專利名稱：一種豬疫苗使用的pIL－6基因佐劑及制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及豬疫苗使用的佐劑和其制備方法，以及用本發(fā)明的佐劑構成的豬用疫苗。
背景技術：
自從上世紀20年代以來，許多物質被嘗試作為免疫佐劑，但只有鋁膠佐劑獲得了人類疫苗的許可，并大量用于豬疫苗。它作為抗原的儲存庫和載體，緩慢釋放抗原從而延長誘導機體的體液免疫反應，但缺點是僅誘導Th2體液免疫反應，抗體以IgG1型為主，無TCL反應。油佐劑和弗氏完全佐劑雖能明顯提高免疫應答能力，但在實際應用中常出現(xiàn)不良反應，如注射部位腫脹、疼痛、發(fā)燒，或發(fā)生過敏等，僅限用于實驗室動物試驗。206佐劑是目前商品化的高效動物疫苗油佐劑，已廣泛使用于動物疫苗中，實踐證實是可靠的、有效的和安全的，但需要進口，價格較高。
我國是世界養(yǎng)豬大國，2002年以來生豬飼養(yǎng)量在11億頭以上，在畜牧業(yè)生產中占有較大的比重，同時養(yǎng)豬業(yè)也是我國部分省區(qū)的主要生產支柱和新的經濟增長點。但面對當前養(yǎng)豬業(yè)重大疫病發(fā)生和流行愈加復雜的形勢——舊病未除，新病又起，疫情不斷，這就要求我們必須運用新的科學理論和生產技術來發(fā)展豬用安全、高效疫苗預防和控制各種疫病的發(fā)生和流行，而佐劑研制是疫苗研究的主要組成部分。

發(fā)明內容
本發(fā)明的第一個目的是提供一種新的供豬免疫疫苗使用的基因佐劑，這種佐劑可使低應答或無應答以及應答不全的疫苗產生有效的免疫反應。
本發(fā)明的第二個目的是提供本發(fā)明的基因佐劑有制備方法。
本發(fā)明的第三個目的是提供兩類采用本發(fā)明佐劑的豬用免疫疫苗。
本發(fā)明的豬免疫疫苗使用的基因佐劑是指包含有豬白介素6基因(pIL-6)的佐劑。
本發(fā)明的一個具體實例的佐劑為動物細胞表達質粒pcDNA3.1和豬白介素6基因(pIL-6)的重組質粒pcDNA-pIL-6。
本發(fā)明所述的佐劑中的豬白介素4基因的重組質粒pcDNA-pIL-6的制備方法是將豬pIL-6細胞經刺激誘導培養(yǎng)后，采用RT-PCR技術擴增克隆獲得全基因序列，再根據(jù)pcDNA3.1載體的特性在豬IL-6基因閱讀框兩側設計引物克隆其全基因序列，并引入相應的酶切位點，擴增后用相應的酶分別同時酶切目的基因和載體，用T4連接酶連接重組，構建環(huán)形重組表達質粒pcDNA-pIL-6，將所得的重組質粒表達載體轉化大腸桿菌，進行擴增培養(yǎng)，然后再用堿性裂解法大量提取和純化所述這些目的基因的重組表達質粒DNA。
本發(fā)明的兩類豬免疫疫苗是豬用抗囊尾蚴蟲的疫苗組合物和豬口蹄疫病毒滅活疫苗組合物，這兩類疫苗組合物分別是豬用抗囊尾蚴蟲的疫苗組合物是由含有選自豬囊尾蚴蟲體抗原和TSO18重組抗原疫苗，與本發(fā)明的基因佐劑或基因佐劑與206佐劑的混合或乳化而成；豬口蹄疫病毒滅活疫苗組合物是由豬口蹄疫病毒滅活疫苗與與本發(fā)明的基因佐劑或基因佐劑與206佐劑的混合或乳化而成。
細胞因子是機體內免疫細胞或非免疫細胞產生的一類具有廣泛生物學活性的調節(jié)因子，在體內能激活和調節(jié)免疫活性細胞，對免疫應答的產生和調節(jié)具有重要作用(孫衛(wèi)民等編著.細胞因子研究方法學，1999年第一版)。早在DNA疫苗產生之前就有人把細胞因子作為佐劑與疫苗聯(lián)用，但由于細胞因子在體內半衰期太短且造價昂貴，未能在傳統(tǒng)疫苗中廣泛應用。受DNA疫苗以質粒作為抗原載體的啟發(fā)，構建細胞因子重組表達質粒的形式在動物體內表達而發(fā)揮免疫調節(jié)作用即基因佐劑。用細胞因子基因佐劑與疫苗同時注射，可使低應答或無應答以及應答不全的疫苗產生有效的免疫反應。這是建立本發(fā)明的佐劑的理論依據(jù)。
白介素-6(Interleukin 6，IL-6)是細胞因子網絡中的一種多效應的細胞因子，它是一種由多種細胞產生的具有多種生物功能的細胞因子，它可以刺激各種細胞增殖、分化。IL-6對免疫系統(tǒng)的作用主要是能夠促進體液免疫和細胞免疫，主要功能(1)能夠刺激B細胞的分化和Ig的產生，并對T細胞的激活起著重要的作用；(2)對外周T細胞(peripheral T cell)和胸腺T細胞(thymic T cell)成熟分化為細胞毒型T細胞起重要的作用。在機體免疫應答、骨髓造血、自身免疫和機體防御等方面均起著重要作用。本發(fā)明的重組表達質粒在體外具有較高的穩(wěn)定性，在體內表達后具有明顯的免疫增強效果，可以用作多種疫苗的佐劑，特別是用于預防和/或治療常見豬疫病的疫苗佐劑。
本發(fā)明的基因佐劑的優(yōu)越性有1)在宿主體內表達所所需的細胞因子，在構象上接近天然分子結構，活性不受影響；2)一次少量給予即可長時間低量表達，無須多次給藥；3)制備簡單，質量易于控制，易規(guī)?；a，成本低廉，易于保存和運輸；4)安全性好。細胞因子是機體內本身存在的免疫調節(jié)分子，對人體無毒副作用，同時也受機體免疫調節(jié)網絡的控制；5)易于構建和改造。利用分子生物學技術在基因水平可自由地選擇細胞因子種類，實現(xiàn)人們所期望的免疫應答強度和類型。一般情況下，接種某種類型的細胞因子(Th1或Th2類)質?？纱龠M相應類型的免疫反應。
經相關的實驗表明，本發(fā)明的基因佐劑具有可使低應答或無應答以及應答不全的疫苗產生有效的免疫反應的作用，采用本發(fā)明的佐劑的疫苗較不使用佐劑的疫苗有更強烈的免疫作用。


圖1pcDNA-pIL-6表達質粒對豬囊尾蚴蟲體抗原的免疫抗體的增強效果。圖1中CAg代表豬囊尾蚴抗原；IL-6代表pcDNA-pIL-6重組表達質粒；V代表pcDNA空質粒；206代表206佐劑；control代表接種不含抗原的疫苗稀釋液；縱軸代表ELISA法檢測的OD值，橫軸代表免疫后的天數(shù)。
圖2pcDNA-pIL-6表達質粒對豬口蹄疫滅活疫苗的免疫抗體滴度的增強效果。圖2中FAg代表豬口蹄疫滅活疫苗；IL-6代表pcDNA-pIL-6重組表達質粒；V代表pcDNA空質粒；control代表接種不含抗原的疫苗稀釋液?？v軸代表阻斷ELISA法檢測的抗體滴度值，橫軸代表免疫后的天數(shù)。
具體實施例方式
本發(fā)明的佐劑的制備方法詳述如下(1)從豬外周血或淋巴結中分離單個核細胞，經誘導劑刺激培養(yǎng)后，RT-PCR克隆出目的細胞因子基因，經序列同源性、遺傳演化關系以及其分子結構與功能預測分析后，作為基因佐劑的候選基因；(2)采用基因工程重組技術，選擇合適的含酶切位點的表達性引物將目的細胞因子基因克隆入動物細胞表達質粒載體；(3)用步驟(2)所得的重組質粒載體轉化原核宿主菌，挑選陽性克隆，測序鑒定后，再進行擴增培養(yǎng)；和(4)大量提取和純化目的基因的重組質粒DNA。
其中步驟(2)中的質粒載體是基因工程核酸疫苗中常用的載體即pcDNA3.1質粒載體，用于目的基因的擴增，并使細胞因子在動物體內穩(wěn)定、持久表達，以保持其佐劑效應。這類載體是本領域普通技術人員熟知的，添加的酶切位點和克隆的方法是現(xiàn)有技術中的常規(guī)手段，酶切位點通常是其多克隆位點的特定位點。
步驟(3)中的原核宿主菌也是基因工程領域中常用的，能夠大量擴增重組質粒，例如大腸桿菌。宿主細胞的轉化、陽性克隆的篩選、序列測定、宿主菌株的培養(yǎng)以及重組表達質粒的提取純化都是本領域技術人員熟知的，例如描述于Sambrook等人的《Molecular CloningA Laboratory Manual》(紐約，冷泉港實驗室，2001年)。
以是本發(fā)明的一個具體的實施例從長白豬外周血或淋巴結中用淋巴細胞分離液分離單個核細胞，經誘導劑(PHA、LPS或二者聯(lián)合)37℃刺激培養(yǎng)后，在不同時間段提取已刺激培養(yǎng)細胞的總RNA或mRNA，設計特異性引物(pIL-6上游引物5′-CG GGA TCC ATG CCGGAA CGC CTG GAA GAA-3′，下游引物5′-CG GAA TTC TTA CAT CAT CCGAAT GGC CC-3′，酶切位點為BamH I和EcoR I)，以其為模板RT-PCR克隆出目的細胞因子基因pIL-6全序列，分別經序列同源性、遺傳演化關系以及其分子結構與功能預測分析后，作為基因佐劑的候選基因。
在pIL-6，分別設計含酶切位點的表達性引物，通過基因工程重組技術，定向將其克隆入動物細胞表達質粒載體pcDNA3.1中，構建重組表達載體pcDNA-pIL-6；將重組質粒表達載體轉化原核宿主菌，挑選陽性克隆，測序鑒定后，再進行擴增培養(yǎng)。培養(yǎng)所得產物的基因序列見后。
分別選擇細胞因子重組質粒的高拷貝陽性菌株，接種到1000ml含氨芐的LB培養(yǎng)基中，在搖床中220rpm 37℃培養(yǎng)12～14小時后，用SDS堿裂解法大量提取重組質粒。粗提取的質粒經5M冰冷的LiCl分離后，其上清用等體積異丙醇沉淀，再用70％乙醇洗滌沉淀，離心除去上清；將沉淀用含RNase的TE緩沖液溶解，室溫處理30分鐘后，再用酚氯仿抽提2次，2倍無水乙醇沉淀離心；用1ml滅菌水溶解沉淀后，加入0.5ml PEG-MgCl2溶液(30mM MgCl2中加入40％PEG 8000)，充分混勻后放置15分鐘，13000rpm離心20分鐘，沉淀用70％的乙醇洗滌2次，再用TE緩沖液或無菌水溶解沉淀，即得到所在的佐劑，經用核酸蛋白檢測儀分別測定其含量和純度，在4℃保存?zhèn)溆谩?br> 以下為本發(fā)明基因佐劑的中pIL-6基因及其推導氨基酸序列atg aac tcc ctc tcc aca agc gcc ttc agt cca gtc gcc ttc tcc 45Met Asn Ser Leu Ser Thr Ser Ala Phe Ser Pro Val Ala Phe Ser-28-25 -20 -15ctg ggg ctg ctt ctg gtg atg gct act gcc ttc cct acc ccg gaa 90Leu Gly Leu Leu Leu Val Met Ala Thr Ala Phe Pro Thr Pro Glu-10 -5 -1 1cgc ctg gaa gaa gat gcc aaa ggt gat gcc acc tca gac aaa atg 135Arg Leu Glu Glu Asp Ala Lys Gly Asp Ala Thr Ser Asp Lys Met5 10 15ctc ttc acc tct ccg gac aaa act gaa gaa ctc att aag tac atc 180Leu Phe Thr Ser Pro Asp Lys Thr Glu Glu Leu Ile Lys Tyr Ile20 25 30ctc ggc aaa atc tct gca atg aga aag gag atg tgt gag aag tat 225
Leu Gly Lys Ile Ser Ala Met Arg Lys Glu Met Cys Glu Lys Tyr35 40 45gag aag tgt gaa aac agc aag gag gta ctg gca gaa aac aac ctg 270Glu Lys Cys Glu Asn Ser Lys Glu Val Leu Ala Glu Asn Asn Leu50 55 60aac ctt cca aaa atg gca gaa aaa gac gga tgc ttc caa tct ggg 315Asn Leu Pro Lys Met Ala Glu Lys Asp Gly Cys Phe Gln Ser Gly65 70 75ttc aat cag gag acc tgc ttg atg aga atc acc acc ggt ctt gtg 360Phe Asn Gln Glu Thr Cys Leu Met Arg Ile Thr Thr Gly Leu Val80 85 90gag ttt cag ata tac ctg gac tac ctc cag aaa gag tat gag agc 405Glu Phe Gln Ile Tyr Leu Asp Tyr Leu Gln Lys Glu Tyr Glu Ser95 100 105aat aag gga aat gtc gag gct gtg cag att agt acc aaa gca ctg 450Asn Lys Gly Asn Val Glu Ala Val Gln Ile Ser Thr Lys Ala Leu110 115 120atc cag acc ctg agg caa aag gga aag aat cca gac aaa gcc acc 495Ile Gln Thr Leu Arg Gln Lys Gly Lys Asn Pro Asp Lys Ala Thr125 130 135acc cct aac ccc acc aca aat gcc ggc ctg ctg gat aag ctg cag 540Thr Pro Asn Pro Thr Thr Asn Ala Gly Leu Leu Asp Lys Leu Gln140 145 150tca cag aac gag tgg atg aag aac aca aag atc att ctc atc ctg 585Ser Gln Asn Glu Trp Met Lys Asn Thr Lys Ile Ile Leu Ile Leu155 160 165cgc agc ctt gag gat ttc ctg cag ttc agc ctg agg gcc att cgg 630Arg Ser Leu Glu Asp Phe Leu Gln Phe Ser Leu Arg Ala Ile Arg170 175 180ata atg tag 639Ile Met***
本發(fā)明的佐劑對疫苗免疫作用的影響見下述的相關實驗1、pcDNA-pIL-6重組表達質?；蜃魟ωi囊尾蚴病抗原的免疫增強作用(1)將重組表達質粒pcDNA-pIL-6與豬囊尾蚴蟲體抗原(200μg/只)配伍，制備疫苗免疫小鼠，以206佐劑(200μl/只)和pcDNA3.1空載體(100μg/只)為佐劑對照，接種劑量400μl，后肢股內側各注射200μl；在第一次免疫后，25d和63d各加強免疫一次。在免疫后不同時間剪尾采血分離血清，進行測定。試驗證明pcDNA-pIL-6重組表達質粒能明顯增強小鼠抗豬囊尾蚴蟲體抗原的體液免疫水平，高于或相當于206佐劑的免疫增強水平，且明顯高于空質粒免疫對照組，(見圖1)。
2、pcDNA-pIL-6重組表達質?；蜃魟ωi口蹄疫滅活疫苗的作用將重組表達質粒pcDNA-pIL-6 100μg單獨分別與豬口蹄疫滅活疫苗(200μg/只)配伍，制備疫苗免疫小鼠(400μl/只)，以206佐劑(200μl/只)和pcDNA3.1空載體(100μg/只)為佐劑對照，后肢股內側各注射200μl；在第一次免疫后，25d和63d各加強免疫一次。在免疫后不同時間剪尾采血分離血清，用液相阻斷ELISA法檢測口蹄疫抗體滴度。發(fā)現(xiàn)三種豬細胞因子重組質?；蜃魟ωi口蹄疫抗原均有較強的佐劑效應或免疫調節(jié)作用，其抗體滴度在初次免疫后90天可達150以上(見圖3)。
上述實驗表明，本發(fā)明的佐劑性能具體表現(xiàn)在(1)能顯著增強豬囊尾蚴病蟲體抗原和重組抗原的免疫效果。用于實驗動物小鼠時，這些細胞因子重組質粒同時與豬囊尾蚴蟲體抗原組合配制疫苗肌肉接種免疫小鼠，其能夠在小鼠體內表達，調節(jié)機體產生較強的免疫應答，其增強囊尾蚴蟲體抗原誘導體液反應的能力高于或相當于206標準佐劑。
(2)能顯著增強豬口蹄疫滅活疫苗的免疫效果。用IL-4、IL-6和IFN-γ重組質粒分別同時與豬口蹄疫滅活疫苗肌肉接種免疫小鼠，重組質粒在小鼠體內表達的這些細胞因子能夠調節(jié)機體產生較強的免疫應答，其增強豬口蹄疫滅活疫苗誘導體液反應的能力顯著高于標準疫苗對照，實驗誘導組的抗體滴度在免疫后90天時可達150，而空質粒標準疫苗對照組僅為50左右。
(3)該類細胞因子重組表達質粒具有使用劑量小，毒性低的特性。分別用100μg、300μg劑量的重組質粒免疫刺激小鼠和家豬，可達到比206佐劑標準劑量更好的免疫效果，也未發(fā)現(xiàn)對小鼠和家豬的毒副作用。
(4)該類豬細胞因子重組表達質粒對小鼠的免疫刺激也具有交叉活性，因此該類基因佐劑適應的動物譜和抗原譜較廣，實驗動物小鼠可作為該基因佐劑效果評價的動物模型。
權利要求
1.一種豬疫苗使用的基因佐劑，其特征在于該基因佐劑包含有豬白介素6基因(pIL-6)。
2.根據(jù)權利要求1所述的豬疫苗使用的基因佐劑，其特征在于這種佐劑為動物細胞表達質粒pcDNA3.1和豬白介素6基因(pIL-6)的重組質粒pcDNA-pIL-6。
3.根據(jù)權利要求2所述的豬疫苗使用的佐劑中的豬白介素6基因的重組質粒pcDNA-pIL-6的制備方法，其特征在于將豬pIL-6分泌細胞經刺激誘導培養(yǎng)后，采用RT-PCR技術擴增克隆獲得全基因序列，再根據(jù)pcDNA3.1載體的特性在豬IL-6基因閱讀框兩側設計表達型引物克隆其全基因序列，并引入相應的酶切位點，擴增后用相應的酶分別同時酶切目的基因和載體，用T4連接酶連接重組，構建環(huán)形重組表達質粒pcDNA-pIL-6，將所得的重組質粒表達載體轉化大腸桿菌，進行擴增培養(yǎng)，然后再用堿性裂解法大量提取和純化所述這些目的基因的重組表達質粒DNA。
4.一種豬抗囊尾蚴病的疫苗組合物，其特征在于組合物由含有選自豬囊尾蚴蟲體抗原疫苗，與權利要求1或2所述的佐劑混合或乳化而成。
5.一種豬口蹄疫病毒滅活疫苗組合物，其特征在于豬口蹄疫病毒滅活抗原疫苗與權利要求1或2所述的佐劑混合或乳化而成。
全文摘要
本發(fā)明公開一種豬疫苗使用的佐劑和其制備方法，以及用本發(fā)明的佐劑構成的豬用疫苗。本發(fā)明的豬疫苗使用的基因佐劑是指包含有豬白介素6基因(pIL－6)的佐劑，或者本發(fā)明的佐劑為動物細胞表達質粒pcDNA3.1和豬白介素6基因(pIL－6)的重組質粒pcDNA－pIL－6。本發(fā)明的豬疫苗是豬用抗囊尾蚴蟲的疫苗組合物和豬口蹄疫病毒滅活疫苗與基因佐劑的組合物。本發(fā)明的佐劑制備采用基因克隆，重組和重組質粒的擴增、提取和純化等方法。
文檔編號A61K39/125GK1772298SQ20051011972
公開日2006年5月17日 申請日期2005年11月3日 優(yōu)先權日2005年11月3日
發(fā)明者景志忠, 才學鵬, 竇永喜, 蒙學蓮, 王佩雅, 陳國華, 羅啟慧, 袁改玲, 侯俊玲, 駱學農 申請人:中國農業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所