專利名稱：P物質(zhì)用于間充質(zhì)干細(xì)胞的動(dòng)員或增殖以及用于傷口愈合或促進(jìn)傷口愈合的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用P物質(zhì)(Substance-P)制造從骨髓動(dòng)員或增殖間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)，或促進(jìn)所述動(dòng)員或增殖的藥物的用途，以及利用P物質(zhì)制造用于傷口愈合或促進(jìn)傷口愈合的藥物的用途。
背景技術(shù)：
P物質(zhì)是由11個(gè)氨基酸組成的神經(jīng)肽，這個(gè)速激肽家族在感覺神經(jīng)元、巨噬細(xì)胞、嗜曙紅細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、和角膜的細(xì)胞，例如上皮細(xì)胞和角膜細(xì)胞，以及肉芽組織中表達(dá)。一些報(bào)道已經(jīng)提出在造血調(diào)節(jié)中的神經(jīng)免疫通訊中涉及有P物質(zhì)。骨髓基質(zhì)受P物質(zhì)神經(jīng)纖維的支配，并且P物質(zhì)刺激了骨髓基質(zhì)細(xì)胞通過其表面受體NK-1來產(chǎn)生干細(xì)胞因子和白介素-1，這些可能是作為滋養(yǎng)有利于造血刺激。但是，在全身MSC動(dòng)員和骨髓中的MSC再增殖中P物質(zhì)的作用還沒有報(bào)道。
傷口本身創(chuàng)造了一個(gè)獨(dú)特和特異的微環(huán)境，這個(gè)環(huán)境由生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、神經(jīng)激素、和細(xì)胞外基質(zhì)組成，所有這些都是由鄰近細(xì)胞，血生細(xì)胞和感覺神經(jīng)元分泌的。在傷口微環(huán)境中有些因子可能持續(xù)足夠長(zhǎng)的時(shí)間而擴(kuò)散到外周血中，并且依次影響骨髓中的干細(xì)胞，來誘導(dǎo)骨髓細(xì)胞動(dòng)員進(jìn)入外周血，促使向傷口位置提供骨髓細(xì)胞，以及促進(jìn)骨髓細(xì)胞參與傷口愈合。
最近使用骨髓干細(xì)胞和培養(yǎng)的MSC進(jìn)行的細(xì)胞移植試驗(yàn)顯示其與肺、胃腸道、和梗塞的心肌的組織修復(fù)有關(guān)。但是，在正常的沒有創(chuàng)傷的生理學(xué)狀態(tài)下，除了骨髓，在諸如脂肪組織和翼狀胬肉的組織中檢測(cè)到MSC，但是其很少出現(xiàn)在外周血中。由此，認(rèn)為在組織修復(fù)和病理進(jìn)展過程中，可能有某個(gè)系統(tǒng)將MSC從骨髓動(dòng)員到其他外周組織中去。
角膜是由透明的，無血管的且受密集神經(jīng)支配的組織組成，其完整性可能在角膜損傷和角膜疾病的情況下被破壞。角膜傷口刺激角膜上皮細(xì)胞的橫向運(yùn)動(dòng)，這很可能是由角膜緣干細(xì)胞提供的，其還刺激了炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)，和傷口基質(zhì)內(nèi)新血管的形成，所有這些可能是受獨(dú)特的角膜傷口微環(huán)境的刺激。以前的報(bào)告提出，角膜的去神經(jīng)支配是在傷口愈合過程中實(shí)際延遲的一個(gè)原因，并且在糖尿病病人中P物質(zhì)的水平低于非糖尿病病人，這也是引起延遲表皮再殖和延遲愈合的一個(gè)原因。由于角膜表面廣泛受到三叉神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的支配，并且內(nèi)源性的P物質(zhì)在角膜上皮細(xì)胞和角膜細(xì)胞中表達(dá)，人們預(yù)期P物質(zhì)與傷口微環(huán)境有關(guān)并且參與角膜修復(fù)。
發(fā)明概述本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)P物質(zhì)是在角膜堿灼傷的小鼠的眼睛和外周血中增多的第一個(gè)神經(jīng)肽。并且，他們發(fā)現(xiàn)，即使將P物質(zhì)靜脈注射進(jìn)角膜無傷口的小鼠中，很多CD29+MSC還是被動(dòng)員進(jìn)入外周血。而且，在體外的3-D膠原凝膠中顯示P物質(zhì)通過誘導(dǎo)基質(zhì)降解酶和抑制該酶的抑制劑來刺激人MSC的遷移。而且，他們發(fā)現(xiàn)P物質(zhì)刺激MSC的細(xì)胞增殖，β-連環(huán)蛋白的細(xì)胞核轉(zhuǎn)位作用，及其目標(biāo)基因VEGF和纖連蛋白的表達(dá)，并且因此P物質(zhì)可能在MSC動(dòng)員之后在MSC的骨髓再增殖中起作用。而且，本發(fā)明人確定了輸入堿灼傷的兔子耳靜脈的Di 1標(biāo)記的MSC在傷口床處被成功動(dòng)員起來，并且促進(jìn)了角膜傷口的愈合，改善角膜的透明度和視力恢復(fù)。進(jìn)一步的，他們顯示了靜脈注射的P物質(zhì)能夠促進(jìn)堿灼傷的兔眼的傷口愈合。
因此，本發(fā)明的首要目的是提供P物質(zhì)用于制造從骨髓動(dòng)員或增殖間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)，或促進(jìn)所述動(dòng)員或增殖的藥物的用途。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供P物質(zhì)用于制造傷口愈合或促進(jìn)傷口愈合的藥物的用途。
本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供用于從骨髓中動(dòng)員或增殖MSC，或促進(jìn)所述動(dòng)員或增殖的制劑，其含有P物質(zhì)作為有效成分。
本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供一種傷口愈合或促進(jìn)傷口愈合的制劑，其含有P物質(zhì)作為有效成分。
本發(fā)明的第五個(gè)目的是提供一種傷口愈合或促進(jìn)傷口愈合的制劑，其含有MSC作為有效成分，其中，通過P物質(zhì)的處理來從骨髓中動(dòng)員或增殖MSC。
本發(fā)明的第六個(gè)目的是提供一種分離MSC的方法，包含通過P物質(zhì)處理從骨髓動(dòng)員MSC的步驟。
本發(fā)明的第七個(gè)目的是提供一種增殖MSC的方法，包含在有P物質(zhì)存在下增殖MSC的步驟。
本發(fā)明的第八個(gè)目的是提供一種愈合傷口或促進(jìn)傷口愈合的方法，包括施用治療有效量的P物質(zhì)。
本發(fā)明的第九個(gè)目的是提供一種愈合傷口或促進(jìn)傷口愈合的方法，包括施用治療有效量的MSC，其中通過P物質(zhì)的處理從骨髓動(dòng)員或增殖MSC。
附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示了在角膜堿灼傷后，在兔子的外周血和傷口床中c-kit+干細(xì)胞的增加(用箭頭指示傷口床處的c-kit陽(yáng)性細(xì)胞)。
圖2a顯示了在角膜堿灼傷之后，小鼠眼睛的RT-PCR分析結(jié)果。
圖2b顯示了小鼠角膜堿灼傷之后的第0、1、3、5、7、10、14天收集的外周血的ELISA分析結(jié)果。
圖2c顯示了小鼠眼睛堿灼傷之后傷口床的蘇木精&曙紅染色結(jié)果，以及P物質(zhì)抗體免疫組化染色的結(jié)果。
圖2d顯示了小鼠眼晴堿灼傷之后的傷口處用c-kit、CD-29、和α-SM肌動(dòng)蛋白的抗體進(jìn)行免疫組化染色的結(jié)果。
圖3a顯示了在靜脈注射P物質(zhì)之后從小鼠血液中分離出的粘附細(xì)胞中用CD-29抗體免疫細(xì)胞化學(xué)染色的結(jié)果。
圖3b是顯示在靜脈注射P物質(zhì)之前或之后的血液中CD-29+細(xì)胞平均數(shù)量的圖表。
圖4a顯示了應(yīng)答P物質(zhì)處理在3-D膠原凝膠上人MSC的遷移和膠原蛋白降解的結(jié)果。
圖4b顯示了在用P物質(zhì)(0-100nM)處理后，從培養(yǎng)在3-D膠原凝膠上的人MSC收集的培養(yǎng)物上清液的明膠酶譜分析結(jié)果。
圖4c顯示了在用P物質(zhì)(0-100nM)處理后從人MSC收集的培養(yǎng)物上清液中針對(duì)MMP-1、MMP-2、MMP-9、TIMP-1和TIMP-2的抗體的免疫沉淀結(jié)果。
圖5a是顯示在用P物質(zhì)處理后，存活的人MSC的數(shù)量(n＝4，平均數(shù)±S.D)的圖表。
圖5b顯示了在P物質(zhì)(0-100nM)存在下培養(yǎng)的人MSC用β-連環(huán)蛋白抗體的免疫熒光染色結(jié)果。
圖5c是從P物質(zhì)處理過的人MSC的培養(yǎng)物上清液中收集的VEGF的ELISA分析結(jié)果的圖表。
圖5d顯示了從P物質(zhì)處理的人MSC的培養(yǎng)物上清液中使用針對(duì)人類纖連蛋白的單克隆抗體的Western印跡分析結(jié)果。
圖6a顯示了角膜堿灼傷后的第14、30天，有或沒有Di 1標(biāo)記的兔MSC輸注的兔眼裂隙燈檢查結(jié)果照片。
圖6b顯示了通過熒光立體顯微鏡的FLAT mount檢查觀察到的角膜中Di 1標(biāo)記的MSC存在的照片。
圖7a顯示了靜脈注射或沒有注射P物質(zhì)的兔子角膜堿灼傷之后，角膜傷口恢復(fù)的照片。
圖7b顯示了在角膜堿灼傷之后，靜脈注射或沒有注射P物質(zhì)的組織切片的H&E染色結(jié)果的照片。
圖7c顯示了在角膜堿灼傷之后靜脈注射或沒有注射P物質(zhì)的組織切片中，用CD-29抗體免疫組化染色的照片。
發(fā)明詳述首先，本發(fā)明涉及P物質(zhì)用于制造從骨髓動(dòng)員或增殖間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)，或促進(jìn)所述動(dòng)員或增殖的藥物的用途。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述藥物可以包括MSC。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述藥物可以是細(xì)胞性治療劑。
第二，本發(fā)明涉及P物質(zhì)用于制造傷口愈合，例如角膜和皮膚傷口愈合或促進(jìn)傷口愈合的藥物的用途。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述藥物可以包括MSC。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述藥物可以是細(xì)胞性治療劑。
第三，本發(fā)明涉及一種用于從骨髓中動(dòng)員或增殖MSC，或促進(jìn)所述的動(dòng)員或增殖的制劑，其包含P物質(zhì)作為有效成分。
第四，本發(fā)明涉及一種傷口愈合，或促進(jìn)傷口愈合的制劑，包含P物質(zhì)作為有效成分，例如，用于角膜和皮膚傷口。
第五，本發(fā)明涉及一種傷口愈合，或促進(jìn)傷口愈合的試劑，其含有MSC作為有效成分，其中通過P物質(zhì)的處理來從骨髓中動(dòng)員或增殖MSC。
第六，本發(fā)明涉及一種分離MSC的方法，包括通過P物質(zhì)的處理來從骨髓中動(dòng)員MSC的步驟。
第七，本發(fā)明涉及一種增殖MSC的方法，包括在P物質(zhì)存在下增殖MSC的步驟。
第八，本發(fā)明涉及一種愈合傷口或促進(jìn)傷口愈合的方法，包括施用治療有效量的P物質(zhì)。
第九，本發(fā)明涉及一種愈合傷口或促進(jìn)傷口愈合的方法，包括施用治療有效量的MSC，其中通過P物質(zhì)處理從骨髓中動(dòng)員或增殖MSC。
本發(fā)明詳細(xì)描述如下。
本發(fā)明人使用了堿灼傷角膜的動(dòng)物模型，這個(gè)模型在檢測(cè)傷口愈合過程中干細(xì)胞的全身性參與方面要優(yōu)于其他創(chuàng)傷模型，這是由于角膜是透明并且是無血管的。
在觀察到c-kit+細(xì)胞在角膜堿灼傷的兔子角膜和外周血中出現(xiàn)之后，使用RT-PCR分析和ELISA檢測(cè)傷口微環(huán)境中細(xì)胞因子和其他因子的表達(dá)情況，以及角膜堿灼傷的小鼠外周血的情況。結(jié)果顯示P物質(zhì)是在角膜傷口和角膜堿灼傷的小鼠的外周血中表達(dá)增加的第一個(gè)神經(jīng)肽。當(dāng)時(shí)，P物質(zhì)在角膜中首先升高并且稍后在外周血中升高。這顯示P物質(zhì)是由角膜常駐細(xì)胞，例如感覺神經(jīng)元、上皮細(xì)胞、角膜細(xì)胞、和內(nèi)皮細(xì)胞，而不是通過中性粒細(xì)胞或巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)提供的。血液中P物質(zhì)濃度的提高可能來自P物質(zhì)的全身擴(kuò)散。并且，嗜中性粒細(xì)胞中缺乏P物質(zhì)的免疫反應(yīng)性，P物質(zhì)的誘導(dǎo)和終止要比炎癥階段(直到創(chuàng)傷后第五天)更早，并且在創(chuàng)傷愈合的晚期階段(創(chuàng)傷后7-10天)上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞中的P物質(zhì)染色很弱，支持了這樣的假設(shè)，即P物質(zhì)是由感覺神經(jīng)元感受傷害的刺激而提供的。
隨后，為了與傷口微環(huán)境中發(fā)現(xiàn)的其他因子分開單獨(dú)確定P物質(zhì)的全身效應(yīng)，向無創(chuàng)傷的小鼠靜脈注射P物質(zhì)，檢測(cè)CD29+MSC向外周血的動(dòng)員。結(jié)果，觀察到靜脈注射了P物質(zhì)的小鼠比沒有注射的小鼠有大約15倍更多的CD29+MSC被動(dòng)員到外周血中。在此認(rèn)為，沒有傷口的小鼠中MSC被動(dòng)員到外周血中是因?yàn)樵跓o傷口床情況下沒有傷口位置供MSC來動(dòng)員。
并且，為了檢測(cè)P物質(zhì)在MSC從骨髓的骨內(nèi)膜表面動(dòng)員中的作用機(jī)制，采用了體外細(xì)胞遷移分析，并且檢測(cè)了P物質(zhì)對(duì)MSC遷移、基質(zhì)降解酶的動(dòng)力學(xué)、細(xì)胞增殖和β-連環(huán)蛋白定位的作用。結(jié)果，顯示在體外3D膠原凝膠中，P物質(zhì)誘導(dǎo)了基質(zhì)降解酶并抑制了它們的抑制劑，由此刺激了人MSC的遷移。這個(gè)結(jié)果進(jìn)一步支持了P物質(zhì)在MSC遷移中的作用。并且，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)P物質(zhì)刺激了細(xì)胞增殖和β-連環(huán)蛋白的細(xì)胞核轉(zhuǎn)位作用，由此在MSC的動(dòng)員之后促進(jìn)了MSC的骨髓再增殖。
此外，本發(fā)明人基于對(duì)角膜透明度和視力恢復(fù)的評(píng)分，檢驗(yàn)了靜脈注射的MSC是否到達(dá)了受損組織并且參與了角膜的修復(fù)。結(jié)果，他們證實(shí)輸入堿灼傷的兔子耳靜脈的Di 1-標(biāo)記的MSC成功供給到傷口床中并且提高了角膜的透明度和促進(jìn)了視力恢復(fù)，由此促進(jìn)了角膜傷口的愈合。
最后，本發(fā)明人基于肉眼檢驗(yàn)、H&E染色、和免疫組化染色檢驗(yàn)了P物質(zhì)的靜脈注射是否能促進(jìn)角膜傷口的愈合。結(jié)果，與對(duì)照組(未注射P物質(zhì)的組)相比較，注射了P物質(zhì)的組角膜傷口的愈合進(jìn)展迅速。
總之，發(fā)現(xiàn)在角膜傷口和外周血中P物質(zhì)是最先增加的，并且促進(jìn)了MSC向外周血的動(dòng)員，以及促進(jìn)了角膜傷口的愈合和骨髓中MSC的增殖。
因此，結(jié)論是P物質(zhì)發(fā)揮了作為傷口信號(hào)啟動(dòng)者的作用，參與了MSC從骨髓到傷口位置的動(dòng)員和補(bǔ)給。也確定了MSC動(dòng)員到傷口位置并且參與了傷口愈合。
鑒于上述結(jié)果，MSC能夠作為傷口愈合或促進(jìn)傷口愈合的藥物使用，或作為細(xì)胞生治療藥物使用。并且，P物質(zhì)也能夠用作為傷口愈合或促進(jìn)傷口愈合的藥物，或細(xì)胞性治療藥物，或MSC的動(dòng)員、或增殖的藥物、或促進(jìn)其動(dòng)員或增殖的藥物。
在本發(fā)明中，P物質(zhì)的有效劑量是0.1μg/kg至100μg/kg，MSC的有效劑量是3×104個(gè)細(xì)胞/kg至3×107個(gè)細(xì)胞/kg，特別是1×105個(gè)細(xì)胞/kg至1×107個(gè)細(xì)胞/kg。但是，這些劑量可依病人的體重、年齡、性別或傷口程度予以調(diào)整。
依照本發(fā)明的配方，可以通過腸道外或局部施用給人體，例如通過靜脈注射、皮下注射、內(nèi)皮注射、和肌肉注射。優(yōu)選通過靜脈注射給藥。對(duì)于此目的，有效成分懸浮或溶解于藥理學(xué)上可接受的載體，優(yōu)選水溶性載體。
下面，通過下列實(shí)施例更為明確地闡述本發(fā)明，但是并不以任何方式有意限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例實(shí)施例1外周血中c-kit陽(yáng)性干細(xì)胞的增加以及其在角膜堿灼傷后供給到傷口床中的鑒定重2-3kg的新西蘭白兔購(gòu)買自Samtako BioKorea。全部這些動(dòng)物實(shí)驗(yàn)都經(jīng)過韓國(guó)放射醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院倫理委員會(huì)(Ethical Committee，Korea Instituteof Radiological and Medical Sciences)和中央大學(xué)(CHUNG ANG UNIVERSITY)的認(rèn)可，并且按照ARVO關(guān)于眼科和視覺研究中動(dòng)物的使用聲明(ARVO Statementfor the Use of Animal in Ophthalmic and Vision Research)進(jìn)行。為了堿灼傷，將兔眼與吸收有1N NaOH的6mm圓形Whatman濾紙接觸30秒。在堿灼傷后1、3、5、7、10和14天，分離兔眼和全血。將血涂片和角膜切片用抗-C kit抗體染色，該結(jié)果顯示于圖1中。
完整無損的角膜是無血管的組織，在此的廣泛損傷可能需要血管提供炎性細(xì)胞和其他干細(xì)胞用于角膜修復(fù)。如圖1中顯示，當(dāng)堿灼傷在兔角膜上完成后，外周血中的c-kit陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量較之正常對(duì)照有了增加，這種現(xiàn)象在堿灼傷后5天的角膜傷口床中也檢測(cè)到了。這個(gè)結(jié)果確證了源自骨髓的干細(xì)胞可能活躍參與到了角膜的修復(fù)中。
實(shí)施例2P物質(zhì)作為角膜堿灼傷引致的傷口信號(hào)啟動(dòng)者的作用的鑒定重30-40g的Balb/c小鼠購(gòu)自Jackson Lab(West Grove，PA)。對(duì)于堿灼傷，將鼠眼與吸收有1N NaOH的3mm圓形Whatman濾紙接觸10秒。在堿灼傷之后1、3、5、7、10和14天，分離鼠眼和全血。
組織損傷本身可能組成獨(dú)特的傷口微環(huán)境引起例如炎癥的全身性反應(yīng)，以及誘導(dǎo)從骨髓動(dòng)員干細(xì)胞以修復(fù)損傷組織。采用RT-PCR分析堿灼傷角膜的傷口微環(huán)境中保持這些功能的候選因子。
具體地，使用Trizol(Invitrogen)從堿灼傷的眼中分離RNA。使用反轉(zhuǎn)錄聚合酶試劑盒(Takara)對(duì)總量為1μg的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄(RT)，然后使用下述的小鼠基因特異性引物進(jìn)行PCRVEGF(預(yù)期大小407)，(有義)5′GTACCTCCACCATGCCAAGT3′，(反義)5′AATGCTTTCTCCGCTCTGAA 3′，TNF-α(預(yù)期大小438)，(有義)5′GAACTGGCAGAAGAGGCACT3′，(反義)5′GTGGGTGAGGAGCACGTAGT3′，IL-1(預(yù)期大小432)，(有義)5′GCTGCTTCCAAACCTTTGAC3′，(反義)5′AGGCCACAGGTATTTTGTCG3′，P物質(zhì)(預(yù)期大小309)，(有義)5′TCGATGCCAACGATGATCTA3′，(反義)5′AGTTCTGCATTGCGCTTCTT3′
圖2a顯示了PCR的結(jié)果。如圖2a所示，發(fā)現(xiàn)角膜損傷后，眼中誘導(dǎo)出了P物質(zhì)、IL-1、TNF-α和VEGF。
為了進(jìn)一步監(jiān)測(cè)這些因子的全身狀況，以及評(píng)估其在干細(xì)胞從骨髓動(dòng)員中的可能作用，對(duì)外周血進(jìn)行了ELISA試驗(yàn)(R&D系統(tǒng))。結(jié)果顯示于圖2b中。如圖2b中所示，與無傷口狀態(tài)相比較，血清中P物質(zhì)的水平在第一天增加了大約3.2倍，3天時(shí)增加了大約4.4倍，5天時(shí)增加了大約1.3倍。但是，在堿灼傷后的第5天和第3天分別檢出促炎癥細(xì)胞因子TNF-α和IL-1的誘導(dǎo)，而從第7天時(shí)開始誘導(dǎo)出VEGF，比它們晚得多。
對(duì)于組織學(xué)檢測(cè)，對(duì)角膜傷口床進(jìn)行了蘇木精和伊紅(H&E)染色，并且用P物質(zhì)抗體(Santa Cruz BiotechnologyCat#sc-9758，1200)進(jìn)行免疫組化染色。小鼠的眼睛用4％的多聚甲醛(paraformaldehyde)固定48小時(shí)。將石蠟包埋標(biāo)本縱向切為4-μm切片，并轉(zhuǎn)移到多聚-D-賴氨酸包被的玻片上。之后用蘇木精和伊紅(H&E)染色并進(jìn)行組織學(xué)檢驗(yàn)。對(duì)于P物質(zhì)的免疫組化染色，用0.5％的H2O2孵育10分鐘以封閉內(nèi)源性過氧化物酶的活性。之后將組織用0.3％的Triton x-100透化處理5分鐘，并且用一抗孵育，其余步驟按照廠商的說明書(ABC kit，Vector)進(jìn)行，并且用固紅復(fù)染細(xì)胞。
結(jié)果顯示于圖2c中。作為H&E染色的結(jié)果，炎性中性粒細(xì)胞最多持續(xù)5天，在第五天可以辨別遷移的上皮細(xì)胞，在第七天成纖維細(xì)胞的浸潤(rùn)顯而易見，多數(shù)巨噬細(xì)胞在第14天已經(jīng)消失。免疫反應(yīng)性P物質(zhì)在1天后的傷口床中被最為強(qiáng)烈地檢測(cè)出來，并到第三天變?nèi)?。在第五天，P物質(zhì)僅僅在成纖維細(xì)胞和遷移的上皮細(xì)胞中檢測(cè)出來，但是在炎癥細(xì)胞中未檢測(cè)到，這暗示了早期的炎癥細(xì)胞可能不分泌P物質(zhì)。因此，角膜傷口本身似乎創(chuàng)造了一個(gè)富含P物質(zhì)的微環(huán)境，這可能是角膜常駐細(xì)胞提供的，可能依次引起血清中P物質(zhì)的升高。
為了確定來自骨髓的MSC是否被供給到傷口位置，用MSC的標(biāo)記物-抗CD-29(Santa Cruz Biotechnology；Cat#sc-6622，1200)，抗c-kit(SantaCruz Biotechnology；Cat#sc-1493，1100)、和抗α-SM肌動(dòng)蛋白抗體(Progen，Cat#61001，1200)進(jìn)行免疫組化染色。該結(jié)果顯示于圖2d中。從圖2d中可知，在炎癥早期沒有檢測(cè)到表達(dá)CD-29、c-kit、和α-SM-肌動(dòng)蛋白的成纖維細(xì)胞，直到第五天。從第七天到第十天，在傷口床處檢測(cè)到它們，這與纖維組織形成期相符合，并且于14天后已經(jīng)大部分消失從而符合重塑期。這個(gè)結(jié)果與傷口愈合的早期階段傷口床處成纖維細(xì)胞的缺失與第七天傷口床處成纖維細(xì)胞首先出現(xiàn)相關(guān)聯(lián)。由于只有一些成纖維細(xì)胞存在于正常的角膜基質(zhì)中(Fig.2c)，并且常駐的成纖維細(xì)胞在7天之前的炎癥期是缺失的，第7天傷口床處的CD-29，α-SM-肌動(dòng)蛋白，和c-kit陽(yáng)性細(xì)胞大概是從血液中輸入的MSC。
實(shí)施例3通過靜脈注射P物質(zhì)將MSC從骨髓到動(dòng)員到外周血中的鑒定對(duì)P物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)來確定其是否是動(dòng)員干細(xì)胞進(jìn)入血流的原因，或是否是傷口微環(huán)境中的一些其他未確定因素與干細(xì)胞動(dòng)員有關(guān)。
為了區(qū)分傷口微環(huán)境中其他因素的效應(yīng)，向沒有進(jìn)行眼睛堿灼傷的Balb-c小鼠尾靜脈中靜脈注射P物質(zhì)(0.1nmole/g體重)(Calbiochem)，1天之后收集全血。用percoll梯度離心去除紅細(xì)胞之后，將粘附的細(xì)胞培養(yǎng)48小時(shí)以去除淋巴細(xì)胞，并且之后為了將MSC與淋巴細(xì)胞區(qū)分開，用CD-29(β1整聯(lián)蛋白)的抗體來進(jìn)行免疫染色，巨噬細(xì)胞中不表達(dá)CD-29。
結(jié)果顯示于圖3a和3b中。在1天之內(nèi)，P物質(zhì)的靜脈注射強(qiáng)烈刺激了CD-29陽(yáng)性MSC動(dòng)員進(jìn)入外周血，這比未注射的小鼠高大約15倍(圖3b)。這顯示了P物質(zhì)的新作用，可能是在傷口愈合過程的早期階段表現(xiàn)以動(dòng)員MSC從骨髓進(jìn)入全身血液，向角膜傷口部位供給MSC，并且促進(jìn)角膜的修復(fù)。
實(shí)施例4鑒定P物質(zhì)引起MMP活性的提升MSC堅(jiān)固粘附于骨髓的骨內(nèi)膜表面，為了確定在MSC的動(dòng)員中P物質(zhì)的機(jī)制，首先檢測(cè)P物質(zhì)來確定其是否刺激了人MSC的遷移，該MSC培養(yǎng)于3-D膠原凝膠的頂部。按照廠商的說明書(Nitta gelatin，Japan)，在12mm的插入式細(xì)胞培養(yǎng)皿(Millicell)的膜(微孔12-μm孔徑)中制備出I型膠原凝膠基質(zhì)，并且用IV型膠原(Nitta)包被過夜。將MSC鋪板于膠原凝膠的頂部，并且外腔(outer chamber)用含有P物質(zhì)的MSCGM(Cambrex Bio Science)充滿。用相差顯微鏡(Olympus)監(jiān)測(cè)膠原凝膠的清除。72小時(shí)的時(shí)候，插入式細(xì)胞培養(yǎng)皿的嵌入物和外部器皿固定并用蘇木精染色，之后儲(chǔ)存培養(yǎng)物上清液用于明膠酶譜分析法。該結(jié)果顯示于圖4a中。如圖4a中所示，施加到底部皿的P物質(zhì)以劑量依賴性方式刺激了膠原凝膠的降解和MSC的遷移。
使用培養(yǎng)物上清液進(jìn)行白明膠酶譜分析法的檢測(cè)。在8％的SDS-PAGE中，對(duì)培養(yǎng)液的上清進(jìn)行電泳，這里添加的是不含巰基乙醇的樣品緩沖液。凝膠用2.5％的Triton x-100進(jìn)行復(fù)性以去除SDS，之后用顯影緩沖液(50mM Tris-HCl，pH 7.2 100mM NaCl，20mM CaCl2)孵育，于37℃下過夜，并且將凝膠用考馬斯藍(lán)染色。該結(jié)果顯示于圖4b中。如圖4b所顯示，培養(yǎng)基的明膠酶譜分析法顯示了MSC遷移過程中MMP-9和MMP-2活性的強(qiáng)誘導(dǎo)。
通過培養(yǎng)基和使用35S-甲硫氨酸標(biāo)記的MSC細(xì)胞裂解液的免疫沉淀反應(yīng)檢測(cè)P物質(zhì)對(duì)于MMP(基質(zhì)金屬蛋白酶)及其抑制劑的生物合成的效果。MSC用P物質(zhì)進(jìn)行處理并且用50μCi/ml 35S-甲硫氨酸(Amersham)標(biāo)記16小時(shí)。用裂解緩沖液(1％的NP40，10mM Tris-HCl，pH 7.4，150mM NaCl，1mM EDTA，2mMPMSF)制備細(xì)胞裂解液。對(duì)于分泌的MMP-1、MMP-2、MMP-9、TIMP-1和TIMP-2的免疫沉淀反應(yīng)，將培養(yǎng)液的上清與其特異性的抗體[抗MMP-1(chemicon；Cat#MAB3307，1100)、抗MMP-2(Chemicon；Cat#MAB13405，1200)、抗MMP-9(Calbiochem；Cat#444236，1100)、抗TIMP-1(Calbiochem；Cat#IM32L，1250)和抗TIMP-2(Calbiochem；Cat#IM11L，1250)]在恒定的轉(zhuǎn)速下孵育2小時(shí)，并通過G蛋白瓊脂糖4B(Biorad)收集抗體。沉淀用免疫沉淀反應(yīng)緩沖液(150mM NaOH，50mM Tris-HCl pH 7.4，0.2％SDS和0.5％脫氧膽酸鈉)洗滌3次，用高鹽緩沖液(10mM Tris-HCl，pH 7.4，0.5M NaCl)洗滌一次，用低鹽緩沖液(10mM Tris-HCl，pH 7.4)洗滌一次。SDS-PAGE之后，在2M水楊酸鈉中浸泡凝膠，干燥，并暴光于X射線底片2周。對(duì)于MMP-9的免疫沉淀反應(yīng)，將細(xì)胞裂解液與MMP-9抗體孵育，其余步驟與上面描述相同。該結(jié)果如圖4c所示。
MMP-1、MMP-2、MMP-9、和MT1-MMP的生物合成受到劑量依賴的刺激。相比之下，其抑制劑TIMP-1和TIMP-2的生物合成受到P物質(zhì)的抑制。
結(jié)果，P物質(zhì)刺激了3D膠原凝膠中MSC的遷移、MMP的誘導(dǎo)、及其抑制劑TIMP的抑制。
實(shí)施例5P物質(zhì)促進(jìn)MSC再增殖的鑒定如果P物質(zhì)僅有從骨髓中動(dòng)員MSC的能力，動(dòng)員之后骨髓基質(zhì)中的MSC庫(kù)可能變空。再次檢測(cè)P物質(zhì)對(duì)細(xì)胞增殖和自我更新能力的作用效果。
在用P物質(zhì)處理3天后，進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)排染活細(xì)胞計(jì)數(shù)。結(jié)果顯示于圖5a中。
P物質(zhì)提高了活細(xì)胞的數(shù)目，與對(duì)照組相比，1nM時(shí)為1.7倍，10nM為2.1倍，100nM為2.2倍。
為了檢測(cè)P物質(zhì)是否影響人MSC自我更新的能力，檢測(cè)wnt信號(hào)通路下游的效應(yīng)子β-連環(huán)蛋白。將MSC(Cambrex Bio Science)以1×104/孔的密度鋪板，并與MSCGM(Cambrex Bio Science)孵育。細(xì)胞粘附之后，用各個(gè)濃度的P物質(zhì)處理細(xì)胞，孵育16小時(shí)和48小時(shí)。MSC用4％的多聚甲醛進(jìn)行固定并且用0.3％的Triton X-100透化。用20％常規(guī)的山羊血清(血清在磷酸緩沖液中稀釋)封閉非特異性抗原1小時(shí)之后，用針對(duì)β-連環(huán)蛋白的抗體(BDBiosciencs；Cat#6010153，1100)孵育蓋片90分鐘，之后用FITC偶連的二抗孵育60分鐘(Vector)。細(xì)胞用DAPI復(fù)染，并用共聚焦顯微鏡(Leica)檢驗(yàn)。這個(gè)結(jié)果顯示于圖5b。
用P物質(zhì)處理以后16小時(shí)，主要在人MSC的細(xì)胞質(zhì)中觀察到了β-連環(huán)蛋白。但是只有用100nM的P物質(zhì)處理的少量MSC顯示出β-連環(huán)蛋白的核定位。但是P物質(zhì)處理以后48小時(shí)，β-連環(huán)蛋白的核轉(zhuǎn)位作用更為顯著，特別是用100nM P物質(zhì)處理過的所有MSC都顯示出β-連環(huán)蛋白的核轉(zhuǎn)位作用。
纖連蛋白和VEGF是Tcf/β-連環(huán)蛋白的下游基因，對(duì)二者進(jìn)行了ELISA和Western印跡分析。這些結(jié)果顯示在圖5c和5d中。
如圖5c和5d所顯示，P物質(zhì)誘導(dǎo)了VEGF和纖連蛋白。這證實(shí)了P物質(zhì)在剩余MSC的再增殖中起了作用，這是通過眾所周知的經(jīng)典wnt信號(hào)通路刺激細(xì)胞增殖或自我更新獲得的。
總之，P物質(zhì)刺激了細(xì)胞增殖、β-連環(huán)蛋白的轉(zhuǎn)位、和β-連環(huán)蛋白下游基因VEGF和纖連蛋白的誘導(dǎo)，所有這些都提示P物質(zhì)在骨髓的再增殖中發(fā)揮作用。
實(shí)施例6鑒定I.V.注射的MSC向角膜傷口床的供給以及視力恢復(fù)的改善如圖3所示，P物質(zhì)的靜脈注射足以刺激小鼠的CD-29+MSC動(dòng)員進(jìn)入外周血。為了檢測(cè)動(dòng)員的MSC是否能夠真正參與角膜傷口的愈合，在角膜堿灼傷之后24小時(shí)，將Di 1-標(biāo)記的MSC注入未經(jīng)照射的兔子耳靜脈中，以使MSC歸巢至骨髓最小化，而使供給到傷口位置的MSC最大化。
從一月齡的異源兔子的脛骨中，通過骨髓灌洗和抽吸分離出MSC，并用MSCGM培養(yǎng)多至三代。通過c-kit、STRO-1、和α-平滑肌(SM)肌動(dòng)蛋白的表達(dá)確定粘附的細(xì)胞是MSC，并且用于細(xì)胞輸注實(shí)驗(yàn)。為了跟蹤輸注的MSC，胰蛋白酶消化的細(xì)胞與Di 1溶液[Celltracker CM-Di I(Cat#C-7000)；Molecular Probes]在37℃孵育5分鐘以及在4℃孵育15分鐘。標(biāo)記之后用PBS洗滌三次，將MSC(1×106個(gè)細(xì)胞/ml)重懸于不含血清的新鮮培養(yǎng)液中，并在角膜堿灼傷之后1天注射進(jìn)10只兔子的耳靜脈。
在堿灼傷創(chuàng)傷后的第2周和第4周，用裂隙燈檢查未注射組和MSC注射組(用Di I標(biāo)記)的眼睛。該結(jié)果顯示在圖6a中。在MSC注射組中，角膜視力的恢復(fù)要好于未注射組。
用光-裂隙顯微鏡檢查和照片材料(photo-documentation)檢驗(yàn)上皮缺損的閉合來確定上皮愈合時(shí)間。按照下面的標(biāo)準(zhǔn)為角膜的不透明性評(píng)級(jí)；0級(jí)-無不透明性，1級(jí)-虹膜結(jié)構(gòu)可見及輕度不透明性，2級(jí)-虹膜微細(xì)結(jié)構(gòu)不可見，3級(jí)-僅看到虹膜為棕色，和4級(jí)-完全不透明。這個(gè)結(jié)果顯示于表1中。
表1

*p＜0.05如表1中顯示，注射了MSC的兔子上皮愈合的時(shí)間縮短了2倍，比未注射組的角膜透明度更好，角膜的新血管形成更少。
進(jìn)行FLAT mount是為了確證輸注的Di 1標(biāo)記的MSC是否定位于傷口床。為了確定角膜中Di 1標(biāo)記的MSC，用熒光立體顯微鏡(Leica)于1天、2周、和3個(gè)月時(shí)，檢測(cè)FLAT mount。
該結(jié)果顯示于圖6b中。如圖6b所示，在上皮水平和基質(zhì)水平檢測(cè)到Di 1-標(biāo)記的MSC。早在靜脈內(nèi)輸注后一天就在傷口床處檢測(cè)到Di 1-標(biāo)記的MSC，并且甚至在自輸注3個(gè)月之后仍檢測(cè)到其存在，盡管Di 1的密度較低。
實(shí)施例7通過P物質(zhì)的靜脈注射促進(jìn)角膜傷口愈合的鑒定如圖3所示，P物質(zhì)的靜脈注射足以促進(jìn)小鼠的CD-29+MSC動(dòng)員進(jìn)入外周血中，并且如圖6所示，P物質(zhì)的靜脈注射改善了角膜視力的恢復(fù)。因此，檢測(cè)僅P物質(zhì)是否能刺激角膜傷口的愈合。為了評(píng)估P物質(zhì)靜脈注射加速傷口愈合的效果，在灼傷后立即首先靜脈注射劑量為6.5μg/kg的P物質(zhì)，然后在灼傷后的第二天再次注射。在靜脈注射之后7天，通過照數(shù)碼相片來裸眼評(píng)估角膜的恢復(fù)。本結(jié)果顯示于圖7a中。如圖7a所示，在注射了P物質(zhì)的兔子中，角膜再生比沒有注射的對(duì)照組快很多。如圖中顯示的角膜不透明的清除和出血區(qū)域的消失，與沒有注射的對(duì)照組兔子相比，P物質(zhì)的靜脈注射強(qiáng)烈加速了角膜的愈合。
為了觀察組織學(xué)水平上的傷口愈合程度，分離出兔眼并且固定，之后，H&E染色并且針對(duì)CD29進(jìn)行免疫染色。H&E的染色結(jié)果顯示于圖7b中。如圖7b所示，注射P物質(zhì)的組顯示有完全厚度的上皮覆蓋、組織良好的血管結(jié)構(gòu)、和致密膠原束的有序排列，除了上皮下仍有巨噬細(xì)胞和多形核巨大細(xì)胞存在外，這些與未損傷的平行側(cè)的相類似。相反的，未注射的兔子在同一天僅僅顯示出上皮細(xì)胞稀疏的覆蓋，大的成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞的活躍浸潤(rùn)、和基質(zhì)內(nèi)松散無組織的膠原小纖維，這些與P物質(zhì)注射組第五天觀察到的相似。
CD29染色的結(jié)果顯示在圖7c中。如圖7c所示，未注射組顯示未分化的間充質(zhì)干細(xì)胞(表達(dá)CD29的細(xì)胞)，但是，注射了P物質(zhì)的組顯示了處于膠原蛋白纖維之間的小的紡錘形狀CD29+細(xì)胞，這與正常的角膜基質(zhì)相似。因此，在整個(gè)時(shí)期中，比較在注射了P物質(zhì)和未注射的角膜之間的組織學(xué)觀察，確證了SP IV的注射加速了愈合的速率，這比對(duì)照組要快。這些結(jié)果意味著P物質(zhì)的注射對(duì)于角膜傷口的愈合是有效的。
根據(jù)本發(fā)明，P物質(zhì)最初在堿灼傷的角膜中增加，并且通過血液移動(dòng)進(jìn)入骨髓，之后刺激骨髓中的間充質(zhì)干細(xì)胞，并且誘導(dǎo)骨髓中MSC的再增殖。
因此，P物質(zhì)能夠作為傷口愈合或促進(jìn)傷口愈合的藥物、動(dòng)員或增殖MSC、或促進(jìn)MSC動(dòng)員或增殖的藥物使用。
并且，證實(shí)了MSC直接參與傷口愈合。因此，MSC能夠被作為傷口愈合或促進(jìn)傷口愈合的藥物使用，或作為細(xì)胞性治療劑使用。
權(quán)利要求
1.P物質(zhì)制造用于從骨髓動(dòng)員或增殖間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)，或促進(jìn)所述動(dòng)員或增殖的藥物的用途。
2.P物質(zhì)制造用于傷口愈合或促進(jìn)傷口愈合的藥物的用途。
3.權(quán)利要求1或2的用途，其中所述藥物包括MSC。
4.權(quán)利要求3的用途，其中所述藥物是細(xì)胞性治療劑。
5.一種用于從骨髓動(dòng)員或增殖MSC，或促進(jìn)所述動(dòng)員或增殖的制劑，其含有P物質(zhì)作為有效成分。
6.一種傷口愈合或促進(jìn)傷口愈合的制劑，其含有P物質(zhì)作為有效成分。
7.一種傷口愈合或促進(jìn)傷口愈合的制劑，其含有MSC作為有效成分，其中，通過P物質(zhì)的處理來從骨髓動(dòng)員或增殖MSC。
8.一種分離MSC的方法，包括通過P物質(zhì)處理從骨髓中動(dòng)員MSC的步驟。
9.一種增殖MSC的方法，包括在有P物質(zhì)存在下增殖MSC的步驟。
10.一種愈合傷口或促進(jìn)傷口愈合的方法，包括施用治療有效量的P物質(zhì)。
11.一種愈合傷口或促進(jìn)傷口愈合的方法，包括施用治療有效量的MSC，其中通過P物質(zhì)處理從骨髓動(dòng)員或增殖MSC。
全文摘要
本發(fā)明涉及利用P物質(zhì)制造用于從骨髓動(dòng)員或增殖間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)，或促進(jìn)上述動(dòng)員或增殖的藥物的用途，以及利用P物質(zhì)制造用于傷口愈合或促進(jìn)傷口愈合的藥物的用途。
文檔編號(hào)A61K45/00GK1824289SQ20051013802
公開日2006年8月30日 申請(qǐng)日期2005年10月27日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月27日
發(fā)明者孫英淑, 洪賢淑, 金在燦 申請(qǐng)人:韓國(guó)原子力研究所, 中央大學(xué)校算學(xué)協(xié)力團(tuán)