專利名稱：含有去甲基斑蝥酸鈉的脂質(zhì)微球注射液及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，確切地說它是一種含有去甲基斑蝥酸鈉的脂質(zhì)微球注射液(水包油乳劑)及制備方法。
背景技術(shù)：
半個世紀(jì)以來，醫(yī)學(xué)科學(xué)取得巨大的進(jìn)展，人類籍化學(xué)、免疫、抗生素療法三大防治手段，基本上控制了以往主要威脅人類健康的傳染病，而諸如腫瘤、心腦血管疾病等非傳染性疾病則逐漸成為人類健康的主要敵人，其中尤以腫瘤的危害為甚。多年來，人們雖然進(jìn)行了很多的努力并取得較大的進(jìn)展，但迄今為止腫瘤的危害仍未能被有效遏制。有數(shù)據(jù)表明，2002年國內(nèi)因惡性腫瘤及癌癥致死的人數(shù)占當(dāng)年死亡人口總數(shù)的25.37％，腫瘤已成為危害人類健康的第一殺手。近兩年來，腫瘤的發(fā)病呈上升趨勢，發(fā)病年齡也從平均的55歲明顯下移?？梢灶A(yù)言，在今后的二、三十年內(nèi)，癌癥的發(fā)病率及死亡率將呈繼續(xù)上升的趨勢。因此，抗腫瘤藥物的開發(fā)是許多藥學(xué)工作者研究的重中之重。另外，由于多數(shù)抗腫瘤藥物不良反應(yīng)嚴(yán)重，在治療過程中對患者的身心造成很大傷害，因此如何在提高藥物療效的同時，降低藥物的刺激性及毒性、從而提高患者生存質(zhì)量逐漸成為目前抗腫瘤藥物研究新的方向與重點(diǎn)。
斑蝥(Mylabris)系鞘翅目芫菁科昆蟲，藥用已有兩千余年歷史。南宋時期已有明確記載斑蝥可以治療癌癥，70年代曾用于治療原發(fā)性肝癌。斑蝥屬劇毒藥，如果濫用、超量應(yīng)用、與酒蒜同用、生用(或泡制不當(dāng))、外用面積過大、蓄積、肝腎功能不全、沖服會引起中毒，中毒劑量為0.6g，致死劑量為1.5g；斑蝥素0.14μg能誘發(fā)皮膚起泡，10mg可產(chǎn)生嚴(yán)重中毒或致死，限制了其在臨床上的應(yīng)用。近年來，人們經(jīng)過長期的研究和試驗(yàn)，合成了部分斑蝥素的衍生物或類似物，如去甲基斑蝥素、斑蝥酸鈉和羥基斑蝥胺等抗癌藥物來替代斑蝥素，實(shí)驗(yàn)表明，它們的藥理作用相似，但毒性較斑蝥素小得多。1989年我國首先合成了抗癌新藥去甲基斑蝥素(Norcantharidin)，它是將斑蝥素去除1，2位甲基而得。去甲基斑蝥酸鈉為去甲斑蝥素直接水解制得的鈉鹽，僅在少數(shù)有機(jī)溶劑(如丙酮、乙酸乙酯)及熱水中溶解，在冷水及油中的溶解度很低。
與斑蝥素相比，去甲基斑蝥酸鈉的泌尿系統(tǒng)刺激作用大大降低，同時具有較斑蝥素更為顯著的升高白細(xì)胞作用。體外實(shí)驗(yàn)表明去甲基斑蝥酸鈉對肝癌、食道癌、喉癌、官頸癌等細(xì)胞株的形態(tài)或增殖有破壞或抑制作用。對肝癌患者可見生存期延長，AFP下降，瘤體及腫大的肝臟回縮、質(zhì)地變軟，能減輕肝區(qū)疼痛及腹水；對食管癌、胃癌、賁門癌患者可見癌灶穩(wěn)定或縮小，疼痛及梗阻緩解，進(jìn)食改善。在病理標(biāo)本中，可見上述癌變發(fā)生不同的退變或壞死，同時可見癌巢淋巴細(xì)胞浸潤等。動物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示，去甲基斑蝥酸鈉對小鼠艾氏腹水癌、S180肝癌實(shí)體型有一定抑制作用，可提高腹水肝癌H22、癌細(xì)胞線粒體的呼吸控制律與溶酶體酶活性，干擾癌細(xì)胞分裂，抑制DNA合成，使癌細(xì)胞骨架(微絲、微管)破壞，影響其超微結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致線粒體、微絨毛及質(zhì)膜損傷。本品對正常細(xì)胞影響較小，能拮抗骨髓抑制，升高白細(xì)胞。本品為細(xì)胞周期特異性藥物，阻斷于M周期，并影響其周期運(yùn)行速度。臨床上主要應(yīng)用于肝癌、食道癌、胃癌、賁門癌等術(shù)前用藥或聯(lián)合化療，可用于白細(xì)胞降低及乙型肝炎。去甲基斑蝥酸鈉片小鼠灌胃研究顯示，本品吸收后較快分布于各組織，在動物的肝、腎、胃、腸、心、肺、唾液腺、甲狀腺及瘤體中具有較高的藥物濃度，給藥后15min在肝臟、癌組織達(dá)高峰濃度，6小時候濃度顯著下降，24h后大部分經(jīng)腎排泄完畢，在體內(nèi)較少積蓄。本品給動物靜注后，可較快分布于各組織，在肝、腎、肺、胃、腸、心、唾液腺、甲狀腺、癌組織中均有較高的藥物濃度。藥物主要通過泌尿系統(tǒng)排泄，靜注后，尿中藥物濃度0.5～1小時達(dá)高峰，24小時大部分自尿中排出。
目前，去甲基斑蝥酸鈉主要以片劑和去甲基斑蝥酸鈉注射劑應(yīng)用于臨床。去甲基斑蝥酸鈉雖然明顯減輕了斑蝥素的毒性，但并未完全消除。動物實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，給藥劑量增大到一定程度時，腎臟和肝臟組織出現(xiàn)病理變化。使用劑量的嚴(yán)格限制也嚴(yán)重阻礙了藥物療效的發(fā)揮。臨床使用時部分患者在靜脈給藥每日超過20mg或口服每日超過30mg時即出現(xiàn)不良反應(yīng)，口服不良反應(yīng)主要表現(xiàn)為惡心、嘔吐、頭暈等癥狀。由于注射液為堿性溶液，其pH值約為8，遠(yuǎn)大于血液pH值(7.35～7.45)，因此對血管壁刺激較大，易引起化學(xué)性靜脈炎；且由于藥物本身具有較強(qiáng)刺激性，亦可引起血管痙攣，血液減少，相對局部斑蝥酸鈉濃度增大，加重靜脈炎，且若輸液速度大于血液流速，則靜脈炎的發(fā)生率明顯增高。主要不良反應(yīng)表現(xiàn)為易引起靜脈炎癥，靜脈部紅、腫、熱、痛，沿靜脈走行長條狀發(fā)紅，如有滲出則紅腫成塊狀，活動受限，經(jīng)熱敷理療處理好轉(zhuǎn)治愈。因此在臨床用于外周淺靜脈輸液時，發(fā)生淺靜脈炎的比例相當(dāng)高，有的病人拒絕用該藥治療，影響藥物在臨床上正常實(shí)用。
因此鑒于上述特性，為使去甲基斑蝥酸鈉更好地發(fā)揮臨床療效，研究和開發(fā)新劑型，以新劑型的高效、低毒的優(yōu)勢充分發(fā)揮去甲基斑蝥酸鈉抗腫瘤活性并降低毒副作用，這無疑將對進(jìn)一步促進(jìn)和推廣去甲基斑蝥素在臨床中的應(yīng)用具有重要意義。目前，有關(guān)于去甲基斑蝥素的新劑型報(bào)道非常有限，僅有微囊、白蛋白微球及偶聯(lián)靶向性材料等。
脂肪乳劑作為腸外能量的重要補(bǔ)給方式應(yīng)用于臨床已近半個世紀(jì)。1920～1930年間，日本學(xué)者曾用蓖麻油為原料、卵磷脂為乳化劑，首先人工合成脂肪乳劑試用于動物；美國50年代推出了以棉花籽油為基礎(chǔ)的Lipomul應(yīng)用于病人但均因嚴(yán)重毒性而未能推廣。1964年，美國停止生產(chǎn)和應(yīng)用脂肪乳劑。但在歐洲，以Wretling為代表的一批學(xué)者不懈地研究和應(yīng)用以大豆油為基礎(chǔ)、以卵黃磷脂為乳化劑、以甘油為等張劑的脂肪乳劑Introlipid。1962年，Introlipid在瑞典被正式批準(zhǔn)用于臨床。1967年，由Hallberg等發(fā)表的文章“脂肪乳劑應(yīng)用于完全靜脈營養(yǎng)”全面總結(jié)了Introlipid的實(shí)驗(yàn)和臨床研究，證明它應(yīng)用于臨床是安全、可靠的，并提出了Introlipid臨床應(yīng)用的準(zhǔn)則。此文與1968年Dudrick等發(fā)表的“長期完全腸外營養(yǎng)下獲生長、發(fā)育和正氮平衡”一文，被公認(rèn)為是對腸外營養(yǎng)發(fā)展為常規(guī)臨床應(yīng)用有重大影響的兩篇經(jīng)典著作。此后20多年，Introlipid在世界各地得到了廣泛應(yīng)用，德、法、日、美等發(fā)達(dá)國家相繼發(fā)展了本國的脂肪乳劑。1976年，美國有關(guān)當(dāng)局又批準(zhǔn)了脂肪乳劑可在臨床常規(guī)應(yīng)用。目前，全世界至少已有20余種脂肪乳劑面市。我國亦于80年代末與瑞典Kabi公司合資，大量生產(chǎn)Introlipid供臨床應(yīng)用。1973年，Solassol等首先介紹了三合一(All-in-one，AIO)溶液的概念，證明脂肪乳劑和所有其它營養(yǎng)液可混合于一個瓶內(nèi)或袋內(nèi)，在一定條件和時間內(nèi)可保持穩(wěn)定和營養(yǎng)支持效果。此后推廣了AIO輸液塑料袋，這一簡單但又有重大意義的改進(jìn)大大簡化了腸外營養(yǎng)液的配制和輸注，為脂肪乳劑的臨床廣泛應(yīng)用拓寬了道路。到目前為止，通常的脂肪乳劑是指以脂肪酸甘油酯作為分散相，以蛋黃卵磷脂為乳化劑的水包油型(oil in water，o/w)亞微乳劑。由于脂肪乳劑乳滴的組成及粒徑與口服脂肪類食物后在血液內(nèi)存在的乳糜微粒十分類似，因此通常認(rèn)為脂肪乳劑的乳滴在人體內(nèi)的行為同乳糜微粒亦相似。隨著對脂肪乳劑的深入研究，其在制藥領(lǐng)域也正發(fā)揮著越來越重要的作用。
脂肪乳劑的特殊的理化特性和低毒性決定了其可以作為脂溶性藥物，特別是抗癌藥物、麻醉藥物及抗炎藥物的良好載體。常采用的方法是將藥物包裹于脂肪乳劑的脂質(zhì)核心部分，由于該結(jié)構(gòu)亦類似于微球，因此脂質(zhì)微球(LipidMicrosphere，LM)的名稱也應(yīng)運(yùn)而生。一般認(rèn)為脂質(zhì)微球是通過將藥物溶于脂肪油中，并經(jīng)磷脂乳化分散于水相后制成，是一種以脂肪油為軟基質(zhì)而被磷脂膜包封的微粒分散體系，平均粒徑在200nm左右。
LM具有許多物理化學(xué)及生物學(xué)上的優(yōu)點(diǎn)1.是脂溶性藥物的良好載體。臨床不少藥物水溶性差，必須依靠有機(jī)溶劑才能發(fā)揮作用，而有機(jī)溶劑不僅本身有一定毒性，還可能干擾藥物效果。
2.可有效增加藥物的穩(wěn)定性。含藥脂質(zhì)微球中，有相當(dāng)一部分藥物分布在油相或油水界面膜中，避免了直接與水接觸。對于易水解或?qū)H變化敏感的藥物，這種“隔離”起到了增加穩(wěn)定性的作用。
3.LM中藥物部分包裹于油相或界面膜中，避免了與體液的直至接觸，因而降低了藥物自身可能產(chǎn)生的局部及血管刺激性。另外，藥物在體內(nèi)是由油相中緩慢釋放，可避免藥物在注射用時由于初期濃度過高而引起的不良反應(yīng)。
4.粒徑在200nm左右的小微粒能被機(jī)體的網(wǎng)狀組織系統(tǒng)的吞噬細(xì)胞所吞噬而滯留在網(wǎng)狀組織系統(tǒng)(如肝臟、肺等)中，具有靶向性，這種特點(diǎn)對于抗腫瘤藥物提高藥效、降低毒副作用尤為重要。
Takahashi等人的有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道用博萊霉素試制成LM，并用水劑作對照，以荷瘤大鼠作試驗(yàn)。進(jìn)行靜脈或腫瘤內(nèi)給藥，然后分別測定腫瘤大小和腫瘤中藥物濃度，結(jié)果顯示LM組的腫瘤縮小50％以上，給藥后10小時仍可檢出藥物；而水劑組的腫瘤無明顯縮小，30分鐘到1小時后已檢測不出藥物。以上說明藥物的劑型不同，效果也不同，表明了LM具有選擇性分布并緩慢釋放的特點(diǎn)，對肝臟、淋巴組織系統(tǒng)的疾病和癌癥化療都是一個較適宜的載體劑型。研究證明這種特點(diǎn)對于抗腫瘤藥物提高藥效、降低毒副作用尤為重要。
近幾年來，以LM作為藥物載體的靶向轉(zhuǎn)移作用逐漸受到人們的重視。藥物脂肪乳劑一經(jīng)開發(fā)，便在臨床上廣泛應(yīng)用，收到了良好的效益。日本的水島裕研制的Lipo PGE1和Lipo PGI2等一系列載藥脂肪乳劑產(chǎn)品的開發(fā)上市預(yù)示了此類制劑廣闊的前景。尤其是已臻成熟的乳劑生產(chǎn)工藝和合成的或天然的表面活性劑的應(yīng)用以及乳劑生產(chǎn)技術(shù)的提高，促進(jìn)了具有商業(yè)價值、穩(wěn)定外形的乳劑產(chǎn)品的發(fā)展(穩(wěn)定期大約為2年)，為含藥脂肪乳的開發(fā)生產(chǎn)創(chuàng)造了更好的條件。如依托米酯、異丙酚、棕櫚酸地塞米松脂肪乳劑、氟比洛芬乙氧基α-乙酯脂質(zhì)乳劑、前列腺素E1脂質(zhì)乳等。
理論上，要將難溶性藥物溶解，有兩個條件是必需的1.有效的振搖或攪拌過程；2.未溶顆粒具有較大的比表面積。在我們的實(shí)驗(yàn)中，就是利用了這兩個原則，我們實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)理論為首先，在高速攪拌下將藥物粉末加入乳劑中可得到一種超微的油滴與藥物細(xì)小顆粒同時分散在水中的粗分散體系。第二步，對該分散體系進(jìn)行一個高壓勻化過程，高速的氣流撞擊形成一種超音速攪拌，使藥物顆粒迅速溶解并以分子形式滲透到油水界面膜中。其中藥物可以以兩種形式加入，一種是超微的粉末，另一種是納米級分散的混懸液。藥物加入方法也有兩種，即將藥物直接加入到制備好的注射用乳劑中或?qū)⑺幬锛尤胫脸跞橹性傧♂?。目前，這項(xiàng)技術(shù)目前已成功的應(yīng)用于兩性霉素B(Amphotericin B)，R.H.Müller等于2001年制備出了兩性霉素B注射用膜載藥納米乳劑。
本發(fā)明制備的去甲基斑蝥素脂質(zhì)微球注射液(水包油乳劑)，降低了去甲基斑蝥酸鈉的血管刺激性，提高療效并降低毒副作用，因而具有一定的創(chuàng)新性和較強(qiáng)的實(shí)用性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種含有去甲基斑蝥酸鈉的脂質(zhì)微球注射液(水包油乳劑)及制備方法。
該注射液包含去甲基斑蝥酸鈉，脂溶性介質(zhì)，水和表面活性劑。其中去甲基斑蝥酸鈉可以是去甲基斑蝥素，也可以是由去甲基斑蝥素在制劑制備過程中經(jīng)過反應(yīng)生成去甲基斑蝥酸鈉。
脂溶性介質(zhì)指示一大類生理可接受性物質(zhì)，不管是礦物油，植物油，動物油，精油或合成油，或其混合物。因此，脂溶性介質(zhì)用以指一個寬范圍的具有十分不同化學(xué)性質(zhì)的物質(zhì)。在以類型或功能分類油時，如礦物油源自石油并包含脂肪或蠟基烴，芳香烴或混合的脂肪與芳香基烴。在礦物油類別中也包含石油衍生的油如精制石蠟油等。在植物油類別中，油主要來源于種子或堅(jiān)果，并包含干性油如亞麻子和桐油；半干性油如紅花油和大豆油；不干性油如蓖麻油、棉籽油和椰子油和可用作的皂料如棕櫚油和椰子油。在動物油類別中，油通常來自作為牛羊脂，豬油和硬脂酸的脂肪。液狀動物油包含魚油，油酸，鯨蠟油等。它們通常含大量脂肪酸。包含一些植物油，如橄欖油，棉籽油，谷物油和花生油，也包含一些特殊的魚油，它們由于富含維生素而被廣泛的用作藥物，如鱈魚肝，鯊魚肝油等。液狀脂肪油如單、雙、三甘油酯，或其混合物為優(yōu)選的油。根據(jù)本發(fā)明，中等鏈長的三甘油酯也為有用的油。優(yōu)選為長鏈脂肪酸甘油酯、中鏈脂肪酸甘油酯，及其混合物。
所用表面活性劑可為任何表面活性劑，通常為磷脂，吐溫(Tween)，普朗尼克(poloxamer)，油酸鈉，油酸，膽酸，去氧膽酸及其混合物。所述磷脂選自卵磷脂，豆磷脂，及其混合物。所述吐溫選自吐溫20，吐溫40，吐溫60，吐溫80，吐濕85，及其混合物。優(yōu)選為卵磷脂，豆磷脂，油酸鈉，油酸，吐溫80，普朗尼克F68，及其混合物。
典型地，以制劑質(zhì)量計(jì)本發(fā)明的配方組成為油相 5％～30％去甲基斑蝥酸鈉 0.01％～0.5％表面活性劑 0.5％～5％純甘油 0.5％～5％其余為注射用水如果需要，組合物中也可以添加多種添加劑。如可能含有金屬螯合劑。一般金屬螯合劑為依地酸二鈉(乙二胺四乙酸二鈉鹽)，依地酸鈉鈣(乙二胺四乙酸鈣二鈉鹽)，及其混合物。金屬螯合劑以制劑計(jì)用量為約0％至約1％。
本發(fā)明也涉及含有去甲基斑蝥酸鈉的脂質(zhì)微球注射液和水包油乳劑的制備方法。包含以下步驟中的一種或幾種1.將去甲基斑蝥酸鈉超微顆?；鞈乙夯蛘呤浅⒌姆勰┘尤胫敛缓先ゼ谆唑徕c的空白乳劑經(jīng)混合制得去甲基斑蝥酸鈉脂質(zhì)微球注射液。
2.將去甲基斑蝥酸鈉超微顆?；鞈乙夯蛘呤浅⒌姆勰┘尤胫梁胁糠秩ゼ谆唑徕c的乳劑中經(jīng)混合制得去甲基斑蝥酸鈉脂質(zhì)微球注射液。
3.將去甲基斑蝥酸鈉加入至含有表面活性劑的水溶性介質(zhì)中，然后與油相混合，經(jīng)過高速攪拌制備初乳。
4.該制劑的制備方法主要包括高速攪拌過程及高壓均質(zhì)過程。
5.制劑的滅菌采用高壓旋轉(zhuǎn)滅菌法。
本發(fā)明涉及一種混合去甲基斑蝥酸鈉到油中的方法，包含以下步驟將去甲基斑蝥酸鈉溶在所述油和所述去甲基斑蝥酸鈉共溶劑的溶液中；并除去所述共溶劑已構(gòu)成所述去甲基斑蝥酸鈉的所述油溶液。通常所述共溶劑為短鏈醇。特別是甲醇，乙醇和異丙醇。這些共溶劑最終通過蒸發(fā)除去。
本發(fā)明所述制劑應(yīng)用界面膜載藥的原理，提高了油水中均難溶的藥物去甲基斑蝥酸鈉在乳劑中的載藥量、降低其毒性并使其在體內(nèi)能夠靶向釋藥。其中，去甲基斑蝥酸鈉在油水兩相的界面膜中有一定的分布(約20～80％)，其余部分去甲基斑蝥酸鈉分布于水相及油相中。本制劑為一種抗腫瘤藥物的制劑，經(jīng)注射給藥后在體內(nèi)的特征主要表現(xiàn)為低毒性、肝靶向性。


圖1為脂質(zhì)微球結(jié)構(gòu)示意圖。
圖2為去甲基斑蝥酸鈉脂質(zhì)微球稀釋后粒度測定結(jié)果圖。(其中， A-1表示制劑以氯化鈉注射液(0.9％)稀釋1-10倍后平均粒徑， A-2表示制劑以氯化鈉注射液(0.9％)稀釋20-100倍后平均粒徑， B-1表示制劑以葡萄糖注射液(5.4％)稀釋1-10倍后平均粒徑， B-1表示制劑以葡萄糖注射液(5.4％)稀釋20-100倍后平均粒徑， SD-A-1表示以氯化鈉注射液(0.9％)稀釋1-10倍后粒度分布值， SD-A-2表示以氯化鈉注射液(0.9％)稀釋20-100倍后粒度分布值， SD-B-1表示以葡萄糖注射液(5.4％)稀釋1-10倍后粒度分布值， SD-B-2表示以葡萄糖注射液(5.4％)稀釋20-100倍后粒度分布值。)
圖3為稀釋樣品ζ-電位測定結(jié)果圖。
圖4為稀釋后樣品水相中的分布圖。
圖5為NCTD血藥濃度—時間曲線圖。
(其中， 表示去甲基斑蝥酸鈉脂質(zhì)微球注射液， 表示去甲基斑蝥酸鈉普通注射液)圖6為NCTD心臟中藥物濃度—時間曲線圖。(其中， 表示去甲基斑蝥酸鈉脂質(zhì)微球注射液， 表示去甲基斑蝥酸鈉普通注射液)圖7為NCTD肝中藥物濃度—時間曲線圖。(其中， 表示去甲基斑蝥酸鈉脂質(zhì)微球注射液， 表示去甲基斑蝥酸鈉普通注射液)圖8為NCTD腎中藥物濃度—時間曲線圖。(其中， 表示去甲基斑蝥酸鈉脂質(zhì)微球注射液， 表示去甲基斑蝥酸鈉普通注射液)圖9為給藥0.5小時的大鼠體內(nèi)各組織藥物分布圖。(其中， 表示去甲基斑蝥酸鈉脂質(zhì)微球注射液，■表示去甲基斑蝥酸鈉普通注射液)圖10為給藥6小時的大鼠體內(nèi)各組織藥物分布圖。(其中， 表示去甲基斑蝥酸鈉脂質(zhì)微球注射液，■表示去甲基斑蝥酸鈉普通注射液)圖11為給藥12小時的大鼠體內(nèi)各組織藥物分布圖。(其中， 表示去甲基斑蝥酸鈉脂質(zhì)微球注射液，■表示去甲基斑蝥酸鈉普通注射液)圖12為給藥24小時后大鼠體內(nèi)各組織AUC值分布圖。(其中， 表示去甲基斑蝥酸鈉脂質(zhì)微球注射液，■表示去甲基斑蝥酸鈉普通注射液)具體實(shí)施方式
實(shí)施例1去甲基斑蝥酸鈉原料的制備去甲基斑蝥酸鈉雖然有注射液，但是都是從去甲斑蝥素直接水解制得鈉鹽水溶液。其原料藥沒有生產(chǎn)和銷售。而從去甲斑蝥素制備去甲斑蝥酸鈉是一個最基本的有機(jī)反應(yīng)，因此，我們參照文獻(xiàn)報(bào)道，以去甲斑蝥素為原料，經(jīng)過水解成鹽，脫水，洗滌，干燥，制得去甲斑蝥酸鈉。反應(yīng)式如下
一般合成方法如下氫氧化鈉10-30g，加水100mL，溶解后放冷，邊攪拌邊加入去甲斑蝥素10-30g，待近全部溶解后，濾除少量不溶物。將溶液減壓濃縮近干，得大量白色粉末狀固體，加乙醇5-50mL，抽濾，得到白色晶體，用乙醇多次洗滌，每次洗后檢查洗出液的pH值，待洗出液pH值為4-9時，抽濾，真空干燥，得白色結(jié)晶性粉末。
精制將上述白色粉末5-50g，溶于5-50mL水中，用G3垂熔漏斗過濾，濾液加入100-1000mL乙醇，放置2-20小時后抽濾，真空干燥，得白色粉末狀固體。
實(shí)施例2去甲基斑蝥酸鈉制劑的處方制備工藝處方1注射用薏苡仁油 5-30g去甲基斑蝥酸鈉 0.01g-5g卵磷脂 0.5-5g甘油 0-5g注射用水加至100ml制備方法1(1)將處方量的卵磷脂、甘油及去甲基斑蝥酸鈉與預(yù)熱至40-100℃的適量注射用水進(jìn)行混合，轉(zhuǎn)入組織搗碎機(jī)內(nèi)，攪拌數(shù)分鐘，1-5次，直至各成份均勻分散；(2)于上述分散液中加入處方量的預(yù)熱至40-100℃的油相，轉(zhuǎn)入組織搗碎機(jī)內(nèi)，攪拌數(shù)分鐘，1-5次，直至油相均勻分散；(3)取上述初乳加入預(yù)熱至40-100℃的注射用水至全量，轉(zhuǎn)移至高壓均質(zhì)機(jī)內(nèi)，勻化1-10次，取樣鏡檢，至油滴在0.5微米以下；(4)取去甲基斑蝥酸鈉亞微乳劑灌封于輸液瓶中，充氮，置于高壓旋轉(zhuǎn)滅菌器中滅菌。
處方2注射用大豆油 5-30g去甲基斑蝥酸鈉 0.01g-5g豆磷脂 0.5-5g甘油 0-5gTween-80 0-1g注射用水加至100ml制備方法2(1)將處方量去甲基斑蝥酸鈉分散于0％-5％的Tween-80溶液中，高速攪拌器攪拌數(shù)分鐘，1-5次，然后用高壓乳勻機(jī)勻化1-10次(50-100MP，20-100℃)即得，所制混懸液的去甲基斑蝥酸鈉含量為納米乳劑的10倍；(2)將處方量的卵磷脂、甘油與預(yù)熱至40-100℃的適量注射用水進(jìn)行混合，轉(zhuǎn)入組織搗碎機(jī)內(nèi)，攪拌數(shù)分鐘，1-5次，直至各成份均勻分散；(3)于上述分散液中加入處方量的預(yù)熱至40-100℃的大豆油，轉(zhuǎn)入組織搗碎機(jī)內(nèi)，攪拌數(shù)分鐘，1-5次，直至油相均勻分散，加入20-100℃的注射用水至全量；(4)將去甲基斑蝥酸鈉超微顆?；鞈乙杭尤肟瞻壮跞橹?，高壓均質(zhì)1-10次，取樣鏡檢，至油滴在0.5微米以下；(5)取去甲基斑蝥酸鈉亞微乳劑灌封于輸液瓶中，充氮，置于高壓旋轉(zhuǎn)滅菌器中滅菌。
處方3注射用鴉膽子油 5-30g去甲基斑蝥酸鈉 0.01g-5g卵磷脂 0.5-5g甘油 0-5gTween-80 0-1g注射用水加至100ml制備方法3(1)～(3)步驟同制備方法2；(4)將空白初乳加入高壓均質(zhì)機(jī)中均質(zhì)1-10次，取樣鏡檢，至油滴在0.5微米以下；(5)將去甲基斑蝥酸鈉超微顆?；鞈乙杭尤肟瞻兹閯┲懈咚贁嚢?；(6)取去甲基斑蝥酸鈉亞微乳劑灌封于輸液瓶中，充氮，置于高壓旋轉(zhuǎn)滅菌器中，滅菌。
處方4油相(大豆油/MCT) 5-30g去甲基斑蝥酸鈉 0.01-5g卵磷脂 0.5-5g甘油 0-5g油酸鈉 0-1gEDTA 0-1g注射用水加至 100mL制備方法4(1)將注射用甘油、油酸鈉、EDTA、F68分散于適量注射用水中，至磁力攪拌器中加熱至40-100℃攪拌至全部溶解；(2)注射用卵磷脂、Tween-80、加入至由注射用MCT、注射用大豆油組成的混合油相中，加熱至40-100℃下攪拌至卵磷脂完全溶解，加入去甲基斑蝥酸鈉，進(jìn)行高壓均質(zhì)。(3)將油相加入至水相中，置于高速組織搗碎機(jī)攪拌數(shù)分鐘，1-5次。(4)調(diào)節(jié)pH值至4-9，注射用水稀釋定容至處方量，轉(zhuǎn)移至高壓均質(zhì)機(jī)均質(zhì)3-10次。(5)裝瓶，封罐氮?dú)?，置于高壓旋轉(zhuǎn)滅菌器中，滅菌。
除以上所列處方中組合物外，按以上方法另外制備5個制劑，它們的組成如下


實(shí)施例3去甲基斑蝥酸鈉脂質(zhì)微球稀釋介質(zhì)的篩選本發(fā)明研究了不同稀釋介質(zhì)及稀釋后不同時間對去甲基斑蝥酸鈉脂質(zhì)微球性質(zhì)的影響，以篩選出較合適的臨床用稀釋介質(zhì)，并確定稀釋后可安全使用的時間。
實(shí)驗(yàn)方法將去甲基斑蝥酸鈉脂質(zhì)微球樣品分別以氯化鈉注射液(0.9％)稀釋1-10倍(代號A-1)及20-100倍(代號A-2)，以葡萄糖注射液(5.4％)稀釋1-10倍(代號B-1)及20-100倍(代號B-2)，測定稀釋30min，1h，2h，4h及8h后的粒徑、ζ-電位及藥物包裹率。稀釋后樣品的粒度測定的結(jié)果見附圖2，稀釋樣品ζ-電位變化見附圖3，樣品稀釋后藥物分布隨時間的變化見附圖4，稀釋后樣品水相中的分布圖見附圖5，由以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定，去甲基斑蝥酸鈉脂質(zhì)微球在臨床使用時以葡萄注射液稀釋1-10倍時，在2h內(nèi)使用是安全合理的。
實(shí)施例4去甲基斑蝥酸鈉脂質(zhì)微球注射液刺激性試驗(yàn)(1)血管刺激性實(shí)驗(yàn)選用新西蘭白兔6只，3只白兔于右耳耳緣靜脈注射去甲基斑蝥酸鈉注射液Qs，左耳注射相同劑量無菌的5％葡萄糖注射液作為對照；另3只白兔于右耳耳緣靜脈注射去甲基斑蝥酸鈉脂質(zhì)微球注射液Qz，左耳注射相同劑量無菌的5％葡萄糖注射液作為對照。每日一次，連續(xù)三天，末次給藥24小時后，處死白兔，肉眼觀察注射部位的反應(yīng)情況，并解剖兔耳血管及周圍組織做石蠟切片，染色，光鏡檢查。
結(jié)果顯示去甲基斑蝥酸鈉注射液兩種劑型血管刺激性實(shí)驗(yàn)肉眼觀察結(jié)果表明Qz的血管刺激性弱于Qs；鏡檢報(bào)告表明Qs組對新西蘭白兔耳血管有一定程度的血管刺激性，Qz組對新西蘭白兔耳血管未見明顯刺激性。
(2)肌肉刺激性實(shí)驗(yàn)選用新西蘭白兔4只，每種劑型2只，分別在右側(cè)股四頭肌注射Qs和Qz注射液1ml，左側(cè)股四頭肌注射等量的無菌5％葡萄糖注射液作為對照，注射48小時后，處死白兔，解剖取出股四頭肌，縱向切開，觀察注射部位肌肉組織的反應(yīng)情況，確定反應(yīng)級數(shù)。
0級無變化。
1級輕度充血，其范圍在0.5cm×1.0cm以下。
2級中度充血，其范圍在0.5cm×1.0cm以上。
3級重度充血，伴有肌肉變性。
4級出現(xiàn)壞死，有褐色變性。
5級出現(xiàn)廣泛性壞死。
然后算出4塊股四頭肌反應(yīng)級數(shù)總和，如果股四頭肌反應(yīng)級數(shù)的最高值和最低值之差大于2，則應(yīng)另取2只健康白兔重新實(shí)驗(yàn)。得到結(jié)果后，若4塊股四頭肌反應(yīng)級數(shù)總和小于10，則認(rèn)為供試品的局部刺激性實(shí)驗(yàn)符合規(guī)定。
結(jié)果表明Qz的肌肉刺激性弱于Qs。
實(shí)施例5溶血性實(shí)驗(yàn)自新西蘭白兔的頸總動脈取血20ml，置于燒瓶內(nèi)，用玻璃棒輕輕攪動，數(shù)分鐘后，除去纖維蛋白，取出血液，加等量5％葡萄糖注射液，離心，除去上清液；沉淀的紅細(xì)胞再加5％葡萄糖注射液清洗，離心。如此反復(fù)直至上清液透明，按紅細(xì)胞的容量用5％葡萄糖注射液配成2％的混懸液。
取干凈試管7支，分別編號，依次加入下表內(nèi)各液，第6管不加供試液作為空白對照管，第7管用蒸餾水代替5％葡萄糖注射液，搖勻，置于37℃水浴中，分別于0.5小時、1小時、2小時、3小時觀察是否有溶血現(xiàn)象發(fā)生。
結(jié)果表明Qs、Qz都未見溶血現(xiàn)象發(fā)生，兩種劑型的溶血性實(shí)驗(yàn)都合格。
實(shí)施例6過敏性實(shí)驗(yàn)取健康豚鼠8只，Qs、Qz兩種劑型各4只，每只豚鼠腹腔注射相應(yīng)供試液0.5ml，隔日一次，共三次。在首次注射后的第14、21天于每只豚鼠的后腳掌外側(cè)靜脈注入相應(yīng)供試藥液1ml(劑量折算同前)，進(jìn)行攻擊。每次靜脈給藥觀察2小時，如出現(xiàn)抓鼻、豎毛、咳嗽、呼吸困難中的兩種或兩種以上者判為陽性；如有痙攣、大小便失禁、虛脫、休克、死亡現(xiàn)象之一者判為陽性。一切正常為陰性。
結(jié)果表明Qs、Qz兩種劑型都符合過敏性實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。
實(shí)施例7大鼠血漿藥代動力學(xué)研究給藥方案12只大鼠隨機(jī)分成二組，每組6只，實(shí)驗(yàn)前禁食一夜。甲組為對照組，于右后股靜脈注射去甲基斑蝥酸鈉氯化鈉注射液(2mg·mL-1)，乙組為受試組，于右后股靜脈注射去甲基斑蝥酸鈉脂質(zhì)微球，分別于10min，20min，30min，45min，1h，2h，4h，6h，8h，12h，24h眼眶取0.5mL血，置預(yù)先肝素化的尖底離心試管中，離心，精密吸取上層血漿200μL，加入20μL注射用水，按一定方法處理后，取20μL進(jìn)樣，以當(dāng)日的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各時間點(diǎn)樣品中去甲基斑蝥酸鈉的濃度。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果見附圖6隔室模型藥物動力學(xué)參數(shù)用3P97藥物動力學(xué)程序處理去甲基斑蝥酸鈉脂質(zhì)微球和注射液的平均血藥濃度數(shù)據(jù)。根據(jù)AIC和擬合度判斷兩者的模型歸屬，結(jié)果表明，去甲基斑蝥酸鈉脂質(zhì)微球和注射液的血藥濃度數(shù)據(jù)均符合雙隔室模型。
非隔室模型藥物動力學(xué)參數(shù)由血藥濃度-時間實(shí)測數(shù)據(jù)描述體內(nèi)過程，計(jì)算藥物動力學(xué)參數(shù)。結(jié)果顯示，主要藥動學(xué)參數(shù)AUC0-∞，AUMC0-∞，AUC0-t，AUMC0-t，S2，MRT，VRT無顯著性差異。
實(shí)施例8大鼠組織分布動力學(xué)研究給藥方案60只大鼠隨機(jī)分成二組，每組30只。甲組為對照組，于右后股靜脈注射NCTD氯化鈉注射液，乙組為受試組，于右后股靜脈注射NCTD脂質(zhì)微球，分別于0.5h，2h，6h，12h，24h(每點(diǎn)6只大鼠，甲、乙組各3只)斷頭處死動物，取出心，肝，脾，肺，腎，腦，用生理鹽水沖洗干凈，用濾紙吸干，稱取0.5g，加1mL生理鹽水勻漿，小于0.5g的組織直接勻漿，離心，取上清液，按“組織樣品處理與測定”項(xiàng)下處理后，取20μL進(jìn)樣，以當(dāng)日的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各時間點(diǎn)樣品中NCTD的濃度。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)動物靜脈注射NCTD脂質(zhì)微球和NCTD注射液后各時間點(diǎn)的藥物濃度測定結(jié)果見表10～12，實(shí)驗(yàn)動物各時間點(diǎn)各組織藥物濃度的平均值與時間的關(guān)系見附圖6～12。
在本試驗(yàn)給藥條件下，受試制劑與參比制劑給藥后24h內(nèi)大鼠脾、肺、腦的血藥濃度無法測到，故未列出結(jié)果。
另外，給于受試制劑的大鼠組給藥12h～24h后有兩只動物死亡，且補(bǔ)加實(shí)驗(yàn)后仍死亡，故受試制劑組24h大鼠各組織分布數(shù)據(jù)僅得到一組。
由大鼠體內(nèi)血漿藥動學(xué)試驗(yàn)結(jié)果顯示，去甲基斑蝥酸鈉脂質(zhì)微球注射液在大鼠體內(nèi)并無明顯緩釋作用。組織分布動力學(xué)考察實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，去甲基斑蝥酸鈉在腎臟、肝臟、心臟及血漿中的分布較多，而在肺、脾及腦中幾乎無分布。改變劑型后，除肝臟中的總分布略有改變外，基本未改變藥物體內(nèi)其它組織的分布特征。
以去甲基斑蝥酸鈉溶液劑為參比制劑，測定大鼠體內(nèi)的組織分布動力學(xué)特征，結(jié)果表明將去甲基斑蝥酸鈉制備成脂質(zhì)微球后靜脈給藥后，未改變藥物在大鼠脾、肺、腎、腦、及血漿中的滯留時間及藥物分布量，在肝組織中的分布略有增加。
權(quán)利要求
1.一種含有去甲基斑蝥酸鈉的脂質(zhì)微球注射液，其特征在于它包括去甲基斑蝥酸鈉、脂溶性介質(zhì)、水、表面活性劑和等滲調(diào)節(jié)劑，其中所述脂溶性介質(zhì)以制劑計(jì)用量為5％至約30％，去甲基斑蝥酸鈉以制劑計(jì)用量為0.01％至5％，表面活性劑以制劑計(jì)用量為0.5％至5％，等滲調(diào)節(jié)劑以制劑計(jì)用量為0.5％至5％，余量為水。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種含有去甲基斑蝥酸鈉的脂質(zhì)微球注射液，其特征在于制劑中還含有金屬螯合劑；等滲調(diào)節(jié)劑甘油、山梨醇、甘露醇、葡萄糖，及其混合物；還含有氫氧化鈉，鹽酸，及其混合物，其中螯合劑以制劑計(jì)用量為0％至1％，等滲調(diào)節(jié)劑以制劑計(jì)用量為0.5％至5％。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種含有去甲基斑蝥酸鈉的脂質(zhì)微球注射液，其特征在于所述注射液包括供靜脈輸液用的含去甲基斑蝥酸鈉的水包油乳劑，構(gòu)成脂質(zhì)微球注射液的組合物與水包油乳劑的組合物相同。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的一種含有去甲基斑蝥酸鈉的脂質(zhì)微球注射液，其特征在于所述注射液應(yīng)用界面膜載藥的原理，注射液中去甲基斑蝥酸鈉在油水兩相的界面膜中有分布約占20～80％，其余部分去甲基斑蝥酸鈉分布于水相及油相中。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的一種含有去甲基斑蝥酸鈉的脂質(zhì)微球注射液，其特征在于所述注射液中去甲基斑蝥酸鈉可以是去甲基斑蝥素，也可以是由去甲基斑蝥素在制劑制備過程中經(jīng)過反應(yīng)生成去甲基斑蝥酸鈉。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種含有去甲基斑蝥酸鈉的脂質(zhì)微球注射液，其特征在于所述的脂溶性介質(zhì)選自礦物油，植物油，動物油，精油和合成油，或其混合物，所述表面活性劑選自磷脂，吐溫，普朗尼克，油酸鈉，油酸，膽酸，去氧膽酸及其混合物。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種含有去甲基斑蝥酸鈉的脂質(zhì)微球注射液，其特征在于所述油選自紅花油，大豆油，玉米油，中鏈脂肪酸甘油三酯，薏苡仁油，鴉膽子油，及其混合物；其中所述磷脂選自卵磷脂，豆磷脂，或者是二者混合物；所述吐溫選自吐溫20，吐溫40，吐溫60，吐溫80，吐溫85，或者是以上不同規(guī)格的任意比例混合物。
8.一種含有去甲基斑蝥酸鈉的脂質(zhì)微球注射液的制備方法，包含以下步驟將去甲基斑蝥酸鈉超微顆?；鞈乙夯蛘呤浅⒌姆勰┘尤胫敛缓ゼ谆唑徕c的空白乳劑或者是含有部分去甲基斑蝥酸鈉的乳劑中經(jīng)混合制得去甲基斑蝥酸鈉脂質(zhì)微球注射液。
9.一種含有去甲基斑蝥酸鈉的脂質(zhì)微球注射液，其特征在于包含以下工藝步驟將去甲基斑蝥酸鈉加入至含有表面活性劑的水溶性介質(zhì)中，然后與油相混合，經(jīng)過高速攪拌制備初乳后，進(jìn)行高壓均質(zhì)過程，制劑的滅菌采用高壓旋轉(zhuǎn)滅菌法。
10.一種含有去甲基斑蝥酸鈉的脂質(zhì)微球注射液，其特征在于包含以下工藝步驟將去甲基斑蝥酸鈉與脂溶性介質(zhì)混和后，再分散在水相中，經(jīng)過高速攪拌制備初乳后，進(jìn)行高壓均質(zhì)過程，制劑的滅菌采用高壓旋轉(zhuǎn)滅菌法。
全文摘要
本發(fā)明涉及含去甲基斑蝥酸鈉的脂質(zhì)微球注射液和水包油乳劑的組合物，還涉及其制備方法。所述制劑應(yīng)用界面膜載藥的原理，提高了油水中均難溶的藥物去甲基斑蝥酸鈉在乳劑中的載藥量、降低其毒性并使其在體內(nèi)能夠靶向釋藥。它包括去甲基斑蝥酸鈉、脂溶性介質(zhì)、水、表面活性劑和等滲調(diào)節(jié)劑，其中所述脂溶性介質(zhì)以制劑計(jì)用量為5％至30％，去甲基斑蝥酸鈉以制劑計(jì)用量為0.01％至5％，表面活性劑以制劑計(jì)用量為0.5％至5％，等滲調(diào)節(jié)劑以制劑計(jì)用量為0.5％至5％，余量為水。其中，去甲基斑蝥酸鈉在油水兩相的界面膜中有一定的分布，其余部分去甲基斑蝥酸鈉分布于水相及油相中。本制劑為一種抗腫瘤藥物的制劑，經(jīng)注射給藥后在體內(nèi)的特征主要表現(xiàn)為低毒性、肝靶向性。
文檔編號A61K9/107GK1788723SQ20051012523
公開日2006年6月21日 申請日期2005年11月20日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月20日
發(fā)明者唐星, 邵瑞瑩, 王濤 申請人:沈陽藥科大學(xué)