化合物101HNMR(300MHz，DMSO)，(ppm)12.654(s1H，NH)，12.16(s，1H，NH)，9.27(s，1H，4-H)，8.0-6.61(m，8H，ArH)，4.691(s，2H，OCH2)實(shí)施例27 1-甲基-3-(乙氧羰基苯胺羰基)-6-硝基-二氫喹啉酮-2(19)根據(jù)實(shí)施例化合物31的制備方法，化合物19的制備，不同點(diǎn)在于以1-甲基-3-羧基-6-硝基二氫喹啉酮-2與4-乙氧羰基苯胺進(jìn)行反應(yīng)得化合物191HNMR(300MHz，DMSO)，(ppm)11.907(s，1H，NH)，9.155(s，1H，4-H)，9.07(d，1H，J＝1.5Hz，5-H)，8.54(dd，1H，J1＝1.5Hz，J2＝5.4Hz，7-H)，8-7.88(m，5H，5-H，8-H，2’-H，6’-H，3’-H，5’-H)，4.33(q，2H，J＝4.2Hz，-CH2)，3.85(s，3H，N-CH3)，1.34(t，3H，J＝4.2Hz，C-CH3)實(shí)施例281-甲基-3-(3’-羧基-4’-羥基苯胺羰基)-6-硝基-二氫喹啉酮-2(21)根據(jù)實(shí)施例化合物31的制備方法，化合物21的制備，不同點(diǎn)在于以1-甲基-3-羧基-6-硝基二氫喹啉酮-2與5-氨基水楊酸進(jìn)行反應(yīng)得化合物211HNMR(300MHz，DMSO)，(ppm)11.601(s，1H，NH)，9.114(s，1H，4-H)，9.08(d，1H，J＝2.7，5-H)，8.51(dd，1H，J1＝2.4Hz，J2＝9.3Hz，7-H)，8.26(d，1H，J＝2.7Hz，6’-H)，7.87(d，1H，J＝4.3Hz，8-H)，7.77(dd，1H，J1＝2.7Hz，J2＝9Hz，3’-H)，6.98(d，1H，J＝9Hz，2’-H)，3.81(s，3H，N-CH3)實(shí)施例291-甲基-3-苯胺羰基-6-硝基-二氫喹啉酮-2(22)根據(jù)實(shí)施例化合物31的制備方法，化合物22的制備，不同點(diǎn)在于以1-甲基-3-羧基-6-硝基二氫喹啉酮-2與苯氨進(jìn)行反應(yīng)得化合物221HNMR(300MHz，DMSO)，(ppm)11.71(s，1H，NH)，9.15(s，1H，4-H)，9.08(d，1H，J＝2.7Hz，5-H)，8.52(dd，1H，J1＝2.7Hz，J2＝9.3Hz，7-H)，7.87(d，J＝9.3Hz，8-H)，7.73(d，2H，J＝8.4Hz，2’-H，6’-H)，7.38(t，J＝8.4Hz，3’-H，5’-H)，7.13(t，J＝7.5Hz，4’-H)，3.81(s，3H，N-CH3)實(shí)施例301-甲基-3-(4’-羥基苯胺羰基)-6-硝基-二氫喹啉酮-2(24)根據(jù)實(shí)施例化合物31的制備方法，化合物24的制備，不同點(diǎn)在于以1-甲基-3-羧基-6-硝基二氫喹啉酮-2與對(duì)氨基苯酚進(jìn)行反應(yīng)得化合物241HNMR(300MHz，DMSO)，(ppm)11.51(s，1H，NH)，9.12(s，1H，4-H)，9.07(d，1H，J＝2.7Hz，5-H)，8.5(dd，1H，J1＝2.4Hz，J2＝9.3Hz，7-H)，7.87(d，1H，J＝9.6Hz，8-H)，7.53(d，2H，J＝8.7Hz，2’-H，6’-H)，6.76(s2H，J+8.7Hz，3’-H，5’-H)，3.806(s，3H，N-CH3)
實(shí)施例311-甲基-3-(3’-羥基-4’-羧基苯胺羰基)-6-硝基-二氫喹啉酮-2(20)根據(jù)實(shí)施例化合物31的制備方法，化合物20的制備，不同點(diǎn)在于以1-甲基-3-羧基-6-硝基二氫喹啉酮-2與4-氨基水楊酸進(jìn)行反應(yīng)得化合物201HNMR(300MHz，DMSO)，(ppm)9.158(s，1H，CO2H)，9.092(d，1H，OH)，8.532(dd，1H，J鄰＝2.4Hz，J間＝9.3Hz，7-H)，7.933-7.876(m，3H，ArH)，7.776(d，1H，J＝8.4Hz，8-H)，7.555(s1H，4-H)，7.107(dd，1H，J鄰＝8.7Hz，J間＝1.8Hz，Ar-5’H)，2.853(s，3H，N-CH3)實(shí)施例321-甲基-3-(4’-羧基苯胺羰基)-6-硝基-二氫喹啉酮-2(23)根據(jù)實(shí)施例化合物31的制備方法，化合物23的制備，不同點(diǎn)在于以1-甲基-3-羧基-6-硝基二氫喹啉酮-2與對(duì)氨基苯甲酸進(jìn)行反應(yīng)得化合物231HNMR(300MHz，DMSO)，(ppm)11.94(s，1H，NH)，9.14(s，1H，4-H)，9.07(d，1H，J＝2.7Hz，5-H)，8.50(dd，1H，J1＝2.4，J2＝9.3，7-H)，7.95-7.81(m，5H，8-H，2’-H，3’-H，5’-H，6’-H)，3.81(s3H，NCH3)實(shí)施例331-甲基-3-[4’-(1”，2”3”，4”-四唑-5”)苯氨羰基-6-硝基-二氫喹啉酮-2(25)根據(jù)實(shí)施例化合物31的制備方法，化合物25制備，不同點(diǎn)在于以1-甲基-3-羧基-6-硝基二氫喹啉酮-2與4-(1’，2’3’，4’-四唑-5’)苯氨進(jìn)行反應(yīng)得化合物251HNMR(300MHz，DMSO)，(ppm)11.985(s，1H，NH)，9.20(s，1H，4-H)，9.129(s，1H，5-H)，8.56(d，1H，J＝9.3，7-H)，7.94(m，5H，ArH))，3.84(s，3H，NCH3)實(shí)施例341-異丙基-3-[4’-(1”，2”3”，4”-四唑-5”)苯氨羰基]-6-硝基-二氫喹啉酮-2(28)根據(jù)實(shí)施例化合物31的制備方法，化合物28的制備，不同點(diǎn)在于以1-異丙基-3-羧基-6-硝基二氫喹啉酮-2與4-(1’，2’3’，4’-四唑-5’)苯氨進(jìn)行反應(yīng)得化合物281HNMR(300MHz，DMSO)，(ppm)9.00(s，1H，5-H)，8.89(d，1H，J＝9.3Hz，7-H)，8.47(s，1H，4-H)，8.07(d，2H，J＝7.2Hz，Ar’H)，7.9(d，2H，J＝7.2Hz，Ar’H)，7.59(d，1H，J＝9.3，8-H)，5.55(m，1H，異丙基-CH)，1.41(d，6H，異丙基-(CH3)2)實(shí)施例351-異丙基-3-[3’-(1”，2”3”，4”-四唑-5”)苯氨羰基]-6-硝基-二氫喹啉酮-2(29)根據(jù)實(shí)施例化合物31的制備方法，化合物29的制備，不同點(diǎn)在于以1-異丙基-3-羧基-6-硝基二氫喹啉酮-2與3-(1’，2’3’，4’-四唑-5’)苯氨進(jìn)行反應(yīng)得化合物291HNMR(300MHz，DMSO)，(ppm)9.00(d，1H，J＝2.4Hz，5-H)，8.80(m，1H，7-H)，8.50(s，1H，4-H)，8.47(d，J＝2.4，2’-H)，7.96(m，1H，4’-H)，7.79(m，2H，5’，6’-H)，7.60(m，1H，8-H)，5.59(m，1H，異丙基-CH)，1.40(d，6H，異丙基-(CH3)2)化合物7、8、9、26、和27等按以上方法制備實(shí)施例363-[2’-(4”-硝基苯羰基)-吡咯-N-亞甲基]-二氫喹啉酮-2(41)將0.464克(2.20mmol)2-氯-3-氯甲基二氫喹啉置于10ml圓底瓶中，加入0.475克(2.37mmol)2-對(duì)硝苯羰基吡咯及0.910克(6.60mmol)無(wú)水碳酸鉀和4毫升N，N-二甲基甲酰胺(分子篩干燥)于外浴55℃反應(yīng)，TLC監(jiān)測(cè)(石油醚∶乙酸乙酯＝5∶1)5.5小時(shí)后反應(yīng)完全。后處理過(guò)濾，濾餅用乙酸乙酯充分洗滌，后用水溶解，乙酸乙酯提取，合并有機(jī)相，飽和食鹽水洗，無(wú)水硫酸鎂干燥，濃縮后用石油醚\乙酸乙酯重結(jié)晶的0.397克產(chǎn)物，2-氯-3-[2’-(4”-硝基苯羰基)-吡咯-N-亞甲基]-二氫喹啉，產(chǎn)率52.24％，mp.159.0～159.9℃1HNMR(300MHz，CDCL3)，δ(ppm)8.292(d，2H，J＝8.4Hz3，5ArH)8.032(d，1H，J＝8.4Hz，5H)7.896(d，2H，J＝8.7Hz，2，6-ArH)，7.7447.478(m，4H)，7.210(s，1H，QU4-H)6.862(d，1H，PY5-H)6.388(t，1H，PY3-H)5.879(s，2H，-CH2N)ESI-MS m/z(Intensity)392.5(100，M+)將0.350克(0.895mmol)2-氯-3-[2’-(4”-硝基苯羰基)-吡咯-N-亞甲基]-二氫喹啉置于10ml圓底瓶中，加入2ml醋酸和一滴水于外浴120℃回流反應(yīng)，原料在加熱后全部溶解，TLC監(jiān)測(cè)(石油醚∶乙酸乙酯＝1∶1，2滴醋酸)，二天后反應(yīng)完全，反應(yīng)液冷卻后，有灰色結(jié)晶析出。
后處理過(guò)濾，用二氯甲烷充分洗滌灰色針晶，干燥得0.275克淺綠色針晶，，產(chǎn)率82.58％，mp.275.0～276.9℃1HNMR(300MHz，DMSO)，δ(ppm)8.301(d，2H，J＝9Hz，3，5ArH)，7.921(d，2H，J＝9Hz，2，6rH)，7.5637.090(m，6H)6.807(m，1H，Pyr3-H)，6.347(m，1H，Pry4-H)，5.497(s，2H，CH2-N)ESI-MS m/z(Intensity)374.5(8.3，M+)實(shí)施例373-(2’-乙氧羰基吡咯-N-亞甲基)二氫喹啉酮-2(71)根據(jù)實(shí)施例化合物41的制備方法，化合物71的制備，不同點(diǎn)在于以2-乙氧羰基吡咯與2-氯-3-氯甲基二氫喹啉進(jìn)行反應(yīng)得化合物711H-NMR(300MHz，CDCl3，δppm，JHz)，11.956(S，1H，N-H)，7.493(d，1H，J＝8.1，H-5)，7.44(d，1H，J＝7.8，H-8)，7.312(S，1H，H-4)，7.28(t，1H，J＝8.1，H-6)，7.107(t，1H，J1＝7.8，J2＝7.2，H-7)，6.961(dd，1H，J1＝2.4，J2＝1.5，H-4’)，6.866(S，1H，H-5’)，6.227(t，1H，J1＝3.9，J2＝2.7，H-3’)，5.389(S，2H，-CH2-)，4.115(m，2H，-OCH2CH3)，1.171(t，3H，J＝7.2-OCH2CH3)。
EI-MS(％)296(M+，47)，158(100)，250(78)實(shí)施例383-(2’-苯羰基吡咯N-亞甲基)香豆素(60)根據(jù)實(shí)施例化合物41的制備方法，化合物60的制備，不同點(diǎn)在于以2-苯羰基吡咯與3-氯甲基香豆素進(jìn)行反應(yīng)得化合物601HNMR(300MHz，CDCl3)，(ppm)7.62(s，1H，4-H)，7.20-7.60(m，10H，ArH，Py5-H，Ar”H)，6.80(d，1H，J＝3.3Hz，Py-3’-H)，6.20(d，1H，J＝3.3Hz，Py-4’-H)，5.55(s，2H，N-CH2)實(shí)施例393-[2’-(4”-氯苯羰基)吡咯-N-亞甲基)香豆素(62)根據(jù)實(shí)施例化合物41的制備方法，化合物62的制備，不同點(diǎn)在于以2-(4’-氯苯羰基吡咯與3-氯甲基香豆素進(jìn)行反應(yīng)得化合物621HNMR(300MHz，CDCl3)，(ppm)7.70(d，2H，J＝8.4Hz，2”，6”-H)，7.60(s，1H，4-H)，7.4(d，2H，J＝8.4Hz，3”，5”-H)，7.2-7.5(m，5H，ArH，Py3-H)，6.70(d，1H，J+3.6Hz，Py5’-H)，6.20(t，1HJ＝3.6Hz，Py 4’-H)，5.53(s，2H，N-CH2)實(shí)施例403-[2’-(4”-甲氧苯羰基)吡咯-N-亞甲基]香豆素(61)根據(jù)實(shí)施例化合物41的制備方法，化合物61的制備，不同點(diǎn)在于以2-(4’-甲氧苯羰基吡咯與3-氯甲基香豆素進(jìn)行反應(yīng)得化合物611H-NMR(300MHz，CDCl3，δppm，JHz)7.70(d，2H，J＝8.1Hz，2”，6”-H)，7.10-7.40(m，6H，4，5，6，7，8-H，Py3’-H)，6.90(d，2H，J＝8.1Hz，3”，5”-H)，6.80(t，1H，J＝3.1Hz，Py-4’-H)，6.20(d，1H，J＝3.1Hz，Py-5’-H)，5.52(s，2H，N-CH2)，3.87(s，3H，OCH3)實(shí)施例413-(2’-苯羰基吡咯-N-亞甲基)-7甲氧基-二氫喹啉酮-2(54)根據(jù)實(shí)施例化合物41的制備方法，化合物54的制備，不同點(diǎn)在于以2-苯羰基吡咯與2-氯-3-氯甲基-7-甲氧基二氫喹啉進(jìn)行反應(yīng)得化合物541H-NMR(300MHz，CDCl3，δppm，JHz)10.843(br，1H，NH)，7.798(d，2H，J＝9Hz，5，6-H)，7.759(s，1H，4-H)，7.523-7.354(m，5H，Ar’H)，6.86-6.79(m，2H，Py-3，5-H)，6.73(s，1H，8-H)，6.228(t，1H，J＝3Hz，Py4-H)，5.648(s，2H，NCH2)，3.888(s，3H，OCH3)實(shí)施例423-(3’--苯羰基吡咯-N-亞甲基)-7甲氧基-二氫喹啉酮-2(55)根據(jù)實(shí)施例化合物41的制備方法，化合物55的制備，不同點(diǎn)在于以3-苯羰基吡咯與2-氯-3-氯甲基-7-甲氧基二氫喹啉進(jìn)行反應(yīng)得化合物551H-NMR(300MHz，CDCl3，δppm，JHz)8.835(d，2H，J＝7.2Hz，5，6-H)，7.502-7.403(m，5H.Ar’H)，7.358(s，1H，4-H)，6.849-6.755(m，4H，8-H，Py2-H，Py4-H，Py5-H)，5.12(s，2H，NCH2)，3.872(s，3H，OCH3))實(shí)施例433-[2’-(4”-氯苯羰基)吡咯-N-亞甲基]-7甲氧基-二氫喹啉酮-2(56)根據(jù)實(shí)施例化合物41的制備方法，化合物56的制備，不同點(diǎn)在于以2-(4’-氯苯羰基)吡咯與2-氯-3-氯甲基-7-甲氧基二氫喹啉進(jìn)行反應(yīng)得化合物561H-NMR(300MHz，CDCl3，δppm，JHz)8.724(d，2H，J＝8.4Hz，Ar’-2，6-H)，7.541(d，2H，J＝8.4Hz，Ar’-3，5-H)，7.473-7.443(m，2H，4-H，Py3-H)，7.058(s，1H，8-H)，6.791-6.756(m，2H，5-H，Py5-H)，6.727(dd，1H，J鄰＝8.7Hz，J間＝2.4Hz，Py4-H)，6.300-6280(m，1H，6-H)，5.422(s，2H，NCH2)，3.766(s，3H，OCH3)實(shí)施例443-[2’-(4”-甲氧苯羰基)吡咯-N-亞甲基]-7-甲氧基-二氫喹啉酮-2(52)根據(jù)實(shí)施例化合物41的制備方法，化合物52的制備，不同點(diǎn)在于以2-(4’-甲氧基苯羰基)吡咯與2-氯-3-氯甲基-7-甲氧基二氫喹啉進(jìn)行反應(yīng)得化合物521H-NMR(300MHz，CDCl3，δppm，JHz)8.717(d，2H，J＝9Hz，Ar’-2，6-H)，7.424(d，1H，J＝9Hz，5-H)，7.377(s，1H，4-H)，7.007(d，1H，J＝2.7Hz，8-H)，7.011-6.984(m，2H，Py3，5-H)，6.770-6.697(m，3H，6-H，Ar’3，5-H)，6.257(s，1H，Py4-H)，5.390(s，2H，NCH2)，3.798(s，3H，7-OCH3)，3.751(s，3H，Ar’-OCH3)實(shí)施例453-[3’-(4”-硝基苯羰基)吡咯-N-亞甲基]-7-甲氧基-二氫喹啉酮-2(50)根據(jù)實(shí)施例化合物41的制備方法，化合物50的制備，不同點(diǎn)在于以3-(4’-硝基苯羰基)吡咯與2-氯-3-氯甲基-7-甲氧基二氫喹啉進(jìn)行反應(yīng)得化合物501H-NMR(300MHz，CDCl3，δppm，JHz)8.929(D，2h，j＝9Hz，Ar’3，5-H)，7.951(d，2H，J＝9Hz，Ar’-2，6-H)，7.482(d，2H，J＝9Hz，5，6-H)，7.400(s，1H，4-H)，6.919-6.861(m，2H，Py2-H，8-H)，6.72(d，2H，J＝1.8Hz，Py4，5-H)，5.114(s，2H，NCH2)，3.897(s，3H，OCH3)實(shí)施例463-(2’-乙氧羰基咪唑-N-亞甲基)二氫喹啉酮-2(67)根據(jù)實(shí)施例化合物41的制備方法，化合物67的制備，不同點(diǎn)在于以2-乙氧羰基吡咯與2-氯-3-氯甲基二氫喹啉進(jìn)行反應(yīng)得化合物671H-NMR(300MHz，CDCl3，δppm，JHz)，10.11(S，1H，N-H)，7.847(S，1H，H-4)，7.508-7.687(m，4H，H-5，H-6，H-7，H-8)，7.334(d，1H，J＝8.4，H-5’)，7.217(d，1H，J＝6.9，H-4’)，5.676(S，2H，-CH2-)，4.476(m，2H，-OCH2CH3)，1.465(t，3H，J1＝7.2，J2＝6.9，-OCH2CH3)。
EI-MS(％)297(M+，100)，158(77)實(shí)施例473-(3’-三氟甲基-4′-乙氧羰基吡唑-N-亞甲基)二氫喹啉酮-2(69)根據(jù)實(shí)施例化合物41的制備方法，化合物69的制備，不同點(diǎn)在于以3-三氟甲基-4-乙氧羰基吡唑與2-氯-3-氯甲基二氫喹啉進(jìn)行反應(yīng)得化合物691H-NMR(300MHz，CDCl3，δppm，JHz)，10.278(S，1H，N-H)，8.329(S，1H，H-5’)，7.889(S，1H，H-4)，7.635-7.552(m，2H，H-5，H-8)，7.26-7.376(m，2H，H-6，H-7)，5.36(S，2H，-CH2-)，4.298(m，2H，-OCH2CH3)，1.325(t，3H，J1＝7.2，J2＝6.9，-OCH2CH3)。
EI-MS(％)365(M+，100)，158(77)實(shí)施例483-(2’-甲酰基吡咯-N-亞甲基)二氫喹啉酮-2(64)根據(jù)實(shí)施例化合物41的制備方法，化合物64的制備，不同點(diǎn)在于以2-甲?；?吡唑與2-氯-3-氯甲基二氫喹啉進(jìn)行反應(yīng)得化合物641H-NMR(300MHz，CDCl3，δppm，JHz)，10.412(S，1H，N-H)，9.55(S，1H，-CHO)，7.741(S，1H，H-4)，7.563-7.493(m，2H，H-5，H-8)，7.343-7.237(m，2H，H-6，H-7)，7.224(d，1H，J＝7.8，H-5’)，6.989(d，1H，J＝3.9，H-4’)，6.287(S，1H，H-3’)。
ESI-MS(％)253[M+1]+實(shí)施例493-(3’-正丙基-5′-乙氧羰基吡唑-N-亞甲基)二氫喹啉酮-2(70)根據(jù)實(shí)施例化合物41的制備方法，化合物70的制備，不同點(diǎn)在于以3-正丙基-4-乙氧羰基吡唑與2-氯-3-氯甲基二氫喹啉進(jìn)行反應(yīng)得化合物701H-NMR(300MHz，CDCl3，δppm，JHz)，10.904(S，1H，N-H)，7.563-7.480(m，2H，H-5，H-8)，7.340-7.219(m，3H，H-6，H-7，H-4)，6.706(S，1H，H-4’)，5.407(S，2H，-CH2-)，4.421(m，2H，-OCH2CH3)，2.612(t，2H，J1＝6.9，J2＝7.8，-CH2CH2CH3)，1.684(m，2H，-CH2CH2CH3)，1.406(t，3H，J1＝7.8，J2＝6.9，-OCH2CH3)，0.971(t，3H，J1＝6.9，J2＝7.8，-CH2CH2CH3)。
EI-MS(％)339(M+，92)，158(100)，135(89)實(shí)施例503-(4’-乙氧羰基-5′-甲基咪唑-N-亞甲基)二氫喹啉酮-2(66)根據(jù)實(shí)施例化合物41的制備方法，化合物66的制備，不同點(diǎn)在于以4-乙氧羰基5’-甲基咪唑與2-氯-3-氯甲基二氫喹啉進(jìn)行反應(yīng)得化合物661H-NMR(300MHz，CDCl3，δppm，JHz)，8.022(S，1H，H-2’)，7.605-7.496(m，3H，H-4，H-5，H-8)，7.260-7.147(m，2H，H-6，H-7)，5.643(S，2H，-CH2-)，4.407(m，2H，-OCH2CH3)，2.689(S，3H，-CH3)，1.397(t，3H，J＝7.2-OCH2CH3)。
EI-MS(％)311(M+，48)，158(100)，265(80)實(shí)施例513-(2’-羧基吡咯-N-亞甲基)二氫喹啉酮-2(72)根據(jù)實(shí)施例化合物41的制備方法，化合物72的制備，不同點(diǎn)在于以2-羧基吡咯與2-氯-3-氯甲基二氫喹啉進(jìn)行反應(yīng)得化合物721H-NMR(300MHz，CDCl3，δppm，JHz)，11.947(S，1H，-COOH)，7.498-7.427(m，2H，H-5，H-6)，7.300(d，1H，J＝8.4，H-8)，7.226(t，1H，J1＝2.1，J2＝5.1，H-5’)，7.109(t，1H，J1＝7.5，J2＝7.8，H-7)，6.920(dd，1H，J1＝1.8，J2＝2.1，H-4’)，6.851(S，1H，H-4)，6.198(t，1H，J1＝3.9，J2＝2.7，H-3’)，5.397(S，2H，-CH2-)。
EI-MS(％)268(M+，23)，158(100)，224(70)實(shí)施例523-(2’-羧基咪唑-N-亞甲基)二氫喹啉酮-2(68)根據(jù)實(shí)施例化合物41的制備方法，化合物68的制備，不同點(diǎn)在于以2-羧基咪唑與2-氯-3-氯甲基二氫喹啉進(jìn)行反應(yīng)得化合物681H-NMR(300MHz，CDCl3，δppm，JHz)，11.973(S，1H，-COOH)，7.755(S，1H，H-4)，7.604(d，1H，J＝5.7，H-5)，7.487(t，1H，J1＝7.8，J2＝6.9，H-6)，7.305(d，1H，J＝8.1，H-8)，7.226(S，1H，H-5’)，7.164(t，1H，J1＝7.5，J2＝7.8，H-7)，6.922(S，1H，H-4’)，5.073(S，2H，-CH2-)。
ESI-MS(％)270[M+1]+實(shí)施例533-(4’-羧基5′-甲基咪唑-N-亞甲基)二氫喹啉酮-2(65)根據(jù)實(shí)施例化合物41的制備方法，化合物65的制備，不同點(diǎn)在于以4-羧基5’-甲基咪唑與2-氯-3-氯甲基二氫喹啉進(jìn)行反應(yīng)得化合物651H-NMR(300MHz，CDCl3，δppm，JHz)，12.035(S，1H，-COOH)，9.068(S，1H，N-H)，7.696(S，1H，H-2’)，7.643(d，1H，J＝7.8，H-5)，7.519(m，1H，H-6)，7.336(d，1H，J＝8.1，H-8)，7.189(t，1H，J1＝7.8，J2＝7.5，H-7)，5.483(S，2H，-CH2-)，2.501(S，3H，-CH3)。
EI-MS(％)283(M+，10)，158(100)，239(65)實(shí)施例543-[2’-(4”-硝基苯羰基)吡咯-N-亞甲基]香豆素(63)根據(jù)實(shí)施例化合物41的制備方法，化合物63的制備，不同點(diǎn)在于以2-(4’-硝基苯羰基吡咯與3-氯甲基香豆素進(jìn)行反應(yīng)得化合物631H-NMR(300MHz，CDCl3，δppm，JHz)，8.30(d，2H，J＝7.8，Ar-H-3，5)，7.89(d，2H，J＝7.8，Ar-H-2，6)，7.703(S，1H，H-4)，7.196-7.606(m，4H，H-5，6，7，8)，6.908(S，1H，H-3’)，6.779(S，1H，H-4’)，6.296(S，1H，H-5’)，5.551(S，2H，-CH2-).
ESI-MS(％)375[M+1]+.
實(shí)施例553-[3’-(4”-甲氧苯甲酰)吡咯-N-亞甲基]-二氫喹啉酮-2(44)根據(jù)實(shí)施例化合物41的制備方法，化合物44的制備，不同點(diǎn)在于以3-(4’-甲氧苯甲酰)吡咯與2-氯-3-氯甲基-二氫喹啉進(jìn)行反應(yīng)得化合物441HNMR(300MHz，DMSO)，δ(ppm)8.773(d，2H，J＝8.4Hz，2，6-ArH)，7.651(s，1H，QU4-H)，7.616(d，1H，J＝7.8HzQU5-H)，7.563(s，1H，Pyr2-H)，7.484(t，1H，J＝7.5Hz，QU7-H)，7.304(d，1H，J＝8.1Hz，QU8-H)7.160(t，1H，J＝7.5Hz，QU6-H)7.024(d，2H，J＝8.4Hz，3，5-ArH)8.001(m，1H，J＝2.4Hz，Pyr5-H)，6.524(t，1H，J＝2.1Hz，Pyr4-H)5.078(s，2H，-CH2N)，3.817(s，3H，-OCH3)ESI-MSm/z(Intensity)359.6(5.0E5，M+)，74.4(5.5E6，M+-285)實(shí)施例563-[2’-(4”-氯苯甲酰)吡咯-N-亞甲基]-二氫喹啉酮-2(45)根據(jù)實(shí)施例化合物41的制備方法，化合物45的制備，不同點(diǎn)在于以2-(4’-氯苯甲酰)吡咯與2-氯-3-氯甲基-二氫喹啉進(jìn)行反應(yīng)得化合物451HNMR(300MHz，DMSO)，δ(ppm)8.728(d，2H，J＝8.7Hz，2，6-ArH)，7.556～7.421(m，5H)，7.293(d，1H，J＝8.1Hz，QU8-H)8.106(t，1H，J＝7.5Hz，QU6-H)7.048(s，1H，Pyr2-H)6.792(d，1H，J＝3Hz)6.318(t，1H，J＝3Hz，Pyr4-H)5.466(s，2H，-CH2N)ESI-MSm/z(Intensity)363.5(1.23E6，M+)實(shí)施例573-[3’-(4”-氯苯甲酰)吡咯-N-亞甲基]-二氫喹啉酮-2(46)根據(jù)實(shí)施例化合物41的制備方法，化合物46的制備，不同點(diǎn)在于以3-(4’-氯苯甲酰)吡咯與2-氯-3-氯甲基-二氫喹啉進(jìn)行反應(yīng)得化合物461HNMR(300MHz，DMSO)，δ(ppm)8.762(d，2H，J＝8.7Hz，2，6-ArH)，7.650～7.542(m，5H)，7.484(t，1H，J＝8.1Hz，QU7-H)7.302(d，1H，J＝8.4Hz，QU8-H)7.159(t，1H，J＝7.5Hz，QU6-H)7.029(t，1H，J＝2.1Hz，Pyr5-H)，6.548(t，1H，J＝2.1Hz，Pyr4-H)，5.080(s，2H，-CH2N)ESI-MSm/z(Intensity)363.5(3.2E5，M+)，219.4(2.5E5，M+-144)實(shí)施例583-(2’-苯甲酰吡咯-N-亞甲基)二氫喹啉酮-2(47)根據(jù)實(shí)施例化合物41的制備方法，化合物47的制備，不同點(diǎn)在于以2-苯甲酰吡咯與2-氯-3-氯甲基-二氫喹啉進(jìn)行反應(yīng)得化合物471HNMR(300MHz，DMSO)，δ(ppm)8.715(d，2H，J＝6.9Hz，QU5，8-H)，7.598～7.281(m，7H)7.106(t，1H，J＝8.1Hz)7.038(s，1H，QU4-H)6.765(d，1H，J＝4.2Hz，Pyr3-H)6.310(t，1H，J＝3Hz，Pyr4-H)5.480(s，2H，-CH2N)ESI-MSm/z(Intensity)329.5(1.9E6，M+)，212.4(1.0E6，M+-117)實(shí)施例593-(2’-乙酰吡咯-N-亞甲基)二氫喹啉酮-2(48)根據(jù)實(shí)施例化合物41的制備方法，化合物48的制備，不同點(diǎn)在于以2-乙酰苯甲酰吡咯與2-氯-3-氯甲基-二氫喹啉進(jìn)行反應(yīng)得化合物481HNMR(300MHz，DMSO)，δ(ppm)8.453(q，2H，J＝8.1Hz，QU5，8-H)7.303～7.279(m，2H)7.198(dd，1H，J間＝1.8Hz，J鄰＝3.9Hz，Pyr3-H)7.104(t，1H，J＝6.9Hz，QU6-H)6.858(s，1H，QU4-H)6.247(t，1H，J＝3.9Hz，Pyr4-H)5.371(s，2H，-CH2N)，3.367(s，3H，-COCH3)ESI-MSm/z(Intensity)267.5(4.6E6，M+)
實(shí)施例603-(3’-乙酰吲哚-N-亞甲基)二氫喹啉酮-2(59)根據(jù)實(shí)施例化合物41的制備方法，化合物59的制備，不同點(diǎn)在于以3-乙酰吲哚與2-氯-3-氯甲基-二氫喹啉進(jìn)行反應(yīng)得化合物591HNMR(300MHz，DMSO)，δ(ppm)8.457(s，1H，QU4-H)8.190(t，1H，QU7-H)7.603(s，1H，Ind2-H)7.556(d，2H，J＝8.1Hz，QU5，8-H)7.468(t，1H，J＝8.1Hz，QU6-H)7.320～7.097(m，4H，Ind4，5，6，7-H)5.363(s，2H，-CH2N)2.361(s，3H，-COCH3)ESI-MSm/z(Intensity)317.5(3.6E5，M+)275.5(1.6E54-42，M++1-42)實(shí)施例613-(3’-乙酰吲哚-N-亞甲基)-7甲氧基二氫喹啉酮-2(58)根據(jù)實(shí)施例化合物41的制備方法，化合物58的制備，不同點(diǎn)在于以3-乙酰吲哚與2-氯-3-氯甲基-7甲氧基二氫喹啉進(jìn)行反應(yīng)得化合物581HNMR(300MHz，DMSO)，δ(ppm)8.438(s，1H，QU4-H)8.184(q，1H，Ind6-H)7.588(m，2H)7.493(d，1H，QU5-H)7.244～7.167(m，2H)6.801(sd，1H，J＝3.3Hz，QU8-H)6.760(dd，1H，J鄰＝9Hz，J間＝3Hz，QU6-H)5.311(s，2H，-CH2N)3.358(s，3H，-OCH3)2.491(s，3H，-COCH3)ESI-MSm/z(Intensity)297.5(6.0E6，M+-49)實(shí)施例623-[2’-(4”-硝苯甲酰)吡咯-N-亞甲基]-7甲氧基二氫喹啉酮-2(49)根據(jù)實(shí)施例化合物41的制備方法，化合物49的制備，不同點(diǎn)在于以2-(4’-硝苯羰基吡咯與3-氯甲基-7甲氧基二氫喹啉酮-2進(jìn)行反應(yīng)得化合物491HNMR(300MHz，DMSO)，δ(ppm)8.303(d，2H，J＝9Hz，3，5-ArH)，7.919(d，2H，J＝9Hz，2，6-ArH)，7.520(s，1H，Pyr5-H)7.483(d，1H，J＝8.7Hz，QU5-H)7.119(s，1H，QU4-H)，6.795(d，1H，J＝2.7Hz，QU8-H)，6.773(s，1H，Pyr3-H)，6.739(dd，1H，J鄰＝8.7Hz，J間＝2.7Hz，QU6-H)6.320(dd，1H，J鄰＝4.2Hz，J間＝2.7Hz，Pyr4-H)5.452(s，2H，-CH2N)3.771(s，3H，-OCH3)ESI-MSm/z(Intensity)404.6(5.6E5，M+)219.4(1.3E5，)實(shí)施例633-(2’-乙酰吡咯-N-亞甲基)-7甲氧基二氫喹啉酮-2(51)根據(jù)實(shí)施例化合物41的制備方法，化合物51的制備，不同點(diǎn)在于以2-乙酰吡咯與3-氯甲基-7甲氧基二氫喹啉酮-2進(jìn)行反應(yīng)得化合物511HNMR(300MHz，DMSO)，δ(ppm)8.409(d，1H，J＝8.7Hz，QU5-H)7.273(t，1H，J＝1.8Hz，Pyr4-H)7.174(dd，1H，J鄰＝3.6Hz，J間＝1.5Hz，Pyr5-H)6.885(s，1H，QU4-H)6.792(d，1H，J＝2.7Hz，QU8-H)6.726(dd，J鄰＝8.7Hz，J間＝2.1Hz，QU6-H)6.219(dd，1H，J鄰＝2.1Hz，J間＝3.3HzPyr3-H)5.330(s，2H，-CH2N)3.771(s，3H，-OCH3)2.341(s，3H，-COCH3)ESI-MSm/z(Intensity)297.5(1.8E6，M+)實(shí)施例643-[3’-(4”-甲氧苯羰基)吡咯-N-亞甲基]-7-甲氧基-二氫喹啉酮-2(53)根據(jù)實(shí)施例化合物41的制備方法，化合物53的制備，不同點(diǎn)在于以3-(4’-甲氧基苯羰基)吡咯與2-氯-3-氯甲基-7-甲氧基二氫喹啉進(jìn)行反應(yīng)得化合物531HNMR(300MHz，DMSO)，δ(ppm)8.763(d，2H，J＝8.7Hz，2，6-ArH)，7.646(s，1H，QU4-H)7.555～7.523(m，2H)，7.024(d，2H，J＝9Hz，3.，5-ArH)，6.980(t，1H，Pyr5-H)6.7996.765(m，2H，QU6，8-H)，6.502(t，1H，Pyr4-H)5.021(s，2H，-CH2N)3.819(s，3H，QU-OCH3)3.782(s，3H，Ar-OCH3)EI-MSm/z(100％)388.5(M+)實(shí)施例653-[3’-(4”-氯苯羰基)吡咯-N-亞甲基-7甲氧基-二氫喹啉酮-2(57)根據(jù)實(shí)施例化合物41的制備方法，化合物57的制備，不同點(diǎn)在于以3-(4’-氯苯羰基)吡咯與2-氯-3-氯甲基-7-甲氧基二氫喹啉進(jìn)行反應(yīng)得化合物571HNMR(300MHz，DMSO)，δ(ppm)8.752(d，2H，J＝8.1Hz2，6-ArH)，7.640(s，1H，QU4-H)，7.569～7.522(m，4H)，7.003(t，1H，J＝2.1Hz，Pyr5-H)6.797～6.773(m，2H)，6.527(t，1H，J＝2.1Hz，Pyr4-H)5.023(s，2H，-CH2N)3.782(s，3H，-OCH3)EI-MS(％)392(27，M+)，188.2(100，M+-204)化合物42和43按以上方法制備藥理實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)例1本發(fā)明化合物對(duì)cisplatin所致小鼠急性腎損傷的保護(hù)作用方法取雄性昆明(KM)小鼠，16g～22g，按體重隨機(jī)分為溶劑對(duì)照組和順鉑模型組、給藥組，每組8只。對(duì)照組腹腔注射生理鹽水，順鉑以生理鹽水溶解，腹腔注射，按7mg/kg。以上各給藥體積均為0.4ml/20g，于注射順鉑前2天開(kāi)始給藥，注射順鉑后第3天、5天、7天分別眼球取血，用試劑盒檢測(cè)血清BUN、Scr，并稱體重。
結(jié)果見(jiàn)表1、2、3、4、5、6和7。
表1化合物對(duì)順鉑造成小鼠腎損傷的保護(hù)作用(造模后3天)

表2化合物對(duì)順鉑造成小鼠腎損傷的保護(hù)作用(造模后5天)

表3化合物對(duì)順鉑造成小鼠腎損傷的保護(hù)作用(造模后3天)

表4化合物對(duì)順鉑造成小鼠腎損傷的保護(hù)作用(造模后5天)

表5化合物對(duì)順鉑造成小鼠腎損傷的保護(hù)作用(造模后7天)

表6化合物對(duì)順鉑造成小鼠腎損傷的保護(hù)作用(造模后5天)


表7化合物對(duì)順鉑造成小鼠腎損傷的保護(hù)作用(造模后7天)


#P＜0.05，與對(duì)照相比；##P＜0.01，與對(duì)照相比*P＜0.05，與模型相比；**P＜0.01，與模型相比實(shí)驗(yàn)例2本發(fā)明化合物31在體外對(duì)cisplatin所引起腎臟細(xì)胞損傷的保護(hù)作用(一)MTT法觀察本發(fā)明化合物31與cisplatin合用對(duì)大鼠腎系膜細(xì)胞rMCs生長(zhǎng)的影響取指數(shù)生長(zhǎng)期的大鼠腎系膜細(xì)胞(rat mesangial cell，rMC)，加入適量含0.02％EDTA的0.25％胰蛋白酶液消化細(xì)胞，使貼壁細(xì)胞脫落。用RPMI1640培養(yǎng)基(含20％小牛血清)制備成濃度為104/ml的細(xì)胞懸液，于96孔板中每孔接種0.1ml。將平板置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱，24小時(shí)后加不同濃度藥物。設(shè)對(duì)照組(n＝6)，cisplatin 0.12、0.37、1.0、3.0、10.0、30μmol/L不同濃度組，本發(fā)明化合物31在0、33、100μmol/L分別與順鉑上述不同濃度合用組，每組設(shè)3個(gè)平行孔。
繼續(xù)培養(yǎng)72或96小時(shí)，棄去培養(yǎng)基，每孔加入0.1ml無(wú)血清RPMI1640培養(yǎng)液配制的MTT(0.5mg/ml)，37℃溫育4小時(shí)，活細(xì)胞可將MTT還原為甲簪。棄上清液，加入150μl DMSO溶解甲簪，于平板振蕩器上充分振搖。用酶標(biāo)儀以450nm作參比波長(zhǎng)，于570nm檢測(cè)波長(zhǎng)測(cè)定吸光度(OD)。
細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率％＝1-(加藥組細(xì)胞OD值/對(duì)照組細(xì)胞OD值)×100％結(jié)果如下MTT實(shí)驗(yàn)的原理是根據(jù)活細(xì)胞能將溴化四氮唑藍(lán)(MTT)還原為一藍(lán)紫色的可溶于DMSO的甲簪化合物，而死細(xì)胞則無(wú)此能力。溶于DMSO的甲簪在570nm處有較強(qiáng)的吸收峰，且此吸收值與活細(xì)胞數(shù)成較好的線性關(guān)系。用MTT法觀察了本發(fā)明化合物31對(duì)cisplatin作用下大鼠腎系膜細(xì)胞的保護(hù)作用。
在cisplatin濃度較低時(shí)，本發(fā)明化合物31對(duì)于cisplatin造成的rMC毒性具有保護(hù)作用。0.12μmol/L cisplatin對(duì)對(duì)照組、33μmol/L本發(fā)明化合物31組、100μmol/L本發(fā)明化合物31組細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率分別為10.7％、8.3％、3.8％；0.37μmol/L cisplatin對(duì)對(duì)照組、33μmol/L本發(fā)明化合物31組、100μmol/L本發(fā)明化合物31組細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率分別為19.0％、12.8％、7.6％；1μmol/Lcisplatin對(duì)對(duì)照組、33μmol/L本發(fā)明化合物31組、100μmol/L本發(fā)明化合物31組細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率分別為25.4％、18.2％、12.0％。本發(fā)明化合物31對(duì)于3μmol/L cisplatin、10μmol/L cisplatin以及30μmol/L cisplatin造成的rMC毒性未見(jiàn)明顯的保護(hù)作用。(見(jiàn)表8，附圖1)表8.本發(fā)明化合物31對(duì)cisplatin引起大鼠腎系膜細(xì)胞(rMC)損傷的保護(hù)作用

(二)MTT法觀察本發(fā)明化合物31與cisplatin合用對(duì)人腎小管上皮細(xì)胞(HKC)生長(zhǎng)的影響取指數(shù)生長(zhǎng)期的人腎小管上皮細(xì)胞(HKC)，加入適量含0.02％EDTA的0.25％胰蛋白酶液消化細(xì)胞，使貼壁細(xì)胞脫落。用DMEM/F12培養(yǎng)基(含20％小牛血清)制備成濃度為104/ml的細(xì)胞懸液，于96孔板中每孔接種0.1ml。將平板置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱，24小時(shí)后加不同濃度藥物。設(shè)對(duì)照組(n＝6)，cisplatin 0.12、0.5、2.5μmol/L不同濃度組，本發(fā)明化合物31在0、2、10、50μmol/L分別與順鉑上述不同濃度合用組每組設(shè)3個(gè)平行孔。
繼續(xù)培養(yǎng)72或96小時(shí)，棄去培養(yǎng)基，每孔加入0.1mll無(wú)血清RPMI1640培養(yǎng)液配制的MTT(0.5mg/m)，37℃溫育4小時(shí)，活細(xì)胞可將MTT還原為甲簪。棄上清液，加入150μl DMSO溶解甲簪，于平板振蕩器上充分振搖。用酶標(biāo)儀以450nm作參比波長(zhǎng)，于570nm檢測(cè)波長(zhǎng)測(cè)定吸光度(OD)。
細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率％＝1-(加藥組細(xì)胞OD值/對(duì)照組細(xì)胞OD值)×100％結(jié)果如下用MTT法觀察了本發(fā)明化合物31對(duì)cisplatin作用下大鼠HKC細(xì)胞的保護(hù)作用本發(fā)明化合物31對(duì)于cisplatin造成的HKC毒性具有保護(hù)作用。0.12μmol/Lcisplatin對(duì)對(duì)照組、2μmol/L本發(fā)明化合物31組、10μmol/L本發(fā)明化合物31、50μmol/L本發(fā)明化合物31組細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率分別為5.9％、3.8％、0.1％、0.1％；0.50μmol/L cisplatin對(duì)對(duì)照組、2μmol/L本發(fā)明化合物31組、10μmol/L本發(fā)明化合物31、50μmol/L本發(fā)明化合物31組細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率分別為11.1％、5.5％、3.5％、6.7％；2.5μmol/L cisplatin對(duì)對(duì)照組、2μmol/L本發(fā)明化合物31組、10μmol/L本發(fā)明化合物31組、50μmol/L本發(fā)明化合物31組細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率分別為78.0％、69.6％、47.7％、43.1％。(見(jiàn)表9，圖2)表9.本發(fā)明化合物31對(duì)cisplatin引起人腎小管上皮細(xì)胞(HKC)損傷的保護(hù)作用

實(shí)驗(yàn)例3本發(fā)明化合物31對(duì)Cisplatin所致大鼠急性腎損傷的保護(hù)作用(一)檢測(cè)方法1.血清生化指標(biāo)血清尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)采用北京化工廠生產(chǎn)的臨床診斷用試劑盒檢測(cè)。
2.考馬氏亮藍(lán)G-250法測(cè)定尿蛋白含量2.1原理考馬氏亮藍(lán)G-250在酸性溶液中呈棕紅色(游離態(tài))，當(dāng)它與蛋白通過(guò)疏水作用結(jié)合后，變?yōu)樗{(lán)色，最大吸收峰在595nm。以小牛血清白蛋白(BSA)作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線推測(cè)尿蛋白濃度。
2.2試劑配制100mg G-250溶解于50ml 95％乙醇中，加入85％(w/v)的磷酸100ml，加水定容至1L。
2.3方法與操作步驟標(biāo)準(zhǔn)曲線取標(biāo)準(zhǔn)蛋白(1mg/ml)0、5、10、20、40、60、80μl，用雙蒸水補(bǔ)至100μl，使得終濃度為0、50、100、200、400、600、800μg/ml。加5mlG-250染液，混勻，室溫放置15min，在595nm處測(cè)量OD值。
測(cè)定取尿液樣本100μl，同上操作。
(二)實(shí)驗(yàn)方法50只雄性Wistar大鼠按體重隨機(jī)分為5組，每組10只，分別為溶劑對(duì)照組、cisplatin模型組、cisplatin合用Benazapril 10mg/kg組、cisplatin合用本發(fā)明化合物31 10mg/kg組、cisplatin合用本發(fā)明化合物31 30mg/kg組。溶劑對(duì)照組腹腔注射10ml/kg生理鹽水；cisplatin模型組腹腔注射cisplatin 6mg/kg一次；cisplatin合用benazepril 10mg/kg組于腹腔注射cisplatin 6mg/kg前3天灌胃給予benazepril 10mg/kg共計(jì)3天，以后每日灌胃給予benazapril 10mg/kg一次，共計(jì)4日，總計(jì)給藥7天；cisplatin合用本發(fā)明化合物3110mg/kg組及cisplatin合用本發(fā)明化合物31 30mg/kg組分別于腹腔注射cisplatin 6mg/kg前3天灌胃給予本發(fā)明化合物31 10mg/kg、30mg/kg共計(jì)3天。以后每日分別灌胃給藥本發(fā)明化合物31 10mg/kg、30mg/kg一次，共計(jì)4日，總計(jì)給藥7天。以上各給藥體積均為10ml/kg。
每日稱體重，末次給藥后收集大鼠24小時(shí)尿量，用G-250法檢測(cè)24小時(shí)尿蛋白量。末次給藥后24小時(shí)，以戊巴比妥鈉30mg/kg麻醉大鼠，于眼眶取血。分別用試劑盒檢測(cè)血清BUN、Scr、TGF-β1和血漿ANGII濃度。
處死動(dòng)物，取腎組織，稱重，計(jì)算腎臟器系數(shù)。將1/2左側(cè)腎臟用磷酸緩沖液(pH7.4)制備10％組織勻漿，測(cè)其脂質(zhì)過(guò)氧化及谷胱甘肽水平；其余部分用Trizol制備10％組織勻漿，提取總RNA，進(jìn)行RT-PCR，分析腎組織TGF-β1mRNA水平。右側(cè)腎用中性福爾馬林固定做病理檢查。
(三)檢測(cè)指標(biāo)與對(duì)照組相比較，觀察模型組、cisplatin合用bennazapril組、cisplatin合用本發(fā)明化合物31 10mg/kg組、cisplatin合用本發(fā)明化合物31 30mg/kg組大鼠各組間血清生化及體重、尿蛋白、臟器指數(shù)的變化，并于給藥后4天處死大鼠，取腎臟作病理檢查。
(四)實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.本發(fā)明化合物31對(duì)cisplatin所致急性腎損傷大鼠血清生化(BUN及Scr)水平的影響給藥后7天，cisplatin模型組大鼠BUN及Scr水平較溶劑對(duì)照組明顯升高，分別增加747.3％及285.4％(P＜0.01)；cisplatin合用bennazapril組、cisplatin合用本發(fā)明化合物3110mg/kg組、cisplatin合用本發(fā)明化合物31 30mg/kg組大鼠與cisplatin模型組相比，BUN水平顯著降低，分別降低23.2％(P＜0.01)、40.0％(P＜0.01)及46.9％(P＜0.01)。Scr水平顯著降低，分別降低24.3％(P＜0.05)、32.3％(P＜0.05)及35.8％(P＜0.05)(見(jiàn)表10)表10.本發(fā)明化合物31對(duì)cisplatin所致急性腎損傷大鼠血清生化(BUN及Scr)水平的影響(n＝10)

##P＜0.01 vs control，*P＜0.05 vs cisplatin model，**P＜0.01 vs cisplatin model2.本發(fā)明化合物31對(duì)cisplatin所致急性腎損傷大鼠尿蛋白(UP)水平的影響給藥后7天，cisplatin模型組大鼠24小時(shí)尿蛋白量較對(duì)照組明顯升高354.6％(P＜0.01)，cisplatin合用bennazapril組、cisplatin合用本發(fā)明化合物3110mg/kg組、cisplatin合用本發(fā)明化合物31 30mg/kg組大鼠與cisplatin模型組相比，24小時(shí)尿蛋白量明顯下降，分別下降59.8％(P＜0.05)、48.8％(P＜0.05)、63.6％(P＜0.05)。(見(jiàn)表11)表11.本發(fā)明化合物31對(duì)cisplatin所致急性腎損傷大鼠尿蛋白(UP)水平的影響(n＝10)

##P＜0.01 vs control，*P＜0.05 vs cisplatin model3.本發(fā)明化合物31對(duì)cisplatin所致急性腎損傷大鼠體重及腎臟指數(shù)的影響給藥后7天，大鼠體重明顯降低，腎組織肥大，色暗紅或灰白。cisplatin合用bennazapril組、cisplatin合用本發(fā)明化合物31 10mg/kg組、cisplatin合用本發(fā)明化合物31 30mg/kg組大鼠，體重亦明顯降低，腎組織肥大較輕，色鮮紅或暗紅。三組體重減輕較小，腎臟指數(shù)增加較少。其中cisplatin合用本發(fā)明化合物31 30mg/kg組大鼠腎臟指數(shù)與cisplatin模型組大鼠相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)(見(jiàn)表12)表12.本發(fā)明化合物31對(duì)cisplatin所致急性腎損傷大鼠體重及腎臟指數(shù)的影響(n＝10)

##P＜0.01 vs control，*P＜0.05 vs cisplatin model實(shí)驗(yàn)例4本發(fā)明化合物31對(duì)大鼠5/6腎切除所致慢性腎功能不全的影響(一)檢測(cè)方法血清生化檢測(cè)BUN、Src試劑盒為北京北化精細(xì)化學(xué)品有限責(zé)任公司生產(chǎn)；血漿ANGII放免試劑盒為北京北方生物技術(shù)研究所產(chǎn)品；TGF-β1 ELISA kit為Biotech產(chǎn)品上海森雄科技實(shí)業(yè)有限公司分裝。
尿蛋白測(cè)定 將大鼠置于代謝籠中收集24小時(shí)尿，采用考馬氏亮藍(lán)G-250法測(cè)定尿蛋白含量。以小牛血清白蛋白(BSA)作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線推算尿蛋白濃度，計(jì)算24小時(shí)尿蛋白量(UP·day-1)。
(二)實(shí)驗(yàn)方法參照《新藥臨床前研究指導(dǎo)原則》建立大鼠部分腎臟切除引起的慢性腎功能不全模型1.模型建立取體重200g-240g雄性Wistar大鼠，腹腔注射戊巴比妥鈉35mg/kg，待麻醉后，手術(shù)摘除右腎，切除左腎上下極腎實(shí)質(zhì)，止血，關(guān)閉腹腔，縫合。
2.分組給藥實(shí)驗(yàn)共設(shè)6組，每組10只鼠，設(shè)假手術(shù)組、模型組、benazepril(4mg/kg)陽(yáng)性對(duì)照組，losartan(10mg/kg)陽(yáng)性對(duì)照組，本發(fā)明化合物31 10mg/kg、30mg/kg兩個(gè)劑量給藥組。
手術(shù)4周后，檢測(cè)大鼠血清尿素氮、肌酐指標(biāo)，依據(jù)血清尿素氮、肌酐水平隨機(jī)分組，并開(kāi)始給藥。本發(fā)明化合物31為灌胃給藥，每周6次，持續(xù)給藥到16周(給藥12周)；benazepril和losartan，均為灌胃給藥每周6次，持續(xù)給藥至16周(給藥12周)。假手術(shù)組、模型組灌胃0.5％羧甲基纖維素鈉(CMC)混懸液，給予體積為10ml·kg-1，持續(xù)給予溶劑對(duì)照至16周(給藥12周)。
3.檢測(cè)指標(biāo)于術(shù)后8、12、16周，乙醚麻醉動(dòng)物，眼球后靜脈叢取血，檢測(cè)血清BUN、Scr水平，放免法測(cè)定血漿ANGII水平，ELISA法測(cè)定血漿TGF-β1水平，將大鼠置于代謝籠中收集24小時(shí)尿，測(cè)尿蛋白量(UP·day-1)；每周稱體重觀察大鼠生長(zhǎng)狀況；術(shù)后16周(給藥12周)，除測(cè)定上述指標(biāo)，各組分別處死動(dòng)物，稱量心臟重量，計(jì)算心臟指數(shù)，取腎臟做病理。
(三)實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.本發(fā)明化合物31對(duì)5/6腎切除模型大鼠BUN水平的影響結(jié)果見(jiàn)表13。與假手術(shù)組相比，模型組大鼠BUN水平在術(shù)后一直維持較高水平，在術(shù)后4周升高46.5％(P＜0.01)，術(shù)后8周升高71.7％(P＜0.01)，術(shù)后12周升高127.7％(P＜0.01)，術(shù)后16周升高84.2％(P＜0.01)。各給藥組術(shù)后8周與模型組相比無(wú)明顯差別。術(shù)后12周，losartan組與模型組相比下降26.8％，benazepril組、本發(fā)明化合物31 10mg/kg、30mg/kg兩個(gè)劑量與模型組相比無(wú)明顯差別；術(shù)后16周losartan組、benazepril組、本發(fā)明化合物31 10mg/kg、本發(fā)明化合物31 30mg/kg組與模型組相比分別下降22.1％(P＜0.01)、14.7％、13.2％、19.9％(P＜0.05)。
表13.本發(fā)明化合物31對(duì)5/6腎切除模型大鼠BUN水平的影響


##P＜0.01 vs SM，*P＜0.05 vs model group，**P＜0.01 vs model group2.本發(fā)明化合物31對(duì)5/6腎切除模型大鼠Scr水平的影響結(jié)果見(jiàn)表14。與假手術(shù)組相比，模型組大鼠Scr水平在術(shù)后4周、術(shù)后8周無(wú)明顯變化，術(shù)后12周升高104.0％(P＜0.01)，術(shù)后16周升高68.2％(P＜0.01)。與模型組相比，術(shù)后12周losartan組、benazepril組、本發(fā)明化合物31 10mg/kg組、本發(fā)明化合物31 30mg/kg組與模型組相比分別下降13.2％、15.5％、7.3％、39.0％(P＜0.01)。術(shù)后16周losartan組、benazepril組、本發(fā)明化合物31 10mg/kg、本發(fā)明化合物31 30mg/kg組與模型組相比分別下降21.4％(P＜0.05)、14.9％、20.3％、34.9％(P＜0.01)。
表14.本發(fā)明化合物31對(duì)5/6腎切除模型大鼠Scr水平的影響


##P＜0.01 vs SM，*P＜0.05 vs model group，**P＜0.01 vs model group3.本發(fā)明化合物31對(duì)5/6腎切除模型大鼠尿蛋白(UP)水平的影響結(jié)果見(jiàn)表15。與假手術(shù)組相比，模型組大鼠UP·day-1水平明顯升高，術(shù)后8周時(shí)升高314.1％(P＜0.01)，術(shù)后12周升高280.3％(P＜0.01)，術(shù)后16周升高816.9％(P＜0.01)。術(shù)后8周losartan組、benazepril組、本發(fā)明化合物31 30mg/kg組與模型組相比分別下降49.1％(P＜0.05)、48.2％(P＜0.05)、46.7％(P＜0.05)，本發(fā)明化合物31 10mg/kg組與模型組相比未見(jiàn)下降；術(shù)后12周losartan組、benazepril組、本發(fā)明化合物31 10mg/kg組、本發(fā)明化合物31 30mg/kg組與模型組相比分別下降27.3％(P＜0.05)、26.6％、30.3％(P＜0.05)、36.6％(P＜0.05)；術(shù)后16周losartan組、benazepril組、本發(fā)明化合物31 10mg/kg組、本發(fā)明化合物31 30mg/kg組與模型組相比分別下降61.0％(P＜0.01)、51.4％(P＜0.05)、40.1％(P＜0.05)、72.3％(P＜0.01)。
表15.本發(fā)明化合物31對(duì)5/6腎切除模型大鼠尿蛋白(UP)水平的影響


##P＜0.01 vs SM，*P＜0.05 vs model group，**P＜0.01 vs model group4.本發(fā)明化合物31對(duì)5/6腎切除模型大鼠體重的影響結(jié)果見(jiàn)表16。術(shù)后4周假手術(shù)組、模型組、losartan組、benazepril組、本發(fā)明化合物31 10mg/kg組、本發(fā)明化合物31 30mg/kg組體重未見(jiàn)明顯差異。與假手術(shù)組相比，術(shù)后16周模型組大鼠、losartan組、benazepril組體重下降約35g(10％)；本發(fā)明化合物31 10mg/kg、本發(fā)明化合物31 30mg/kg組下降約10g(2％)。本發(fā)明化合物31 10mg/kg、本發(fā)明化合物31 30mg/kg組體重下降幅度較小。
表16.本發(fā)明化合物31對(duì)5/6腎切除模型大鼠體重的影響

#P＜0.05 vs SM，*P＜0.05 vs model group5.本發(fā)明化合物31對(duì)5/6腎切除模型大鼠心臟指數(shù)的影響結(jié)果見(jiàn)表17。與假手術(shù)組相比，術(shù)后16周模型組大鼠心臟指數(shù)升高17.8％(P＜0.01)。losartan組、benazepril組、本發(fā)明化合物31 10mg/kg、本發(fā)明化合物31 30mg/kg組與模型組相比分別下降18.0％(P＜0.01)、6.4％、2.4％、13.7％(P＜0.01)。其中l(wèi)osartan組、本發(fā)明化合物31 30mg/kg組心臟指數(shù)下降較為明顯，與假手術(shù)組相近。
表17.本發(fā)明化合物31對(duì)5/6腎切除模型大鼠心臟指數(shù)的影響


##P＜0.01 vs SM，**P＜0.01 vs model group實(shí)驗(yàn)例5本發(fā)明化合物31對(duì)鏈脲霉素所致大鼠糖尿病腎病模型的影響(一)檢測(cè)方法血清生化檢測(cè) 采用荷蘭威同selecrta-E全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定尿蛋白測(cè)定 將大鼠置于代謝籠中收集24小時(shí)尿液，采用考馬氏亮藍(lán)G-250法測(cè)定尿蛋白含量。以小牛血清白蛋白(BSA)作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線推算尿蛋白濃度，計(jì)算24小時(shí)尿蛋白量(UP·day-1)。
(二)實(shí)驗(yàn)方法1.模型建立取體重200g-240g雄性Wistar大鼠，腹腔注射鏈脲霉素(streptozotocin STZSigma公司產(chǎn)品)60mg/kg(以0.1mol/L檸檬酸緩沖液(pH＝7.4)配成所需要的濃度)2.分組給藥實(shí)驗(yàn)共設(shè)4組，設(shè)對(duì)照組、模型組、losartan(10mg/kg)組，本發(fā)明化合物3110mg/kg給藥組。造模同時(shí)給藥。本發(fā)明化合物31為灌胃給藥，每周6次，持續(xù)給藥到24周；losartan為灌胃給藥，每周6次，持續(xù)給藥至24周。對(duì)照組、模型組灌胃0.5％羧甲基纖維素鈉(CMC)混懸液，給予體積為10ml·kg-1，持續(xù)給予至24周。
3.檢測(cè)指標(biāo)于造模后4、8、12、16、24周，乙醚麻醉動(dòng)物，眼球后靜脈叢取血，檢測(cè)血清BUN、Scr、Glu水平，放免法測(cè)定血漿ANGII水平，將大鼠置于代謝籠中收集24小時(shí)尿，測(cè)定尿蛋白量(UP·day-1)；每周稱體重觀察大鼠生長(zhǎng)狀況；術(shù)后16周、24周，除測(cè)定上述指標(biāo)，各組分別處死動(dòng)物，取腎臟做病理。
(三)實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.造模后4周(見(jiàn)表18)與對(duì)照組大鼠相比，模型組大鼠Glu水平升高473.7％；BUN水平升高61.8％(P＜0.05)，Scr.水平升高18.1％(P＜0.05)，說(shuō)明糖尿病大鼠模型造模成功，且大鼠腎功能已出現(xiàn)損傷。各給藥組大鼠Glu、BUN、Scr.亦升高，腎功能未見(jiàn)明顯改善。本發(fā)明化合物31組大鼠ANGII水平均較模型組低。
表18.本發(fā)明化合物31對(duì)鏈脲霉素所致大鼠糖尿病腎病模型的各項(xiàng)指標(biāo)的影響(造模后4周n＝6)


#P＜0.05，vs control group2.造模后8周(見(jiàn)表19)與對(duì)照組大鼠相比，模型組大鼠Glu水平升高409.9％(P＜0.05)；BUN水平升高65.9％(P＜0.05)，Scr.水平升高25.9％(P＜0.05)，各給藥組大鼠Glu、Scr.亦升高，losartan組、本發(fā)明化合物31組大鼠BUN水平有所下降，分別較模型組降低25.8％及17.0％。
表19.本發(fā)明化合物31對(duì)鏈脲霉素所致大鼠糖尿病腎病模型的各項(xiàng)指標(biāo)的影響(造模后8周n＝6)

#P＜0.05，vs control group3.造模后12周(見(jiàn)表20，21)與對(duì)照組大鼠相比，模型組大鼠Glu水平升高484.2％(P＜0.05)；BUN水平升高88.2％(P＜0.05)，Scr.水平升高21.1％。各給藥組大鼠Glu、BUN、Scr.亦升高。與對(duì)照組大鼠相比，模型組大鼠尿蛋白水平升高63.9％，losartan組、本發(fā)明化合物31組大鼠分別較模型組降低23.4％及47.5％。
表20.本發(fā)明化合物31對(duì)鏈脲霉素所致大鼠糖尿病腎病模型的各項(xiàng)指標(biāo)的影響(造模后12周)

#P＜0.05，vs control group表21.本發(fā)明化合物31對(duì)鏈脲霉素所致大鼠糖尿病腎病模型尿蛋白的影響(造模后12周)

#P＜0.05，vs control group*P＜0.05，vs model group4.造模后16周(見(jiàn)表22)與對(duì)照組大鼠相比，模型組大鼠Glu水平升高512.5％(P＜0.05)；BUN水平升高127.7％(P＜0.05)，Scr.水平升高42.6％。各給藥組大鼠Glu.亦升高，本發(fā)明化合物31組大鼠BUN水平有所下降，較模型組降低19.1％；losartan組Scr.水平有所下降，較模型組降低27.1％；血漿ANGII水平，各組無(wú)差異。與對(duì)照組大鼠相比，模型組大鼠腎臟臟器指數(shù)升高105.5％(P＜0.05)，各給藥組大鼠亦升高，無(wú)顯著差異。
表22.本發(fā)明化合物31對(duì)鏈脲霉素所致大鼠糖尿病腎病模型的各項(xiàng)指標(biāo)的影響(造模后16周)

#P＜0.05，vs control group5.造模后24周(見(jiàn)表23，24)與對(duì)照組大鼠相比，模型組大鼠Glu水平升高28.0％；BUN水平升高251.0％(P＜0.05)，Scr.水平升高12.6％。各給藥組大鼠Glu、BUN、Scr.亦升高；血漿ANGII水平，各組無(wú)差異；與對(duì)照組大鼠相比，模型組大鼠腎臟臟器指數(shù)升高85％，各給藥組大鼠亦升高。與對(duì)照組大鼠相比，模型組大鼠尿蛋白水平升高119.3％，losartan組、本發(fā)明化合物31組大鼠分別較模型組降低34.9％及47.0％。
表23.本發(fā)明化合物31對(duì)鏈脲霉素所致大鼠糖尿病腎病模型的各項(xiàng)指標(biāo)的影響(造模后24周)

#P＜0.05，vs control group表24.本發(fā)明化合物31對(duì)鏈脲霉素所致大鼠糖尿病腎病模型尿蛋白的影響(造模后24周)

#P＜0.05，vs control group，*P＜0.05，vs model group本發(fā)明化合物31抗腎功能不全的作用機(jī)制研究(一)本發(fā)明化合物31對(duì)細(xì)胞凋亡的影響1.熒光顯微鏡檢測(cè)凋亡細(xì)胞方法取指數(shù)生長(zhǎng)期的人腎小管上皮細(xì)胞(HKC)，加入適量含0.02％EDTA的0.25％胰蛋白酶液消化細(xì)胞，使貼壁細(xì)胞脫落。用DMEM/F12培養(yǎng)基(含20％小牛血清)制備成濃度為104/ml的細(xì)胞懸液，于24孔板中每孔接種0.5ml。將平板置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱，24小時(shí)后加不同濃度藥物。繼續(xù)作用所需時(shí)間。收集HKC細(xì)胞，PBS洗一次，離心，去上清，4℃，4％多聚甲醛固定細(xì)胞20分鐘，PBS洗一次，加入Hoechst 33342(終濃度為10μg/ml)，37℃染色5-10分鐘。離心除去染液，滴片，Olympus熒光顯微鏡下觀察并照相。
結(jié)果細(xì)胞核形態(tài)變化為凋亡細(xì)胞最典型的特征，也是判斷凋亡細(xì)胞的基本參數(shù)。凋亡細(xì)胞的主要形態(tài)學(xué)變化包括，細(xì)胞核固縮，染色體DNA廣泛斷裂，斷片沿核膜濃聚成多型性高密度顆粒區(qū)；核膜皺縮，崩解后包裹染色體片段彌散于細(xì)胞漿。細(xì)胞全面皺縮，細(xì)胞膜皺縮外突，但細(xì)胞膜包裹細(xì)胞器或核片段形成凋亡小體。Hoechst 33342是一種親脂性染料，可跨膜進(jìn)入細(xì)胞對(duì)DNA進(jìn)行染色。本研究采用熒光染色方法觀察了cisplatin合用不同濃度本發(fā)明化合物31(2-50μmol/L)作用24小時(shí)的HKC細(xì)胞形態(tài)變化。用熒光染料Hoechst 33342對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，在紫外光的激發(fā)下，發(fā)出藍(lán)色熒光。從圖可見(jiàn)cisplatin組凋亡細(xì)胞特征性形態(tài)明顯，染色體DNA斷裂并聚集成細(xì)小的凝聚塊，并可見(jiàn)到凋亡小體。隨著本發(fā)明化合物31藥物濃度的加大，鏡下凋亡細(xì)胞比例逐漸漸少，(見(jiàn)圖3)2.本發(fā)明化合物31對(duì)cisplatin誘導(dǎo)的HKC細(xì)胞染色體DNA斷裂的影響方法取指數(shù)生長(zhǎng)期的人腎小管上皮細(xì)胞(HKC)，加入適量含0.02％EDTA的0.25％胰蛋白酶液消化細(xì)胞，使貼壁細(xì)胞脫落。用DMEM/F12培養(yǎng)基(含20％小牛血清)制備成濃度為104/ml的細(xì)胞懸液，于培養(yǎng)瓶中接種4ml。將培養(yǎng)瓶置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱，24小時(shí)后加不同濃度藥物。繼續(xù)作用所需時(shí)間。收集2×106個(gè)細(xì)胞，用PBS洗滌兩次，重懸于0.5ml細(xì)胞消化液中(100mmol/L NaCl，10mmol/L Tris-HCl pH8.0，25mmol/L EDTA pH8.0，0.1mg/ml Proteinase K)，混勻后，50℃保溫12小時(shí)，消化后，細(xì)胞用等體積苯酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)抽提一次，水相再用氯仿/異戊醇(24∶1)抽提兩次除蛋白，所得水相用2.5倍體積無(wú)水乙醇沉淀DNA，用醋酸鈉(3mol/L)或醋酸銨(2.5mol/L)助沉，12000g/min取各管離心，取上清18μl，加5μl上樣緩沖液，在1.5％瓊脂糖凝膠上電泳，紫外光下觀察并照相。
結(jié)果細(xì)胞凋亡最主要的生化標(biāo)志是內(nèi)源性鈣-鎂離子依賴性核酸內(nèi)切酶被激活，選擇性降解染色體核小體間DNA，導(dǎo)致細(xì)胞DNA廣泛斷裂，形成大小不一的DNA片段，甚至單聚或寡聚核小體，從而在瓊脂糖凝膠電泳上呈現(xiàn)規(guī)則的、間隔180～200bp的“DNA梯子”樣條帶。本文以cisplatin作為對(duì)照藥，用不同濃度的本發(fā)明化合物31(2-50μmol/L)合同cisplatin作用于HKC細(xì)胞36小時(shí)，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，由圖可見(jiàn)隨著本發(fā)明化合物31濃度的加大，cisplatin誘導(dǎo)的“DNA梯子”樣條帶逐漸減弱，呈一定的劑量依賴性。本發(fā)明化合物31對(duì)10μmol/L cisplatin誘導(dǎo)的HKC凋亡具有明顯的抑制作用。(見(jiàn)圖4)(二)抗氧化作用1.本發(fā)明化合物31對(duì)Fe2+-L-cys誘發(fā)肝微粒體脂質(zhì)過(guò)氧化的影響方法取大鼠肝微粒體(蛋白含量約為15mg/ml)0.1ml；加入不同濃度的藥物和試劑(1)不同藥物濃度10μl；(2)1mmol/L FeSO450μl；(3)10mmol/L L-半胱氨酸20μl；(4)PBS(pH7.4)0.82ml。合計(jì)為1ml。在37℃環(huán)境中反應(yīng)30min；加20％TCA 0.3ml終止反應(yīng)；2000rpm離心15min；取上清1.0ml加0.67％硫代巴比妥酸(TBA)0.6ml，沸水加熱10min；冷卻后，在532nm處測(cè)OD值，計(jì)算抑制率。
結(jié)果本發(fā)明化合物31在體外對(duì)Fe2+-L-半胱氨酸誘發(fā)的肝微粒體脂質(zhì)過(guò)氧化作用具有一定的抑制作用，且在10ug/ml達(dá)到最大抑制濃度，抑制率為32.3％。作用弱于酚羥基化合物S-3-1。(見(jiàn)表25，圖5)表25.本發(fā)明化合物31對(duì)Fe2+-L-cys誘發(fā)肝微粒體脂質(zhì)過(guò)氧化的影響

2.本發(fā)明化合物31對(duì)cisplatin所致急性腎損傷大鼠腎組織脂質(zhì)過(guò)氧化水平的影響方法上述藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)(本發(fā)明化合物31對(duì)順鉑所致大鼠急性腎損傷的保護(hù)實(shí)驗(yàn))中大鼠，取腎組織勻漿(每克腎組織制備勻漿10ml)，按下述方法測(cè)定各組大鼠腎組織脂質(zhì)過(guò)氧化水平，比較各給藥組間差異。腎組織勻漿丙二醛(MDA，malondialdehyde)測(cè)定如下取0.1ml勻漿，加入0.1ml 10％SDS，室溫靜置20min；加2ml 0.1N HCl和1.0ml 1％TBA，混勻，100℃水浴，40min；冷卻后加4ml正丁醇，振蕩3～5min，萃取，3000rpm離心10min；取上層正丁醇液0.2ml加至96孔板中，用酶標(biāo)儀在532nm處測(cè)定OD值；標(biāo)準(zhǔn)曲線以四乙氧基丙烷(TEP)0、20、40、60、80、100μmol/L作為標(biāo)準(zhǔn)。
結(jié)果給大鼠腹腔單次注射6mg/kg cisplatin后4天，腎組織脂質(zhì)過(guò)氧化水平明顯高于對(duì)照組(P＜0.05)，cisplatin合用本發(fā)明化合物31組、合用Benazapril組大鼠腎組織脂質(zhì)過(guò)氧化水平降低，其中cisplatin合用本發(fā)明化合物31(30mg/kg)組大鼠腎組織脂質(zhì)過(guò)氧化水平與cisplatin組相比下降45.2％(P＜0.05)。本發(fā)明化合物31在體內(nèi)具有一定的抗脂質(zhì)過(guò)氧化作用。(見(jiàn)表26)表26.本發(fā)明化合物31對(duì)cisplatin所致急性腎損傷大鼠腎組織脂質(zhì)過(guò)氧化水平的影響(n＝10)

#P＜0.05 vs control，*P＜0.05 vs cisplatin model3.本發(fā)明化合物31對(duì)cisplatin所致急性腎損傷大鼠腎組織谷胱甘肽水平的影響方法上述藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)(本發(fā)明化合物31對(duì)cisplatin所致大鼠急性腎損傷的保護(hù)實(shí)驗(yàn))中大鼠，取腎組織勻漿(每克腎組織制備勻漿10ml)，按下述方法測(cè)定各組大鼠腎組織谷胱甘肽水平，比較各給藥組間差異。腎組織勻漿巰基(-SH)含量測(cè)定(DTNB法)如下(1)總GSH(T-SH)0.5ml組織勻漿加入1.5ml的0.2mol/L Tris緩沖液(pH8.2)，0.1ml 0.01mol/L DTNB，7.9ml無(wú)水乙醇，使得總體積為10ml；試劑空白同樣制備；標(biāo)準(zhǔn)曲線取還原型谷胱甘肽(GSH)0、125、250、500、1000μmol/L作為標(biāo)準(zhǔn)；上述顏色反應(yīng)15min后，在室溫下3000g離心15min；取上清0.2ml加至96孔板中，用酶標(biāo)儀在410nm處測(cè)OD值。
(2)非蛋白結(jié)合型GSH(NP-SH)2.5ml組織勻漿加入2ml雙蒸水，0.5ml50％TCA，不斷搖動(dòng)10～15min，3000g離心15min；試劑空白同樣制備；標(biāo)準(zhǔn)曲線同上；1.0ml濾液或上清液中加入2.0ml 0.4mol/L Tris(pH8.9)，0.1ml0.01mol/L DTNB，搖勻；DTNB加入后5min內(nèi)，取上清0.2ml加至96孔板中，用酶標(biāo)儀在412nm處測(cè)OD值。
(3)蛋白結(jié)合型GSH(PB-SH)其值即為T(mén)-SH測(cè)量值減去NP-SH測(cè)量值。
結(jié)果給大鼠腹腔單次注射6mg/kg cisplatin后4天，腎組織總GSH(T-GSH)、蛋白結(jié)合型GSH(PB-GSH)水平均低于對(duì)照組(P＜0.01)，非蛋白結(jié)合型GSH(NB-GSH)水平無(wú)明顯變化。cisplatin合用Benazapril組、cisplatin合用本發(fā)明化合物31組大鼠腎組織總GSH(T-GSH)、蛋白結(jié)合型GSH(PB-GSH)水平亦下降，與cisplatin組相比無(wú)明顯變化。(見(jiàn)表27)表27.本發(fā)明化合物31對(duì)cisplatin所致急性腎損傷大鼠腎組織谷胱甘肽水平的影響(n＝10)

##P＜0.01 vs control(三)與腎素-血管緊張素-TGF-β通路相關(guān)的機(jī)制1.體外檢測(cè)本發(fā)明化合物31對(duì)血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)的抑制作用方法反應(yīng)底物HHL以緩沖液(HEPES 50mM，NaCl 300mM，pH＝8.3)配成10mM，ACE以緩沖液配成80mU/ml，每一藥物濃度均設(shè)對(duì)照管，依次如下表加藥

37℃，振搖反應(yīng)30min后加125ul1N HCl終止反應(yīng)；各管(實(shí)驗(yàn)管和對(duì)照管)加入1.5ml乙酸乙酯振搖萃取，取上層乙酸乙酯1.0ml；120℃、30min揮發(fā)干乙酸乙酯，加水1ml溶解，紫外228nm處測(cè)吸收值。ACE活性以如下公式(A228-A228control)×5.6×10-3；以加水管為對(duì)照計(jì)算各加藥管的抑制率。
結(jié)果體外通過(guò)檢測(cè)在血管緊張素轉(zhuǎn)化酶作用下HHL反應(yīng)生成馬尿酸(Hippuricacid)的量來(lái)判斷血管緊張素轉(zhuǎn)化酶的活性。本發(fā)明化合物31體外在10-9mol/L、10-8mol/L濃度下對(duì)血管緊張素轉(zhuǎn)化酶具有微弱的抑制作用。(見(jiàn)表28)表28.本發(fā)明化合物31在體外對(duì)血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)的抑制作用

2.本發(fā)明化合物31對(duì)TGF-β1受體結(jié)合試驗(yàn)的拮抗作用方法將Balb/c 3T3或NIH 3T3細(xì)胞接種到96孔板，培養(yǎng)條件為37℃，5％CO2，DMEM培養(yǎng)基(含10％胎牛血清)。培養(yǎng)2-4天后，在細(xì)胞接近融合時(shí)，將培養(yǎng)液換成結(jié)合緩沖液(50mmol/L HEPES中含有NaCl，KCl，MgSO4和CaCl2)，加入100pmol/L[125I]TGF-β1激發(fā)試驗(yàn)，同時(shí)加入受試化合物。細(xì)胞培養(yǎng)4小時(shí)后，棄去培養(yǎng)基，用冰冷的結(jié)合緩沖液洗滌細(xì)胞。測(cè)定10nmol/L TGF-β1的非特異性結(jié)合。細(xì)胞溶解在Triton X-100緩沖液中，測(cè)定放射性。
結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表29，本發(fā)明化合物31對(duì)TGF-β1受體結(jié)合具有一定的抑制作用。
表29.本發(fā)明化合物31在體外對(duì)TGF-β1受體結(jié)合試驗(yàn)的拮抗作用


3.本發(fā)明化合物31對(duì)cisplatin致急性腎損傷大鼠血漿TGF-β1升高的抑制作用方法(1)標(biāo)準(zhǔn)曲線制作設(shè)標(biāo)準(zhǔn)孔8孔，每孔中各加入樣品稀釋液100μl，第一孔加標(biāo)準(zhǔn)品100μl，混勻后用加樣器吸出100μl，移至第二孔。如此反復(fù)作對(duì)倍稀釋至第七孔，最后，從第七孔中吸出100μl棄去，使之體積均為100μl。第八孔為空白對(duì)照。
(2)加樣待測(cè)品孔中每孔各加入已激活的待測(cè)樣品100μl。將反應(yīng)板置37℃120min。洗板用洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌4～6次，在濾紙上印干。
(3)每孔中加入第一抗體工作液50μl。將反應(yīng)板充分混勻后置于37℃60min。洗板用洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌4～6次，在濾紙上印干。
(4)每孔加酶標(biāo)抗體工作液100μl。將反應(yīng)板置37℃60min。洗板用洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌4～6次，在濾紙上印干。
(5)每孔加入底物工作液100μl，置于37℃暗處反應(yīng)5～10min。
(6)每孔加入1滴終止液混勻。
(7)在492nm處測(cè)定OD值。
(8)結(jié)果計(jì)算所有OD值均減去空白值后計(jì)算。以標(biāo)準(zhǔn)品2000、1000、500、250、125、62.5、32pg/ml對(duì)OD值作標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)該標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算相應(yīng)的TGF-β1值。
結(jié)果上述cisplatin所致急性腎損傷大鼠模型，腹腔注射6mg/kg cisplatin后4天，血漿TGF-β1水平較對(duì)照組動(dòng)物增加72.8％(P＜0.05)，與cisplatin模型組相比，cisplatin合用bennazapril組、cisplatin合用本發(fā)明化合物31 10mg/kg組、cisplatin合用本發(fā)明化合物31 30mg/kg組大鼠血漿TGF-β1水平分別下降44.5％(P＜0.05)、60.8％(P＜0.01)、61.4％(P＜0.01)(見(jiàn)表30)表30.本發(fā)明化合物31對(duì)cisplatin致急性腎損傷大鼠血漿TGF-β1水平的影響(n＝10)

#P＜0.05 vs control，*P＜0.05 vs cisplatin model，**P＜0.01 vs cisplatin model4.本發(fā)明化合物31對(duì)5/6腎切除模型大鼠血漿TGF-β1水平的影響方法同本發(fā)明化合物31對(duì)cisplatin致急性腎損傷大鼠血漿TGF-β1升高的抑制作用結(jié)果結(jié)果見(jiàn)表31。與假手術(shù)組相比，模型組大鼠血漿TGF-β1水平在術(shù)后12周無(wú)明顯變化；術(shù)后16周開(kāi)始升高，較假手術(shù)組升高40.7％。術(shù)后16周losartan組、benazepril組、本發(fā)明化合物31 10mg/kg、本發(fā)明化合物31 30mg/kg組與模型組相比分別下降35.7％、9.3％、16.7％、39.9％。
表31.本發(fā)明化合物31對(duì)5/6腎切除模型大鼠血漿TGF-β1水平的影響

**P＜0.01 vs model group5.RT-PCR觀察本發(fā)明化合物31對(duì)cisplatin所致急性腎損傷大鼠腎組織TGF-β1mRNA表達(dá)的影響方法腎組織總RNA提取(1)在經(jīng)過(guò)DEPC處理過(guò)的50ml離心管中放置0.5g液氮凍存的腎組織，加入5ml Trizol試劑，用勻漿器充分勻漿約1～2min，隨后Vortex振蕩混勻，冰浴10min。
(2)加入1.75ml氯仿，充分振蕩或上下來(lái)回顛倒數(shù)次，稍靜止后出現(xiàn)分層，隨即于4℃，12000rpm離心15min。
(3)將上清(水相)轉(zhuǎn)移于另一支干凈50ml離心管中，注意不要吸到中間層的蛋白沉淀。加入等體積的異丙醇(4℃預(yù)冷)混勻。4℃，12000rpm離心20min。
(4)沉淀即所需要的總RNA，倒掉上清后，加入1.5ml 75％乙醇，晃蕩洗滌一次并小心地倒掉乙醇。再12000rpm離心幾秒鐘，用Tip頭吸干上清。然后加入200μl DEPC處理過(guò)的水溶解沉淀，儲(chǔ)存于-20℃待用。
(5)吸20μl RNA提取液加DEPC處理水至400μl，于260nm及280nm測(cè)OD值。若OD260nmOD280nm＞2，則所測(cè)RNA較純。由1OD260nm＝40μg/mlRNA推算RNA濃度。
大鼠TGF-β1引物Sense primer5’ATG GTG GAC CGC AAC AAC 3’Anti-sense primer5’CCA AGG TAA CGC CAG GAA T大鼠β-actin引物Sense primer5’GTG GGG CGC CCC AGG CAC CA 3’Anti-sense primer5’CTT CCT TAA TGT CAC GCA CGA TTT C 3’RT-PCR反應(yīng)體系(Add nuclease-free water to total volume 50μl)

反應(yīng)條件

電泳取RT-PCR產(chǎn)物40μl，加6×上樣緩沖液8μl，于1.7％瓊脂糖凝膠電泳(恒壓70V)，拍照。
結(jié)果上述藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)(本發(fā)明化合物31對(duì)cisplatin所致大鼠急性腎損傷的保護(hù)實(shí)驗(yàn))中大鼠腎組織RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，觀察DNA條帶強(qiáng)弱。結(jié)果cisplatin組大鼠的DNA條帶強(qiáng)于對(duì)照組；cisplatin合用benazapril組、cisplatin合用本發(fā)明化合物31組大鼠的DNA條帶弱于cisplatin組大鼠，通過(guò)半定量分析分別下降42.0％、14.2％、44.5％(見(jiàn)圖6，7)。benazapril和本發(fā)明化合物31均能不同程度地抑制cisplatin誘導(dǎo)的大鼠腎組織TGF-β1 mRNA表達(dá)增高。
6.本發(fā)明化合物31對(duì)cisplatin所致急性腎損傷大鼠血漿AngII水平的影響方法
血管緊張素II(ANG II)放免分析測(cè)定大鼠腹腔注射35mg/kg戊巴比妥鈉麻醉后，用毛細(xì)玻璃管于眼底靜脈叢取血1ml，置于冰水浴冷卻的酶抑制劑抗凝管中，搖勻，即刻再置入冰水浴中冷卻，待離心時(shí)取出。4℃1000rpm離心5min，分離血漿(在-20℃可保存2月)。
步驟在冰水浴中按下表加樣

搖勻，室溫放置15min、3500rpm離心15min，吸去上清，再測(cè)定各管沉淀物的放射性Bi(cpm)。
結(jié)果計(jì)算結(jié)合百分率計(jì)算設(shè)S0管計(jì)數(shù)為B0，各標(biāo)準(zhǔn)管或樣品管計(jì)數(shù)為B，則計(jì)算公式如下BB0%=B-NSBB0-NSB×100%]]>Logit計(jì)算公式如下Logit=B/B0%100-B/B0%]]>以標(biāo)準(zhǔn)濃度取常用對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的logit值為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。待測(cè)樣品ANG II濃度即可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出。
結(jié)果上述cisplatin所致急性腎損傷大鼠模型，腹腔注射6mg/kg cisplatin后4天，血漿ANGII水平較對(duì)照組動(dòng)物增加279.6％(P＜0.01)，與cisplatin單藥組相比，cisplatin合用bennazapril組、cisplatin合用本發(fā)明化合物31 10mg/kg組、cisplatin合用本發(fā)明化合物31 30mg/kg組大鼠血漿Ang II水平分別下降44.3％(P＜0.05)、45.0％(P＜0.01)、60.2％(P＜0.01)(見(jiàn)表32)。cisplatin與本發(fā)明化合物31合用組大鼠的血漿Ang II水平亦升高，各實(shí)驗(yàn)組間血漿Ang II水平無(wú)顯著性差異。
表32.本發(fā)明化合物31對(duì)cisplatin所致急性腎損傷大鼠血漿Ang II水平的影響(n＝10)

##P＜0.01 vs control，**P＜0.01 vs cisplatin model
7.本發(fā)明化合物31對(duì)5/6腎切除模型大鼠血漿AngII水平的影響方法同本發(fā)明化合物31對(duì)cisplatin所致急性腎損傷大鼠血漿ANG II水平的影響。
結(jié)果結(jié)果見(jiàn)表33。與假手術(shù)組相比，模型組ANGII水平在術(shù)后16周升高23.9％，術(shù)后16周benazepril組、本發(fā)明化合物31 10mg/kg組、本發(fā)明化合物31 30mg/kg組與模型組相比分別下降18.3％、7.7％、39.8％；losartan組與模型組相比有所升高。
表33.本發(fā)明化合物31對(duì)5/6腎切除模型大鼠血漿AngII水平的影響

(四)與膠原形成和分解相關(guān)的機(jī)制1.底物酶譜法分析本發(fā)明化合物31對(duì)HT-1080細(xì)胞分泌基質(zhì)金屬蛋白酶能力的影響方法根據(jù)Heussen等的方法加以改進(jìn)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HT-1080細(xì)胞，消化后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，以1×105/孔的密度接種于24孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)過(guò)夜。次日每孔加入含有一定濃度藥物和對(duì)照溶劑的培養(yǎng)基培養(yǎng)12h。棄培養(yǎng)上清，PBS洗三次，然后換無(wú)血清加藥培養(yǎng)基300μl繼續(xù)培養(yǎng)12小時(shí)。收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，4℃，200g離心10min去除細(xì)胞碎片，上清液于-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?，?xì)胞消化計(jì)數(shù)。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳參考文獻(xiàn)進(jìn)行。配制一定體積的8％分離膠和5％濃縮膠，分離膠中含0.1％(w/v)明膠。按細(xì)胞數(shù)折算出相同細(xì)胞數(shù)所對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)上清體積，并按此體積加樣電泳(上樣緩沖液中不含DTT)。電泳完畢后，剝離凝膠，以蒸餾水漂洗后，移入100ml 2.5％TritonX-100溶液中，在搖床上低速搖動(dòng)以洗脫SDS。30min后，換新的TritonX-100溶液繼續(xù)洗脫30min。凝膠移入100ml明膠酶緩沖液(50mmol/L Tris-HCl，pH7.5，10mmol/L CaCl2，200mmol/LNaCl，1μmol/L ZnCl2)中，37℃恒溫溫育16小時(shí)。蒸餾水漂洗后，凝膠以0.1％考馬斯亮藍(lán)R-250染液染色4小時(shí)，蒸餾水漂洗后，在脫色液(冰醋酸∶甲醇∶水∶＝10∶45∶45)中脫色1-2h，至對(duì)照組出現(xiàn)明顯、清晰的負(fù)染條帶。凝膠掃描照相，負(fù)染條帶的寬度和亮度反映明膠酶的活性，用Gel-Pro Analyzer 3.1軟件對(duì)負(fù)染條帶密度掃描并進(jìn)行半定量分析。
結(jié)果IV型膠原是細(xì)胞外基質(zhì)的重要組成成分，明膠酶(gelatinase)或稱IV型膠原酶能降解組成基質(zhì)膜的IV型膠原，其活性是影響IV型膠原降解重要因素之一。用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳可以將HT1080細(xì)胞分泌到培養(yǎng)上清中的明膠酶和它們的活性形式按分子量大小分開(kāi)，經(jīng)TritonX-100去除和蛋白結(jié)合的SDS后，明膠酶能恢復(fù)其蛋白降解活性。藥物作用細(xì)胞后，如果影響到明膠酶表達(dá)和分泌的調(diào)節(jié)通路，則分泌到培養(yǎng)上清中的各種形式的明膠酶的含量將發(fā)生變化。如果把明膠摻入到凝膠液中使之與丙烯酰胺共價(jià)聚合，在適宜的反應(yīng)條件下，明膠酶就能降解其周圍的明膠，蛋白降解區(qū)不能被考馬斯亮藍(lán)染色，所以在明膠酶的活性區(qū)域附近就能出現(xiàn)一條負(fù)染帶。腫瘤細(xì)胞分泌的明膠酶越多，帶的亮度和寬度也就越大。用這種底物酶譜法(Zymography)觀察本發(fā)明化合物31對(duì)HT-1080細(xì)胞分泌基質(zhì)金屬蛋白酶能力的影響，結(jié)果表明在cisplatin作用下HT1080細(xì)胞分泌明膠酶比對(duì)照組明顯減少；cisplatin合用本發(fā)明化合物31組明膠酶分泌增加，且具有一定的濃度依賴關(guān)系。(見(jiàn)圖8)2.底物酶譜法分析本發(fā)明化合物31對(duì)大鼠腎系膜細(xì)胞(rMC)分泌基質(zhì)金屬蛋白酶能力的影響方法細(xì)胞改用大鼠腎系膜細(xì)胞(rat mesangial cell，rMC)方法同底物酶譜法分析本發(fā)明化合物31對(duì)HT-1080細(xì)胞分泌基質(zhì)金屬蛋白酶能力的影響。
結(jié)果用底物酶譜法(Zymography)觀察本發(fā)明化合物31對(duì)大鼠腎系膜細(xì)胞分泌基質(zhì)金屬蛋白酶能力的影響，結(jié)果表明在cisplatin作用下HT1080細(xì)胞分泌明膠酶比對(duì)照組減少；本發(fā)明化合物31組可使rMC明膠酶分泌增加，且具有一定的濃度依賴關(guān)系。(見(jiàn)圖9)
權(quán)利要求
1.一種如通式(I)所示的化合物 其中X選自O(shè)，NH；W選自CO，CH2；R選自C1-C6直鏈或支鏈的烷基；R3選自未取代或取代的N-吡咯基，(吡咯環(huán)上的取代基為-R10，其中R10選自H，COOH，C1-C4羰烷基，烷氧羰基，未取代或取代的苯羰基，苯環(huán)上的取代基為H，鹵素，C1-C4甲氧基，NO2)；未取代單取代或多取代的咪唑基或吡唑基(咪唑基或吡唑基上的取代基選自H，C1-C6烷基，CF3，CHO，CO2H，CO2C2H5)；取代的N-吲哚基，(吲哚環(huán)上的取代基為H，C1-C4烷羰基)；NHR11，其中R11選自-CH(CO2CH3)CH2C6H4-OH-4”，未取代、單或多取代的苯基(苯環(huán)上的取代基為H，鹵素，OH，羧基，C1-C4酯基，C1-C4羧基烷氧基，C-四氮唑基，等)，取代苯基烷基(C1-C4)；R6選自H，C1-C4烷基，NO2；R7選自H，OH，C1-C4烷氧基；R8選自H，C1-C8烷基，烷氧基，硝基；
2.如權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于，如通式(Ia)所示 其中X、R、R6、R7和R8的定義和權(quán)利要求1相同；R11選自C6H5-，p-HOC6H4-，p-HO2CC6H4-，p-EtO2CC6H4-，m-HO2CCH2OC6H4-，3’-HO-4’-HO2CC6H3-，3’-HO2C-4’-HOC6H3-，3’-Cl-4’-HO2CC6H3-，-CH2CH2C6H4-OH-4’，-CH(CO2CH3)CH2C6H4-OH-4’，
3.如權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于，如通式(Ib)所示 其中X，R，R6，R7，R8的定義和權(quán)利要求1相同；R12選自N-(取代的吡咯基)即( 其中R10選自2’-COCH3，2’-CO2CH3，2’-CO2H，2’-CO2C2H5，2’-COC6H5，3’-CO-C6H5，2’-CO-C6H4-Cl-4”，3’-CO-C6H4-Cl-4”，2’-CO-C6H4-OCH3-4”，3’-CO-C6H4-OCH3-4”，2’-CO-C6H4-NO2-4”，3’-CO-C6H4-NO2-4”)；N-(取代的咪唑基)即( 其中R10a或R10b選自CH3，CO2H，CO2C2H5，)；或吡唑基即( 其中R10c或R10d選自CH3，C3H7，CF3，CO2H，CO2C2H5)；N-(3’-取代的吲哚基)即、
4.如權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于所述的化合物，選自式(Ia)所代表的以下化合物的群組之一， 其中，R-X＝NH，R11＝苯基，R6＝NO2，R7＝R8＝H R-X＝NH，R11＝3’-CO2H-4’-OH-苯基，R6＝NO2，R7＝R8＝HR-X＝NH，R11＝3’-OH-4’-CO2H-苯基，R6＝NO2，R7＝R8＝H R-X＝NH，R11＝4’-(1”，2”3”，4”-四唑-5”)-苯基，R6＝NO2，R7＝R8＝HR-X＝NH，R11＝3’-(1”，2”3”，4”-四唑-5”)-苯基，R6＝NO2，R7＝R8＝H R-X＝NH，R11＝3’-Cl-4’-CO2H-苯基，R6＝NO2，R7＝R8＝HR-X＝NH，R11＝4’-CO2Et-苯基，R6＝NO2，R7＝R8＝HR-X＝NH，R11＝4’-CO2H-苯基，R6＝NO2，R7＝R8＝HR-X＝NH，R11＝4’-OH-苯基，R6＝NO2，R7＝R8＝HR-X＝NH，R11＝3’-OCH2CO2H-苯基，R6＝NO2，R7＝R8＝HR-X＝NH，R11＝苯基，R6＝R7＝R8＝HR-X＝NH，R11＝4’-CO2Et-苯基，R6＝R7＝R8＝HR-X＝NH，R11＝4’-CO2H-苯基，R6＝R7＝R8＝HR-X＝NH，R11＝3’-OH-4’-CO2H-苯基，R6＝R7＝R8＝HR-X＝NH，R11＝3’-CO2H-4’-OH-苯基，R6＝R7＝R8＝HR-X＝NH，R11＝4’-OH-苯基，R6＝R7＝R8＝HR-X＝NH，R11＝4’-(1”，2”3”，4”-四唑-5”)-苯基，R6＝R7＝R8＝HR-X＝NH，R11＝3’-(1”，2”3”，4”-四唑-5”)-苯基，R6＝R7＝R8＝HR-X＝NCH3，R11＝4’-CO2Et-苯基，R6＝NO2，R7＝R8＝HR-X＝NCH3，R11＝3’-OH-4’-CO2H-苯基，R6＝NO2，R7＝R8＝HR-X＝NCH3，R11＝3’-CO2H-4’-OH-苯基，R6＝NO2，R7＝R8＝HR-X＝NCH3，R11＝苯基，R6＝NO2，R7＝R8＝HR-X＝NCH3，R11＝4’-CO2H-苯基，R6＝NO2，R7＝R8＝HR-X＝NCH3，R11＝4’-OH-苯基，R6＝NO2，R7＝R8＝HR-X＝NCH3，R11＝4’-(1”，2”3”，4”-四唑-5”)-苯基，R6＝NO2，R7＝R8＝HR-X＝NCH3，R11＝3’-(1”，2”3”，4”-四唑-5”)-苯基，R6＝NO2，R7＝R8＝HR-X＝NCH3，R11＝3’-Cl-4’-CO2H-苯基，R6＝NO2，R7＝R8＝HR＝NCH(CH3)2，R11＝4’-(1”，2”3”，4”-四唑-5”)-苯基，R6＝NO2，R7＝R8＝HR＝NCH(CH3)2，R11＝3’-(1”，2”3”，4”-四唑-5”)-苯基，R6＝NO2，R7＝R8＝HR-X＝O，R11＝苯基，R6＝C2H5，R7＝OCH3，R8＝HR-X＝O，R11＝4’-(1”，2”3”，4”-四唑-5”)-苯基，R6＝NO2，R7＝OH，R8＝CH3R-X＝O，R11＝3’-(1”，2”3”，4”-四唑-5”)-苯基，R6＝NO2，R7＝OH，R8＝CH3R-X＝O，R11＝3’-(1”，2”3”，4”-四唑-5”)-苯基，R6＝NO2，R7＝OH，R8＝C4H9R-X＝O，R11＝4’-(1”，2”3”，4”-四唑-5”)-苯基，R6＝NO2，R7＝OH，R8＝C4H9R-X＝O，R11＝4’-(1”，2”3”，4”-四唑-5”)-苯基，R6＝H，R7＝OCH3，R8＝C4H9R-X＝O，R11＝3’-(1”，2”3”，4”-四唑-5”)-苯基，R6＝H，R7＝OCH3，R8＝C4H9R-X＝O，R11＝4’-(1”，2”3”，4”-四唑-5”)-苯基，R6＝H，R7＝R8＝OCH3R-X＝O，R11＝1’-甲氧羰基-2’-(4”-羥苯基)-乙基，R6＝NO2，R7＝OH，R8＝CH3R-X＝NH，R11＝(4”-羥苯基)-乙基，R6＝R7＝R8＝HR-X＝NH，R11＝4’-(1”，2”3”，4”-四唑-5”)-苯基，R6＝H，R7＝OCH3，R8＝NO2
5.如權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于所述的化合物，選自式(Ib)所代表的以下化合物的群組之一， 其中，R-X＝NH，R12＝N-[2’-(4”-硝基苯羰基)吡咯基]，R6＝R7＝R8＝HR-X＝NH，R12＝N-[3’-(4”-硝基苯羰基)吡咯基]，R6＝R7＝R8＝HR-X＝NH，R12＝N-[2’-(4”-甲氧基苯羰基)吡咯基]，R6＝R7＝R8＝HR-X＝NH，R12＝N-[3’-(4”-甲氧基苯羰基)吡咯基]，R6＝R7＝R8＝HR-X＝NH，R12＝N-[2’-(4”-氯苯羰基)吡咯基]，R6＝R7＝R8＝HR-X＝NH，R12＝N-[3’-(4”-氯苯羰基)吡咯基]，R6＝R7＝R8＝HR-X＝NH，R12＝N-(2’-苯羰基吡咯基)，R6＝R7＝R8＝HR-X＝NH，R12＝N-(2’-甲基羰基吡咯基)，R6＝R7＝R8＝HR-X＝NH，R12＝N-[2’-(4”-硝基苯羰基)吡咯基]，R7＝OCH3，R6＝R8＝HR-X＝NH，R12＝N-[3’-(4”-硝基苯羰基)吡咯基]，R7＝OCH3，R6＝R8＝HR-X＝NH，R12＝N-(2’-甲基羰基吡咯基)，R7＝OCH3，R6＝R8＝HR-X＝NH，R12＝N-[3’-(4”-甲氧基苯羰基)吡咯基]，R7＝OCH3，R6＝R8＝HR-X＝NH，R12＝N-[2’-(4”-甲氧基苯羰基)吡咯基]，R7＝OCH3，R6＝R8＝HR-X＝NH，R12＝N-(2’-苯羰基吡咯基)，R7＝OCH3，R6＝R8＝HR-X＝NH，R12＝N-(3’-苯羰基吡咯基)，R7＝OCH3，R6＝R8＝HR-X＝NH，R12＝N-[2’-(4”-氯苯羰基)吡咯基]，R7＝OCH3，R6＝R8＝HR-X＝NH，R12＝N-[3’-(4”-氯苯羰基)吡咯基]，R7＝OCH3，R6＝R8＝HR-X＝NH，R12＝N-(3’-甲基羰基吲哚基)，R7＝OCH3，R6＝R8＝HR-X＝NH，R12＝N-(3’-甲基羰基吲哚基)，R6＝R7＝R8＝HR-X＝O，R12＝N-(2’-苯羰基吡咯基)，R6＝R7＝R8＝HR-X＝O，R12＝N-[2’-(4”-甲氧基苯羰基)吡咯基]，R6＝R7＝R8＝HR-X＝O，R12＝N-[2’-(4”-氯苯羰基)吡咯基]，R6＝R7＝R8＝HR-X＝O，R12＝N-2’-(4”-硝基苯羰基)吡咯基，R6＝R7＝R8＝HR-X＝NH，R12＝N-2’-甲?；量┗?，R6＝R7＝R8＝HR-X＝NH，R12＝N-(4′-CO2H-5′-CH3咪唑基)，R6＝R7＝R8＝HR-X＝NH，R12＝N-(4′-CO2C2H5-5′-CH3咪唑基)，R6＝R7＝R8＝HR-X＝NH，R12＝N-(2′-CO2C2H5-咪唑基)，R6＝R7＝R8＝HR-X＝NH，R12＝N-(2′-CO2H-咪唑基)，R6＝R7＝R8＝HR-X＝NH，R12＝N-(3′-CF3-4′-CO2C2H5-吡唑基)，R6＝R7＝R8＝HR-X＝NH，R12＝N-(3′-C3H7-5′-CO2C2H5-吡唑基)，R6＝R7＝R8＝HR-X＝NH，R12＝N-2’-CO2C2H5-吡咯基，R6＝R7＝R8＝HR-X＝NH，R12＝N-2’-CO2H-吡咯基，R6＝R7＝R8＝H
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于，該化合物還包括其藥用鹽、水合物、酯或前體藥物。
7.制備如權(quán)利要求1所述的化合物的方法，其特征在于，i)用取代的3-羧基香豆素、與相應(yīng)的取代胺類化合物縮合；或ii)用各種取代的苯胺類化合物與氯代乙酰氯進(jìn)行反應(yīng)，得到的中間體與三氯氧磷及二甲基甲酰胺反應(yīng)，生成取代的3-氯甲基喹啉，然后其氯甲基與相應(yīng)的各種取代吡咯類化合物1-位氮反應(yīng)，所得產(chǎn)物水解后得各種目的化合物。
8.根據(jù)權(quán)利要求7中任一制備方法，其特征在于，所述的反應(yīng)所用的反應(yīng)試劑包括三氯化磷、三氯氧磷、五氯化磷、二氯亞砜、草酰氯、乙酸酐、1，二環(huán)己基碳化亞胺(DCC)、二吡啶碳酸酯(2-DPC)、1，3-二異丙基碳酰亞胺(DIPC)、1-(3-二甲胺丙基)-3-乙基碳酰亞胺(EDCI)、乙酸酐、三氯氧磷和二甲基甲酰氨；所用的催化劑包括三級(jí)胺、吡啶、4-二甲氨基吡啶和4-吡咯烷基吡啶；所用的有機(jī)溶劑包括二甲基亞砜(DMSO)、甲苯、二氯甲烷、乙二醇二甲醚，1，2-二氯乙烷、四氫呋喃和N，N-二甲基甲酰胺(DMF)。
9.一種藥物組合物，其特征在于，含有藥物有效劑量的如權(quán)利要求1-6所述
的任一化合物及藥用載體。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的藥物組合物，其特征在于，所述的藥物組合物可以是片劑、膠囊、液體口服液、丸劑、注射劑、緩釋制劑、控釋制劑及各種微粒給藥系統(tǒng)。
11.如權(quán)利要求1-6任一化合物作為制備轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)抑制劑中的應(yīng)用，從而作為制備抑制治療腎臟疾患的藥物中的應(yīng)用。
12.如權(quán)利要求1-6任一化合物作為制備血管緊張素II(AII)轉(zhuǎn)化酶受體拮抗劑中的應(yīng)用。
13.如權(quán)利要求1-6任一化合物在制備治療心腦血管疾患的藥物中的應(yīng)用。
14.如權(quán)利要求1-6任一化合物在制備治療II型糖尿病的藥物中的應(yīng)用。
15.根據(jù)權(quán)利要求13的應(yīng)用，其特征在于，所述的心腦血管疾患是高血壓、心、腦栓塞、心肌梗塞、腦中風(fēng)。
16.如權(quán)利要求1-6任一化合物在制備治療肝硬化、前列腺肥大的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了新結(jié)構(gòu)類型的香豆素及二氫喹啉酮衍生物及其藥用鹽、這類化合物的制備方法、含有這類化合物的藥物組合物，特別是用于制備治療慢性腎衰、糖尿病、高血壓和心腦血管疾患以及肝硬化和前列腺肥大藥物中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61K31/4704GK1955175SQ200510116739
公開(kāi)日2007年5月2日 申請(qǐng)日期2005年10月28日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月28日
發(fā)明者謝平, 陳曉光, 徐世平, 李洪艷, 李蘭敏, 周艷麗, 劉悅, 羅志剛, 焦曉臻, 鄭旭光 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所