專利名稱：一種可透血腦屏障的脂質(zhì)體和以該脂質(zhì)體為載體的藥物組合物及其制備方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領域，涉及一種可以透過血腦屏障的脂質(zhì)體，還涉及一種以該脂質(zhì)體為載體的藥物組合物及其制備方法。具體涉及一種含血腦屏障錨點的脂質(zhì)體，和一種以該脂質(zhì)體為載體包被有治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)有效量的藥物的藥物組合物及其制備方法。該藥物組合物具有較長的血循環(huán)時間并能主動透過血腦屏障進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)達到治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的作用。
背景技術(shù)：
血腦屏障(blood-brain barrier，簡稱BBB)是由毛細血管內(nèi)皮細胞形成的血液與腦組織間的屏障。它為腦組織提供了一個相對穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境，保障了腦袋正常功能。但是由于BBB的存在使得95％的藥物無法從血液進入腦組織，特別是一些親水性，大分子藥物，因此多數(shù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)藥物都難以透過血腦屏障達到理想的治療效果，一些脂溶性小分子(Mw小于500D)雖然容易透過BBB，但很快又被細胞膜上的高效外排泵攝入血液中(Begley DJ.The blood-brain barrierprinciples for targeting peptides and drugs to the central nervous system[J].J Pharm Pharmacol.1996，48(2)136-146.)。因此，對于中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，發(fā)現(xiàn)一種能透過BBB的有效藥物傳遞方法與發(fā)現(xiàn)一種新藥同等重要。
為了克服BBB，已報道了不少方法，如(1)通過造成血液高滲而使腦毛細血管內(nèi)皮細胞緊密連接瞬時開放，屏障作用消失；(2)將藥物做成適宜的親脂性前體藥物；(3)使用聚氰基丙烯酸酯(PACA)、聚乳酸(PLA)、乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)等材料的納米粒作為載體將藥物送入腦內(nèi)；(4)以免疫脂質(zhì)體為載體，脂質(zhì)體表面的單克隆抗體與BBB上相應的受體發(fā)生特異性結(jié)合，啟動受體介導的胞吞轉(zhuǎn)運，從而使藥物透過BBB；(5)改變給藥途徑，例如通過鼻腔給藥等。但是方法(1)可能使一些有毒有害物質(zhì)在緊密連接瞬時開放期間入腦，影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能，方法(2)由于高效外排泵的存在作用不大，方法(3)尚處于研究階段，且制備工藝復雜，設備條件要求高，而方法(4)則因脂質(zhì)體穩(wěn)定性較差和成本昂貴而不適合進行普遍應用(KREUTER J，ALYAUTDIN RN，KHARKEVICH DA，et al.Passage of peptides through theblood-brain barrier with colloidal polymer particles(nanoparticles)[J].Brain Res，1995，647(1)171-174.；SCHRODER U，SABEL BA..Nanoparticles，a drug carrier system to pass the blood-brain barrier，permit central analgesic effects of iv dalargin injections[J].BrainRes，1996，710(122)121-124.)。研究發(fā)現(xiàn)，在BBB中存在有吸收膠體類物質(zhì)的運輸系統(tǒng)，因此有研究者據(jù)此設計了一些藥物的膠體載體，如納米粒和脂質(zhì)體等，希望能通過該膠體載體使藥物透BBB而入腦(A.Prokop.Bioartificial organs in the twenty-first centurynanobiological devices.Ann.NY Acad.Sci.2001，944472-490.)。然而，此類膠體載體經(jīng)注射入血后會被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(RES)當作異源物質(zhì)迅速清除，主要是被肝、脾的巨噬細胞吞噬。如普通脂質(zhì)體在血液中半衰期僅5～15min，帶負電脂質(zhì)體半衰期更短。
綜上結(jié)論，藥物載體為了能實現(xiàn)把藥物透BBB入腦，就必須滿足這幾個要求第一，增強載體在血液中的穩(wěn)定性，防止被血清蛋白等吸附和破壞；第二，避免RES的清除作用，延長載體在血液循環(huán)時間；第三，具有和BBB特異結(jié)合作用并主動滲透入腦；第四，入腦后能迅速和中樞神經(jīng)細胞融合而釋放藥物分子產(chǎn)生治療作用。脂質(zhì)體是一種首選的傳遞系統(tǒng)，普通脂質(zhì)體的優(yōu)勢是血漿中較穩(wěn)定，可全身用藥。同時也發(fā)展出長循環(huán)脂質(zhì)體，可明顯延長全身循環(huán)時間，如美國專利US4837028公開的聚乙二醇化脂質(zhì)體等。由此可見，可在普通脂質(zhì)體基礎上設計一種可滿足上述要求的可透BBB的中樞神經(jīng)系統(tǒng)藥物載體。
GM1是迄今為止被證明能透過BBB的少數(shù)糖脂分子之一，它已被用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷和修復，是一種重要的神經(jīng)修復因子(WellsJM，Ventura RF，Eisenhauer PB，McKenna DC，F(xiàn)ine RE，Ullman MD.Transportof GM1 and GM1 inner ester across an in vitro model of the blood-brainbarrier.Neurosci Lett.1996.217121-1244.)。同時GM1也是一種可用于制備脂質(zhì)體的重要脂類(Shoko Yokoyama，Tadahiro Takeda，Masahiko Abe，Preparation of ganglioside GM1 liposomes and their membrane properties.Colloids Surf.BBiointerfaces.2002，27181-187.)。同時還有研究表明，紅細胞、血小板和淋巴細胞能在血液中穩(wěn)定存在而不被當作異源物質(zhì)被RES清除，其膜表面神經(jīng)節(jié)苷脂的唾液酸和糖蛋白等起到了重要作用，去除唾液酸基團的紅細胞、血小板和淋巴細胞會被肝臟迅速清除，因此唾液酸分子在RES清除過程中具有明顯抗識別作用(Durocher JR，Payne RC，Conrad ME.Role of sialic acid in erythrocytesurvival.Blood.1975，45(1)11-20.)，因此含唾液酸的GM1的脂質(zhì)體也能夠有效地減少RES的清除作用而延長血循環(huán)時間，同時在血清中很穩(wěn)定。
現(xiàn)在已有不少文獻報道了一種可促進細胞間融合的脂類物質(zhì)，即N-乙酰磷脂酰乙醇胺。研究表明，在脂質(zhì)體中參入N-棕櫚酰磷脂酰乙醇胺(NPPE)或N-硬脂酰磷脂酰乙醇胺(NSPE)不僅能增加脂質(zhì)體膜穩(wěn)定性，更能促進脂質(zhì)體與細胞融合，從而把脂質(zhì)體內(nèi)藥物釋放到細胞內(nèi)(J.C.Domingo，M.Mora，and M.A.De Madariaga.Incorporationof N-acylethanolamine pohospholipids into egg phosphatidylcholinevesiclescharacterization and permeability properties of the binarysystems.Biochim.Biophys.Acta.1993.1148308-316)。
常見的脂質(zhì)體制備方法，包括薄膜水化法、有機溶劑置換法、去垢劑去除法和乙醇注射法等。有些方法已用于工業(yè)化生產(chǎn)。但這些方法所得的脂質(zhì)體大部分不適合過濾、不穩(wěn)定、不能很好去除殘留有機溶劑，同時也很難獲得適合注射和具有較好生物利用度的均勻脂質(zhì)體。因此迫切需要建立可放大、穩(wěn)定、便于無菌處理同時粒徑均勻和費用低廉的脂質(zhì)體制備方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提出一種可透血腦屏障的脂質(zhì)體，使其能作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)藥物載體，具有明顯透過血腦屏障進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用，以滿足醫(yī)療領域的需要；本發(fā)明的目的之二是提出一種以上述可透血腦屏障的脂質(zhì)體為載體的藥物組合物，使其能透過血腦屏障入腦達到治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的作用；本發(fā)明的目的之三是提出上述藥物組合物的制備方法。
本發(fā)明的發(fā)明目的之一是通過選用一種含有5～15％摩爾含量血腦屏障錨點的脂質(zhì)體實現(xiàn)的。
進一步說，上述脂質(zhì)體中含有高相變溫度磷脂 50～70％(摩爾含量)膽固醇 10～30％(摩爾含量)血腦屏障錨點5～15％(摩爾含量)
助融劑15～25％(摩爾含量)所述的高相變溫度磷脂為神經(jīng)鞘磷脂(簡稱SM，下同)和中性合成磷脂。其中所述的中性合成磷脂可以為二棕櫚酰磷脂酰膽堿(簡稱DPPC，下同)、二硬脂酰磷脂酰膽堿(簡稱DSPC，下同)或二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿(簡稱DMPC，下同)，均為符合cGMP要求的產(chǎn)品，可采用Lipoid公司的產(chǎn)品；所述膽固醇為符合cGMP的產(chǎn)品，可采用Lipoid公司產(chǎn)品；所述血腦屏障錨點為單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂(簡稱GM1，下同)和GM1金屬鹽，為一個低聚糖與神經(jīng)鞘胺醇和一個唾液酸分子通過葡萄糖苷鍵相連得到的化合物，可采用Folch，J.，Lees，M.B.，and Sloane Stanley，G.H.等在(1957)J.Biol.Chem.226，497-509.文獻報道方法制備，GM1的結(jié)構(gòu)式為 本發(fā)明優(yōu)選GM1鈉鹽作為血腦屏障錨點。GM1鈉為糖脂類分子，可作為脂類材料參入脂質(zhì)體膜中，通過與血腦屏障上特異性GM1受體結(jié)合而主動透過血腦屏障進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)中。
所說的助融劑為N-乙酰磷脂酰乙醇胺。
所說的N-乙酰磷脂酰乙醇胺可以為N-棕櫚酰磷脂酰乙醇胺(簡稱NPPE，下同)或N-硬脂酰磷脂酰乙醇胺(簡稱NSPE，下同)，本發(fā)明優(yōu)選NPPE作為助融劑。
上述脂質(zhì)體粒徑范圍為0.05～0.5μm。
本發(fā)明的發(fā)明目的之二是通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)的，一種利用上述可以透過血腦屏障的脂質(zhì)體為載體的藥物組合物，其特征在于，該藥物組合物中含有治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)有效量的藥物。
進一步說，上述作為載體的脂質(zhì)體，包被了治療有效量的中樞神經(jīng)系統(tǒng)藥物。
所述治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)有效量的藥物可以為甲鈷胺、胞磷膽堿鈉或神經(jīng)生長因子(簡稱NGF)。
目前，超過95％的神經(jīng)系統(tǒng)藥物不能通過血腦屏障直接進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，因此不能達到很好的治療作用，諸如NGF類蛋白大分子就更不易進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)了。本發(fā)明所述的含血腦屏障錨點的脂質(zhì)體具有以下優(yōu)勢(以血腦屏障錨點為GM1舉例)1.延長在血液中循環(huán)時間，這是因為GM1中唾液酸分子在網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(簡稱RES，下同)清除過程中具有明顯抗識別作用，因此在血液中具有更長的循環(huán)時間，這就增加了脂質(zhì)體透過血腦屏障的機會，達到一種長效的作用。
2.增加了血腦屏障的靶向性，這是因為脂質(zhì)體表面參入的GM1可與血腦屏障特殊受體結(jié)合而主動通過血腦屏障。
3.促進細胞對藥物分子的利用，這是因為助融劑可促進脂質(zhì)體與細胞融合，從而使藥物分子迅速釋放入細胞中。
這些關(guān)鍵優(yōu)點可以對中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病產(chǎn)生更好的治療效果，提高藥物的生物利用度和臨床適應癥范圍。
本發(fā)明所述利用可以透過血腦屏障的脂質(zhì)體為載體的藥物組合物制劑可采用逆相蒸發(fā)法結(jié)合高壓過濾法進行制備，包括如下步驟(1)按脂質(zhì)體摩爾含量百分比稱取各種脂類，高相變溫度磷脂50～70％，膽固醇10～30％，血腦屏障錨點5～15％，助融劑15～25％，用脂質(zhì)體5～10倍體積的溶劑將上述脂類溶解為清澈溶液，所述溶劑為氯仿、甲醇或二者混合；(2)上述溶液置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)燒瓶中，減壓蒸發(fā)蒸干溶劑，得一層附著在蒸發(fā)燒瓶壁的脂膜；(3)取上述步驟(2)含脂膜燒瓶，充氮，以下至步驟(6)操作一直保持充氮，加入有機溶劑溶解脂類至脂類終濃度為100μm/ml，成為有機相溶液，所述有機溶劑為乙醚、二乙醚、氯仿、四氫呋喃或異丙醚；(4)取治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)有效量的藥物配為藥物濃度為0.05～50mg/ml水相溶液；(5)混合有機相溶液和水相溶液，有機相溶液和水相溶液混合時體積比為2∶1～6∶1，超聲處理；(6)將步驟(5)中的混合溶液置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)燒瓶中，室溫減壓蒸干至凝膠狀；再加等體積水相減壓蒸發(fā)至樣品為懸液，結(jié)束充氮；(7)所得樣品置高壓勻漿擠壓器處理并通過微孔濾膜過濾得均勻粒徑脂質(zhì)體。
(8)脂質(zhì)體樣品采用離子交換色譜法、凝膠過濾色譜法或超速離心法進行分離純化，使游離主藥和脂質(zhì)體分離。
(9)純化脂質(zhì)體保持與內(nèi)水相等滲條件，于等滲緩沖中進行制劑，制備成注射液或凍干劑。
其中，步驟(7)中微孔濾膜孔徑優(yōu)選為0.2～0.5μm，高壓勻漿壓力優(yōu)選為50～500psi。
經(jīng)體外血腦屏障模型試驗驗證和體內(nèi)血清和腦組織分布試驗驗證，與未包被藥物相比，經(jīng)本發(fā)明所述脂質(zhì)體包被的中樞神經(jīng)系統(tǒng)藥物具有明顯透過血腦屏障的作用，而且在血液中循環(huán)時間明顯延長。


圖1是NGF脂質(zhì)體用1ml含1％Triton X-100的溶液溶解后取20ul樣品測定所得色譜圖。
圖2是NGF脂質(zhì)體用1m注射用水溶解并高速離心后取上清樣品20ul測定所得色譜圖。
圖3是NGF脂質(zhì)體血漿中考察趨勢曲線。
圖4是NGF和NGF脂質(zhì)體在體外血腦屏障模型中通透性比較。
圖5是125I-NGF組在體內(nèi)血清、肝脾和腦組織分布比較圖。
圖6是125I-NGF脂質(zhì)體組在體內(nèi)血清、肝脾和腦組織分布比較圖。
具體實施例方式
實施例1含GM1鈉鹽的脂質(zhì)體為載體，包被NGF的藥物組合物按脂質(zhì)體摩爾含量百分比稱取各種脂類，DMPC 50％，CH 20％，GM1鈉鹽10％，NPPE 20％，其中，DMPC、NPPE和CH購至Lipoid公司，GM1鈉鹽為自己純化所得。用脂質(zhì)體5倍體積的溶劑(氯仿∶甲醇，體積比2∶1)溶解為清澈溶液。上述溶液置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)燒瓶中，減壓蒸發(fā)蒸干溶劑，為一層附著在蒸發(fā)燒瓶壁的脂膜。取含脂膜燒瓶，充氮(以下操作一直保持充氮)，加入有機溶劑(乙醚)至脂類終濃度為100μm/ml，溶解清澈后為有機相溶液。取神經(jīng)生長因子，溶解在10mMNaCL，10mM Tris-Cl，pH 7.4的緩沖液中，終濃度為0.1mg/ml即為水相溶液。按有機相∶水相，體積比4∶1比例混合二者，超聲處理，5min/4℃。將上述混合溶液置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)燒瓶中，20℃/10～50mmHg至凝膠狀；再加等體積水相30℃/10～50mmHg/15min蒸發(fā)至樣品為懸液，結(jié)束充氮。上述脂質(zhì)體樣品置高壓勻漿擠壓器處理，濾膜選用0.45μm，壓力100psi，循環(huán)3次。上述樣品根據(jù)過CM SepharoseFast Flow陽離子交換層析介質(zhì)，讓脂質(zhì)體樣品在該條件下通過層析介質(zhì)，脂質(zhì)體透過，游離NGF吸附在介質(zhì)上，達到游離主藥和脂質(zhì)體分離。純化脂質(zhì)體樣品用10mM NaCL，10mM Tris-Cl，pH 7.4懸浮稀釋至合適濃度，加入4％甘露醇后分裝凍干，得凍干劑。
實施例2含GM1鈉鹽的脂質(zhì)體為載體，包被甲鈷胺的藥物組合物按脂質(zhì)體摩爾含量百分比稱取各種脂類，DMPC 50％，CH 30％，GM1鈉鹽5％，NPPE 15％，其中，DMPC、NPPE和CH購至Lipoid公司，GM1鈉鹽為自己純化所得。用脂質(zhì)體7.5倍體積的溶劑(氯仿∶甲醇，體積比1∶1)溶解為清澈溶液。上述溶液置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)燒瓶中，減壓蒸發(fā)蒸干溶劑，為一層附著在蒸發(fā)燒瓶壁的脂膜。取含脂膜燒瓶，充氮(以下操作一直保持充氮)，加入有機溶劑(二乙醚)至脂類終濃度為100μm/ml，溶解清澈后為有機相溶液。取甲鈷胺，溶解在注射用水中，終濃度為10mg/ml即為水相溶液。按有機相∶水相，體積比6∶1比例混合二者，超聲處理，5min/4℃。將上述混合溶液置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)燒瓶中，20℃/10～50mmHg至凝膠狀；再加等體積水相30℃/10～50mmHg/15min蒸發(fā)至樣品為懸液，結(jié)束充氮。上述脂質(zhì)體樣品置高壓勻漿擠壓器處理，濾膜選用0.5μm，壓力50psi，循環(huán)3次。上述樣品過凝膠過濾色譜柱，達到游離主藥和脂質(zhì)體分離。純化脂質(zhì)體樣品用10mMNaCL，10mM PB，pH 6.8懸浮稀釋至合適濃度，加入5％甘露醇后分裝，得注射液。
實施例3含GM1鈉鹽的脂質(zhì)體為載體，包被胞磷膽堿鈉的藥物組合物按脂質(zhì)體摩爾含量百分比稱取各種脂類，DMPC 60％，CH 10％，GM1鈉鹽5％，NPPE 25％，其中，DMPC、NPPE和CH購至Lipoid公司，GM1鈉鹽為自己純化所得，用脂質(zhì)體10倍體積的溶劑(氯仿)溶解為清澈溶液。上述溶液置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)燒瓶中，減壓蒸發(fā)蒸干溶劑，為一層附著在蒸發(fā)燒瓶壁的脂膜。取含脂膜燒瓶，充氮(以下操作一直保持充氮)，加入有機溶劑(四氫呋喃)至脂類終濃度為100μm/ml，溶解清澈后為有機相溶液。取胞磷膽堿鈉，溶解在注射用水中，終濃度為2.5mg/ml即為水相溶液。按有機相∶水相，體積比2∶1比例混合二者，超聲處理，5min/4℃。將上述混合溶液置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)燒瓶中，20℃/10～50mmHg至凝膠狀；再加等體積水相30℃/10～50mmHg/15min蒸發(fā)至樣品為懸液，結(jié)束充氮。上述脂質(zhì)體樣品置高壓勻漿擠壓器處理，濾膜選用0.2μm，壓力500psi，循環(huán)3次。上述樣品經(jīng)超速離心，達到游離主藥和脂質(zhì)體分離。純化脂質(zhì)體樣品用10mM NaCL，10mM PB，pH 6.8懸浮稀釋至合適濃度，加入5％甘露醇后分裝，得注射液。
實施例4含GM1鈉鹽的脂質(zhì)體為載體，包被NGF的藥物組合物按脂質(zhì)體摩爾含量百分比稱取各種脂類，DMPC 60％，CH 15％，GM1鈉鹽15％，NPPE 10％，其中，DMPC、NPPE和CH購至Lipoid公司，GM1鈉鹽為自己純化所得。用脂質(zhì)體5倍體積的溶劑(甲醇)溶解為清澈溶液。上述溶液置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)燒瓶中，減壓蒸發(fā)蒸干溶劑，為一層附著在蒸發(fā)燒瓶壁的脂膜。取含脂膜燒瓶，充氮(以下操作一直保持充氮)，加入有機溶劑(異丙醚)至脂類終濃度為100μm/ml，溶解清澈后為有機相溶液。取神經(jīng)生長因子，溶解在10mM NaCL，10mM Tris-Cl，pH7.4的緩沖液中，終濃度為0.8mg/ml即為水相溶液。按有機相∶水相，體積比6∶1比例混合二者，超聲處理，5min/4℃。將上述混合溶液置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)燒瓶中，20℃/10～50mmHg至凝膠狀；再加等體積水相30℃/10～50mmHg/15min蒸發(fā)至樣品為懸液，結(jié)束充氮。上述脂質(zhì)體樣品置高壓勻漿擠壓器處理，濾膜選用0.2μm，壓力300psi，循環(huán)3次。上述樣品根據(jù)過CM Sepharose Fast Flow陽離子交換層析介質(zhì)，讓脂質(zhì)體樣品在該條件下通過層析介質(zhì)，脂質(zhì)體透過，游離NGF吸附在介質(zhì)上，達到游離主藥和脂質(zhì)體分離。純化脂質(zhì)體樣品用10mM NaCL，10mM Tris-Cl，pH 7.4懸浮稀釋至合適濃度，加入4％甘露醇后分裝凍干，得凍干劑。
實施例5含GM1鈉鹽的脂質(zhì)體為載體，包被胞磷膽堿鈉的藥物組合物按脂質(zhì)體摩爾含量百分比稱取各種脂類，DMPC 70％，CH 10％，GM1鈉鹽5％，NPPE 15％，其中，DMPC、NPPE和CH購至Lipoid公司，GM1鈉鹽為自己純化所得。用脂質(zhì)體10倍體積的溶劑(氯仿∶甲醇，體積比1∶1)溶解為清澈溶液。上述溶液置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)燒瓶中，減壓蒸發(fā)蒸干溶劑，為一層附著在蒸發(fā)燒瓶壁的脂膜。取含脂膜燒瓶，充氮(以下操作一直保持充氮)，加入有機溶劑(氯仿)至脂類終濃度為100μm/ml，溶解清澈后為有機相溶液。取胞磷膽堿鈉，溶解在注射用水中，終濃度為4mg/ml即為水相溶液。按有機相∶水相，體積比4∶1比例混合二者，超聲處理，5min/4℃。將上述混合溶液置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)燒瓶中，20℃/10～50mmHg至凝膠狀；再加等體積水相30℃/10～50mmHg/15min蒸發(fā)至樣品為懸液，結(jié)束充氮。上述脂質(zhì)體樣品置高壓勻漿擠壓器處理，濾膜選用0.2μm，壓力250psi，循環(huán)3次。上述樣品經(jīng)超速離心，達到游離主藥和脂質(zhì)體分離。純化脂質(zhì)體樣品用10mM NaCL，10mM PB，pH 6.8懸浮稀釋至合適濃度，加入5％甘露醇后分裝，凍干，得凍干劑。
本申請人對本發(fā)明所述包被NGF的藥物組合物(NGF脂質(zhì)體)作了如下性質(zhì)研究和效果驗證1、性質(zhì)研究(1)NGF含量測定取1支NGF脂質(zhì)體凍干粉，加0.9ml注射用水溶解，再加入0.1ml10％Triton X-100，振蕩混勻后離心取上清液作為含量測定樣品溶液。取NGF原液，配制成不同濃度的NGF標準溶液。用Shodex PROTEINKW-82.5凝膠色譜柱對標準溶液和樣品溶液進行分析，根據(jù)標準溶液色譜結(jié)果計算樣品溶液中NGF濃度。結(jié)果如表1，峰面積與蛋白濃度線形回歸方程為“C(μg/ml)＝0.0004A-1.2691，R2＝0.9984”，經(jīng)計算，NGF主藥含量為77.8μg/ml。
表1高效液相法測定NGF脂質(zhì)體主藥含量結(jié)果

(2)形態(tài)和粒度分布測定取少量脂質(zhì)體，用1％磷鎢酸負染，透射電鏡觀察?？梢妳⑷隚M1和NPPE的脂質(zhì)體包被NGF后形態(tài)未改變，且分布均勻，呈典型的指紋結(jié)構(gòu)。經(jīng)激光粒度散射儀測定脂質(zhì)體平均粒徑為97.3±10.4nm。
(3)包封率測定取2支NGF脂質(zhì)體凍干粉，其中1支照“含量測定”方法測定NGF總量；另1支加1.0ml注射用水溶解，高速離心后取上清液同法測定NGF含量，計算脂質(zhì)體的包封率。經(jīng)計算，NGF含量為77.36μg/ml，離心上清中NGF含量為2.55μg/ml，NGF脂質(zhì)體包封率為96.7％。圖1和圖2分別為NGF脂質(zhì)體含量測定樣品和高速離心后上清樣品HPLC色譜圖。
(4)滲漏率測定取NGF脂質(zhì)體，分別于4℃和37℃放置，然后在不同時間點取樣進行滲漏率測定，根據(jù)滲漏率確定NGF脂質(zhì)體穩(wěn)定性和存放條件，測定結(jié)果見表2和表3。結(jié)果顯示，在4℃條件下，NGF脂質(zhì)體穩(wěn)定性很好，放置12個月時滲漏率低于5％。但在37℃條件下不能長期保存，放置1個月滲漏率就超過5％，放置3個月達到17.5％。
表2NGF脂質(zhì)體滲漏率測定結(jié)果(4℃)

表3NGF脂質(zhì)體滲漏率測定結(jié)果(37℃)

(5)相變溫度測定取NGF脂質(zhì)體，用注射用水溶解后用電導法測定脂質(zhì)體相變溫度，結(jié)果為38.3±0.9℃。
(6)血漿中穩(wěn)定性測定取NGF脂質(zhì)體，加入1.0ml人血漿后于透析管37℃孵育，測定24小時內(nèi)滲漏情況，測定方法為在不同時間點取樣高速離心后取上清進行凝膠高效液相分析，測定NGF脂質(zhì)體滲漏率。測定結(jié)果見表4。結(jié)果顯示，NGF脂質(zhì)體在血漿中穩(wěn)定性很好，24小時內(nèi)滲漏率低于5％。圖2為NGF脂質(zhì)體血漿中穩(wěn)定性趨勢曲線。
表4NGF脂質(zhì)體血漿中滲漏率考察測定結(jié)果(37℃)

(7)有機溶劑殘留取NGF脂質(zhì)體，用氣相色譜法測定樣品溶液中氯仿、甲醇、乙醚殘留量，測定結(jié)果見表5。結(jié)果顯示，NGF脂質(zhì)體有機溶劑殘留量很低，符合中國藥典相關(guān)規(guī)定。
表5NGF脂質(zhì)體有機溶劑殘留量測定結(jié)果

2、NGF脂質(zhì)體在血腦屏障體外模型中通透性測定根據(jù)參考文獻(Wells JM，Ventura RF，Eisenhauer PB，McKennaDC，F(xiàn)ine RE，Ullman MD.Transport of GM1 and GM1 inner esteracross an in vitro model of the blood-brain barrier.NeurosciLett.1996.217121-1244.)方法培養(yǎng)牛腦內(nèi)皮細胞形成血腦屏障體外模型。細胞培養(yǎng)至匯合后取NGF脂質(zhì)體和NGF原液，分別用試驗用培養(yǎng)基稀釋為1.0μg/ml，各取1ml加入1個供試池，受試池中加入試驗用培養(yǎng)基2ml，使細胞插入器內(nèi)外液面相平，以消除液面差產(chǎn)生的靜壓力對通透性的影響。然后在24小時內(nèi)于不同時間點從受試池取樣50μl，取樣結(jié)束后用NGF酶聯(lián)免疫試劑盒測定所取樣品NGF含量。測定結(jié)果見表6。結(jié)果顯示，與NGF原液相比，NGF脂質(zhì)體具有明顯透過血腦屏障的作用。圖4顯示NGF溶液和NGF脂質(zhì)體透過血腦屏障模型的趨勢。
表6體外血腦屏障模型對NGF溶液和NGF脂質(zhì)體通透性測定結(jié)果

3、NGF脂質(zhì)體在體內(nèi)血清、肝脾和腦組織中分布測定取NGF原液，根據(jù)參考文獻(Poduslo JF，Curran GL，Dyck PJ.Increase in albumin，IgG，and IgM blood-nerve barrier indices in human diabeticneuropathy[J].Proc Natl Acad Sci USA，1988，85(13)4879-4883.)敘述方法，采用氯胺T法標記NGF制備125I-NGF，。按實施例2方法制備125I-NGF脂質(zhì)體。
取SD雄性大鼠40只，均分為兩組，即125I-NGF溶液組和125I-NGF脂質(zhì)體組。用15％烏拉坦麻醉后分離其單側(cè)頸動脈和股靜脈，頸動脈近心端結(jié)扎，遠心端做頸動脈插管。股靜脈給藥，劑量為125I-NGF 0.5μg/g。分別于給藥后15，30和60min從插管處取血1mL，然后用蠕動泵灌注生理鹽水20min，最后剪斷對側(cè)頸動脈，繼續(xù)灌流15min，以此消除腦毛細血管中殘留的藥物對腦組織分布的影響。血樣3000×g離心5min得到血清，用γ-計數(shù)儀測定放射活性；同時也于給藥后15，30和60min處死大鼠，取肝脾和腦組織用0.5％Triton X-100勻漿后經(jīng)10,000×g離心10min，取上清液測定放射活性。測定結(jié)果見表7。結(jié)果顯示，125I-NGF組放射活性主要分布于血液和肝脾中，腦組織含量甚微，血藥濃度迅速下降，主要被肝脾吸收；而125I-NGF脂質(zhì)體組一直維持較高的血藥濃度，肝脾吸收甚微，主要被腦組織吸收。由此可明顯反映125I-NGF脂質(zhì)體具有較長血循環(huán)時間和透血腦屏障入腦的作用。
表7NGF和NGF脂質(zhì)體體內(nèi)血清、肝脾和腦組織分布測定結(jié)果

權(quán)利要求
1.一種可以透過血腦屏障的脂質(zhì)體，其特征在于，該脂質(zhì)體含有5～15％摩爾含量的血腦屏障錨點。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種可以透過血腦屏障的脂質(zhì)體，其特征在于，所述脂質(zhì)體含有高相變溫度磷脂 50～70％(摩爾含量)膽固醇 10～30％(摩爾含量)血腦屏障錨點5～15％(摩爾含量)助融劑 15～25％(摩爾含量)
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述一種可以透過血腦屏障的脂質(zhì)體，其特征在于，所述高相變溫度磷脂為神經(jīng)鞘磷脂和合成中性磷脂。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述一種可以透過血腦屏障的脂質(zhì)體，其特征在于，所述合成中性磷脂為二棕櫚酰磷脂酰膽堿、二硬脂酰磷脂酰膽堿或二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述一種可以透過血腦屏障的脂質(zhì)體，其特征在于，所述血腦屏障錨點為單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂GM1和GM1的金屬鹽。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述一種可以透過血腦屏障的脂質(zhì)體，其特征在于，所述GM1金屬鹽為GM1鈉鹽。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述一種可以透過血腦屏障的脂質(zhì)體，其特征在于，所述助融劑為N-乙酰磷脂酰乙醇胺。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述一種可以透過血腦屏障的脂質(zhì)體，其特征在于，所述N-乙酰磷脂酰乙醇胺為N-棕櫚酰磷脂酰乙醇胺或N-硬脂酰磷脂酰乙醇胺。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至8所述一種可以透過血腦屏障的脂質(zhì)體，其特征在于，所述脂質(zhì)體粒徑范圍為0.05～0.5μm。
10.一種利用權(quán)利要求1或2所述可以透過血腦屏障的脂質(zhì)體為載體的藥物組合物，其特征在于，該藥物組合物中含有治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)有效量的藥物。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述藥物組合物，其特征在于，所述治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)有效量的藥物被所述脂質(zhì)體包被。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述藥物組合物，其特征在于，所述治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)的藥物為甲鈷胺、胞磷膽堿鈉或神經(jīng)生長因子。
13.一種制備權(quán)利要求10所述藥物組合物的制備方法，其特征在于，該方法包括如下步驟(1)按脂質(zhì)體摩爾含量百分比稱取各種脂類，高相變溫度磷脂50～70％，膽固醇10～30％，血腦屏障錨點5～15％，助融劑15～25％，用脂質(zhì)體5～10倍體積的溶劑將上述脂類溶解為清澈溶液，所述溶劑為氯仿、甲醇或二者混合；(2)上述溶液置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)燒瓶中，減壓蒸發(fā)蒸干溶劑，得一層附著在蒸發(fā)燒瓶壁的脂膜；(3)取上述步驟(2)含脂膜燒瓶，充氮，以下至步驟(6)操作一直保持充氮，加入有機溶劑溶解脂類至脂類終濃度為100μm/ml，成為有機相溶液，所述有機溶劑為乙醚、二乙醚、氯仿、四氫呋喃或異丙醚；(4)取治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)有效量的藥物配為藥物濃度為0.05～50mg/ml水相溶液；(5)混合有機相溶液和水相溶液，有機相溶液和水相溶液混合時體積比為2∶1～6∶1，超聲處理；(6)將步驟(5)中的混合溶液置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)燒瓶中，室溫減壓蒸干至凝膠狀；再加等體積水相減壓蒸發(fā)至樣品為懸液，結(jié)束充氮；(7)所得樣品置高壓勻漿擠壓器處理并通過微孔濾膜過濾得均勻粒徑脂質(zhì)體。(8)脂質(zhì)體樣品采用離子交換色譜法、凝膠過濾色譜法或超速離心法進行分離純化，使游離主藥和脂質(zhì)體分離。(9)純化脂質(zhì)體樣品保持與內(nèi)水相等滲條件，于等滲緩沖中進行制劑，制備成注射液或凍干劑。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述藥物組合物的制備方法，其特征在于，所述步驟(7)中微孔濾膜孔徑為0.2～0.5μm，高壓勻漿壓力為50～500psi。
全文摘要
本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領域，涉及一種可透血腦屏障的脂質(zhì)體和以該脂質(zhì)體為載體的藥物組合物及其制備方法。該脂質(zhì)體脂質(zhì)體含有5～15％摩爾含量的血腦屏障錨點，還包含高相變溫度磷脂、膽固醇和助融劑，脂質(zhì)體粒徑范圍為0.05～0.5μm。該脂質(zhì)體藥物組合物包被有治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)有效量的藥物，具有較長的血循環(huán)時間，并且能攜帶所包被藥物透過血腦屏障進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)達到治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的作用。
文檔編號A61K47/24GK1833633SQ200510120550
公開日2006年9月20日 申請日期2005年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月29日
發(fā)明者陳亞, 李汝霖, 湯華東, 陳煌 申請人:武漢海特生物制藥股份有限公司