專利名稱：抗病毒藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及包含抑制量的dsRNA的藥物組合物，用于抑制甲殼類動物體內(nèi)病毒復制的藥物組合物、這些藥物組合物的用途以及生產(chǎn)這些藥物組合物的方法。
背景技術(shù)：
甲殼類動物(crustaceans)，特別是蝦(shrimp)易感染很多種病毒性疾病。幾種蝦病毒傳染病常見于大規(guī)模的蝦水產(chǎn)業(yè)項目。顯然，這些病毒傳染病有巨大的經(jīng)濟影響。已知的給大規(guī)模蝦養(yǎng)殖場造成嚴重威脅的病毒有斑節(jié)對蝦桿狀病毒(Monodon Baculovirus)(MBV)，黃頭病桿狀病毒(Yellow-headBaculovirus)(YBV)以及密切相關(guān)的腮聯(lián)病毒(Gill-associated virus)(GAV)，傳染性造血組織和皮下壞死病毒(Infectious Haematopoietic and HypodermalNecrosis virus)(IHHNV)，肝胰腺細小病毒(Hepatopancreatic Parvovirus)(HPV)，蝦Taura綜合癥病毒(Shrimp Taura Syndrome virus)(TSV)和白斑綜合癥病毒(White Spot Syndrome virus)(WSSV)。Flegel，T.W.在World Journ.Microbiol&Biotechn.13433-442(1997)中蝦主要病毒疾病作了綜述。
僅舉一例在養(yǎng)殖的蝦中一次WSSV的爆發(fā)能夠在3-10天內(nèi)達到最高100％的累計致死率，因而給蝦養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。
因此強烈需要對抗上述列出的所有病毒傳染病，特別是WSSV傳染病的保護作用。
疫苗在此保護作用中一直起重要作用。最近，對例如有免疫原性且能夠提供抗WSSV傳染病的免疫力的WSSV蛋白的鑒定和描述表征已導致了這樣疫苗的開發(fā)。僅舉一例，專利申請EP1366169和EP1206550給出了能夠形成疫苗基礎(chǔ)的WSSV-蛋白的例子。
最近三年以來，盡管猶豫不決，人們?nèi)钥紤]了另一種完全不同的在哺乳動物體內(nèi)防止病毒的方法，作為傳統(tǒng)引發(fā)免疫體系的接種疫苗方法的具有誘惑力的但仍不確定的替代方式。這種方法以雙鏈siRNA(短干擾/抑制RNA)對基因表達的抑制作用為基礎(chǔ)。這個領(lǐng)域中大部分知識涉及哺乳動物細胞中的基因沉默作用。關(guān)于抑制病毒復制的知識不是很多。幾乎沒有非哺乳動物領(lǐng)域的經(jīng)驗，更不用說無脊椎動物了。
在這種所謂的RNA干擾，簡稱為RNAi后面的工作機制以及在siRNA后面的工作機制在某種程度上仍然令人迷惑，因此它們已成為過去五年中許多出版物的主題。為了確定它們在宿主中的作用，RNAi主要應用于研究宿主或者宿主細胞的基因特異沉默。Hannon，G.J.在Nature 418244-251(2002)以及Deni，A.M.和Hannon，G.J.在TRENDS in Biochemical Sciences 28196-201(2003)中已作了這個課題的綜述。其它由Bertrand，J.R.等在B.B.R.C.2961000-1004(2002)中和Sorensen，D.R.等在J.Mol.Biol.327761-766(2003)中發(fā)表的文章，描述了siRNA在基因沉默中的應用。
RNAi在哺乳動物體內(nèi)的病毒沉默中的特定應用，如上所述，僅僅在前不久才被提及并由Quan-Chu Wang等(World J.Gastroenterol.91657-1661(2003))綜述。
在WO03/004644中，描述了向節(jié)肢動物遞送dsRNA。WO03/004644明確地旨在確定節(jié)肢動物RNA的生物功能。這一點通過節(jié)肢動物自身基因的特異沉默來達到。為了達到這個目的，使用了重組節(jié)肢動物病毒。使用dsRNA作為保護甲殼類動物以防止病毒的方法沒有被提到或暗示。
然而，本發(fā)明的目的是提供避免或除去病毒感染的方法，因而不改變宿主本身的遺傳組成。
至今為止，RNAi方法從未被考慮用于特異攻擊甲殼類動物體內(nèi)的病毒。這有幾方面的原因。
首先，通常關(guān)于RNAi用于抗病毒方法存在一個普遍關(guān)注人們發(fā)現(xiàn)可以出現(xiàn)對RNAi的抗性。僅舉一例用siRNA長時間處理脊髓灰質(zhì)炎病毒感染的細胞后，發(fā)現(xiàn)有逃脫的脊髓灰質(zhì)炎病毒突變體。
第二，雖然RNAi-介導的基因沉默在分子水平是有效的，但總有一定數(shù)量(盡管是少量)的表達的RNA不結(jié)合siRNA。因此，最后可以形成統(tǒng)計學上顯著數(shù)量的病毒粒，從而一旦SiRNA被降解或甚至在siRNA被降解前將導致新一輪感染。而且，許多DNA病毒包括WSSV和MBV的一個特征是許多基因取決于它們的功能在不同時刻按時表達。早期基因，即感染后早期表達的基因通常編碼酶，例如DNA聚合酶。即使極少量的通過這些早期基因表達的早期RNA逃脫了與siRNA的雜交和隨后的RISC降解，也將會導致足以復制少量病毒DNA的酶活性。晚期基因，即感染周期結(jié)束時表達的基因，通常編碼涉及新病毒粒裝配的結(jié)構(gòu)蛋白。這些晚期基因大量表達，因為它們不編碼酶活性而是編碼結(jié)構(gòu)蛋白。許多晚期RNA分子將不可避免地逃脫與siRNA的雜交和隨后的RISC降解，因而提供了病毒結(jié)構(gòu)蛋白。因此，結(jié)果是即使復制過程本身可能減慢，新病毒粒仍然會形成。
對于將siRNA沉默僅用于研究基因的功能而言，siRNA滲漏可能不會是問題。然而，對于用于抗病毒治療目的，它是嚴重的問題。雖然至今為止在討論RNAi用于抗病毒治療的發(fā)表文章中從未提及這一點，但是盡管RNA干擾但實際上仍有一些病毒粒形成的明顯事實仍明顯地可能導致一些致病的和因而十分有害的效果。
第三，對于大DNA病毒，比如MBV和尤其是WSSV(它擁有所有已知病毒的最大基因組之一300kbp)存在特殊的問題。這些大DNA病毒有一個巨大的工具盒供其使用以部分地避免基因沉默的效應。因此，可以預見到RNAi對這些病毒的作用比目前試驗中描述的對小基因組病毒的作用有低的效率。
最后，與人類醫(yī)學和畜牧業(yè)的獸醫(yī)實踐情況相反，通過注射方式向甲殼類動物施用siRNA是極其費力的，因而如果僅從經(jīng)濟角度上考慮這是非常沒有吸引力的。siRNA經(jīng)口服給藥在理論上可行而且遠遠更有吸引力，但是這需要服用相對大量的siRNA。這是由于這些小RNA高度不穩(wěn)定的事實。因此，口服給藥，雖然原則上可行，但是價格昂貴。
使用長dsRNAs可能能夠部分地解決這個問題。這部分地是因為盡管它們不能解決為了避免滲漏(leakiness)必須高劑量給藥的問題，但是，它們比siRNAs更加穩(wěn)定，而且在進入宿主細胞后，已知它們會被稱為DICER的RNA酶加工成siRNA。然而，盡管乍看使用長dsRNA似乎是有利的，但根據(jù)哺乳動物試驗目前已知，dsRNA，甚至不止siRNA，會對天然免疫系統(tǒng)產(chǎn)生深遠的影響。哺乳動物的天然免疫系統(tǒng)(innate immune system)是一個以非特異方式引發(fā)以應答任何病毒感染的系統(tǒng)。它可被任何病毒引發(fā)，其應答通常將抑制病毒傳播，而不與引發(fā)應答的病毒的特征無關(guān)。天然免疫系統(tǒng)不依賴記憶而發(fā)揮作用。因此，它不依賴于早先與病原體/抗原的接觸。該系統(tǒng)涉及例如釋放如干擾素這樣的細胞因子。但是大量的siRNA和甚至更大量的更長dsRNA，比如使病毒復制沉默所必要的那些，將引起此天然系統(tǒng)以完全非天然的方式過度反應。Toll-樣受體，例如TLR3，識別dsRNA和啟動信號轉(zhuǎn)導，最終導致從關(guān)閉蛋白合成到大量細胞凋亡的整個級聯(lián)效應。見Gil，J.等Apoptosis 5107-114(2001)，Kalai，M.等Cell Death Differ 9981-994(2002)，Chawla-Sarkar，M.等Apoptosis8237-249(2003)和Hovanessian，A.G.，J.Interferon Res.11 199-205(1991)。這些危險而且不可預料的反應當然是有害的不期望的反應。因此在dsRNA用于抗病毒治療時，它們是一個常見的和主要的問題/威脅。
實際上，上面所述問題可能甚至一直是本領(lǐng)域技術(shù)人員不使用RNAi-基礎(chǔ)的方法來保護甲殼類動物免受病毒感染的主要原因。為了避免甲殼類動物吸收的dsRNA劑量太低，待經(jīng)口服給藥的疫苗量在定義上相對高。因此，實踐上非常難以避免dsRNA的過量給藥，而預期這種過量給藥無論如何將會對甲殼類動物造成損害(類似于高等生物中已知的情形)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一目的是提供以dsRNA為基礎(chǔ)的藥物組合物，它顯著地克服了上面提出的問題，即使是對大DNA病毒而言也是如此。
首先令人驚奇地發(fā)現(xiàn)含有dsRNA的藥物組合物(即使該dsrRNA與任何病毒特異核苷酸序列不相關(guān)，)能夠十分顯著地阻斷甲殼類動物體內(nèi)的病毒復制。到目前為止，沒有記載過甲殼類動物體內(nèi)特異或者非特異的可誘導的天然抗病毒系統(tǒng)。甚至令人更加驚奇的是，非特異dsRNA需要的量大約與阻斷病毒復制所需要的WSSV-特異性dsRNA的量相當。
考慮到如下事實這甚至更令人驚奇即使在相關(guān)(雖然親緣關(guān)系非常遠)節(jié)肢動物昆蟲體內(nèi)，也從未觀察到這樣的現(xiàn)象。非病毒特異dsRNA已被用于測試昆蟲體內(nèi)dsRNA-介導的病毒復制阻斷作用的對照，并清楚表明沒有任何作用(Valdes等Journ.Bioch.Chem.278，19317-19324(2003)和Flores-Jasso等Virus Research 10275-84(2004))。
重要的是，本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)了沒有料到的優(yōu)點，即，與高等生物體內(nèi)RNAi研究基礎(chǔ)上可能預見到的情形相反，甲殼類動物體內(nèi)看來沒有出現(xiàn)比如大規(guī)模細胞凋亡這樣的不可預料且不期望的有害反應。甚至更進一步地根據(jù)這些沒有料到的發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)在可以推測非病毒dsRNA防止病毒感染的有益作用是因為強烈引發(fā)了天然免疫系統(tǒng)，然而沒有造成任何有害反應。因此，與從高等動物得知的情形和在昆蟲中的發(fā)現(xiàn)相反，在甲殼類動物體內(nèi)使用高劑量的病毒特異和非特異dsRNA看來都是安全的，能夠誘導防止病毒感染的基礎(chǔ)水平。
因此，本發(fā)明的第一實施方案涉及包含抑制量的dsRNA和藥學可接受載體的藥物組合物，其用于抑制甲殼類動物體內(nèi)病毒的復制。
dsRNA的抑制量是指能夠以如下程度抑制甲殼類動物體內(nèi)病毒復制的量，其中所述抑制的程度將使感染后疾病的發(fā)作或由該疾病所致的死亡在時間上延遲，或者與未被處理的感染動物相比，患病/死亡的動物數(shù)量降低。
如前所述，該dsRNA可以是或者不是病毒來源。
因此，本發(fā)明此實施方案的一個優(yōu)選形成涉及用于抑制甲殼類動物體內(nèi)病毒復制的包含非病毒來源的dsRNA的藥物組合物。
該實施方案中適合使用的dsRNA的唯一特征是它包含具有至少19，優(yōu)選22或者更多個核苷酸的雙鏈RNA分子。
“非病毒dsRNA”被認為是一種其雙鏈都不與病毒的部分基因組互補的dsRNA。
本實施方案的另一種形式涉及包含(可能地非病毒來源的)dsRNA的藥物組合物在生產(chǎn)抑制甲殼類動物體內(nèi)病毒復制的藥物中的應用。
基于上述相同原因，病毒X的dsRNA同樣能夠用于預防病毒Y病毒X的dsRNA可被認為對病毒Y是非特異的。因此，第一實施方案的另一同樣優(yōu)選的形式涉及包含抑制量的第一病毒的dsRNA和藥學可接受載體的藥物組合物，其中第一病毒的dsRNA用于保護甲殼類動物以對抗第二病毒。
在本發(fā)明中，“病毒X的dsRNA”被認為是它的一條鏈與病毒X的部分基因組互補的dsRNA。病毒本身是單鏈或雙鏈DNA病毒，還是單鏈或雙鏈RNA病毒則不重要。
蝦需要預防的致病病毒中最重要的一組由斑節(jié)對蝦桿狀病毒(MonodonBaculovirus)，黃頭病桿狀病毒(Yellow-head Baculovirus)，腮聯(lián)病毒(Gill-associated virus)，傳染性造血組織和皮下壞死病毒(InfectiousHaematopoietic and Hypodermal Necrosis virus)，肝胰腺細小病毒(Hepatopancreatic Parvovirus)，蝦Taura綜合癥病毒(Shrimp TauraSyndrome virus)和白斑綜合癥病毒(White Spot Syndrome virus)組成。
因此，在本實施方案更優(yōu)選的形式中，用于抑制選自上述病毒組的第二病毒的病毒復制。
該實施方案的另一形式涉及包含抑制量的來自第一病毒的dsRNA和藥學可接受載體的藥物組合物在生產(chǎn)抑制第二病毒的病毒復制的藥物中的應用。
作為對如前所述的非特異dsRNA方法的附加的另一方法是使用特異dsRNA使病毒基因沉默。
該方法在某種意義上的確是附加的，它針對在如上所述的非特異性保護作用之外的一個完全不同的目標。當非特異dsRNA方法引發(fā)非特異天然免疫系統(tǒng)時，特異dsRNA特異地干擾病毒RNA或者病毒mRNA序列，因而直接且特異地干狀該dsRNA的靶病毒的復制。
這種方法的優(yōu)點是，它不僅固有地擁有非特異dsRNA的作用—就其引發(fā)甲殼類動物體內(nèi)如上所述的顯著水平的保護作用的意義上來說；它另外克服了滲漏問題，因而結(jié)果甚至更好。
在這樣的情況中，dsRNA可被設(shè)計成與(部分)信使RNA或者病毒RNA互補。通過dsRNA的互補鏈與同源(部分)mRNA或病毒RNA的結(jié)合，這樣新形成的結(jié)構(gòu)可以取決于它的長度被RISC降解或者先被DICER消化隨后被RISC降解。結(jié)果是不再能獲得用于翻譯目的的病毒RNA或mRNA。
因而，本發(fā)明第二實施方案涉及保護甲殼類動物免受甲殼類動物的致病性病毒感染的藥物組合物，其特征在于所述藥物組合物包含抑制量的所述病毒的dsRNA，其中如果所述病毒是DNA病毒，該dsRNA包含與所述病毒的靶基因的核苷酸序列等同的核苷酸序列，或者如果所述病毒是RNA病毒，則該dsRNA包含與所述病毒的至少部分RNA等同的核苷酸序列。
“靶基因”是被與(部分)mRNA等同的dsRNA攻擊的mRNA的基因。
上述詞語“等同”是指dsRNA和被攻擊的病毒RNA或者mRNA的核苷酸序列之間的同一性程度必須足以允許形成RISC-復合體及隨后剪切病毒RNA或者mRNA。
上述詞語“(部分)信使RNA或病毒RNA”是指dsRNA當然不一定必須覆蓋被攻擊的病毒RNA或者mRNA的全長。dsRNA與具有允許形成RISC-復合體和隨后剪切病毒RNA或mRNA的足夠長度的部分病毒RNA或者mRNA等同即可。后面將更詳細地討論這樣部分的長度，但是應該不少于至少19個，優(yōu)選至少22個核苷酸。
在這個和進一步的實施方案中，dsRNA被認為是這樣的雙鏈RNA，與RISC-復合體有關(guān)而且可能地在被DICER首先消化之后該雙鏈RNA的鏈能與另一RNA，通常是基因組RNA或信使RNA(mRNA)，由于該RNA與dsRNA雙鏈中的一條鏈之間的互補作用而形成雙鏈結(jié)構(gòu)。這樣雙鏈結(jié)構(gòu)的形成建立在兩個RNA互補的基礎(chǔ)之上。
RNAi的原理，如前所述，是建立在與RISC復合體有關(guān)地，RNA(通常是信使RNA或病毒RNA)被RNA的互補鏈(干擾RNA)結(jié)合，從而提供了雙鏈RNA的事實基礎(chǔ)之上的。正是雙鏈RNA/RISC復合體的形成，最終導致了信使RNA被降解。因此，dsRNA應該包含與轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生該待被抑制/降解的(m)RNA的RNA基因組(靶基因組)或基因(靶基因)的一部分等同的核苷酸序列。
DICER結(jié)合/消化的機制和RISC結(jié)合/消化的機制由Tuschl，T.和Borkhardt，A.在Molecular Inventions 2158-167(2002)中以及Hannon，G.J.(見上面)作了清楚描述。
使用的dsRNA可以是長度約19-25個核苷酸，優(yōu)選21-23個，更優(yōu)選22個核苷酸的小干擾RNA。這樣的siRNA能夠容易地摻入RISC復合體中。
與dsRNA核苷酸序列等同的部分基因或基因組的核苷酸序列因而也有至少約19-25個核苷酸的長度。
既然本發(fā)明的優(yōu)點之一是第一次證明了RNAi方法用于甲殼類動物的可行性，因此本領(lǐng)域技術(shù)人員現(xiàn)在能夠容易地發(fā)現(xiàn)合適的靶基因或序列。如后面列出的，本領(lǐng)域技術(shù)人員已知大量的蝦病毒序列。這些資料現(xiàn)在可用于非常簡單直接地設(shè)計靶向病毒基因組RNA或病毒mRNA的dsRNA。
Sittidilokratna，N.等在Diseases of aquatic organisms 5087-93(2002)上已測定了黃頭病病毒的部分基因組的核酸序列。Cowley，J.A.等在Diseasesof aquatic organisms 36153-157(1999)上分析了YBV和密切相關(guān)的GAV的基因組的另外部分。這些論文中提供的序列是非常合適的RNAi靶。
Nunan，L.M.等(Mar.Biotechnol.2319-328(2000)(GeneBank AF218266)測序了IHHNV(幾乎)全長的基因組，包括它的三個開放閱讀框架。因此，這三個開放閱讀框架現(xiàn)在可十分適合地用作RNAi的靶。
Sukhumsirichart，W.等在Diseases of Aquatic organisms 381-10(1999)上給出了5.8kb HPV ssDNA的156bp序列。同樣，這個序列現(xiàn)在也能用作合適的RNAi靶。
至于斑節(jié)對蝦桿狀病毒(Monodon Baculovirus)(Monodon Baculovirus)(MBV)，Hsu，Y.L.等在Diseases of Aquatic organisms 4093-99(2000)上已分析其DNA聚合酶基因的序列。Chang，P.S.等(J.Invert.Pathol.62116-120，(1993))，Vicker，J.E.等(J.FishDis.16507-511(1993))，Lu，C.C.等(J.Fish Dis.18337-345(1995))和Nunan，L.M.與Lightner，D.V.(J.Virol.Methods 63193-201(1997))測定了多角體蛋白基因的序列。這些提供了適于RNAi方法的極好的早期和晚期基因靶。
Mari.J等(Journ.Gen.Virol.839151-926(2002))分析了TSV的基因組組構(gòu)。該篇文章中提供的兩個大的開放閱讀框架及它們的序列也是非常合適的RNAi靶物。Robles-Sikisaka，R.，(Arch.Virol.146941-952(2001))提供的TSV的3’端的序列是RNAi非常合適的靶物的另一個例子。
因而，第二實施方案的優(yōu)選形式涉及保護甲殼類動物免受甲殼類動物致病性病毒感染的藥物組合物，其中所述藥物組合物包含抑制量的斑節(jié)對蝦桿狀病毒(Monodon Baculovirus)，黃頭病桿狀病毒(Yellow-head Baculovirus)，腮聯(lián)病毒(Gill-associated virus)，傳染性造血組織和皮下壞死病毒(Infectious Haematopoietic and Hypodermal Necrosis virus)，肝胰腺細小病毒(Hepatopancreatic Parvovirus)，蝦Taura綜合癥病毒(Shrimp TauraSyndrome virus)或白斑綜合癥病毒(White Spot Syndrome virus)的dsRNA。
該實施方案的另一形式涉及保護甲殼類動物免受甲殼類動物致病性病毒感染的藥物組合物，其中所述藥物組合物包含抑制量的所述病毒的dsRNA用于抑制甲殼類動物體內(nèi)的病毒復制，其中如果所述病毒是DNA病毒，該dsRNA包含與所述病毒的靶基因的核苷酸序列等同的核苷酸序列，或者如果所述病毒是RNA病毒，該dsRNA包含與所述病毒的至少部分RNA等同的核苷酸序列。
該實施方案的另一形式涉及保護甲殼類動物免受甲殼類動物致病性病毒感染的藥物組合物的用途，其中所述藥物組合物包含抑制量的所述病毒的dsRNA，如果所述病毒是DNA病毒，該dsRNA包含與所述病毒的靶基因的核苷酸序列等同的核苷酸序列，或者如果所述病毒是RNA病毒，該dsRNA包含與所述病毒的至少部分RNA等同的核苷酸序列，其中所述用途為用于生產(chǎn)抑制甲殼類動物體內(nèi)病毒復制的藥物。
如上所述，本發(fā)明優(yōu)點之一是令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，為了減少滲漏而施用大量的短的或長的dsRNA后，出乎預料地在蝦體內(nèi)沒有造成問題。然而，本發(fā)明的一個目的是提供進一步地減少基于RNAi的系統(tǒng)的滲漏的方法。
除此之外，現(xiàn)在令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，如下第一和第二以及任選地其它dsRNA能將病毒復制抑制到使上述問題要么大大減少要么甚至消除的程度，其中所述dsRNA包含與第一和第二以及任選地其它靶基因的部分核苷酸序列等同的核苷酸序列。
因而，本發(fā)明第三實施方案涉及包含來自甲殼類動物致病性病毒的第一和第二以及任選地其它dsRNA以及藥學上可接受載體的藥物組合物，其中所述第一，第二和任選地其它dsRNA的特征在于，它們包含與第一，第二或任選地其它靶基因的部分核苷酸序列等同的核苷酸序列。
此第一和第二以及任選地其它dsRNA協(xié)同作用在多個位點攻擊病毒復制，因而如后面解釋的，強烈地減少了滲漏。
使用各與不同基因互補的兩個或更多個dsRNA的優(yōu)點是在兩個或者更多個不同層次進行攻擊。結(jié)果是一個基因的沉默水平可以和另一個基因的沉默水平相乘，由此導致幾乎完全抑制了病毒粒的形成。
這因此導致病毒粒的形成劇烈減少，因而幾乎沒有或根本沒有逃脫的突變體存在，而且如果有的話，也僅僅存在大大減少的致病效應。此外，在兩個或更多個靶點進行抗病毒攻擊大大縮小了病毒利用逃逸路線的可能性。
在該實施方案的優(yōu)選形式中，第一，第二和任選地其它靶基因是選自由斑節(jié)對蝦桿狀病毒(Monodon Baculovirus)，黃頭病桿狀病毒(Yellow-headBaculovirus)，腮聯(lián)病毒(Gill-associated virus)，傳染性造血組織和皮下壞死病毒(Infectious Haematopoietic and Hypodermal Necrosis virus)，肝胰腺細小病毒(Hepatopancreatic Parvovirus)，蝦Taura綜合癥病毒(ShrimpTaura Syndrome virus)和白斑綜合癥病毒(White Spot Syndrome virus)組成的組的病毒的基因。
在該實施方案的更優(yōu)選形式中，病毒是斑節(jié)對蝦桿狀病毒(MonodonBaculovirus)或者白斑綜合癥病毒(White Spot Syndrome virus)。
當以與立即早期或早期基因等同為基礎(chǔ)選擇所述至少兩個dsRNA中的一個，并且以與晚期基因等同為基礎(chǔ)選擇dsRNA的另一個時，根據(jù)本發(fā)明的方法特別有效。
僅舉一例如果第一dsRNA干擾WSSV聚合酶的mRNA，并且第二dsRNA干擾WSSV結(jié)構(gòu)蛋白的mRNA，這將在兩個完全不同但是同等重要的時刻及時阻斷病毒粒的從頭合成。
這接著導致即使不是完全地也是幾乎完全地阻斷新WSSV粒的形成。
因而，該實施方案的更優(yōu)選形式涉及一種根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物，其中一個dsRNAs的核苷酸序列等同于立即早期或早期基因的部分核苷酸序列，另一個dsRNAs的核苷酸序列等同于晚期基因的部分核苷酸序列。
關(guān)于如上所述的攻擊早期/立即早期表達產(chǎn)物又攻擊晚期表達產(chǎn)物的優(yōu)點立即早期和早期基因是在病毒DNA復制前表達的基因，晚期基因是在病毒基因組復制后表達的基因。
斑節(jié)對蝦桿狀病毒(Monodon Baculovirus)(MBV)的早期和晚期基因的例子是如前所述的DNA聚合酶基因和多角體蛋白基因。
WSSV的早期/立即早期基因的例子是蛋白激酶基因，DNA聚合酶基因，嵌合的胸苷激酶-胸苷酸激酶基因，核糖核苷酸還原酶大亞基基因和核糖核苷酸還原酶小亞基基因。晚期基因的例子有，如WSSV的結(jié)構(gòu)蛋白基因，比如VP15基因，VP19基因，VP24基因，VP26基因和VP28基因。這些基因的描述或提及見Marks，H.等J.Gen Virol.841517-1523(2003)。
因而，在該實施方案的甚至更優(yōu)選形式中，立即早期或早期基因選自由MBVDNA聚合酶基因，WSSV蛋白激酶基因，WSSV DNA聚合酶基因，WSSV嵌合的胸苷激酶-胸苷酸激酶基因，WSSV核糖核苷酸還原酶大亞基基因和WSSV核糖核苷酸還原酶小亞基基因組成的組。
在該實施方案的另一同樣更優(yōu)選形式中，晚期基因選自由MBV多角體蛋白基因，WSSV VP15基因，WSSV VP19基因，WSSV VP24基因，WSSV VP26基因和WSSV VP28基因組成的組。
如前所述，令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，與哺乳動物情況相反，大量的siRNA或長dsRNA在甲殼類動物體內(nèi)沒有產(chǎn)生有害作用。這出乎預料地也允許使用大量的siRNA和更長dsRNA。更長dsRNA的第一個優(yōu)點是它們有更大的穩(wěn)定性。長度至少是siRNA大小的兩倍的更長dsRNA的第二個優(yōu)點是它們一旦被DICER消化，通常產(chǎn)生至少兩個小的(～22核苷酸長度和雙鏈的)siRNA，因而這些siRNA能夠與兩種不同的RISC-復合體反應，由此剪切信使RNA兩次。這樣，更長dsRNA的第二個優(yōu)點是效率更高。
從而，與更長dsRNA的核苷酸序列等同的部分基因或基因組也具有該更長dsRNA的長度。
因而，該方法的優(yōu)點是這些長dsRNA更加穩(wěn)定，能夠解決如前所述siRNA在口服飼喂時不穩(wěn)定的問題，并且更加有效。
因而，dsRNA的最優(yōu)選形式是其長度至少為siRNA長度的兩倍。
siRNA和更長dsRNA都能夠以合成方式足量制備。然而，還有制備這樣的RNA的替代方法。替代方法涉及轉(zhuǎn)錄編碼要制備的dsRNA的一條鏈的DNA片段和轉(zhuǎn)錄編碼要制備的dsRNA的另一條鏈的DNA片段。然后，使這些鏈退火，得到目標dsRNA。
此替代方法的一種甚至更有效形式涉及轉(zhuǎn)錄按順序編碼第一dsRNA、所謂的鉸鏈RNA和與第一dsRNA互補的第二dsRNA的DNA片段。此遺傳信息以單個轉(zhuǎn)錄物進行表達導致了非常快速而且有效地形成dsRNA，在此通過兩個dsRNA片段的互補特征和鉸鏈片段的鉸鏈連接功能使得這種dsRNA的形成成為可能。這種具有發(fā)夾樣結(jié)構(gòu)的dsRNA通常被稱作短發(fā)夾RNA(shRNA)。
該DNA片段中編碼第一dsRNA的部分和編碼互補的第二dsRNA的部分各自長至少22個核苷酸。
鉸鏈的長度不是關(guān)鍵，但是長度為8個或更多的核苷酸，優(yōu)選8-10個核苷酸是非常有效的。顯然對于鉸鏈應當選擇幾乎不或完全不與兩個siRNA片段互補的核苷酸序列。McCaffrey，A.P.等(Nature Biotechnology21639-644(2003))描述了這樣的shRNA結(jié)構(gòu)的例子。
優(yōu)選地，具有發(fā)夾樣結(jié)構(gòu)的dsRNA不是短的而是長的(1hRNA)，這意味它的長度至少是siRNA的兩倍，即至少44個核苷酸。如前所述，這將顯著地增加它的穩(wěn)定性。此外，一個這樣的轉(zhuǎn)錄物被DICER剪接后通常來說會產(chǎn)生至少兩個siRNA。
通過對按順序編碼至少有44個核苷酸的第一RNA片段，鉸鏈RNA以及與第一RNA片段互補的至少有44個核苷酸的第二RNA片段的人工DNA片段進行表達，能夠容易獲得這樣的dsRNA。
這些人工DNA片段能夠合成得到或者使用現(xiàn)有技術(shù)中已知多年的標準重組DNA技術(shù)得到。
編碼shRNA或1hRNA的這些DNA片段的轉(zhuǎn)錄對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，是簡單的而且非常容易達到的?，F(xiàn)有技術(shù)中大量地描述了包含合適啟動子的表達體系。另外，應當記住在此的要求低于標準的表達體系所需要的只是進行轉(zhuǎn)錄。當然不翻譯轉(zhuǎn)錄的RNA。由于為了獲得RNA只需要轉(zhuǎn)錄人工基因，任何轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)只用于轉(zhuǎn)錄目的都會更好。
獲得顯著量的dsRNA的最有效方法是在合適的細胞體系中轉(zhuǎn)錄編碼發(fā)夾RNA的(人工的)基因。
核酸表達的必要條件是與核酸功能性連接的合適啟動子，這樣核酸就處于該啟動子控制之下。對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，顯然啟動子的選擇可以擴展到能夠在用作蛋白表達的宿主細胞的細胞中指導基因轉(zhuǎn)錄的任何真核，原核或病毒的啟動子。
待轉(zhuǎn)錄的DNA分子必須處于功能性連接的啟動子的控制之下。這可用例如標準的分子生物學技術(shù)完成。(Sambrook，J.和Russell，D.W.，分子克隆實驗室手冊，2001.ISBN 0-87969-577-3)。功能性連接的啟動子是能夠控制與它們連接的核酸的轉(zhuǎn)錄的啟動子。這樣的啟動子可以是痛毒啟動子，例如參與待表達基因在體內(nèi)表達的啟動子，前提是該啟動子在用于表達的細胞內(nèi)有功能。它也可以是異源啟動子。當宿主細胞是細菌時，可以使用的有用的表達控制序列包括Trp啟動子和操縱子(Goeddel等，Nucl.Acids Res.，8，4057，1980)；lac啟動子和操縱子(Chang等，Nature，275，615，1978)，外膜蛋白啟動子(Nakamura，K.和Inouge，M.，EMBO J.，1，771-775，1982)，λ噬菌體啟動子和操縱子(Remaut，E.等，Nucl.Acids Res.，11，4677-4688，1983)，α-淀粉酶(枯草芽孢桿菌(B.subtilis))啟動子和操縱子，T7啟動子，終止序列和其它與被選宿主相容的表達增強和控制序列。
當宿主細胞是酵母時，有用的表達控制序列包括例如α-交配因子。對于昆蟲細胞，可使用桿狀病毒的多角體蛋白或p10啟動子(Smith，G.E.等Mol.Cell.Biol.3，2156-65，1983)。當宿主細胞是哺乳動物來源時，有用的表達控制序列的例子包括SV-40啟動子(Berman，P.W.等Science，222，524-527，1983)，巨細胞病毒(CMV)啟動子或金屬硫蛋白啟動子(Brinster，R.L.，Nature，296，39-42，1982)或熱激啟動子(Voellmy等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82，4949-53，1985)。
細菌，酵母，真菌，昆蟲和哺乳動物細胞表達系統(tǒng)是十分常用的體系。這些系統(tǒng)在本領(lǐng)域是已知的并通常是可得到的，例如通過Invitrogen(www.invitrogen.com)，Novagen(www.merckbiosciences.de)或ClontechLaboratiories公司4030 Fabian Way，Palo Alto，California94303-4607，USA的商業(yè)途徑得到。除了這些表達系統(tǒng)外，基于寄生蟲的表達系統(tǒng)也是吸引人的表達體系。例如在公開號為2714074的法國專利申請和公開號為US08/043109(Hoffman，S.和Rogers，W
公開日1993.12.01)的美國NTIS中描述了這樣的系統(tǒng)。
富含GC的序列優(yōu)選作為靶序列，因為它們形成有效和穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)。因此，當構(gòu)建用于表達長發(fā)夾RNA的人工基因時，優(yōu)選專門使用靶基因中富含GC的部分。更優(yōu)選，人工基因包括幾個富含GC的區(qū)域，它們選自靶基因中一個以上，優(yōu)選非相鄰的，富含GC的位點。僅舉一例如果靶基因包含800堿基對，其中核苷酸50-150，250-350及500-600區(qū)域特別富含GC，那么人工基因優(yōu)選包括以下序列段50-150，250-350，500-600，鉸鏈區(qū)，反義600-500，反義350-250，反義150-50。
這將提供長發(fā)夾RNA，用DICER消化長發(fā)夾RNA后，將會產(chǎn)生幾個(極有可能12個)22個核苷酸的siRNA，它們能牢固結(jié)合要被沉默的靶基因組或靶基因的RNA上不同的(極有可能12個)靶區(qū)域。這又將導致甚至更高的RISC消化效率，因而造成甚至更低水平的滲漏結(jié)果。
一種最優(yōu)選的長dsRNA或長發(fā)夾dsRNA包括來自早期/立即早期基因和晚期基因的2段或更多段，優(yōu)選富含GC的，至少22個核苷酸的序列。這樣的構(gòu)建體被DICER消化后，產(chǎn)生幾個針對早期/立即早期靶基因的不同部分的siRNA和針對晚期靶基因的不同部分的siRNA。
因而，在該實施方案的最優(yōu)選形式中，藥物組合物的特征是至少一個dsRNA包含含有來自早期/立即早期基因及晚期靶基因的兩個或兩個以上，優(yōu)選富含GC的，至少22個核苷酸的序列的長dsRNA或長發(fā)夾dsRNA。
一種非常有效而且吸引人的保護甲殼類動物以對抗病毒感染的方法是結(jié)合使用經(jīng)典接種疫苗和dsRNA的方法，例如施用額外含有免疫原性病毒蛋白的根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物。
該方法具有獲得長期抵抗所要防衛(wèi)的病毒的免疫力的優(yōu)點。對甲殼類動物施用dsRNA后，dsRNA方法幾乎立即發(fā)揮作用，并一直持續(xù)多達兩個星期。然而，針對病毒蛋白的免疫需要時間來建立，在一至兩周后開始有效，并持續(xù)幾個星期。因此，聯(lián)合施用siRNA和免疫原性蛋白質(zhì)的方法將從施用藥物組合物即刻至施用后數(shù)周保護甲殼類動物。這使得可以提供最有效的保護水平。
因而，在優(yōu)選形式中，根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物除了包含dsRNA外，還含有對甲殼類動物有致病性的病毒的免疫原性蛋白質(zhì)。
這樣的蛋白更優(yōu)選選自斑節(jié)對蝦桿狀病毒(Monodon Baculovirus)，黃頭病桿狀病毒(Yellow-head Baculovirus)，腮聯(lián)病毒(Gill-associated virus)，傳染性造血組織和皮下壞死病毒(Infectious Haematopoietic and HypodermalNecrosis virus)，肝胰腺細小病毒(Hepatopancreatic Parvovirus)，蝦Taura綜合癥病毒(Shrimp Taura Syndrome virus)和白斑綜合癥病毒(White SpotSyndrome virus)的病毒蛋白質(zhì)。
最優(yōu)選地，蛋白質(zhì)選自WSSV結(jié)構(gòu)蛋白VP15，VP19，VP24，VP26或者VP28。
該實施方案的另一形式涉及用于抑制甲殼類動物體內(nèi)病毒復制的本發(fā)明藥物組合物。
該實施方案的另一形式涉及根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物在生產(chǎn)用于抑制甲殼類動物體內(nèi)病毒復制的藥物中的應用。
本發(fā)明另一實施方案涉及生產(chǎn)根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物的方法，其特征在于該方法包括混合根據(jù)本發(fā)明的dsRNA和藥學上可接受載體。
正如如前所述針對dsRNA的表達一樣，獲得大量蛋白質(zhì)的最有效方法是在合適的細胞體系中轉(zhuǎn)錄/翻譯病毒基因。適合雙重目的的系統(tǒng)是用于轉(zhuǎn)錄和翻譯遺傳信息的標準表達系統(tǒng)，比如如前所述的系統(tǒng)。
根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物中dsRNA的量不是關(guān)鍵的。對于注射目的，優(yōu)選地，dsRNA的量是10納克至5微克。
如果dsRNA是口服給藥—可能地通過兩步飼喂首先給鹵蟲(brine shrimp)，然后給甲殼類動物—則為了彌補食物鏈中的損失，可能要使用更多的量。
從商業(yè)角度考慮，對于大規(guī)模應用，在細胞中，優(yōu)選細菌細胞中生物合成dsRNA可能是最好的方法，因為化學合成RNA可能更貴些。另一個優(yōu)點是用于dsRNA生物合成的細菌或其它細胞還為形成的dsRNA提供了穩(wěn)定和保護性的環(huán)境，另外它們能夠直接投喂給甲殼類動物。
另外還含有病毒蛋白質(zhì)的根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物，非常適當?shù)睾忻總€動物1-100微克的蛋白質(zhì)量，雖然原理上也可使用更小劑量。雖然超過100微克的劑量在免疫學上是非常合適的，但是基于商業(yè)原因則不太具有吸引力。
根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物中特別合適的藥學可接受載體的例子是無菌水，鹽水，水性緩沖液比如PBS等等。此外，根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物可以包括其它添加劑，比如如下所述的佐劑，穩(wěn)定劑，抗氧化劑等等。
在本發(fā)明中描述的藥物組合物的一種優(yōu)選呈現(xiàn)形式還可以含有免疫刺激物質(zhì)，即所謂的佐劑。它尤其適于那些通過注射給藥的藥物。
佐劑通常包括以非特異方式增強宿主免疫反應的物質(zhì)。現(xiàn)有技術(shù)中有大量已知的不同佐劑。魚和甲殼動物的養(yǎng)殖中經(jīng)常使用的佐劑的例子有胞壁酰二肽，脂多糖類，幾種葡聚糖和多糖以及Carbopol。Jan Raa(Fisheries Science4(3)229-288(1996)中的綜述)在綜述中給出了適于魚和甲殼動物的疫苗的佐劑的全面總結(jié)。
本發(fā)明藥物組合物也可含有所謂的“賦形藥”(vehicle)。賦形藥是粘附蛋白質(zhì)或dsRNA而不用共價鍵與之結(jié)合的化合物。這樣的賦形藥有本領(lǐng)域已知的生物微囊，微藻酸鹽，脂質(zhì)體和macrosol。
這種賦形藥的一種特殊形式，其中抗原部分地包埋在該賦形藥中，是所謂的ISCOM(歐洲專利EP109.942，EP180.564，EP242.380)。
此外，藥物組合物可包括一種或多種合適的表面活性化合物或乳化劑，例如Span或吐溫。
適合在油包水乳劑中使用的油性佐劑是例如礦物油或可代謝油。
礦物油的例子有Bayol，Marcol和Drakeol。
可代謝油的例子有，植物油如花生油和豆油，動物油如魚油角鯊烷和角鯊烯，生育酚及其衍生物。
合適的佐劑例子有，w/o乳劑，o/w乳劑，w/o/w雙乳劑。
非常合適的o/w乳劑例如由5-50％w/w水相和95-50％w/w油性佐劑制得，更優(yōu)選由20-50％w/w水相和80-50％w/w油性佐劑制得。
佐劑添加的量取決于佐劑本身的性質(zhì)，并且廠商提供了有關(guān)這些量的信息。
常常藥物組合物和穩(wěn)定劑混合，例如，用來保護有降解趨向的物質(zhì)，如dsRNA和蛋白質(zhì)免被降解，延長藥物組合物的貯存期限，或者提高冷凍干燥的效率。有用穩(wěn)定劑的例子有，SPGA(Bovarnik等J.Bacteriology 59509(1950))，碳水化合物如山梨糖醇，甘露醇，海藻糖，淀粉，蔗糖，右旋糖苷或葡萄糖，蛋白質(zhì)如清蛋白，或酪蛋白或它們的降解物，緩沖液如堿金屬磷酸鹽。
優(yōu)選地，上述藥物組合物以冷凍干燥的形式保藏。
可使用本領(lǐng)域已知的多種給藥方法。優(yōu)選通過注射，浸泡，浸漬或口服的方法對甲殼類動物施用根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物。給藥方案可按照標準的疫苗接種實踐進行優(yōu)化。優(yōu)選使用浸泡或口服來施用藥物組合物，特別是在商業(yè)化的水產(chǎn)養(yǎng)殖中使用藥物組合物時。
對于口服給藥，該藥物組合物優(yōu)選與適于口服的載體混合，即纖維素，飼料或者可代謝物質(zhì)，如α纖維素或不同的植物或動物來源的油。另一種有吸引力的方式是給高密度的活飼料生物施用藥物組合物，然后將此活飼料喂給目標動物，例如魚。特別優(yōu)選的用于口服遞輸本發(fā)明藥物組合物的飼料載體是能夠包封藥物組合物的活飼料生物體。
合適的活飼料生物體包括浮游生物類非選擇性濾食動物，優(yōu)選輪蟲，Artemia的成員等。高度優(yōu)選鹵蟲Artemia屬種。
一種非常好的給藥方法可按如下步驟進行將已合成dsRNA的細菌，酵母細胞或任何其它細胞直接喂給浮游生物類非選擇性濾食動物，優(yōu)選輪蟲，Artemia成員等。然后向有待對抗病毒感染的甲殼類動物口服施用這樣制造的含有被浮游生物類非選擇性濾食動物消化的那些細菌，酵母細胞或任何其它細胞的藥物組合物。
實施例實施例1蝦的飼養(yǎng)斑節(jié)對蝦(Penaeus mondon)(3.4±0.8g)分籠維持在180升含有鹽度約為千分之二十的人工海水的水族缸(Instant Ocean，Aquarium Systems)中。每個缸安裝了單獨的過濾系統(tǒng)(Eheim，德國)，以28±1℃加熱(Schego，德國)，并持續(xù)通氣。
dsRNA的施用用40μl溶解在TN緩沖液(50mM Tris pH7.5，100mM NaCl)中濃度為100μM的siRNA雙鏈體注射15只蝦。所述siRNA對應于VP28 mRNA的三個不同部分(見圖1)，等量注射(各1.33nmol)。用29號針在蝦的第4或第5腹節(jié)肌內(nèi)注射。用40μl TN緩沖液注射兩個對照蝦組(每組15只蝦)。
WSSV的施用注射后二十四小時，用29號針向蝦第4或第5腹節(jié)肌內(nèi)注射10μl含80％致死劑量的白斑綜合癥病毒(White Spot Syndrome virus)的330mM NaCl。向一個對照組中的蝦注射10μl 330mM的NaCl。
對處理的分析每天記錄兩次死亡率(圖2)，用PCR檢測死亡蝦中WSSV的存在情況。因而，勻漿來自蝦尾部的肌肉組織，并與200μl 5％Chelex100樹脂(Bio-Rad)以及16μl 20mg/ml的蛋白酶K混合?；旌衔镌?6℃過夜孵育，然后在95℃孵育10分鐘以滅活蛋白酶K。使用兩對引物測試樣品。16S rRNA引物對16S-FW1(5′-GTG CGA AGG TAG CAT AATC-3′)和16S-RV1(5′-CTG CTG CAA CAT AAGGAT AC-3′)，用來擴增414bp的蝦核糖體DNA片段，用作分離對照。VP26引物對VP26-FW1(5′-ATG GAA TTT GGC AAC CTA ACA AAC CTG-3′)和VP26-RV1(5′-GGG CTG TGA CGG TAG AGA TGA C-3′)，用來擴增WSSV VP26基因的一部分，用于篩選WSSV陽性動物(Marks等，J.Gen.Virol.841517-1523(2003))。兩組引物對都按94℃30s，52℃30s，和72℃50s進行25個擴增循環(huán)。
結(jié)果從圖2可見，以所用量的VP28 dsRNA單次進行注射至少在第7天前能夠抑制病毒復制。
實施例2dsRNA的施用設(shè)立第二實驗，此次使用vp28和vp15的mRNA作為目標。綠色熒光蛋白(GFP)的siRNA用作陰性對照，因為GFP和WSSV之間沒有序列同源性。同時向一個尾節(jié)肌內(nèi)注射對應于vp28，vp15或gfp序列的三個小干擾siRNA雙鏈體，每個siRNA雙鏈體的量都是1.33nmol(～20μg)(總體積40μl)(見圖3)。兩個對照組僅注射siRNA退火緩沖液(50mM Tris，100mM NaCl，pH7.8)。注射后二十四小時，向一個尾節(jié)注射WSSV(10μl)以攻擊蝦。兩個附加對照組注射WSSV或者緩沖液(330mM NaCl)。
結(jié)果從圖4中可以看出，正如在實施例1基礎(chǔ)上所預期的，當VP28，VP15 siRNA注射給蝦后，顯著水平地抑制了病毒復制(卡方檢驗顯著)。此外，可以令人驚奇地得出結(jié)論GFP能夠以相同水平抑制病毒復制。
實施例3長發(fā)夾dsRNA的構(gòu)建編碼vp28，vp15和dna聚合酶的更長dsRNA構(gòu)建體的結(jié)構(gòu)如圖4所示。用PCR擴增具有長200bp的這些基因的構(gòu)建體以及螢光素酶陰性對照構(gòu)建體。將這些構(gòu)建體正義和反義地(中間被400bp GFP結(jié)構(gòu)隔開)克隆進pET28a載體(Novagen，441 Charmany Drive Madsion，WI53719)。使用T7聚合酶由這些構(gòu)建體制備dsRNA。選擇相對大的鉸鏈片段(400bp的GFP片段)是為了避免使用短鉸鏈時可能產(chǎn)生的克隆贗品。這是由于序列和它們的反義序列如果只被一個短的(例如10個堿基對)間隔區(qū)隔開時，更經(jīng)常地會產(chǎn)生不想要的重組贗品。
這樣制備的長dsRNA適合如實施例1和2所示的注射方法，而且它們同樣適合口服給藥，特別是當它們還仍處于合成它們的細胞的保護性環(huán)境中時。


圖1siRNA雙鏈體序列以及它們在WSSV VP28開放閱讀框架中對應的核苷酸位置。
圖2隨時間抑制病毒復制的水平的總結(jié)。
圖3以VP15和VP28開放閱讀框架為基礎(chǔ)的siRNA雙鏈體序列以及以綠色熒光蛋白序列為基礎(chǔ)的siRNA雙鏈體序列。
圖4隨時間抑制病毒復制的水平的總結(jié)。
圖5制備的通過使用T7聚合酶產(chǎn)生發(fā)夾dsRNA的構(gòu)建體。
序列表<110>AKZO Nobel N.V.
<120>抗病毒藥物組合物<130>2004.020EP/PD<160>12<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>19<212>RNA<213>白斑綜合癥桿狀病毒<400>1gaccaucgaa acccacaca19<210>2<211>19<212>RNA<213>白斑綜合癥桿狀病毒<400>2cccacacaga caauaucga19<210>3<211>19<212>RNA<213>白斑綜合癥桿狀病毒<400>3aaccuccgca uuccuguga19<210>4<211>19<212>RNA<213>白斑綜合癥桿狀病毒
<400>4gaccaucgaa acccacaca19<210>5<211>19<212>RNA<213>白斑綜合癥桿狀病毒<400>5cccacacaga caauaucga19<210>6<211>19<212>RNA<213>白斑綜合癥桿狀病毒<400>6aaccuccgca uuccuguga19<210>7<211>19<212>RNA<213>白斑綜合癥桿狀病毒<400>7gaagcgugca ggaaagaag19<210>8<211>19<212>RNA<213>白斑綜合癥桿狀病毒<400>8ugaagaagcg ugcaggaaa19<210>9<211>19<212>RNA<213>白斑綜合癥桿狀病毒
<400>9cugcuggacg caucuccaa19<210>10<211>19<212>RNA<213>綠色熒光蛋白<400>10cuacaacucc cacaacgua19<210>11<211>19<212>RNA<213>綠色熒光蛋白<400>11caggaucgag cuuaaggga19<210>12<211>19<212>RNA<213>綠色熒光蛋白<400>12gaucccaacg aaaagagag19
權(quán)利要求
1.一種包含抑制量的dsRNA和藥學上可接受載體的藥物組合物，其用于抑制甲殼類動物體內(nèi)的病毒復制。
2.用于根據(jù)權(quán)利要求1的用途的藥物組合物，其特征在于所述dsRNA是非病毒來源的。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的藥物組合物用于生產(chǎn)抑制甲殼類動物體內(nèi)病毒復制的藥物的用途。
4.用于根據(jù)權(quán)利要求1的用途的藥物組合物，其特征在于所述dsRNA來自第一病毒，所述用途是抑制第二病毒的病毒復制。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的藥物組合物，其特征在于第二病毒是斑節(jié)對蝦桿狀病毒(Monodon Baculovirus)，黃頭病桿狀病毒(Yellow-head Baculovirus)，腮聯(lián)病毒(Gill-associated virus)，傳染性造血組織和皮下壞死病毒(Infectious Haematopoietic and Hypodermal Necrosis virus)，肝胰腺細小病毒(Hepatopancreatic Parvovirus)，蝦Taura綜合癥病毒(Shrimp TauraSyndrome virus)或白斑綜合癥病毒(White Spot Syndrome virus)。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5的藥物組合物的用途，其中所述dsRNA來自第一病毒，所述用途為用于生產(chǎn)抑制第二病毒的病毒復制的藥物。
7.保護甲殼類動物免受甲殼類動物致病性病毒感染的藥物組合物，其特征在于所述藥物組合物包含抑制量的dsRNA，如果所述病毒是DNA病毒，該dsRNA包含與所述病毒的靶基因的核苷酸序列等同的核苷酸序列，或者如果所述病毒是RNA病毒，該dsRNA包含與所述病毒的至少部分RNA等同的核苷酸序列。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的藥物組合物，其用于抑制甲殼類動物體內(nèi)的病毒復制。
9.根據(jù)權(quán)利要求7的藥物組合物用于生產(chǎn)抑制甲殼類動物體內(nèi)病毒復制的藥物的用途。
10.根據(jù)權(quán)利要求7的藥物組合物，其特征在于所述甲殼類動物致病性病毒選自由斑節(jié)對蝦桿狀病毒(Monodon Baculovirus)，黃頭病桿狀病毒(Yellow-head Baculovirus)，腮聯(lián)病毒(Gill-associated virus)，傳染性造血組織和皮下壞死病毒(Infectious Haematopoietic and HypodermalNecrosis virus)，肝胰腺細小病毒(Hepatopancreatic Parvovirus)，蝦Taura綜合癥病毒(Shrimp Taura Syndrome virus)或白斑綜合癥病毒(White SpotSyndrome virus)組成的組。
11.包含第一和第二以及任選地其它的甲殼類動物致病性病毒的dsRNA以及藥學上可接受載體的藥物組合物，其特征在于所述第一，第二和任選地其它dsRNA包含與第一，第二和任選地其它靶基因的部分核苷酸序列等同的核苷酸序列。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的藥物組合物，其特征在于第一，第二和任選地其它靶基因是選自斑節(jié)對蝦桿狀病毒(Monodon Baculovirus)，黃頭病桿狀病毒(Yellow-head Baculovirus)，腮聯(lián)病毒(Gill-associated virus)，傳染性造血組織和皮下壞死病毒(Infectious Haematopoietic and HypodermalNecrosis virus)，肝胰腺細小病毒(Hepatopancreatic Parvovirus)，蝦Taura綜合癥病毒(Shrimp Taura Syndrome virus)和白斑綜合癥病毒(White SpotSyndrome virus)的病毒的基因。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的藥物組合物，其特征在于所述的靶基因各是MBV或WSSV靶基因。
14.根據(jù)權(quán)利要求11-13的藥物組合物，其特征在于第一基因是立即早期或早期基因，而第二基因是晚期基因。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的藥物組合物，其特征在于立即早期或早期基因選自由MBV DNA聚合酶基因，WSSV蛋白激酶基因，WSSV DNA聚合酶基因，WSSV嵌合的胸苷激酶-胸苷酸激酶基因，WSSV核糖核苷酸還原酶大亞基基因和WSSV核糖核苷酸還原酶小亞基基因組成的組。
16.根據(jù)權(quán)利要求14的藥物組合物，其特征在于晚期基因選自由MBV多角體蛋白基因，WSSV VP15基因，WSSV VP19基因，WSSV VP24基因，WSSV VP26基因和WSSV VP28基因組成的組。
17.根據(jù)權(quán)利要求1-10的藥物組合物，其特征在于所述dsRNA的長度至少是siRNA長度的兩倍。
18.根據(jù)權(quán)利要求11-16的藥物組合物，其特征在于至少一個所述dsRNA的長度至少是siRNA長度的兩倍。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的藥物組合物，其特征在于至少一個所述dsRNA包含含有兩個或兩個以上，優(yōu)選富含GC的，至少22個核苷酸的來自早期/立即早期基因及晚期靶基因的序列段的長dsRNA或長發(fā)夾dsRNA。
20.根據(jù)權(quán)利要求1-19的藥物組合物，其特征在于所述藥物組合物還包含有免疫原性量的甲殼類動物致病性病毒的蛋白質(zhì)。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的藥物組合物，其特征在于所述病毒蛋白選自由斑節(jié)對蝦桿狀病毒(Monodon Baculovirus)，黃頭病桿狀病毒(Yellow-headBaculovirus)，腮聯(lián)病毒(Gill-associated virus)，傳染性造血組織和皮下壞死病毒(Infectious Haematopoietic and Hypodermal Necrosis virus)，肝胰腺細小病毒(Hepatopancreatic Parvovirus)，蝦Taura綜合癥病毒(ShrimpTaura Syndrome virus)和白斑綜合癥病毒(White Spot Syndrome virus)組成的組。
22.根據(jù)權(quán)利要求20的藥物組合物，其特征在于所述病毒蛋白選自由WSSVVP15，VP19，VP24，VP26和VP28組成的組。
23.根據(jù)權(quán)利要求11-22的藥物組合物，其用于抑制甲殼類動物體內(nèi)的病毒復制。
24.根據(jù)權(quán)利要求11-22的藥物組合物用于生產(chǎn)抑制甲殼類動物體內(nèi)病毒復制的藥物的用途。
25.根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物的生產(chǎn)方法，其特征在于所述方法包括混合根據(jù)權(quán)利要求1-22的dsRNA和藥學上可接受載體。
全文摘要
本發(fā)明涉及包含抑制量的dsRNA的藥物組合物，用于抑制甲殼類動物體內(nèi)病毒復制的這些藥物組合物，以及這些藥物組合物的用途和生產(chǎn)這些藥物組合物的方法。
文檔編號A61P31/00GK1824326SQ20051012171
公開日2006年8月30日 申請日期2005年7月28日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月29日
發(fā)明者J·M·沃拉克, D·祖伊德瑪, M·維斯滕比爾格, J·T·M·克曼斯 申請人:阿克佐諾貝爾公司