專利名稱：：治療感染性疾病和免疫系統(tǒng)疾病的化合物及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明一般涉及對感染性疾病的檢測、治療和預(yù)防。具體而言，本發(fā)明涉及含有分離自母牛分枝桿菌(Mycobacteriumvaccae)的免疫原性表位的化合物，并涉及這些化合物在抗感染性疾病的疫苗接種或免疫治療方面以及在某些免疫疾病和癌癥治療方面的用途，所述感染性疾病包括分枝桿菌感染，諸如結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)感染或鳥分枝桿菌(Mycobacteriumavium)感染。
背景技術(shù)：
：本發(fā)明一般涉及治療和預(yù)防感染性疾病，以及治療某些免疫疾病和癌癥。具體而言，本發(fā)明涉及治療和預(yù)防分枝桿菌感染(包括結(jié)核分枝桿菌或鳥分枝桿菌感染)的化合物和方法。結(jié)核病是一種由結(jié)核分枝桿菌(M.tuberculosis)感染引起的慢性感染性疾病。結(jié)核病在發(fā)展中國家是一種主要疾病，并且在世界發(fā)達(dá)地區(qū)問題也愈發(fā)嚴(yán)重，每年約800萬新增病例，300萬人死亡。盡管結(jié)核分枝桿菌感染在相當(dāng)長的一段時(shí)間內(nèi)可能無癥狀，但該疾病最常表現(xiàn)為慢性肺炎，導(dǎo)致發(fā)熱和呼吸系統(tǒng)癥狀。如果不治療，可導(dǎo)致病情顯著加重甚至死亡。盡管一般延長抗生素治療可控制結(jié)核病，但這樣的治療不足以預(yù)防該病的蔓延。受感染的個(gè)體可能無癥狀，但在一定時(shí)間內(nèi)會(huì)接觸性傳染。另外，盡管對治療方案的依從性很關(guān)鍵，但患者行為難以監(jiān)控。某些患者沒有完成療程，這可能導(dǎo)致治療無效并產(chǎn)生抗藥性分枝桿菌。抑制結(jié)核病擴(kuò)散需要有效的疫苗接種和對疾病的正確的早期診斷。目前，活菌疫苗接種是最有效的誘導(dǎo)保護(hù)性免疫的方法。為此最常使用的分枝桿菌是卡介苗(BCG)，一種牛分枝桿菌(Mycobacteriumbovis)無毒株。然而，BCG的安全性和有效性一直有爭論，而在某些國家如美國，不接種一般人群。通常使用皮試診斷結(jié)核分枝桿菌感染，皮試就是皮內(nèi)接觸結(jié)核菌素PPD(純化蛋白衍生物)?？乖禺愋訲細(xì)胞應(yīng)答在注射后48-72小時(shí)在注射部位產(chǎn)生可檢測的硬結(jié)，由此指示接觸分枝桿菌抗原。然而，皮試具有敏感性和特異性的問題，并且不能區(qū)分開BCG接種個(gè)體和感染個(gè)體。母牛分枝桿菌是一種已用于免疫治療結(jié)核病以及麻風(fēng)病的少為人知的分枝桿菌，對人是非病原體。然而，與BCG相比，關(guān)于母牛分枝桿菌有效性的信息較少，并且它還沒有廣泛用于接種一般人群。牛分枝桿菌BCG和母牛分枝桿菌被認(rèn)為含有接觸結(jié)核分枝桿菌感染的個(gè)體免疫系統(tǒng)識(shí)別的抗原性化合物。若干專利和其它出版物公開了通過給予分枝桿菌(包括母牛分枝桿菌)或某些分枝桿菌成分治療各種病癥。國際專利公開號(hào)WO91/02542公開了對其中患者異常釋放高水平IL-6和/或TNF或患者的IgG顯示異常高比例的非半乳糖IgG的慢性炎癥性疾病的治療。在該公開專利中提及的疾病當(dāng)中有牛皮癬、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、分枝桿菌疾病、節(jié)段性回腸炎、原發(fā)性膽汁性肝硬化、肉樣瘤病、潰瘍性結(jié)腸炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化病、Guillain-Barre綜合癥、原發(fā)性糖尿病和某些方面的移植排斥反應(yīng)。治療藥物優(yōu)選包括單劑量注射給予高壓滅菌的母牛分枝桿菌。美國專利4,716,038公開了對各種類型的自身免疫病(包括關(guān)節(jié)炎)的診斷、針對性疫苗接種和通過給予分枝桿菌包括母牛分枝桿菌進(jìn)行治療。美國專利4,724,144公開了用于治療分枝桿菌疾病尤其是結(jié)核病和麻風(fēng)病并作為化療輔助劑的免疫治療劑，它包含得自母牛分枝桿菌的抗原性物質(zhì)。國際專利公開號(hào)WO91/01751公開了使用得自母牛分枝桿菌的抗原性物質(zhì)和/或免疫調(diào)節(jié)物質(zhì)作為免疫預(yù)防劑，以延遲和/或預(yù)防AIDS發(fā)生。國際專利公開號(hào)WO94/06466公開了使用得自母牛分枝桿菌的抗原性物質(zhì)和/或免疫調(diào)節(jié)物質(zhì)治療患或未患AIDS以及相關(guān)性結(jié)核病的HIV感染。傳統(tǒng)疫苗包括減毒或滅活形式的致病生物(或其組分)。作為傳統(tǒng)疫苗的替代方法，已開發(fā)了針對多種疾病如AIDS、流感、癌癥和瘧疾的DNA疫苗。針對眾多這樣的疾病的DNA疫苗的臨床實(shí)驗(yàn)正在進(jìn)行中。典型的DNA疫苗包括克隆入無活性質(zhì)粒載體中的編碼抗原的DNA。由所述疫苗DNA編碼抗原的表達(dá)通常處于強(qiáng)啟動(dòng)子控制之下，如人β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子、Rous肉瘤病毒(RSV)啟動(dòng)子或CMV啟動(dòng)子(RamsayAJ等，ImmunologyandCellBiology75360-363，1997)。Tang等人獲得了DNA疫苗能夠誘導(dǎo)需要的免疫應(yīng)答的第一個(gè)實(shí)驗(yàn)證據(jù)(TangD-C等，Nature356152-154，1992)。在這些實(shí)驗(yàn)中，用包含人生長激素編碼基因的質(zhì)粒接種小鼠產(chǎn)生特異性初次抗體應(yīng)答。已經(jīng)在動(dòng)物模型中評(píng)價(jià)了針對兩種含結(jié)核分枝桿菌基因的DNA疫苗的免疫應(yīng)答。第一種疫苗含有GroEL應(yīng)激蛋白(65kDa蛋白；TasconRE等，NatureMed.2888-892，1996)編碼基因。用此DNA疫苗注射小鼠獲得的保護(hù)水平與接受傳統(tǒng)BCG疫苗的小鼠相等。第二種針對結(jié)核分枝桿菌的DNA疫苗包含編碼抗原85復(fù)合物的抗原的DNA，獲得了與Tang等人研究的相似結(jié)果(HuygenK等，NatureMed.2893-898，1996)。美國專利5,736,524公開了通過給予一種多核苷酸結(jié)核疫苗免疫接種馴養(yǎng)哺乳動(dòng)物或家畜，以抵抗結(jié)核分枝桿菌或牛分枝桿菌感染，所述疫苗包含有效連接至轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件的結(jié)核分枝桿菌抗原85基因。最近報(bào)道了第一個(gè)人DNA疫苗實(shí)驗(yàn)(WangR等，Science282476-80，1998)。在該實(shí)驗(yàn)中，將瘧疾的致病因子惡性瘧原蟲(Plasmodiumfalciparum)抗原注射入健康自愿者。根據(jù)出現(xiàn)細(xì)胞毒性T(CD8+)淋巴細(xì)胞(CTL)證實(shí)激發(fā)了需要的免疫應(yīng)答，提示免疫系統(tǒng)應(yīng)當(dāng)能夠清除感染患者體內(nèi)的寄生蟲。McGregor等進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)測定了抗HIV-1感染的人DNA疫苗的安全性和免疫原性(J.Infect.Dis.17892-100，1998)。其它DNA疫苗實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)也提示，在注射DNA疫苗后產(chǎn)生MHCI類限制性CD8+CTL和MHCII類限制性CD4+輔助T細(xì)胞抗體(Ramsay，AJ等，ImmunologyandCellBiology75360-363，1997)。DNA疫苗顯著優(yōu)于包含滅活或減毒生物的多種傳統(tǒng)疫苗。DNA疫苗誘導(dǎo)長效免疫應(yīng)答，并因此可能只需要一次接種?？蓪⒕幋a多種抗原的DNA加入到單一質(zhì)粒中，由此提供抗多種疾病的保護(hù)。生產(chǎn)DNA疫苗的技術(shù)相對簡單，相同的技術(shù)可用于生產(chǎn)所有的疫苗，使得生產(chǎn)成本更便宜。將有效的傳統(tǒng)疫苗傳遞至患者依賴于保持從生產(chǎn)商至診所的完整“冷傳送鏈”。生產(chǎn)的溶液或干燥型DNA疫苗對儲(chǔ)存條件不敏感。最近開發(fā)了構(gòu)建和提供DNA疫苗的替代途徑。在其中一種稱為體細(xì)胞轉(zhuǎn)基因免疫(STI)的技術(shù)中，將攜帶免疫球蛋白重鏈基因、處于組織特異性調(diào)節(jié)元件控制下的質(zhì)粒DNA直接接種入小鼠脾臟，隨后在B細(xì)胞表面表達(dá)所述抗原(XiongS等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA946352-6357，1997)。這些B細(xì)胞產(chǎn)生針對所表達(dá)抗原的抗體，引起免疫應(yīng)答。后來的研究顯示，STI誘導(dǎo)的持久性免疫記憶可達(dá)2年(GerloniM等，Vaccine(2-3)293-297，1998)。表達(dá)文庫免疫(ELI)是另一種使用DNA疫苗的技術(shù)(BarryMA等，Nature377632-635，1995)。在該技術(shù)中，將完整病原體基因組的片段克隆入載體中并用作疫苗。通過篩選和再篩選克隆庫，直至可鑒定出單個(gè)克隆，來選擇保護(hù)性抗原，尤其是誘導(dǎo)CTL的保護(hù)性抗原。然后可將鑒定的多核苷酸或多肽摻入到已批準(zhǔn)使用的傳遞系統(tǒng)中。最近公開了EpimmuneInc.(SanDiego，CA)的科學(xué)家在開發(fā)用于治療和預(yù)防HIV感染的表位型疫苗方面的進(jìn)展(IshiokaGY等，JournalofImmunology1623915-3925，1999)。本領(lǐng)域仍需要有效預(yù)防和治療感染性疾病(例如人和馴養(yǎng)哺乳動(dòng)物或家畜的結(jié)核病和其它分枝桿菌感染)以及有效治療某些免疫系統(tǒng)相關(guān)疾病的化合物和方法。發(fā)明簡述簡而言之，本發(fā)明提供預(yù)防和治療感染性疾病(如分枝桿菌感染)以及治療免疫疾病和癌癥的化合物和方法。第一方面，本發(fā)明提供得自母牛分枝桿菌基因組的分離多核苷酸。這些多核苷酸編碼根據(jù)其多種免疫測定結(jié)果闡明的免疫原性特性選擇的多肽表位。在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明多核苷酸包含選自以下的序列(a)SEQIDNO8-21中提供的序列；(b)按照計(jì)算機(jī)算法BLASTN測定，與SEQIDNO8-21的序列具有至少50％、75％或90％相同殘基的序列；和(c)序列(a)和(b)的互補(bǔ)物。第二方面，本發(fā)明提供含有母牛分枝桿菌抗原的免疫原性表位的分離多肽。在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明多肽包含選自以下的序列(a)SEQIDNO61-77中提供的序列；和(b)按照計(jì)算機(jī)算法FASTX測定，與SEQIDNO61-77的序列具有至少50％、75％或90％相同殘基的序列。還提供含有至少一種本發(fā)明多核苷酸的DNA構(gòu)建物，以及用這樣的DNA構(gòu)建物轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。另一方面，本發(fā)明提供包含至少一種本發(fā)明多肽的融合蛋白。關(guān)于其它方面，本發(fā)明提供包含至少一種本發(fā)明多肽、多核苷酸、融合蛋白或DNA構(gòu)建物以及一種生理學(xué)上可接受的載體的組合物。本發(fā)明還提供包含至少一種上述多肽、多核苷酸、融合蛋白或DNA構(gòu)建物以及一種免疫刺激物的組合物。再一方面，提供增強(qiáng)患者免疫應(yīng)答的方法，包括給予患者有效量的一種或多種上述組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述免疫應(yīng)答為Th1應(yīng)答。本發(fā)明的又一方面，提供治療患者疾病的方法，包括給予患者本發(fā)明的組合物。在某些實(shí)施方案中，所述疾病選自免疫疾病、感染性疾病和癌癥。本發(fā)明的這些方面和其它方面在參考以下的詳述時(shí)會(huì)變得更加清晰。如同每個(gè)參考文獻(xiàn)都單獨(dú)結(jié)合到本文中一樣，本文公開的所有參考文獻(xiàn)通過引用整體結(jié)合到本文中。附圖簡述圖1A-F圖解說明用牛分枝桿菌BCG(分別為圖1A和D)、ME/DDNA(分別為圖1B和E)或rME/D(分別為圖1C和F)免疫接種BALB/cByJ小鼠，以其肺和脾組織勻漿中結(jié)核分枝桿菌CFU降低檢測對保護(hù)性免疫的誘導(dǎo)。圖2A-D顯示用rME/A(圖2A)、rME/B(圖2B)或rME/D(圖2C)皮下免疫BALB/cByJ小鼠時(shí)其淋巴結(jié)細(xì)胞的增殖反應(yīng)。對照小鼠用PBS免疫(圖2D)。圖3A-D顯示用重組多表位構(gòu)建物rME/A(圖3A)、rME/B(圖3B)或rME/D(圖3C)皮下免疫BALB/cByJ小鼠時(shí)其淋巴結(jié)細(xì)胞的IFN-γ分泌。對照小鼠用PBS免疫(圖3D)。圖4A顯示用rME/A、rME/D或ME/DDNA由三種不同免疫途徑免疫BALB/cByJ小鼠時(shí)其淋巴結(jié)細(xì)胞的增殖反應(yīng)。圖4B顯示用PBS免疫的對照小鼠的淋巴結(jié)細(xì)胞的增殖反應(yīng)。圖5A顯示用rME/A、rME/D或ME/DDNA由三種不同免疫途徑免疫BALB/cByJ小鼠時(shí)其淋巴結(jié)細(xì)胞分泌IFN-γ的水平。圖5B顯示用PBS免疫的對照小鼠分泌IFN-γ的水平。圖6A顯示用rME/A、rME/D或ME/DDNA由三種不同免疫途徑免疫BALB/cByJ小鼠時(shí)，各個(gè)表位對小鼠淋巴結(jié)細(xì)胞增殖反應(yīng)的影響。圖6B顯示用PBS免疫的對照小鼠的淋巴結(jié)細(xì)胞的增殖反應(yīng)。圖7A顯示用rME/A、rME/D或ME/DDNA由三種不同免疫途徑免疫BALB/cByJ小鼠時(shí)，各個(gè)表位對小鼠淋巴結(jié)細(xì)胞分泌IFN-γ水平的影響。圖7B顯示用PBS免疫的對照小鼠分泌IFN-γ的水平。圖8A和B顯示用與rME/A和rME/D體外反應(yīng)的ME/DDNA免疫小鼠時(shí)其血清中抗-ME抗體的滴度和亞型。圖8A顯示IgG1抗體的滴度，而圖8B顯示IgG2a抗體的滴度。圖9A-C顯示了用重組單一表位(圖9B)或rME/D(圖9C)免疫BALB/cByJ小鼠時(shí)其記憶脾細(xì)胞的IFN-γ分泌。圖9A顯示用對照刺激后脾細(xì)胞的IFN-γ分泌。圖10A和B顯示了用rME/A、rME/B或rME/D體外刺激后人PBMC的IFN-γ分泌(圖10A)和增殖反應(yīng)(圖10B)。圖11A和B顯示了用八種重組單一表位體外刺激后人PBMC的IFN-γ分泌(圖11A)和增殖反應(yīng)(圖11B)。發(fā)明詳述如上所述，本發(fā)明一般涉及預(yù)防和治療疾病(包括感染性疾病和某些免疫疾病以及癌癥)的組合物和方法。這樣的疾病的實(shí)例包括但不限于分枝桿菌感染，包括結(jié)核分枝桿菌感染和鳥分枝桿菌感染；以及刺激Th1免疫應(yīng)答有益的疾病，包括(但不限于)牛皮癬和過敏性鼻炎。某些病原體(如結(jié)核分枝桿菌)以及某些癌癥可被稱之為細(xì)胞介導(dǎo)免疫的CD4+T細(xì)胞控制的免疫攻擊有效遏制。其它病原體如脊髓灰質(zhì)炎病毒還需要B細(xì)胞產(chǎn)生的抗體來遏制。免疫攻擊的這些不同類型(T細(xì)胞或B細(xì)胞)由不同的CD4+T細(xì)胞亞群控制，通常稱之為Th1細(xì)胞和Th2細(xì)胞。這兩種類型的Th細(xì)胞亞群已經(jīng)在鼠類模型中被充分地特征鑒定過，并由它們在激活時(shí)釋放的細(xì)胞因子定義。Th1亞群分泌IL-2、IFN-γ和腫瘤壞死因子，并介導(dǎo)巨噬細(xì)胞活化和延遲型超敏反應(yīng)。Th2亞群釋放刺激B細(xì)胞活化的IL-4、IL-5、IL-6和IL-10。Th1亞群和Th2亞群相互抑制，使得IL-4抑制Th1型應(yīng)答，而IFN-γ抑制Th2型應(yīng)答。在人類發(fā)現(xiàn)了相似的Th1亞群和Th2亞群，它們釋放的細(xì)胞因子與在鼠類模型觀察到的相同。Th1型免疫應(yīng)答增強(qiáng)是許多疾病病況逆轉(zhuǎn)的決定因素，所述疾病包括呼吸系統(tǒng)疾病，諸如結(jié)核病、肉樣瘤病、哮喘、過敏性鼻炎和肺癌。一方面，本發(fā)明的組合物包括含有至少一種母牛分枝桿菌抗原的免疫原性表位的多肽或其變異體。在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明多肽包含SEQIDNO61-77所提供的序列。這樣的多肽刺激接觸了結(jié)核分枝桿菌的個(gè)體的T細(xì)胞增殖和/或分泌γ干擾素。本文使用的術(shù)語“多肽”包括任意長度的氨基酸鏈，包括全長蛋白(即抗原)，其中所述氨基酸殘基通過共價(jià)肽鍵連接。因此，含有以上一種抗原的免疫原性表位的多肽可完全由所述免疫原性表位組成，或者可包含另外的序列。所述另外的序列可得自天然母牛分枝桿菌抗原或者可以是異源性序列，而且所述序列可以(但不需要)是免疫原性序列。本文使用的“免疫原性”是指激發(fā)患者(如人)或生物樣品免疫應(yīng)答的能力。具體而言，免疫原性表位是能夠刺激生物樣品細(xì)胞增殖、產(chǎn)生IL-12或產(chǎn)生γ干擾素的多肽部分，其中所述生物樣品含有一種或多種以下細(xì)胞得自分枝桿菌免疫個(gè)體的T細(xì)胞、NK細(xì)胞、B細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。一般來說，使用以下實(shí)施例1詳述的測定技術(shù)檢測，免疫原性表位刺激分枝桿菌免疫個(gè)體PBMC增殖的水平比在對照PBMC中觀察到的至少高2倍?；蛘?，或還同時(shí)，根據(jù)實(shí)施例1詳述的ELISA測定OD增加至少2倍的檢測結(jié)果，免疫原性表位刺激分枝桿菌免疫個(gè)體的PBMC產(chǎn)生γ干擾素的水平比在對照細(xì)胞觀察到的至少高2倍。分枝桿菌免疫個(gè)體被認(rèn)為是可利用已建立的針對結(jié)核分枝桿菌、環(huán)境腐生物或BCG的有效T細(xì)胞應(yīng)答抵抗分枝桿菌感染發(fā)生的個(gè)體。這樣的個(gè)體可根據(jù)對結(jié)核蛋白(PPD)的強(qiáng)陽性(即大于約10mm直徑硬結(jié))皮內(nèi)皮試反應(yīng)以及沒有結(jié)核感染的任何癥狀來鑒定。含一種或多種母牛分枝桿菌抗原的至少一種免疫原性表位的多肽一般可用于在患者中誘導(dǎo)抗結(jié)核病的保護(hù)性免疫和/或在患者中刺激免疫應(yīng)答。另一方面，本發(fā)明的組合物包含編碼母牛分枝桿菌抗原的免疫原性表位的分離多核苷酸。在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明多核苷酸包含SEQIDNO5-21的序列。還提供本發(fā)明分離多核苷酸的互補(bǔ)物、反向互補(bǔ)物和反向序列以及它們的變異體。本發(fā)明還包括與所公開的序列不同但由于遺傳密碼簡并性而與本文公開的多核苷酸序列編碼相同多肽的多核苷酸序列。本文使用的術(shù)語“多核苷酸”是指單鏈或雙鏈的脫氧核糖核苷酸堿基或核糖核苷酸堿基的聚合物，包括有義鏈和反義鏈的DNA分子和相應(yīng)的RNA分子(包括HnRNA和mRNA分子)，并且包括cDNA、基因組DNA和重組DNA以及全部或部分合成的多核苷酸。HnRNA分子包含內(nèi)含子并以通常的一對一方式和DNA分子相對應(yīng)。mRNA分子對應(yīng)于HnRNA分子和/或已去除所述內(nèi)含子的DNA分子。多核苷酸可由完整基因組成，或由其任一部分組成。有效的反義多核苷酸可以包含對應(yīng)多核苷酸的片段，因此“多核苷酸”的定義包括所有這些有效反義片段。反義多核苷酸以及涉及反義多核苷酸的技術(shù)是本領(lǐng)域眾所周知的，描述于例如Robinson-Benion等，“反義技術(shù)”，MethodsinEnzymol.254363-375，1995；和Kawasaki等，Artific.Organs20836-848，1996。以下的實(shí)例最清晰地闡述了本文使用的術(shù)語“互補(bǔ)物”、“反向互補(bǔ)物”和“反向序列”的定義。對于序列5′AGGACC3′，互補(bǔ)物、反向互補(bǔ)物和反向序列如下互補(bǔ)物3′TCCTGG5′反向互補(bǔ)物3′GGTCCT5′反向序列5′CCAGGA3′。和通常本領(lǐng)域使用這些術(shù)語一樣，本文描述的所有多核苷酸和多肽都是分離純化的。本發(fā)明的組合物和方法還包括上述多肽和多核苷酸的變異體。變異體可以是天然存在的等位基因變異體，或者可以是非天然存在的變異體。本文使用的術(shù)語“變異體”包括與本發(fā)明的序列具有至少約30％、更優(yōu)選至少約50％、再更優(yōu)選至少約75％和最優(yōu)選至少約90％的相同殘基(或核苷酸或氨基酸)的任一序列。通過對兩個(gè)比較序列進(jìn)行序列對比，測定對比部分的相同殘基數(shù)目，將該數(shù)除以本發(fā)明(或查詢)序列的殘基總數(shù)，并將結(jié)果乘以100，可測得相同殘基的百分率?？梢詫Χ嗪塑账峄蚨嚯男蛄羞M(jìn)行序列對比，并可使用可公開得到的計(jì)算機(jī)算法測定具體區(qū)域中相對于另一種多核苷酸的相同核苷酸百分率。兩種對比和鑒定多核苷酸序列相似性的典型算法是BLASTN算法和FASTA算法?？梢允褂肂LASTP和FASTX算法檢測多肽序列的相似性。BLASTN和BLASTP軟件都可在NCBI匿名FTP服務(wù)器(ftp://ncbi.nlm.nih.gov)上的/blast/executables/之下獲得。BLASTN算法2.0.6版[9-16-1998]優(yōu)選用于測定本發(fā)明的變異體，該算法所設(shè)置的默認(rèn)參數(shù)描述于文件并隨該算法配送。BLAST算法家族(包括BLASTN和BLASTP)的使用描述于URL為http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/newblast.html的NCBIWeb站點(diǎn)和出版物Altschul，StephenF.等，“空位BLAST和PSI-BLAST新一代蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫檢索程序”，NucleicAcidsRes.253389-3402，1997。計(jì)算機(jī)算法FASTA可在Internet上的ftp站點(diǎn)ftp://ftp.virginia.edu/pub/fasta/獲得。1998年8月的3.1t11版的FASTA和FASTX算法優(yōu)選用于測定本發(fā)明的變異體，該算法所設(shè)置的默認(rèn)參數(shù)描述于文件并隨該算法配送。FASTA算法的使用描述于例如Pearson，WR和Lipman，DJ，Proc.Natl.Acad.Sci.USA852444-2448，1998；和Pearson，WR.，MethodsinEnzymol18363-98，1990。FASTX算法的使用描述于例如Pearson，WR等，Genomics4624-36，1997。以下的工作參數(shù)(提供E值和同一性百分率)優(yōu)選用于使用BLASTN測定對比和相似性Unix運(yùn)行命令blastall-pblastn-dembldb-e10-G0-E0-r1-v30-b30-iqueryseq-0results；而參數(shù)默認(rèn)值是-p程序名稱[String]；-d數(shù)據(jù)庫[String]；-e預(yù)期值(E)[Real]；-G空位開放(open)罰分(0調(diào)用默認(rèn)參數(shù))[Integer]；-E空位延長罰分(0調(diào)用默認(rèn)參數(shù))[Integer]；-r核苷酸匹配的獎(jiǎng)勵(lì)(僅對于BLASTN)[Integer]；-v單行描述的數(shù)目(V)[Integer]；-b顯示對比數(shù)目(B)[Integer]；-i查詢文件[FileIn]；-oBLAST報(bào)告輸出文件[FileOut]任選。對于BLASTP，優(yōu)選使用以下的工作參數(shù)blastall-pblastp-dswissprotdb-e10-G0-E0-v30-b30-iqueryseq-0results；-p程序名稱[String]；-d數(shù)據(jù)庫[String]；-e預(yù)期值(E)[Real]；-G空位開放罰分(0調(diào)用默認(rèn)參數(shù))[Integer]；-E空位延長罰分(0調(diào)用默認(rèn)參數(shù))[Integer]；-v單行描述的數(shù)目(V)[Integer]；-b顯示的對比數(shù)目(B)[Integer]；-I查詢文件[FileIn]；-oBLAST報(bào)告輸出文件[FileOut]任選。對于使用FASTX測定對比和相似性，優(yōu)選以下的UNIX命令fastx-E10-b30-Hqueryseq＞output，而對于FASTA，優(yōu)選以下的UNIX命令fasta-E2-b30-H-nqueryseq＞output。由BLASTN、BLASTP、FASTA、FASTX或相似算法獲得的查詢序列對一個(gè)或多個(gè)數(shù)據(jù)庫序列的“命中率”對比和鑒定序列的相似部分。按照相似度和序列重疊長度順序排列命中率。對數(shù)據(jù)庫序列的命中率通常代表僅在查詢序列的一部分序列長度上的重疊。BLASTN和FASTA算法還產(chǎn)生序列對比的“預(yù)期”值。預(yù)期值(E)表示在檢索一定大小的數(shù)據(jù)庫時(shí)，對于一定數(shù)目的連續(xù)序列，人們“預(yù)期”可隨機(jī)發(fā)現(xiàn)的命中序列的數(shù)目。預(yù)期值被用做測定對數(shù)據(jù)庫(諸如優(yōu)選的EMBL數(shù)據(jù)庫)的命中率是否代表真實(shí)相似性的重要閾值。例如，分配給命中序列的E值為0.1，其含義可解釋為在一個(gè)EMBL數(shù)據(jù)庫大小的數(shù)據(jù)庫中，對于具有相似打分(score)的序列的對比部分，人們預(yù)期僅隨機(jī)可獲得0.1匹配序列。根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)，所述序列的對比和匹配部分相同的概率為90％。對于在對比和匹配部分E值為0.01或0.01以下的序列，使用BLASTN或FASTA算法在EMBL數(shù)據(jù)庫中隨機(jī)發(fā)現(xiàn)一個(gè)匹配序列的概率為1％或更小。按照一個(gè)實(shí)施方案，相對于本發(fā)明的每個(gè)多核苷酸的“變異”多核苷酸最好含有這樣的序列其與本發(fā)明的多核苷酸相比，含有的核酸數(shù)目與本發(fā)明的每個(gè)多核苷酸都相同或略多，并且產(chǎn)生的E值為0.01或0.01以下。即變異體多核苷酸是任意的以下序列其與本發(fā)明的多核苷酸相同的概率至少為99％，使用設(shè)定為默認(rèn)參數(shù)的BLASTN或FASTA算法檢測到其E值為0.01或0.01以下。按照一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，變異體多核苷酸是其核酸數(shù)目與本發(fā)明的多核苷酸相同或略多的序列，它與本發(fā)明的多核苷酸相同的概率至少為99％，使用設(shè)定為默認(rèn)參數(shù)的BLASTN或FASTA算法檢測到其E值為0.01或0.01以下。在某些實(shí)施方案中，變異體多核苷酸序列在嚴(yán)格條件下與所述多核苷酸序列雜交。本文使用的“嚴(yán)格條件”是指在6XSSC、0.2％SDS溶液中預(yù)清洗；在65℃、6XSSC、0.2％SDS下過夜雜交；然后在1XSSC、0.1％SDS中于65℃進(jìn)行兩次清洗，每次30分鐘，并在0.2XSSC、0.1％SDS中于65℃進(jìn)行兩次清洗，每次30分鐘。在其它實(shí)施方案中，所述多核苷酸和/或多肽的變異體可分離自各種分枝桿菌。在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽變異體與所述多肽具有相似的活性，這可通過例如按下文詳述檢測它們刺激人PBMC細(xì)胞增殖和/或產(chǎn)生細(xì)胞因子或γ干擾素的能力來評(píng)定。本發(fā)明的多肽可連接至蛋白N末端的信號(hào)(或前導(dǎo))序列，所述序列共翻譯或翻譯后控制轉(zhuǎn)移所述蛋白。所述多肽還可以連接至接頭或其它序列，以易于合成、純化或鑒定所述多肽(例如聚-His)，或增強(qiáng)所述多肽與固相支持物的結(jié)合。例如，多肽可連接至免疫球蛋白Fc區(qū)。本文使用的以特定“x”值為基準(zhǔn)的術(shù)語“x聚合物”是指包含鑒定為SEQIDNO5-21的任一種多核苷酸的至少特定數(shù)目(“x”)的連續(xù)殘基的多核苷酸。x值可以根據(jù)具體序列為約20至約600。本發(fā)明的多核苷酸包括含鑒定為SEQIDNO5-21的任一種多核苷酸或其變異體的至少特定數(shù)目的連續(xù)殘基的多核苷酸(x-聚合物)。按照優(yōu)選的實(shí)施方案，x值優(yōu)選至少20，更優(yōu)選至少40，再更優(yōu)選至少60，而最優(yōu)選至少80。因此，本發(fā)明的多核苷酸包括含鑒定為SEQIDNO5-21的多核苷酸或其中一種多核苷酸的變異體的20聚合物、40聚合物、60聚合物、80聚合物、100聚合物、120聚合物、150聚合物、180聚合物、220聚合物、250聚合物或300聚合物、400聚合物、500聚合物或600聚合物的多核苷酸。一般而言，本發(fā)明的多肽和多核苷酸可使用眾多方法中的任一種制備。例如，可以通過將編碼多肽的多核苷酸插入到表達(dá)載體中并在合適宿主中表達(dá)多肽而重組產(chǎn)生所述多肽。可以使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的各種表達(dá)載體中的任一種。表達(dá)可以在任何已經(jīng)用包含編碼重組多肽的多核苷酸的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的合適宿主細(xì)胞中進(jìn)行。合適的宿主細(xì)胞包括原核細(xì)胞、酵母細(xì)胞和高等真核細(xì)胞。使用的宿主細(xì)胞優(yōu)選為大腸桿菌、分枝桿菌、昆蟲、酵母或哺乳動(dòng)物細(xì)胞系(諸如COS或CHO)。以此方式表達(dá)的多核苷酸可以編碼天然存在的抗原、其部分或其其它變異體?？砂匆韵聦?shí)施例1所述篩選母牛分枝桿菌基因組DNA文庫分離本發(fā)明的多核苷酸?；蛘撸赏ㄟ^在合適的母牛分枝桿菌cDNA或基因組DNA文庫中篩選與得自分離表位的氨基酸序列的簡并寡核苷酸雜交的DNA序列，獲得編碼母牛分枝桿菌表位的多核苷酸。可設(shè)計(jì)和合成合適的簡并寡核苷酸，并可如Sambrook等，MolecularCloningALaboratoryManual，CSHLPressColdSpringHarborNY，1989所述進(jìn)行所述篩選?？墒褂镁酆厦告湻磻?yīng)(PCR)，利用本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)由基因組DNA或cDNA或基因組DNA文庫分離核酸探針。然后可使用分離探針進(jìn)行文庫篩選。本文描述的表位具有誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的能力，而與制備方法無關(guān)。更具體地說，如上所述，所述表位能夠誘導(dǎo)得自分枝桿菌免疫個(gè)體的T細(xì)胞、NK細(xì)胞、B細(xì)胞或巨噬細(xì)胞增殖和/或產(chǎn)生細(xì)胞因子(例如產(chǎn)生γ干擾素和/或IL-12)。對用于評(píng)價(jià)針對表位的免疫應(yīng)答的細(xì)胞類型的選擇取決于需要的應(yīng)答。例如，可使用本領(lǐng)域眾所周知的方法制備包含得自分枝桿菌免疫個(gè)體的T細(xì)胞、NK細(xì)胞、B細(xì)胞和/或巨噬細(xì)胞的制備物，最容易評(píng)價(jià)IL-12產(chǎn)生。例如，可使用外周血單核細(xì)胞(PBMC)制備物，而不需要進(jìn)一步分離細(xì)胞組分。例如可使用密度離心通過FicollTM(WinthropLaboratories，NY)制備PBMC。用于本文所述測定的T細(xì)胞可直接由PBMC純化。或者，可使用具有抗分枝桿菌蛋白活性的富集T細(xì)胞系或具有抗各種分枝桿菌蛋白活性的T細(xì)胞克隆。例如，通過將分枝桿菌免疫個(gè)體的PBMC和分枝桿菌蛋白培養(yǎng)2-4周，可獲得所述T細(xì)胞克隆。這使得僅分枝桿菌蛋白特異性T細(xì)胞擴(kuò)增，產(chǎn)生僅由這樣的細(xì)胞組成的細(xì)胞系。然后克隆這些細(xì)胞，并使用本領(lǐng)域眾所周知的方法測試其與各種蛋白，以更精確地定義個(gè)體T細(xì)胞特異性。可使用例如以下描述的方法測定T細(xì)胞、NK細(xì)胞、B細(xì)胞或巨噬細(xì)胞增殖或產(chǎn)生細(xì)胞因子。在免疫原性表位中，可根據(jù)在上述測定中的應(yīng)答強(qiáng)度和觀察到應(yīng)答的個(gè)體百分率，區(qū)分具有卓越治療特性的本發(fā)明多肽和/或多核苷酸。另外，對于超過約25％的非分枝桿菌免疫個(gè)體的細(xì)胞，具有卓越治療特性的表位在體外不刺激細(xì)胞增殖或產(chǎn)生細(xì)胞因子，由此消除緣于分枝桿菌反應(yīng)型細(xì)胞的非特異性應(yīng)答。因此，誘導(dǎo)高百分率分枝桿菌免疫個(gè)體的T細(xì)胞、NK細(xì)胞、B細(xì)胞或巨噬細(xì)胞制備物應(yīng)答(對其它個(gè)體細(xì)胞制備物的應(yīng)答率低)的抗原具有卓越治療特性。具有卓越治療特性的表位的鑒定還可以根據(jù)其在作為疫苗給予時(shí)緩解實(shí)驗(yàn)動(dòng)物結(jié)核分枝桿菌或其它分枝桿菌感染的嚴(yán)重程度的能力來進(jìn)行。下文詳述用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的合適疫苗制備物。本發(fā)明多肽的各部分和其它變異體可以通過合成或重組方法獲得。使用本領(lǐng)域一般技術(shù)人員周知的技術(shù)可以產(chǎn)生少于約100個(gè)氨基酸通常少于約50個(gè)氨基酸的合成多肽。例如，可以使用任何市售的固相技術(shù)，如氨基酸連續(xù)加入至增長的氨基酸鏈的Merrifield固相合成法，合成所述多肽。參見Merrifield，J.Am.Chem.Soc.852149-2154，1963。自動(dòng)合成多肽的設(shè)備可向如PerkinElmer/AppliedBioSystems，Inc.(FosterCity，California)的供應(yīng)商購買，并可按照生產(chǎn)商的說明書操作?？梢允褂脴?biāo)準(zhǔn)誘變技術(shù)，如寡核苷酸定點(diǎn)特異性誘變，制備天然表位變異體。也可以使用允許制備截短多肽的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)除去DNA序列的若干部分。本發(fā)明還提供包含第一種和第二種本發(fā)明多肽的融合蛋白，或包含本發(fā)明多肽和已知結(jié)核分枝桿菌抗原(例如Andersen和Hansen，Infect.Immun.572481-2488，1989描述的38kDa抗原)的融合蛋白，以及所述融合蛋白的變異體。在相關(guān)方面，還提供包含第一種和第二種本發(fā)明多核苷酸的DNA構(gòu)建物。在以下的實(shí)施例4詳述包含本發(fā)明多個(gè)表位的構(gòu)建物的制備以及相應(yīng)重組蛋白的表達(dá)。一般來說，使用已知的重組DNA技術(shù)構(gòu)建編碼本發(fā)明融合蛋白的多核苷酸，以將分別編碼所述第一種和第二種本發(fā)明多肽的DNA序列裝配入合適的表達(dá)載體。用或不用肽接頭將編碼所述第一種多肽的DNA序列的3′末端連接至編碼所述第二種多肽的DNA序列的5′末端，使得所述序列的讀框協(xié)調(diào)允許mRNA將兩種DNA序列翻譯為單一的融合蛋白，此融合蛋白既保留了所述第一種多肽的生物活性，也保留了所述第二種多肽的生物活性?？梢允褂秒慕宇^序列，以足以確保每個(gè)多肽折疊成其二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)的距離分開所述第一種和第二種多肽。使用本領(lǐng)域眾所周知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將這樣的肽接頭序列加入到融合蛋白中?？筛鶕?jù)以下因素選擇合適的肽接頭序列(1)它們能夠采取柔性延伸構(gòu)象；(2)它們不能采取可作用于所述第一種和第二種多肽上的功能性表位的二級(jí)結(jié)構(gòu)；和(3)缺乏可與所述多肽功能性表位反應(yīng)的疏水或帶電殘基。優(yōu)選的肽接頭序列包括Gly、Asn和Ser殘基。在所述肽接頭序列中還可以使用其它接近中性的氨基酸，如Thr和Ala。可有效用作接頭的氨基酸序列包括Maratea等，Gene4039-46，1985；Murphy等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA838258-8262，1986；和美國專利第4,935,233號(hào)和4,751,180號(hào)描述的氨基酸序列。所述接頭序列的長度可為1至約50個(gè)氨基酸。當(dāng)所述第一種和第二種多肽具有可用于分隔功能結(jié)構(gòu)域并防止空間干擾的非必需N-末端氨基酸區(qū)時(shí)，不需要肽接頭序列。使用本領(lǐng)域一般技術(shù)人員已知的技術(shù)，將編碼融合蛋白的連接DNA序列克隆入合適的表達(dá)系統(tǒng)中。另一方面，本發(fā)明提供使用一種或多種本發(fā)明多肽或融合蛋白(或編碼所述多肽或融合蛋白的多核苷酸)在患者中誘導(dǎo)抗病(如結(jié)核病)保護(hù)性免疫的方法。本文使用的“患者”是指任何溫血?jiǎng)游?，?yōu)選為人?；颊呖苫加屑膊?，或者可以沒有可檢測的疾病或感染。換句話說，可誘導(dǎo)保護(hù)性免疫預(yù)防或治療疾病。在相關(guān)方面，可使用本發(fā)明的母牛分枝桿菌多核苷酸和多肽激活T細(xì)胞和NK細(xì)胞、刺激人PBMC產(chǎn)生細(xì)胞因子(特別是Th1型細(xì)胞因子)、產(chǎn)生抗表位抗體和/或誘導(dǎo)長期記憶細(xì)胞。為了在所述方法中使用，所述多肽、融合蛋白或多核苷酸一般存在于藥用組合物或疫苗中。藥用組合物可以包含一種或多種多肽以及一種生理學(xué)上可接受的載體，其中每種所述多肽都可以包含一種或多種上述序列(或其變異體)。疫苗可以包含一種或多種上述多肽和免疫刺激物，諸如所述多肽摻入到其中的佐劑或脂質(zhì)體。這樣的藥用組合物和疫苗還可以包含其它的分枝桿菌抗原，所述其它抗原加入到融合蛋白中或存在于單獨(dú)的多肽中。另一方面，本發(fā)明的疫苗可以含有編碼一種或多種上述多肽的多核苷酸，使得所述多肽可原位產(chǎn)生。在這樣的疫苗中，所述多核苷酸可以存在于本領(lǐng)域一般技術(shù)人員已知的各種傳遞系統(tǒng)的任一種中，包括核酸表達(dá)系統(tǒng)、細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)和病毒表達(dá)系統(tǒng)。合適的核酸表達(dá)系統(tǒng)包含在患者中表達(dá)必須的DNA/RNA序列(諸如合適的啟動(dòng)子信號(hào)和終止子信號(hào))。細(xì)菌傳遞系統(tǒng)包括給予在其細(xì)胞表面表達(dá)所述多肽的免疫原性表位的細(xì)菌(諸如卡介苗)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，可以使用病毒表達(dá)系統(tǒng)(例如痘苗病毒或其它痘病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒或腺病毒)引入所述DNA和/或RNA，所述系統(tǒng)可以包括使用非致病性病毒或缺陷型可復(fù)制病毒。將DNA和/或RNA加入到所述表達(dá)系統(tǒng)中的技術(shù)是本領(lǐng)域眾所周知的。所述DNA還可以是“裸”DNA，例如Ulmer等，Science2591745-1749，1993中的描述和Cohen，Science2591691-1692，1993的綜述。通過將裸DNA包被在有效轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞中的生物可降解珠上，可增加裸DNA的吸收。給予包含DNA和/或RNA的多核苷酸序列的方法包括在美國專利第5,580,859號(hào)和5,589,466號(hào)中公開的方法。如上所述的多核苷酸疫苗可與本發(fā)明的多肽或已知的分枝桿菌抗原(如上述的38kDa抗原)同時(shí)或序貫給予。例如，可在給予編碼本發(fā)明多肽的DNA后給予抗原，以便增強(qiáng)所述疫苗的保護(hù)性免疫效果。給予的途徑和頻率以及給予劑量在個(gè)體之間有所變化，可與目前牛分枝桿菌BCG免疫中使用的那些條件相同。一般而言，所述藥用組合物和疫苗可以通過注射(例如皮內(nèi)、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)或皮下)、鼻內(nèi)(例如通過吸入)或口服給予?？稍?-36周內(nèi)給予1至3劑。優(yōu)選以3-4個(gè)月間隔給予3劑，此后可定期進(jìn)行加強(qiáng)免疫接種。對于個(gè)別患者可采取備選方案。合適的劑量是當(dāng)如上所述給予時(shí)，多肽或多核苷酸的量能夠激發(fā)患者產(chǎn)生足以保護(hù)所述患者免受分枝桿菌感染至少1-2年的免疫應(yīng)答。一般來說，一劑含有的多肽量(或一劑多核苷酸原位產(chǎn)生的多肽量)為每kg宿主約1pg-約100mg，通常為每kg宿主約10pg-約1mg，優(yōu)選為每kg宿主約100pg-約1μg。合適的劑量范圍將根據(jù)所述患者的大小而有所變化，但通常為約0.1ml-約5ml。盡管可以在本發(fā)明的藥用組合物中使用本領(lǐng)域一般技術(shù)人員已知的任一合適載體，但載體的類型將根據(jù)給予方式而有所變化。對于胃腸外給予，諸如皮下注射，所述載體優(yōu)選包括水、鹽水、醇、脂肪、蠟或緩沖液。對于口服給予，可以使用以上載體中的任一種或固體載體，如甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、滑石粉、纖維素、葡萄糖、蔗糖和碳酸鎂。還可以使用生物可降解微球(例如聚乳酸半乳糖苷)作為本發(fā)明藥用組合物的載體。合適的生物可降解微球公開于例如美國專利第4,897,268號(hào)和第5,075,109號(hào)。在本發(fā)明的疫苗中可以使用各種免疫刺激物中的任一種，諸如佐劑，以非特異性增強(qiáng)免疫應(yīng)答。大多數(shù)佐劑包含用來避免抗原快速分解代謝的物質(zhì)(諸如氫氧化鋁或礦物油)和免疫應(yīng)答的非特異性刺激劑(諸如類脂A、百日咳桿菌(Bordetellapertussis)、結(jié)核分枝桿菌或以下論述的母牛分枝桿菌)。合適的佐劑可市售獲得，如弗氏不完全佐劑和弗氏完全佐劑(DifcoLaboratories，Detroit，MI)，以及Merck佐劑65(MerckandCompany，Inc.，Rahway，NJ)。其它合適的佐劑包括明礬、生物可降解微球、單磷酰脂A和QuilA。提供以下的實(shí)施例是起說明作用，而不是起限制作用。實(shí)施例1克隆和選擇免疫原性母牛分枝桿菌表位于37℃在培養(yǎng)基90(酵母提取物，2.5g/l；胰蛋白胨，5g/l；葡萄糖，1g/l)中培養(yǎng)母牛分枝桿菌(ATCC保藏號(hào)15483，Rockville，MD)4天。按照標(biāo)準(zhǔn)方法由這些細(xì)胞分離基因組DNA，然后在產(chǎn)生約0.25kbDNA片段的條件下用限制性內(nèi)切核酸酶Sau3A消化。使用QIAquickPCR純化系統(tǒng)(Qiagen，Venlo，TheNetherlands)純化所述片段。為表達(dá)三種不同讀框的克隆母牛分枝桿菌DNA，通過插入用三種不同3′引物擴(kuò)增的人生長激素信號(hào)肽(以促進(jìn)重組蛋白分泌)修飾pcDNA3表達(dá)載體(Invitrogen，Carlsbad，CA)。這些引物允許將1個(gè)或2個(gè)額外堿基對插入到PCR產(chǎn)物中，以移動(dòng)所表達(dá)多肽的讀框。所述引物為AD105(人生長激素5′引物；SEQIDNO1)和三種人生長激素(hGH)3′引物AD106、AD107和AD108(分別為SEQIDNO2-4)。通過用限制性內(nèi)切核酸酶BsgII消化由這些PCR片段中除去前導(dǎo)序列切割位點(diǎn)下游的大部分hGH序列。然后將hGHPCR片段克隆入pcDNA3表達(dá)載體中，然后用限制性內(nèi)切核酸酶HindIII和BamHI消化。SEQIDNO5-7給出了插入片段的核苷酸序列，SEQIDNO61-63分別提供相應(yīng)的氨基酸序列。通過將如上所述制備的0.25kb母牛分枝桿菌PCR片段克隆入嵌合pcDNA3/人生長激素載體(pcDNA3-hGH1′、pcDNA3-hGH2′和pcDNA3-hGH3′)的BamHI克隆位點(diǎn)，構(gòu)建三種表達(dá)文庫(三個(gè)讀框的各個(gè)文庫)。用所述文庫構(gòu)建物轉(zhuǎn)化的細(xì)菌菌落制備影印板(replicaliftmasterplate)并儲(chǔ)存。將由這些菌落制備的質(zhì)粒DNA分為500個(gè)庫，每庫含有40-50個(gè)質(zhì)粒DNA。使用脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺試劑(BRLLiftTechnologies，GaithersburgMD)將所述DNA轉(zhuǎn)染入COS7細(xì)胞中，并利用脾細(xì)胞測定檢測每組產(chǎn)物的免疫原性特性，其中如下所述用ELISA測定熱滅活母牛分枝桿菌首次激發(fā)免疫小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)物產(chǎn)生IFN-γ。將激發(fā)免疫應(yīng)答(以脾細(xì)胞測定中增加IFN-γ產(chǎn)生的能力測定)的重組多肽編碼質(zhì)粒庫再細(xì)分為更小的庫，每個(gè)庫含有10個(gè)質(zhì)粒，再將這些庫轉(zhuǎn)染入COS7細(xì)胞中。如上所述對這些細(xì)胞的培養(yǎng)上清液進(jìn)行脾細(xì)胞測定。三輪篩選之后，鑒定出120個(gè)編碼重組多肽的質(zhì)粒，所述重組多肽刺激熱滅活母牛分枝桿菌免疫小鼠脾細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ。使用另外兩種測定篩選用這些質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的120個(gè)COS7細(xì)胞培養(yǎng)上清液，所述兩個(gè)測定即小鼠記憶測定和人外周血單核細(xì)胞(PBMC)測定。在小鼠長期記憶測定中，用亞致死劑量的104菌落形成單位(CFU)結(jié)核分枝桿菌注射小鼠。4周后，用抗生素再治療小鼠4周，以治愈小鼠的結(jié)核分枝桿菌感染，接著是4周的靜止期。第二次注射活結(jié)核分枝桿菌(5×105CFU)4天后，使用上述脾細(xì)胞測定檢測質(zhì)粒產(chǎn)物的免疫原性。在PBMC測定中，以其誘導(dǎo)分枝桿菌免疫人供體外周血細(xì)胞T細(xì)胞增殖和產(chǎn)生IFN-γ的能力篩選120個(gè)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染COS7細(xì)胞培養(yǎng)上清液。已知這些供體為PPD(結(jié)核分枝桿菌的純化蛋白衍生物)陽性，證實(shí)其T細(xì)胞在PPD作用下發(fā)生增殖并產(chǎn)生IFN-γ。在含補(bǔ)加10％(v/v)自體血清、青霉素(60μg/ml)、鏈霉素(100μg/ml)和谷胺酰胺(2mM)的RPMI1640的培養(yǎng)基中培養(yǎng)供體PBMC和COS7培養(yǎng)上清液。3天后，由每孔中取出50μl培養(yǎng)基，如下所述測定IFN-γ水平。再培養(yǎng)平板4天，然后用1μCi/孔的氚化胸苷脈沖處理18小時(shí)，收獲細(xì)胞并使用閃爍計(jì)數(shù)器測定氚攝入。在兩個(gè)復(fù)份測定中刺激增殖的水平比在單獨(dú)培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞觀測到的增殖高兩倍的上清液判為陽生。如下使用酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)檢測IFN-γ。通過將各孔與1μg/ml針對人IFN-γ的小鼠單克隆抗體(Endogen，Wobural，MA)磷酸緩沖鹽水(PBS)溶液于4℃溫育4小時(shí)，使所述抗體包被ELISA板。在室溫下用含0.2％Tween20的PBS封閉各孔1小時(shí)。然后在PBS/0.2％Tween20中清洗所述板4次，并在ELISA板中以培養(yǎng)基1∶2稀釋樣品，于室溫下溫育過夜。再清洗所述板，向每孔中加入在PBS中稀釋至1μg/ml的生物素化多克隆兔抗人IFN-γ血清(Endogen)。然后于室溫下溫育所述板1小時(shí)，清洗并加入在PBS中以1∶4,000稀釋的偶合辣根過氧化物酶的抗生物素蛋白A(VectorLaboratories，Burlingame，CA)。再于室溫溫育1小時(shí)后，清洗板并加入鄰苯二胺(OPD)底物。10分鐘后用10％(v/v)HCl終止反應(yīng)。檢測490nm的光密度(OD)。在兩個(gè)復(fù)份測定中OD高于單獨(dú)培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞的平均OD兩倍的培養(yǎng)上清液判為陽性。根據(jù)這兩個(gè)測定的結(jié)果鑒定出編碼含免疫原性決定簇或表位的重組多肽的59個(gè)質(zhì)粒。發(fā)現(xiàn)這些表位激發(fā)小鼠和人免疫應(yīng)答，并與誘導(dǎo)長期應(yīng)答的結(jié)核分枝桿菌免疫原性決定簇交叉反應(yīng)。測試了這些質(zhì)粒在如下的結(jié)核病小鼠模型中誘導(dǎo)保護(hù)性免疫的能力。在麻醉小鼠的脛骨前肌IM注射每種質(zhì)粒(100μgDNA)，間隔2周注射三次。9周后，用結(jié)核分枝桿菌(5×105CFU)攻擊小鼠。在第12周制備肺和脾的器官勻漿，并在補(bǔ)加油酸-白蛋白-葡萄糖-過氧化氫酶(OADC)的7H9培養(yǎng)基上平板培養(yǎng)，以測定每種勻漿存在的CFU數(shù)。溫育兩周后記錄結(jié)果。使用以上描述的方法選擇8個(gè)含免疫原性表位的質(zhì)粒。在這些構(gòu)建物中鑒定出推定的可讀框(ORF)后，如上所述將僅含有ORF部分的母牛分枝桿菌片段亞克隆入pcDNA3-hGH′中。這些質(zhì)粒稱為DNA5、DNA9、DNA26、DNA27、DNA29、DNA37、DNA44和DNA45。在DNA9中鑒定出三種稱為A、B和C的ORF?？勺x框B和C為反向，廢棄。單獨(dú)克隆ORFA，獲得的質(zhì)粒叫做DNA9A。SEQIDNO13-21分別給出了所測得的DNA5、DNA9A、DNA26、DNA27、DNA29、DNA37、DNA42、DNA44和DNA45插入片段的基因組DNA序列，SEQIDNO69-77分別提供了相應(yīng)ORF的預(yù)期氨基酸序列。在質(zhì)粒DNA5和DNA27的插入片段中鑒定出一個(gè)以上的表位。這些表位通過克隆不能分開，在所有的測定中測試均為多表位。SEQIDNO8-12分別給出了DNA5的表位1、表位2和表位3以及DNA27的表位1和表位2的測定基因組DNA序列，SEQIDNO64-68分別提供了相應(yīng)的預(yù)期氨基酸序列。使用FASTA計(jì)算機(jī)算法對比測定的表位DNA序列和EMBLDNA數(shù)據(jù)庫中的序列。使用FASTX計(jì)算機(jī)算法對比相應(yīng)的預(yù)期蛋白序列(6個(gè)讀框的每一個(gè)中的DNA翻譯的蛋白)和SwissProt數(shù)據(jù)庫中的序列。1999年3月21日比較SEQIDNO8-12提供的DNA序列和EMBLDNA數(shù)據(jù)庫中的序列(使用FASTA)，并比較SEQIDNO64-77提供的氨基酸序列與SwissProt數(shù)據(jù)庫中的序列(使用FASTX)。使用FASTX如上所述測定發(fā)現(xiàn)，DNA5表位2、DNA27表位1、DNA9A、DNA29、DNA37、DNA44和DNA45的預(yù)期氨基酸序列(分別由SEQIDNO65、67、70、73、74、76和77提供)與SwissProt數(shù)據(jù)庫中的序列的同一性小于50％。使用FASTX如上所述測定發(fā)現(xiàn)，DNA5表位1和3的預(yù)期氨基酸序列(分別由SEQIDNO64和66提供)與SwissProt數(shù)據(jù)庫中的序列的同一性小于75％。未發(fā)現(xiàn)與DNA27表位2和DNA26的預(yù)期氨基酸序列(分別由SEQIDNO68和71提供)匹配的序列。以下的表1顯示了如上所述使用FASTX比較本發(fā)明的氨基酸序列與SwissProt數(shù)據(jù)庫中的序列的結(jié)果，其中“相同殘基數(shù)”為對比部分的相同殘基數(shù)。表1實(shí)施例2在原核細(xì)胞和真核細(xì)胞中表達(dá)重組表位將表位DNA亞克隆入載體中，以在細(xì)菌和真核細(xì)胞中表達(dá)多肽。細(xì)菌表達(dá)載體是改良型pET16載體(Novagen，Madison，WI)。除了DNA9之外，所有質(zhì)粒的插入片段都用引物AD136和AD133(分別為SEQIDNO22和23)擴(kuò)增，并通過平端連接入EcoRI消化并用DNA聚合酶合酶PfuI(Stratagene，LaJolla，CA)末端補(bǔ)平的pET16載體中進(jìn)行克隆。DNA9A的插入片段用AD250和AD251(分別為SEQIDNO24和25)擴(kuò)增，并如上所述克隆入pET16載體中。為在真核細(xì)胞中表達(dá)所述多肽，修飾pcDNA3載體(Invitrogen)，以在克隆位點(diǎn)的3′末端包括一個(gè)組氨酸標(biāo)記。這可通過將雙鏈寡核苷酸AD180/AD181克隆入BamHI和EcoRI消化的pcDNA3中完成。SEQIDNO26和27分別給出了寡核苷酸AD180和AD181的序列。使用pcDNA3-hGH′構(gòu)建物作為DNA模板，用hGH特異性N端5′引物AD134(SEQIDNO28)和表位特異性3′末端引物擴(kuò)增質(zhì)粒插入片段。SEQIDNO29-37分別列出了表位特異性3′引物AD151(DNA5)、AD153(DNA26)、AD154(DNA27)、AD155(DNA29)、AD158(DNA42)、AD159(DNA44)、AD160(DNA45)、AD167(DNA37)和AD182(DNA9)的序列。再次修飾該載體，以去除hGH前導(dǎo)序列和表達(dá)序列之間的多余序列(42個(gè)核苷酸)，使得此構(gòu)建物中的hGH′序列被簡化為僅余前導(dǎo)序列和hGH序列的前5個(gè)N-末端氨基酸。使用pcDNA3-hGH3′構(gòu)建物作為模板，使用引物AD105(SEQIDNO1)和AD222(SEQIDNO38)經(jīng)PCR擴(kuò)增縮短融合配偶體。在HindIII和BamHI位點(diǎn)克隆入pcDNA3-His，獲得的構(gòu)建物稱為pcDNA3-hGHls/His。SEQIDNO39給出了克隆入pcDNA3-hGH-ls中的hGH-融合配偶體的測定DNA序列，對應(yīng)的氨基酸序列示于SEQIDNO78。使用引物AD233和AD226(分別為SEQIDNO40和41)通過PCR擴(kuò)增制備由DNA9A插入片段組成的構(gòu)建物。實(shí)施例3重組表位構(gòu)建物的免疫原性本實(shí)施例描述了用8個(gè)選擇的DNA或重組多肽形式的重組表位進(jìn)行免疫原性研究的結(jié)果。A.體外刺激人外周血單核細(xì)胞(PBMC)增殖和分泌γ干擾素(IFN-γ)將pET16細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的重組表位(1和10μg)與人PBMC于37℃培養(yǎng)。48小時(shí)后，按照標(biāo)準(zhǔn)方法用酶聯(lián)免疫測定(ELISA)檢測IFN-γ分泌。用氚化胸苷脈沖平行培養(yǎng)物，并使用DNA合成評(píng)價(jià)PBMC增殖。為了比較，還將細(xì)胞與結(jié)核分枝桿菌純化蛋白衍生物(PPD)一起培養(yǎng)，并將所述細(xì)胞與PBS一起培養(yǎng)作為陰性對照。如表2所示，所有的重組表位都能夠刺激至少某些PBMC樣品產(chǎn)生IFN-γ。在所測試的12個(gè)PBMC樣品中，10個(gè)樣品為PPD陽性，即這些樣品的PBMC當(dāng)與PPD培養(yǎng)時(shí)產(chǎn)生IFN-γ，而2個(gè)樣品為PPD陰性。當(dāng)產(chǎn)生的IFN-γ量至少比PBS對照樣品產(chǎn)生的IFN-γ高3倍時(shí)認(rèn)為PBMC反應(yīng)為陽性。重組表位5(對應(yīng)于DNA5)和44(對應(yīng)于DNA44)刺激100％的PPD+樣品產(chǎn)生IFN-γ。重組表位27(對應(yīng)于DNA27)刺激80％的PPD+樣品產(chǎn)生IFN-γ。重組表位26和37(分別對應(yīng)于DNA26和DNA37)刺激70％的PPD+樣品產(chǎn)生IFN-γ，而表位45(對應(yīng)于DNA45)刺激20％的PPD+PBMC樣品。PPD-PBMC樣品對任何重組表位均沒有明顯反應(yīng)。這證明所述表位在人體內(nèi)具有免疫原性，并觸發(fā)預(yù)先接觸分枝桿菌的供體樣品的回憶反應(yīng)。表2重組表位刺激人PBMC產(chǎn)生IFN-γ*結(jié)果以ngIFN-γ/ml表示。由人PBMC樣品對PPD和重組表位二者的增殖反應(yīng)進(jìn)一步證明了所述表位對人的免疫原性。以刺激指數(shù)表示所述重組表位刺激PBMC增殖的能力。當(dāng)增殖刺激物比僅有培養(yǎng)基對照產(chǎn)生的平均背景增殖高5倍時(shí)，則認(rèn)為增殖刺激物陽性。如表3所示，發(fā)現(xiàn)所有的重組表位都具有刺激至少某些人PBMC樣品的PBMC增殖的能力。重組表位26和27刺激92％的所述樣品的PBMC增殖，而重組表位5、37和44對83％的所述樣品刺激增殖。表位45對17％的所述樣品刺激PBMC增殖。PPD對PBMC的刺激作用為83％。表3對PBMC增殖的刺激作用*用刺激指數(shù)表示人PBMC增殖的結(jié)果。B.用DNA表位免疫小鼠在注射pcDNA-hGH′/His或pcDNA3-hGHls/His構(gòu)建物的8個(gè)重組表位的編碼DNA之后，在BALB/cByJ小鼠中誘導(dǎo)抗隨后的結(jié)核分枝桿菌感染的保護(hù)性免疫。在隨后用結(jié)核分枝桿菌感染后觀察保護(hù)性免疫誘導(dǎo)，當(dāng)與未免疫對照小鼠的平均CFU相比，肺勻漿CFU平均下降0.5log時(shí)，則認(rèn)為誘導(dǎo)的保護(hù)性免疫為陽性。沒有插入片段的質(zhì)粒用做對照。還將表位DNA免疫后的CFU減少與已知的牛分枝桿菌BCG的免疫原性進(jìn)行了比較。結(jié)果清楚顯示，所有測試小鼠的CFU均減少，提示所述重組表位DNA誘導(dǎo)保護(hù)性免疫。在6個(gè)組中，CFU下降超過50％，3個(gè)組的CFU下降與注射牛分枝桿菌BCG誘導(dǎo)的CFU下降相當(dāng)。表4通過用8個(gè)pcDNA-hGH′/His或pcDNA3-hGHls/His構(gòu)建物遺傳免疫小鼠誘導(dǎo)保護(hù)性免疫如下評(píng)價(jià)用8個(gè)pcDNA-hGH′/His或pcDNA3-hGHls/His構(gòu)建物遺傳免疫時(shí)誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)、細(xì)胞因子(IFN-γ、IL-4、IL-6和IL-10)以及增殖和抗體反應(yīng)。CTL測定使用MHC單倍型匹配靶細(xì)胞BALB-3T3(ATCC保藏號(hào)CRL-163，美國典型培養(yǎng)物保藏中心，Manassas，VA)，按照標(biāo)準(zhǔn)兩步法檢測DNA免疫BALB/cByJ小鼠脾細(xì)胞的溶細(xì)胞(CTL)活性。通過用8個(gè)pcDNA-hGH′/His或pcDNA3-hGHls/His表位DNA構(gòu)建物轉(zhuǎn)染BALB/3T3細(xì)胞，制備靶細(xì)胞。通過遺傳霉素選擇(G418；GibcoBRLLifeTechnologies)產(chǎn)生穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系，并通過有限稀釋分離單個(gè)細(xì)胞。使用引物AD105和AD181(分別為SEQIDNO1和27)通過RT-PCR選擇表達(dá)表位的克隆。在用匹配表位DNA轉(zhuǎn)染的絲裂霉素處理BALB-3T3細(xì)胞存在下，在補(bǔ)充10％FCS的cDMEM中培養(yǎng)DNA免疫小鼠脾細(xì)胞，以體外再刺激細(xì)胞毒性T細(xì)胞。于37℃在10％CO2下溫育培養(yǎng)物6天。通過溫育每種刺激細(xì)胞培養(yǎng)物的一部分和用51Cr脈沖的DNA匹配靶細(xì)胞，檢測細(xì)胞培養(yǎng)物上清液中釋放的51Cr，從而監(jiān)測溶細(xì)胞活性。如表5所示，檢測到4種測試DNA構(gòu)建物免疫小鼠的脾細(xì)胞具有特異性CTL活性。細(xì)胞因子和增殖反應(yīng)在用重組表位體外再刺激后評(píng)價(jià)DNA免疫BALB/cByJ小鼠脾細(xì)胞的細(xì)胞因子產(chǎn)生和增殖反應(yīng)。分別如上所述通過ELISA和3H-胸苷脈沖檢測細(xì)胞因子和增殖反應(yīng)。如表5所示，6個(gè)測試組的脾細(xì)胞產(chǎn)生Th1細(xì)胞因子IFN-γ。在刺激細(xì)胞的上清液中未檢測到Th2細(xì)胞因子(例如IL-4、IL-6和IL-10)。增殖反應(yīng)低，且只在兩個(gè)免疫組小鼠脾細(xì)胞中檢測到?？贵w反應(yīng)在注射最后一次DNA之后2周收集三種DNA免疫BALB/cByJ小鼠的血樣，并按照標(biāo)準(zhǔn)方法制備血清。用ELISA檢測抗表位抗體存在與否。用500ng重組表位包被微量滴定板各孔。通過將連續(xù)稀釋的血清加入到各孔中檢測抗體滴度。按照如上所述的ELISA方法檢測抗體滴度。如表5所示，在測試的兩個(gè)血樣中檢測到抗表位抗體。還使用標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行ELISA檢測，以測定所述抗體是屬于IgG1亞型還是屬于IgG2a亞型。結(jié)果顯示所述抗體屬于IgG2a亞型，IgG2a亞型是Th1抗體應(yīng)答的特征。在表5中概述的數(shù)據(jù)表明，用表位DNA免疫在小鼠中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。而且，在所述DNA免疫小鼠中檢測到的細(xì)胞應(yīng)答和體液應(yīng)答表明產(chǎn)生的是Th1型應(yīng)答。表5通過用8個(gè)pcDNA-hGH′/His或pcDNA3-hGHls/His構(gòu)建物遺傳免疫小鼠誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)、細(xì)胞因子反應(yīng)、增殖和抗體反應(yīng)*顯示的數(shù)據(jù)為三只小鼠脾細(xì)胞的裂解平均百分?jǐn)?shù)?？鄢藢φ占?xì)胞的非特異性裂解。**顯示的數(shù)據(jù)為由三只小鼠的三份脾細(xì)胞培養(yǎng)物獲得的平均IFN-γ(ng/ml)。對照細(xì)胞產(chǎn)生的背景IFN-γ為5-7ng/ml。***NT＝未測試。實(shí)施例4母牛分枝桿菌多表位構(gòu)建物的克隆策略裝配實(shí)施例4測定的8個(gè)表位，以形成多表位構(gòu)建物。具體來說，用含BglII5′-延伸和BamHI3′-延伸的引物擴(kuò)增所述DNA，隨后將其克隆入pcDNA3/hGHls/His的BamHI位點(diǎn)。引物為AD223、AD226、AD229、AD230、AD231、AD232、AD233、AD234、AD235、AD236、AD256、AD258、AD259、AD260、AD261和AD262(分別為SEQIDNO40-55)。首先將質(zhì)粒DNA9A的插入片段克隆入pcDNA3-hGHls/His的BamHI位點(diǎn)。僅在克隆接頭3′末端重構(gòu)所述載體的BamHI位點(diǎn)，并將DNA5以外的所有其它插入片段序貫克隆入相同的位點(diǎn)。最后通過平端連接將質(zhì)粒DNA5的插入片段克隆入pcDNA3/hGHls/His的末端補(bǔ)平BamHI位點(diǎn)。在此步驟之后，將各種組合的表位克隆入pcDNA3-hGHls/His載體。SEQIDNO56-58分別顯示了由8聚體多表位組成的三種多表位構(gòu)建物(稱為ME/A、ME/B和ME/D)的測定DNA序列，SEQIDNO79-81分別顯示了預(yù)期的相應(yīng)氨基酸序列。這些多表位構(gòu)建物中的每一個(gè)都包括所述8個(gè)表位中的每一個(gè)，但順序不同。為了在細(xì)菌中表達(dá)多表位重組蛋白，將質(zhì)粒ME/A、ME/B和ME/D的插入片段亞克隆入改良型表達(dá)載體pET16。所有的8聚體多表位DNA組合都分別在其5′和3′末端具有DNA9A和DNA5。使用引物AD272和AD273(分別為SEQIDNO59和60)擴(kuò)增質(zhì)粒插入片段，并通過平端連接將純化的擴(kuò)增片段克隆入EcoRI消化并用DNA聚合酶PfuI(Stratagene)補(bǔ)平末端的pET16載體。按照生產(chǎn)商的方法使用大腸桿菌宿主細(xì)胞表達(dá)重組蛋白并使用標(biāo)準(zhǔn)方法純化。實(shí)施例5用母牛分枝桿菌多表位構(gòu)建物免疫小鼠本實(shí)施例闡明對BALB/cByJ小鼠注射DNA或重組多肽形式的多表位構(gòu)建物后其抗隨后的結(jié)核分枝桿菌感染的保護(hù)性免疫。將BALB/cByJ小鼠分為三組，每組6只，接受不同處理。第1組小鼠用1劑500μg牛分枝桿菌BCG或PBS腹膜內(nèi)免疫。第2組小鼠用100μgME/DDNA或空載體DNA以三周的間隔在小鼠脛骨前肌肌內(nèi)免疫三次。第3組的小鼠用1或2劑的50μg在IFA中的重組ME/D或50μg在IFA中的對照蛋白以三周的間隔腹膜內(nèi)免疫。由非天然存在蛋白組成的對照蛋白GV14B得自分枝桿菌延伸因子G的母牛分枝桿菌同源物的編碼DNA，將其以反向克隆入pET16g3中。最后一次免疫后三周，用活結(jié)核分枝桿菌(5×105CFU)攻擊小鼠。再過三周后制備肺和脾的器官勻漿，并在補(bǔ)加油酸-白蛋白-葡萄糖-過氧化氫酶(OADC)的7H9培養(yǎng)基上平板培養(yǎng)，以測定每種勻漿中存在的CFU數(shù)。溫育兩周后記錄結(jié)果。在隨后用結(jié)核分枝桿菌感染后觀察保護(hù)性免疫誘導(dǎo)，當(dāng)與未免疫對照小鼠的平均CFU相比，肺和脾勻漿CFU平均下降0.5log時(shí)，則認(rèn)為誘導(dǎo)的保護(hù)性免疫為陽性。比較ME/DDNA或重組ME/D多肽免疫后的CFU降低與已知的牛分枝桿菌BCG的免疫原性。結(jié)果(圖1)顯示，ME/DDNA以及重組ME/D構(gòu)建物免疫小鼠的肺和脾的CFU減少。肺和脾二者CFU的下降高于用單一表位構(gòu)建物免疫免疫后的肺CFU下降(表4)，這證明了ME/DDNA和rME/D多肽的保護(hù)性免疫。實(shí)施例6母牛分枝桿菌多表位構(gòu)建物的免疫原性本實(shí)施例描述了用3種DNA或重組多肽形式的多表位構(gòu)建物進(jìn)行免疫原性研究的結(jié)果。A.重組多表位構(gòu)建物ME/A、ME/B和ME/D刺激小鼠淋巴結(jié)細(xì)胞體外增殖和分泌IFN-γ根據(jù)其誘導(dǎo)小鼠淋巴結(jié)細(xì)胞的T細(xì)胞增殖和IFN-γ的能力篩選重組多表位構(gòu)建物rME/A、rME/B和rME/D。為了進(jìn)行此測定，在每個(gè)爪墊用10μg以等體積IFA稀釋的重組多表位構(gòu)建物rME/A、rME/B和rME/C皮下免疫BALB/cByJ小鼠。對照組小鼠接受在IFA中的PBS。9天后處死小鼠，取出淋巴結(jié)。在0、0.125、0.25或0.5μMrME/A、rME/B或rME/D以及對照蛋白GV14B存在下，在含補(bǔ)加10％(v/v)自體血清、青霉素(60μg/ml)、鏈霉素(100μg/ml)和谷胺酰胺(2mM)的DMEM的培養(yǎng)基中培養(yǎng)淋巴結(jié)細(xì)胞。3天后，由每孔中取出50μl培養(yǎng)基，如上所述測定IFN-γ水平。再培養(yǎng)所述平板4天，然后用1μCi/孔的氚化胸苷脈沖18小時(shí)。收獲細(xì)胞并使用閃爍計(jì)數(shù)器測定氚攝取。將在兩個(gè)復(fù)份測定中刺激增殖的水平比單獨(dú)培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞觀察到的增殖高兩倍的上清液判為陽性。圖2A-D顯示了小鼠增殖實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。所有三種重組多表位構(gòu)建物均誘導(dǎo)免疫小鼠淋巴結(jié)細(xì)胞增殖反應(yīng)。三種重組多表位構(gòu)建物rME/A、rME/B和rME/D誘導(dǎo)的增殖水平(分別為圖2A、B和C)相似，表明所述構(gòu)建物抗原性相同。PBS免疫的對照小鼠未出現(xiàn)增殖反應(yīng)(圖2D)。圖3A-C分別顯示了刺激rME/A、rME/B或rME/D免疫小鼠淋巴結(jié)細(xì)胞分泌的IFN-γ水平。所有三種重組多表位構(gòu)建物均刺激淋巴結(jié)細(xì)胞分泌IFN-γ，rME/B的刺激水平最高(圖3B)。PBS刺激的對照小鼠細(xì)胞分泌不能檢測量的IFN-γ(圖3D)。這些結(jié)果表明，用所述多表位構(gòu)建物免疫在小鼠中誘導(dǎo)Th1免疫應(yīng)答。B.重組多表位構(gòu)建物ME/D和ME/DDNA體外刺激不同途徑免疫小鼠的淋巴結(jié)細(xì)胞和脾細(xì)胞增殖和分泌IFN-γ在這些實(shí)驗(yàn)中，用所述重組多表位構(gòu)建物rME/D或其DNA形式皮下、腹膜內(nèi)或肌內(nèi)免疫小鼠，刺激小鼠的淋巴結(jié)細(xì)胞或脾細(xì)胞以誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖和產(chǎn)生IFN-γ?；蛘哂靡粍┰贗FA中的10μgrME/D在每個(gè)爪墊皮下、或者用一劑在IFA中的50μgrME/D腹膜內(nèi)、或者用三劑100μgME/DDNA以三周間隔肌內(nèi)免疫BALB/cByJ小鼠。對照小鼠用PBS經(jīng)所述三種不同免疫途徑免疫。9天后處死經(jīng)皮下和腹膜內(nèi)途徑免疫的小鼠，取出淋巴結(jié)細(xì)胞(皮下免疫)或脾細(xì)胞(腹膜內(nèi)免疫)。在最后一次肌內(nèi)注射免疫后15天收獲免疫小鼠的脾細(xì)胞。如上所述測定這些細(xì)胞的增殖和產(chǎn)生的IFN-γ。圖4和圖5顯示了這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。在圖4A中，顯示了rME/D或ME/DDNA免疫小鼠的淋巴結(jié)細(xì)胞和脾細(xì)胞的特異性增殖反應(yīng)。相比之下，圖4B顯示了對照小鼠的低增殖。同樣，刺激rME/D或ME/DDNA免疫小鼠的淋巴結(jié)細(xì)胞和脾細(xì)胞分泌IFN-γ(圖5A)，而PBS免疫對照小鼠的淋巴結(jié)細(xì)胞和脾細(xì)胞分泌低水平的IFN-γ。C.多表位構(gòu)建物的單個(gè)表位體外刺激重組多表位構(gòu)建物rME/D或ME/DDNA經(jīng)不同途徑免疫小鼠的淋巴結(jié)細(xì)胞和脾細(xì)胞增殖和分泌IFN-γ在這些實(shí)驗(yàn)中，用重組形式的單個(gè)表位DNA5、DNA9、DNA26、DNA27、DNA29、DNA37、DNA44和DNA45再刺激重組多表位構(gòu)建物rME/D或DNA形式的多表位構(gòu)建物ME/D經(jīng)不同免疫途徑免疫小鼠的淋巴結(jié)細(xì)胞和脾細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)步驟與以上的概述相同。這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示于圖6A-B和圖7A-B。在用表位DNA5、DNA9A、DNA26、DNA37和DNA44再刺激的細(xì)胞中檢測到特異性增殖反應(yīng)和IFN-γ分泌(圖6A和圖7A)。表位DNA27、DNA29和DNA45在至少一個(gè)免疫組顯示增殖和IFN-γ分泌。在PBS免疫對照小鼠的細(xì)胞中觀察到低水平的增殖和IFN-γ產(chǎn)生(圖6B和圖7B)。數(shù)據(jù)表明當(dāng)所述表位作為多組分免疫原的組成部分提呈至免疫系統(tǒng)時(shí)，全部單獨(dú)具有抗原性。D.細(xì)胞因子產(chǎn)生如下所述測定用DNA形式的多表位構(gòu)建物ME/D免疫并用rME/A或rME/D再刺激的小鼠脾細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子。用三劑100μgME/DDNA以三周的間隔肌內(nèi)免疫BALB/cByJ小鼠。最后一次注射后15天，處死小鼠并取出脾細(xì)胞。用rME/A、rME/D或?qū)φ盏鞍譍V14B再刺激脾細(xì)胞，并按照標(biāo)準(zhǔn)方法篩選產(chǎn)生細(xì)胞因子的上清液。表6給出了脾細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子的情況。表6MEDNA免疫的BALB/cByJ小鼠脾細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子*以pg/ml檢測細(xì)胞因子濃度，標(biāo)準(zhǔn)誤差＜10％如表6所示，rME/A和rME/D刺激小鼠的脾細(xì)胞分泌IL-2和IL-6。IL-2是Th1型免疫應(yīng)答期間分泌的細(xì)胞因子，這提供了進(jìn)一步的證據(jù)表明所述多表位構(gòu)建物激發(fā)Th1型免疫應(yīng)答。細(xì)胞因子IL-6在針對結(jié)核病的小鼠免疫中起重要作用(Ladel等，Infec.Imm.654883-4849，1997)。經(jīng)檢測，未分泌Th2型細(xì)胞因子IL-4。E.抗體產(chǎn)生在最后一次DNA注射后兩周收集ME/D免疫BALB/cByJ小鼠的血樣，并按照標(biāo)準(zhǔn)方法制備血清。通過ELISA檢測抗-ME/D抗體存在與否。如圖8B所示，檢測出與rME/A和rME/D反應(yīng)的高滴度IgG2a抗體，但沒有IgG1抗體(圖8A)。IgG2a抗體的存在是Th1型免疫應(yīng)答的特征。F.由重組表位和重組多表位構(gòu)建物rME/D在小鼠中誘導(dǎo)長期記憶應(yīng)答如下所述測定在結(jié)核分枝桿菌感染并用重組表位rDNA5、rDNA9A、rDNA26、rDNA27、rDNA37、rDNA44或rDNA45或者重組多表位構(gòu)建物ME/D免疫小鼠中誘導(dǎo)的長期記憶應(yīng)答。在小鼠長期記憶測定中，用亞致死劑量的104菌落形成單位(CFU)結(jié)核分枝桿菌注射BALB/cByJ小鼠。4周后，用抗生素再治療小鼠4周，以治愈小鼠的結(jié)核分枝桿菌感染，接著是8周的靜止期。第二次注射活結(jié)核分枝桿菌(5×105CFU)3天后，使用上述脾細(xì)胞測定檢測重組構(gòu)建物免疫原性。用2μM重組表位或用1、0.33、0.11、0.03或0.01μMrME/D刺激脾細(xì)胞。在圖9A-C中顯示了在脾細(xì)胞測定中測定的IFN-γ產(chǎn)生水平。用無關(guān)蛋白GV14B刺激對照小鼠的脾細(xì)胞(圖9B)。在本實(shí)驗(yàn)中的其它對照包括僅用培養(yǎng)基、2μg/mlConA、10μg/mlPPD和10μg/ml母牛分枝桿菌刺激(圖9A)。重組ME/D刺激結(jié)核分枝桿菌感染小鼠的記憶T細(xì)胞，以劑量依賴方式產(chǎn)生大量IFN-γ(圖9B)。在此測定中產(chǎn)生IFN-γ表明ME/D與誘導(dǎo)長期免疫應(yīng)答的結(jié)核分枝桿菌抗原交叉反應(yīng)。與結(jié)核分枝桿菌抗原交叉反應(yīng)的抗原決定簇似乎位于表位DNA5、DNA9A、DNA26、DNA27和DNA44上(圖9B)。實(shí)施例7用重組單表位和量組多表位構(gòu)建物刺激人外周血單核細(xì)胞(PBMC)的作用A.刺激人外周血單核細(xì)胞(PBMC)體外增殖和分泌γ干擾素(IFN-γ)于37℃培養(yǎng)pET16細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的重組表位和重組多表位構(gòu)建物以及人PBMC。48小時(shí)后，如上所述用酶聯(lián)免疫測定(ELISA)檢測IFN-γ分泌。用氚化胸苷脈沖平行培養(yǎng)物，并使用DNA合成評(píng)價(jià)PBMC增殖。這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果示于圖10A-B和圖11A-B。重組多表位構(gòu)建物刺激人PBMC分泌IFN-γ和增殖(分別為圖10A和B)。這些反應(yīng)是劑量依賴性的，并比單個(gè)重組表位誘導(dǎo)的反應(yīng)強(qiáng)度高(圖11A和B)。B.重組單表位和重組多表位構(gòu)建物rME/A和rME/D刺激人PBMC體外分泌細(xì)胞因子如下用重組單表位或重組rME/A或rME/D體外再刺激后評(píng)價(jià)人PBMC產(chǎn)生的細(xì)胞因子。用2μM重組單表位rDNA5、rDNA9A、rDNA26、rDNA27、rDNA29、rDNA37、rDNA44或rDNA45，或者0.5μMrME/A或rME/D刺激細(xì)胞。對照組細(xì)胞用2μMGV14B或10μg/mlPPD刺激。按照標(biāo)準(zhǔn)方法用ELISA檢測細(xì)胞因子反應(yīng)。如下表7所示，用所述重組單表位或rME/A或rME/D刺激的人PBMC產(chǎn)生Th1細(xì)胞因子IFN-γ和TNF-α。這些重組表位還誘導(dǎo)分泌IL-10。在刺激細(xì)胞的培養(yǎng)上清液中未檢測出Th2細(xì)胞因子IL-5。對照抗原刺激分泌低水平細(xì)胞因子，并且在用PPD刺激后人PBMC分泌所有所測試的細(xì)胞因子。表7用重組單表位和rME體外刺激后人PBMC分泌的細(xì)胞因子實(shí)施例8用重組RME/D免疫后刺激獼猴淋巴細(xì)胞增殖免疫三組獼猴，每組4只，以測試重組多表位構(gòu)建物rME/D的免疫原性。以PBMC增殖測定檢測淋巴細(xì)胞增殖。第I組的獼猴用總體積0.1ml的PBS弗氏不完全佐劑(IFA)皮內(nèi)免疫。第II組的獼猴用33μg在IFA中的rME/D(總體積0.1ml)皮內(nèi)免疫，而第III組的獼猴用10μg在IFA中的rME/D(總體積0.1ml)皮內(nèi)免疫。在第0周和第6周進(jìn)行兩次免疫。免疫后12周由每只獼猴采血樣。每只獼猴的全血以1∶5稀釋，并用對照培養(yǎng)基(補(bǔ)加10％(v/v)自體血清、青霉素(60μg/ml)、鏈霉素(100μg/ml)和谷胺酰胺(2mM)的RPMI1640)刺激，所述對照培養(yǎng)基在1ml總培養(yǎng)體積中包含陽性對照植物凝集素(PHA，10μg/ml)、PPD(10μg/ml)、母牛分枝桿菌(10μg/ml)、rME/D(1μg/ml)或?qū)φ罩亟M蛋白GV-14B(1μg/ml)。培養(yǎng)平板72小時(shí)，然后再用1μCi/孔的氚化胸苷脈沖18小時(shí)，收獲并使用閃爍計(jì)數(shù)器測定氚攝取。淋巴細(xì)胞增殖的結(jié)果示于表8。表8PHA、PPD、母牛分枝桿菌、rME/D或rGV-14刺激的獼猴血樣淋巴細(xì)胞增殖如表8所示，重組多表位構(gòu)建物rME/D在第II組和第III組的免疫獼猴中誘導(dǎo)的PBMC細(xì)胞增殖反應(yīng)與陽性對照(PHA)誘導(dǎo)的增殖反應(yīng)相當(dāng)。用PPD、母牛分枝桿菌或rGV-14刺激后未記錄到增殖。盡管為了清楚理解本發(fā)明已經(jīng)利用附圖和實(shí)施例相當(dāng)詳細(xì)地描述了本發(fā)明，但可以在不偏離本發(fā)明范圍的情況下對本發(fā)明進(jìn)行改變和修飾，而本發(fā)明范圍僅由所附權(quán)利要求書的范圍所限定。序列表<110>Delcayre，Alain(吉尼西斯研究及發(fā)展有限公司)<120>治療感染性疾病和免疫系統(tǒng)疾病的化合物及其使用方法<130>11000.1042c1PCT<150>09/351,348<151>1999-07-12<150>U.S.09/450,072<151>1999-11-29<160>81<170>FastSEQforWindowsVersion3.0<210>1<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>實(shí)驗(yàn)室制備<400>1gagagagaaagcttatggctacaggctcc29<210>2<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>實(shí)驗(yàn)室制備<400>2aaggaaggggatcccgaagccacagctgcc30<210>3<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>實(shí)驗(yàn)室制備<400>3aaggaaggggatccgaagccacagctgcc29<210>4<211>31<212>DNA<213>人工序列<220><223>實(shí)驗(yàn)室制備<400>4aaggaaggggatcccggaagccacagctgcc31<210>5<211>146<212>DNA<213>母牛分枝桿菌(Mycobacteriumvaccae)<400>5aagcttatggctacaggctcccggacgtccctgctcctggcttttggcctgctctgcctg60ccctggcttcaagagggcagtgccttcccaaccattcccttatccaggctttttgacaac120gctatgcagctgtggcttcgggatcc146<210>6<211>145<212>DNA<213>母牛分枝桿菌<400>6aagcttatggctacaggctcccggacgtccctgctcctggcttttggcctgctctgcctg60ccctggcttcaagagggcagtgccttcccaaccattcccttatccaggctttttgacaac120gctatgcagctgtggcttcggatcc145<210>7<211>147<212>DNA<213>母牛分枝桿菌<400>7aagcttatggctacaggctcccggacgtccctgctcctggcttttggcctgctctgcctg60ccctggcttcaagagggcagtgccttcccaaccattcccttatccaggctttttgacaac120gctatgcagctgtggcttccgggatcc147<210>8<211>39<212>DNA<213>母牛分枝桿菌<400>8atcgccgccaccggcccggtgcccggcaccgcgtggatc39<210><211>96<212>DNA<213>母牛分枝桿菌<400>9gttcgtcagtacccgaagctcttgagagctaaggccaattgggaagatacttggaccttc60ccatcaatagaggaaaagcatcgccctaggggatcc96<210>10<211>75<212>DNA<213>母牛分枝桿菌<400>10gtagcgggcccggtgtttcgagtgaacttgggcagggcaatcccatcgcgcgcagcccgc60gcagcggaaatccac75<210>11<211>114<212>DNA<213>母牛分枝桿菌<400>11atcacgcaggtaggccgtccagccgtactcttcgccccagaacagcggtgccgtcgccgc60gcagaccagcggtcctgccgccagatacacccaggcggtggccggcatgtccag114<210>12<211>33<212>DNA<213>母牛分枝桿菌<400>12atcgtggccagcgcgcgcggcacggtggagatc33<210>13<211>210<212>DNA<213>母牛分枝桿菌<400>13atcgccgccaccggcccggtgcccggcaccgcgtggatcgttcgtcagtacccgaagctc60ttgagagctaaggccaattgggaagatacttggaccttcccatcaatagaggaaaagcat120cgccctaggggatccgtagcgggcccggtgtttcgagtgaacttgggcagggcaatccca180tcgcgcgcagcccgcgcagcggaaatccac210<210>14<211>697<212>DNA<213>母牛分枝桿菌<400>14atctactcgaccttcgccgaccgggcgtacccgggtggcctgacgtactccggccatccg60ctggcgaccgcctgcgcggtcgcgacgatcaacgcgatggaagacgaaggcatggtggcc120aacgctgcccgcatcggcgagcaggtgctcggaccgggtctgcgcgatctcgccgcccgg180caccgttcggtcggcgaagtccgcggcctcggcgtcttctgggcggatctcggtgaggtc240gtcctgcggcgactggaatgccacgttgttgacgacgatgtccagtccgccaagctgttt300caccgtgtcctcgaccaccgcgcggcagtgcgccggctcggccaggtcgccgggcaggcg360gaccgcccgctgtccggcctcttcgatcagtgccagcgcatcccgaaccgcggcggcgta420cgcgtcggcgtcggcgccgcgcacggccgggcacggggccacctcccgctccgggcaggc480gggtccgtggaccgcagcacggccgagtcgtttggtacaggtgcgcaccccgctgaaccg540ggccatcagcgccgccgcctcggtcgcgtcgctgcgggaccggaacgggcccaccgcgct600gtcggtgcgcggcgtgcggacggtggagaaccgggggaagggttcgtcggtcagcgtcac660ccaccaccaccggtgcgggaacttcgaccgccggttg697<210>15<211>291<212>DNA<213>母牛分枝桿菌<400>15atcagttcggccctggtcgccagcccgccgagggcagccagttccgctccggcgtcgatc60gggttgggtccgtccggccagcacaccagcatccacccgaggtcgagcaacgggtccccg120acggtgcacatctcccagtcgatgaacgccgcgagctcggggacgtcgcggcgcagcagc180acgttgttcagatggcagtcgccgtgcatgatcccgggttcggcgtcgtcgggcctgcgc240gagtccagccagtcggcgagcacatgcaccgacgggaacgactcgggcgcg291<210>16<211>147<212>DNA<213>母牛分枝桿菌<400>16atcacgcaggtaggccgtccagccgtactcttcgccccagaacagcggtgccgtcgccgc60gcagaccagcggtcctgccgccagatacacccaggcggtggccggcatgtccagatcgtg120gccagcgcgcgcggcacggtggagatc147<210>17<211>138<212>DNA<213>母牛分枝桿菌<400>17atcgcgcggctgtgcgggaaggacgaggccgtagcggcgttgcactacgtcgccccggtt60ggcgagaagcaggactacatcgaccgagccttgcgcaacatcgggccgtatctgccagct120gaggttcccgctctcgtc138<210>18<211>261<212>DNA<213>母牛分枝桿菌<400>18gatcggcaggcatcacgaacagtaagcggtgttccggttgaatccaatgtgctgtcagca60ggcatccgatgccgaacaccgaccacgcgagcagtcgcaatctgtctcgcgaccctggcg120tcacgcggcgtcgtggctccgcaacccgccggcgatgtcgcgcgcgccgctgcggccggc180tctccatggccggttcgttcagtcgctcgtccggtggctgttctgcgaacgggcccgccg240ccccgtcgtccgtccgatacg261<210>19<211>279<212>DNA<213>母牛分枝桿菌<400>19gatctcgttgcgcgtccgcgagatctgcgaccggtacgacctgccctacaccaccgggtc60cttcctggcgcagtacggcaagtcgtggcgcacgatcgcgaaactgtcgctgccggacaa120gttcctgcgcgacaccgccgacgacgccccggagacccgcagcgagcggatgttcgccga180actggatccgtcggagcggcgcgggctgaagtcggccatcgccgcggtgcggtcgcgccg240gcgcgccaaggtcgctgcgaaagccgcgaagatcgcgat279<210>20<211>132<212>DNA<213>母牛分枝桿菌<400>20gatccagaacgggccggtctgcgggttgaggtcctcggtgcccagtgccgtcgacgcgac60gtcgtcggcgctggtgatgcggccgccgtaggcgtcctcggtccacaacgtcagcaccgt120gcccgggcggat132<210>21<211>177<212>DNA<213>母牛分枝桿菌<400>21gatcagctcggggagccgggtgcccagcaacgccagcgtgggaagcaccgagaccggcgc60gatgtgcccgcgcagcagcgcccagccgtgcaccccgcgggaccgggccccgcggaccgc120gtcggagtcgaccccggccgccaccgccgcgcgcgtggtcagcatcagccacgggat177<210>22<211>15<212>DNA<213>人工序列<220><223>實(shí)驗(yàn)室制備<400>22cgcagctgtggcttc15<210>23<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>實(shí)驗(yàn)室制備<400>23ttacttaggttactagtggatc22<210>24<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>實(shí)驗(yàn)室制備<400>24cgatctactcgaccttcgccgac23<210>25<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>實(shí)驗(yàn)室制備<400>25ttacgcccagaagacgccgaggcc24<210>26<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>實(shí)驗(yàn)室制備<400>26gatcccatcaccatcaccatcactga26<210>27<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>實(shí)驗(yàn)室制備<400>27ggtagtggtagtggt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211>70<212>PRT<213>母牛分枝桿菌<400>69IleAlaAlaThrGlyProValProGlyThrAlaTrpIleValArgGln151015TyrProLysLeuLeuArgAlaLysAlaAsnTrpGluAspThrTrpThr202530PheProSerIleGluGluLysHisArgProArgGlySerValAlaGly354045ProValPheArgValAsnLeuGlyArgAlaIleProSerArgAlaAla505560ArgAlaAlaGluIleHis6570<210>70<211>75<212>PRT<213>母牛分枝桿菌<400>70IleTyrSerThrPheAlaAspArgAlaTyrProGlyGlyLeuThrTyr151015SerGlyHisProLeuAlaThrAlaCysAlaValAlaThrIleAsnAla202530MetGluAspGluGlyMetValAlaAsnAlaAlaArgIleGlyGluGln354045ValLeuGlyProGlyLeuArgAspLeuAlaAlaArgHisArgSerVal505560GlyGluValArgGlyLeuGlyValPheTrpAla657075<210>71<211>97<212>PRT<213>母牛分枝桿菌<400>71IleSerSerAlaLeuValAlaSerProProArgAlaAlaSerSerAla151015ProAlaSerIleGlyLeuGlyProSerGlyGlnHisThrSerIleHis202530ProArgSerSerAsnGlySerProThrValHisIleSerGlnSerMet354045AsnAlaAlaSerSerGlyThrSerArgArgSerSerThrLeuPheArg505560TrpGlnSerProCysMetIleProGlySerAlaSerSerGlyLeuArg65707580GluSerSerGlnSerAlaSerThrCysThrAspGlyAsnAspSerGly859095Ala<210>72<211>49<212>PRT<213>母牛分枝桿菌<400>72IleThrGlnValGlyArgProAlaValLeuPheAlaProGluGlnArg151015CysArgArgArgAlaAspGlnArgSerCysArgGlnIleHisProGly202530GlyGlyArgHisValGlnIleValAlaSerAlaArgGlyThrValGlu354045Ile<210>73<211>46<212>PRT<213>母牛分枝桿菌<400>73IleAlaArgLeuCysGlyLysAspGluAlaValAlaAlaLeuHisTyr151015ValAlaProValGlyGluLysGlnAspTyrIleAspArgAlaLeuArg202530AsnIleGlyProTyrLeuProAlaGluValProAlaLeuVal354045<210>74<211>87<212>PRT<213>母牛分枝桿菌<400>74AspArgGlnAlaSerArgThrValSerGlyValProValGluSerAsn151015ValLeuSerAlaGlyIleArgCysArgThrProThrThrArgAlaVal202530AlaIleCysLeuAlaThrLeuAlaSerArgGlyValValAlaProGln354045ProAlaGlyAspValAlaArgAlaAlaAlaAlaGlySerProTrpPro505560ValArgSerValAlaArgProValAlaValLeuArgThrGlyProPro65707580ProArgArgProSerAspThr85<210>75<211>93<212>PRT<213>母牛分枝桿菌<400>75AspLeuValAlaArgProArgAspLeuArgProValArgProAlaLeu151015HisHisArgValLeuProGlyAlaValArgGlnValValAlaHisAsp202530ArgGluThrValAlaAlaGlyGlnValProAlaArgHisArgArgArg354045ArgProGlyAspProGlnArgAlaAspValArgArgThrGlySerVal505560GlyAlaAlaArgAlaGluValGlyHisArgArgGlyAlaValAlaPro65707580AlaArgGlnGlyArgCysGluSerArgGluAspArgAsp8590<210>76<211>44<212>PRT<213>母牛分枝桿菌<400>76AspProGluArgAlaGlyLeuArgValGluValLeuGlyAlaGlnCys151015ArgArgArgAspValValGlyAlaGlyAspAlaAlaAlaValGlyVal202530LeuGlyProGlnArgGlnHisArgAlaArgAlaAsp3540<210>77<211>59<212>PRT<213>母牛分枝桿菌<400>77AspGlnLeuGlyGluProGlyAlaGlnGlnArgGlnArgGlyLysHis151015ArgAspArgArgAspValProAlaGlnGlnArgProAlaValHisPro202530AlaGlyProGlyProAlaAspArgValGlyValAspProGlyArgHis354045ArgArgAlaArgGlyGlnHisGlnProArgAsp5055<210>78<211>39<212>PRT<213>人工序列<220><223>實(shí)驗(yàn)室制備<400>78MetAlaThrGlySerArgThrSerLeuLeuLeuAlaPheGlyLeuLeu151015CysLeuProTrpLeuGlnGluGlySerAlaPheProThrIleProGly202530SerHisHisHisHisHisHis35<210>79<211>582<212>PRT<213>人工序列<220><223>實(shí)驗(yàn)室制備<400>79MetAlaThrGlySerArgThrSerLeuLeuLeuAlaPheGlyLeuLeu151015CysLeuProTrpLeuGlnGluGlySerAlaPheProThrIleProGly202530SerIleTyrSerThrPheAlaAspArgAlaTyrProGlyGlyLeuThr354045TyrSerGlyHisProLeuAlaThrAlaCysAlaValAlaThrIleAsn505560AlaMetGluAspGluGlyMetValAlaAsnAlaAlaArgIleGlyGlu65707580GlnValLeuGlyProGlyLeuArgAspLeuAlaAlaArgHisArgSer859095ValGlyGluValArgGlyLeuGlyValPheTrpAlaGlySerAspPro100105110GluArgAlaGlyLeuArgValGluValLeuGlyAlaGlnCysArgArg115120125ArgAspValValGlyAlaGlyAspAlaAlaAlaValGlyValLeuGly130135140ProGlnArgGlnHisArgAlaArgAlaAspGlySerAspArgGlnAla145150155160SerArgThrValSerGlyValProValGluSerAsnValLeuSerAla165170175GlyIleArgCysArgThrProThrThrArgAlaValAlaIleCysLeu180185190AlaThrLeuAlaSerArgGlyValValAlaProGlnProAlaGlyAsp195200205ValAlaArgAlaAlaAlaAlaGlySerProTrpProValArgSerVal210215220AlaArgProValAlaValLeuArgThrGlyProProProArgArgPro225230235240SerAspThrGlySerAspGlnLeuGlyGluProGlyAlaGlnGlnArg245250255GlnArgGlyLysHisArgAspArgArgAspValProAlaGlnGlnArg260265270ProAlaValHisProAlaGlyProGlyProAlaAspArgValGlyVal275280285AspProGlyArgHisArgArgAlaArgGlyGlnHisGlnProArgAsp290295300GlySerIleSerSerAlaLeuValAlaSerProProArgAlaAlaSer305310315320SerAlaProAlaSerIleGlyLeuGlyProSerGlyGlnHisThrSer325330335IleHisProArgSerSerAsnGlySerProThrValHisIleSerGln340345350SerMetAsnAlaAlaSerSerGlyThrSerArgArgSerSerThrLeu355360365PheArgTrpGlnSerProCysMetIleProGlySerAlaSerSerGly370375380LeuArgGluSerSerGlnSerAlaSerThrCysThrAspGlyAsnAsp385390395400SerGlyAlaGlySerIleThrGlnValGlyArgProAlaValLeuPhe405410415AlaProGluGlnArgCysArgArgArgAlaAspGlnArgSerCysArg420425430GlnIleHisProGlyGlyGlyArgHisValGlnIleValAlaSerAla435440445ArgGlyThrValGluIleGlySerIleAlaArgLeuCysGlyLysAsp450455460GluAlaValAlaAlaLeuHisTyrValAlaProValGlyGluLysGln465470475480AspTyrIleAspArgAlaLeuArgAsnIleGlyProTyrLeuProAla485490495GluValProAlaLeuValGlySerIleAlaAlaThrGlyProValPro500505510GlyThrAlaTrpIleValArgGlnTyrProLysLeuLeuArgAlaLys515520525AlaAsnTrpGluAspThrTrpThrPheProSerIleGluGluLysHis530535540ArgProArgGlySerValAlaGlyProValPheArgValAsnLeuGly545550555560ArgAlaIleProSerArgAlaAlaArgAlaAlaGluIleHisGlySer565570575HisHisHisHisHisHis580<210>80<211>582<212>PRT<213>人工序列<220><223>實(shí)驗(yàn)室制備<400>80MetAlaThrGlySerArgThrSerLeuLeuLeuAlaPheGlyLeuLeu151015CysLeuProTrpLeuGlnGluGlySerAlaPheProThrIleProGly202530SerIleTyrSerThrPheAlaAspArgAlaTyrProGlyGlyLeuThr354045TyrSerGlyHisProLeuAlaThrAlaCysAlaValAlaThrIleAsn505560AlaMetGluAspGluGlyMetValAlaAsnAlaAlaArgIleGlyGlu65707580GlnValLeuGlyProGlyLeuArgAspLeuAlaAlaArgHisArgSer859095ValGlyGluValArgGlyLeuGlyValPheTrpAlaGlySerIleSer100105110SerAlaLeuValAlaSerProProArgAlaAlaSerSerAlaProAla115120125SerIleGlyLeuGlyProSerGlyGlnHisThrSerIleHisProArg130135140SerSerAsnGlySerProThrValHisIleSerGlnSerMetAsnAla145150155160AlaSerSerGlyThrSerArgArgSerSerThrLeuPheArgTrpGln165170175SerProCysMetIleProGlySerAlaSerSerGlyLeuArgGluSer180185190SerGlnSerAlaSerThrCysThrAspGlyAsnAspSerGlyAlaGly195200205SerAspArgGlnAlaSerArgThrValSerGlyValProValGluSer210215220AsnValLeuSerAlaGlyIleArgCysArgThrProThrThrArgAla225230235240ValAlaIleCysLeuAlaThrLeuAlaSerArgGlyValValAlaPro245250255GlnProAlaGlyAspValAlaArgAlaAlaAlaAlaGlySerProTrp260265270ProValArgSerValAlaArgProValAlaValLeuArgThrGlyPro275280285ProProArgArgProSerAspThrGlySerAspGlnLeuGlyGluPro290295300GlyAlaGlnGlnArgGlnArgGlyLysHisArgAspArgArgAspVal305310315320ProAlaGlnGlnArgProAlaValHisProAlaGlyProGlyProAla325330335AspArgValGlyValAspProGlyArgHisArgArgAlaArgGlyGln340345350HisGlnProArgAspGlySerIleThrGlnValGlyArgProAlaVal355360365LeuPheAlaProGluGlnArgCysArgArgArgAlaAspGlnArgSer370375380CysArgGlnIleHisProGlyGlyGlyArgHisValGlnIleValAla385390395400SerAlaArgGlyThrValGluIleGlySerIleAlaArgLeuCysGly405410415LysAspGluAlaValAlaAlaLeuHisTyrValAlaProValGlyGlu420425430LysGlnAspTyrIleAspArgAlaLeuArgAsnIleGlyProTyrLeu435440445ProAlaGluValProAlaLeuValGlySerAspProGluArgAlaGly450455460LeuArgValGluValLeuGlyAlaGlnCysArgArgArgAspValVal465470475480GlyAlaGlyAspAlaAlaAlaValGlyValLeuGlyProGlnArgGln485490495HisArgAlaArgAlaAspGlySerIleAlaAlaThrGlyProValPro500505510GlyThrAlaTrpIleValArgGlnTyrProLysLeuLeuArgAlaLys515520525AlaAsnTrpGluAspThrTrpThrPheProSerIleGluGluLysHis530535540ArgProArgGlySerValAlaGlyProValPheArgValAsnLeuGly545550555560ArgAlaIleProSerArgAlaAlaArgAlaAlaGluIleHisGlySer565570575HisHisHisHisHisHis580<210>81<211>582<212>PRT<213>人工序列<220><223>實(shí)驗(yàn)室制備<400>81MetAlaThrGlySerArgThrSerLeuLeuLeuAlaPheGlyLeuLeu151015CysLeuProTrpLeuGlnGluGlySerAlaPheProThrIleProGly202530SerIleTyrSerThrPheAlaAspArgAlaTyrProGlyGlyLeuThr354045TyrSerGlyHisProLeuAlaThrAlaCysAlaValAlaThrIleAsn505560AlaMetGluAspGluGlyMetValAlaAsnAlaAlaArgIleGlyGlu65707580GlnValLeuGlyProGlyLeuArgAspLeuAlaAlaArgHisArgSer859095ValGlyGluValArgGlyLeuGlyValPheTrpAlaGlySerAspPro100105110GluArgAlaGlyLeuArgValGluValLeuGlyAlaGlnCysArgArg115120125ArgAspValValGlyAlaGlyAspAlaAlaAlaValGlyValLeuGly130135140ProGlnArgGlnHisArgAlaArgAlaAspGlySerIleSerSerAla145150155160LeuValAlaSerProProArgAlaAlaSerSerAlaProAlaSerIle165170175GlyLeuGlyProSerGlyGlnHisThrSerIleHisProArgSerSer180185190AsnGlySerProThrValHisIleSerGlnSerMetAsnAlaAlaSer195200205SerGlyThrSerArgArgSerSerThrLeuPheArgTrpGlnSerPro210215220CysMetIleProGlySerAlaSerSerGlyLeuArgGluSerSerGln225230235240SerAlaSerThrCysThrAspGlyAsnAspSerGlyAlaGlySerAsp245250255GlnLeuGlyGluProGlyAlaGlnGlnArgGlnArgGlyLysHisArg260265270AspArgArgAspValProAlaGlnGlnArgProAlaValHisProAla275280285GlyProGlyProAlaAspArgValGlyValAspProGlyArgHisArg290295300ArgAlaArgGlyGlnHisGlnProArgAspGlySerAspArgGlnAla305310315320SerArgThrValSerGlyValProValGluSerAsnValLeuSerAla325330335GlyIleArgCysArgThrProThrThrArgAlaValAlaIleCysLeu340345350AlaThrLeuAlaSerArgGlyValValAlaProGlnProAlaGlyAsp355360365ValAlaArgAlaAlaAlaAlaGlySerProTrpProValArgSerVal370375380AlaArgProValAlaValLeuArgThrGlyProProProArgArgPro385390395400SerAspThrGlySerIleThrGlnValGlyArgProAlaValLeuPhe405410415AlaProGluGlnArgCysArgArgArgAlaAspGlnArgSerCysArg420425430GlnIleHisProGlyGlyGlyArgHisValGlnIleValAlaSerAla435440445ArgGlyThrValGluIleGlySerIleAlaArgLeuCysGlyLysAsp450455460GluAlaValAlaAlaLeuHisTyrValAlaProValGlyGluLysGln465470475480AspTyrIleAspArgAlaLeuArgAsnIleGlyProTyrLeuProAla485490495GluValProAlaLeuValGlySerIleAlaAlaThrGlyProValPro500505510GlyThrAlaTrpIleValArgGlnTyrProLysLeuLeuArgAlaLys515520525AlaAsnTrpGluAspThrTrpThrPheProSerIleGluGluLysHis530535540ArgProArgGlySerValAlaGlyProValPheArgValAsnLeuGly545550555560ArgAlaIleProSerArgAlaAlaArgAlaAlaGluIleHisGlySer565570575HisHisHisHisHisHis580權(quán)利要求1.一種包含選自SEQIDNO61-70和72-77序列的氨基酸序列的分離多肽。2.一種包含選自以下序列的氨基酸序列的分離多肽(a)根據(jù)計(jì)算機(jī)算法FASTX測定，與SEQIDNO65、67、69和72-77中的任一個(gè)序列具有至少約50％相同殘基的序列；(b)根據(jù)計(jì)算機(jī)算法FASTX測定，與SEQIDNO65-67、69-70和72-77中的任一個(gè)序列具有至少約75％相同殘基的序列；(c)根據(jù)計(jì)算機(jī)算法FASTX測定，與SEQIDNO61-70和72-77中的任一個(gè)序列具有至少約90％相同殘基的序列。3.一種編碼權(quán)利要求1和2中任一項(xiàng)的多肽的分離多核苷酸。4.權(quán)利要求3的分離多核苷酸，其中所述多核苷酸含有選自SEQIDNO8-14和16-21序列及其互補(bǔ)物的序列。5.一種含有選自以下序列的序列的分離多核苷酸(a)根據(jù)計(jì)算機(jī)算法BLASTN測定，與SEQIDNO9、11、13和16-21中任一個(gè)序列具有至少約50％相同殘基的序列；(b)根據(jù)計(jì)算機(jī)算法BLASTN測定，與SEQIDNO9-11、13-14和16-21中任一個(gè)序列具有至少約75％相同殘基的序列；(c)根據(jù)計(jì)算機(jī)算法BLASTN測定，與SEQIDNO8-14和16-21中任一個(gè)序列具有至少約90％相同殘基的序列；(d)(a)、(b)或(c)序列的互補(bǔ)物。6.一種包含權(quán)利要求3-5中任一項(xiàng)的至少一種多核苷酸的DNA構(gòu)建物。7.權(quán)利要求6的DNA構(gòu)建物，其中所述構(gòu)建物包含選自SEQIDNO56-58的序列。8.一種用權(quán)利要求6和7中任一項(xiàng)的DNA構(gòu)建物轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。9.一種包含權(quán)利要求1和2中任一項(xiàng)的至少一種多肽的融合蛋白。10.權(quán)利要求9的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含選自SEQIDNO79-81的序列。11.一種包含權(quán)利要求1和2中任一項(xiàng)的至少一種多肽和生理學(xué)上可接受載體的組合物。12.一種包含權(quán)利要求3-5中任一項(xiàng)的至少一種多肽和生理學(xué)上可接受載體的組合物。13.一種包含權(quán)利要求9的至少一種融合蛋白和生理學(xué)上可接受載體的組合物。14.一種包含權(quán)利要求6的至少一種DNA構(gòu)建物和生理學(xué)上可接受載體的組合物。15.一種包含權(quán)利要求1和2中任一項(xiàng)的至少一種多肽和免疫刺激物的組合物。16.一種包含權(quán)利要求3-5中任一項(xiàng)的至少一種多核苷酸和免疫刺激物的組合物。17.一種包含權(quán)利要求9的至少一種融合蛋白和免疫刺激物的組合物。18.一種包含權(quán)利要求6的至少一種DNA構(gòu)建物和免疫刺激物的組合物。19.一種增強(qiáng)患者免疫應(yīng)答的方法，該方法包括給予所述患者權(quán)利要求11-18中任一項(xiàng)的組合物。20.權(quán)利要求19的方法，其中所述免疫應(yīng)答為Thl應(yīng)答。21.權(quán)利要求19的方法，其中所述組合物激活至少一種選自T細(xì)胞和NK細(xì)胞的細(xì)胞。22.權(quán)利要求19的方法，其中所述組合物刺激產(chǎn)生細(xì)胞因子。23.權(quán)利要求19的方法，其中所述組合物誘導(dǎo)長期記憶細(xì)胞。24.一種治療患者疾病的方法，該方法包括給予所述患者權(quán)利要求11-18中任一項(xiàng)的組合物，其中所述疾病選自免疫性疾病、感染性疾病和癌癥。25.權(quán)利要求29的方法，其中所述疾病為結(jié)核病。全文摘要本發(fā)明提供包含母牛分枝桿菌蛋白的免疫原性表位的多肽、編碼所述多肽的多核苷酸和包含至少一種所述多肽的融合蛋白，以及包含至少一種本發(fā)明多核苷酸的DNA構(gòu)建物。可使用包含所述多肽、多核苷酸、融合蛋白和/或DNA構(gòu)建物的組合物治療感染性疾病和免疫性疾病。文檔編號(hào)A61K38/16GK1800210SQ200510126998公開日2006年7月12日申請日期2000年7月10日優(yōu)先權(quán)日1999年7月12日發(fā)明者A·德爾凱雷申請人:吉尼西斯研究及發(fā)展有限公司