專利名稱：具有乙酰膽堿酯酶抑制活性組合物及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是一種具有乙酰膽堿酯酶抑制活性組合物及其制備方法和應(yīng)用，屬于藥物的技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
具有乙酰膽堿酯酶抑制活性的物質(zhì)，即乙酰膽堿酯酶抑制劑(AchEI)能減少神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿的降解，是目前公認(rèn)的最強(qiáng)的膽堿能增強(qiáng)劑；乙酰膽堿酯酶抑制劑是通過抑制突觸間隙內(nèi)乙酰膽堿的降解，增加毒蕈堿受體和煙堿受體處乙酰膽堿的濃度，從而提高認(rèn)知能力，另外，乙酰膽堿對毒蕈堿受體和煙堿受體的激動具有神經(jīng)保護(hù)作用，大多數(shù)的乙酰膽堿酯酶抑制劑均可以改善認(rèn)知功能。
在老年癡呆癥(Alzheimer’sDisease，AD)病人中，學(xué)習(xí)和記憶能力的喪失，與乙酰膽堿能神經(jīng)功能的下降，也就是說，與乙酰膽堿含量的高低直接關(guān)聯(lián)。因此提高AD患者腦中的乙酰膽堿含量，促進(jìn)膽堿能功能的藥物，為治療老年癡呆癥可供選擇的藥物，如他克林(Tacrine)、多奈哌齊(Donepezil)、加蘭他敏(Galanthanmine)、卡巴拉汀等，占以上市用于治療老年癡呆癥藥物的70％。血管性癡呆、中風(fēng)等，均為腦功能障礙性疾病，伴有認(rèn)知功能障礙，學(xué)習(xí)與記憶能力下降。通過尋找新型乙酰膽堿酯酶抑制劑，增加患者腦中乙酰膽堿的含量，改善膽堿能神經(jīng)功能，改善腦功能障礙，提高學(xué)習(xí)記憶能力，是預(yù)防和治療老年癡呆癥、中風(fēng)等疾病的一條有效途徑。
國外研究發(fā)現(xiàn)吳茱萸中化學(xué)成分之一的去氫吳茱萸堿(胺)(dehydroevodiamine，DHED)體外具有強(qiáng)的抗乙酰膽堿酯酶作用(Park CH；Kim SH；Choi W；Lee YJ；Kim JS；Kang SS；Suh YH，Novel anticholinesterase and antiamnesic activities ofdehydroevodiamine，a constituent of Evodia rutaecarpa.，Planta Med.，1996，62405-409)，可增強(qiáng)腦血流(Akira Haji，Yasumori Momose，Ryuji Takeda，SuehiroNakanishi，Increase Feline Cerebral Blood Flow Induced by DehydroecodiamineHydrochlorideFromEvodia Rutaecarp)，去氫吳茱萸堿能顯著地恢復(fù)東莨菪堿引起的記憶障礙，可以保護(hù)腦缺血對神經(jīng)細(xì)胞造成的損傷、促進(jìn)神經(jīng)生長因子的作用，以及改善β-淀粉樣蛋白誘導(dǎo)的健忘癥(Wang，H.H.，Chou，C.J.，Liao，J.F.，and Chen，C.F.Dehydroevodiamine attenuates beta-amyloid peptide-induced amnesia in mice，European JournalofPharmacology，2001，413(2-3)221-225)。在抗老年性癡呆癥方面，其在體效果比Tacrine還佳。另外去氫吳茱萸堿可修復(fù)腦細(xì)胞達(dá)到治療中風(fēng)的效果，因此，去氫吳茱萸堿可望發(fā)展成為一類新型抗老年癡呆癥和中風(fēng)的藥物。
小檗堿(Berberine)存在于多種植物中，如小檗科植物日本小檗、九連小檗、日本十大功勞，罌粟科植物白屈菜，防己科植物頭花千金藤，毛莨科植物黃連，蕓香科植物黃柏等，具有抗微生物及原蟲，降壓，利膽，鎮(zhèn)靜，解熱，增白等作用，臨床上主要用于治療細(xì)菌性痢疾、傷寒、肺結(jié)核、例行性腦脊髓膜炎、肺膿腫、高血壓、急性扁桃體炎等，服用治療量相當(dāng)安全，長期服用未見任何毒副作用。有研究報道小檗堿在低劑量有增強(qiáng)乙酰膽堿的作用(張冒紹，生理學(xué)報，1963，19(1)12)，高劑量則有抑制作用；小檗堿能增強(qiáng)神經(jīng)生長因子NGF誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞軸突生長和增強(qiáng)NGF誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞的分化作用(ShigetaK.，Otaki K.，Tatemoto H.，et al.，Potential of nerve growth factor-inducedneurite outgrowth in PC12 cells by a Coptidis Rhizoma extract and protoberberinealkaloids[J].Biosci Biotechnol Biochem，2002，66(11)2491-2494)；最近研究發(fā)現(xiàn)，鹽酸小檗堿為M受體的特異性激動劑，可引起血管內(nèi)皮擴(kuò)張，可改善AD癥狀等(王文雅，陳克敏，關(guān)永源，鹽酸小檗堿對毒蕈堿性受體的作用[J].藥學(xué)學(xué)報，1999，34(4)260-263)。另外，小檗堿可改善東莨菪堿致小鼠記憶獲得障礙及促進(jìn)正常小鼠的記憶保持(郭樹仁，羅衛(wèi)芳，劉天培，小檗堿對小鼠學(xué)習(xí)記憶及開場行為的影響，中藥藥理與臨床[J].1997，13(2)17-20)。因此，小檗堿通過增強(qiáng)乙酰膽堿，達(dá)到改善對腦功能的改善作用。

發(fā)明內(nèi)容
我們在開展民族藥中具有抗老年癡呆癥物質(zhì)基礎(chǔ)研究時對多種藥材進(jìn)行了研究、實驗、篩選，在篩選的100余種黔產(chǎn)道地苗藥材中吳茱萸和黃連的乙醇總提取物具有較好的乙酰膽堿酯酶抑制活性，經(jīng)分段處理，結(jié)合活性跟蹤，提取出了活性成分分別為去氫吳茱萸堿和小檗堿的物質(zhì)，本結(jié)果與上述文獻(xiàn)報道一致；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，去氫吳茱萸堿和小檗堿具有協(xié)同的抗乙酰膽堿酯酶作用。
為此，本發(fā)明是為了達(dá)到以下目的1、提供一種具有乙酰膽堿酯酶抑制活性的組合物，即去氫吳茱萸堿與小檗堿組方，以及它們的鹽酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽等組方，形成的組合物。
2、提供組合物中采用的原料制備方法，即人工合成或從植物(如中藥吳茱萸)中分離純化得到的去氫吳茱萸堿(及其鹽)；從中藥如黃連等植物中獲得小檗堿及其鹽并按一定比例進(jìn)行組合成組合物。
3、提供組合物的組合方法，即通過機(jī)械攪拌均勻，也可以是水、乙醇、乙酸乙酯等溶劑溶解后，去除溶劑得到的均勻混合物。
4、提供具有乙酰膽堿酯酶抑制活性的組合物的應(yīng)用，即應(yīng)用在制備預(yù)防和治療老年性癡呆癥、血管性癡呆、學(xué)習(xí)記憶功能障礙、中風(fēng)等疾病的藥物中。
本發(fā)明是這樣構(gòu)成的具有乙酰膽堿酯酶抑制活性的組合物，去氫吳茱萸堿(dehydroevodiamine)與小檗堿(berberine)組方，以及它們的鹽酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽等組方，形成的組合物。按照重量比去氫吳茱萸堿或其鹽0.5～99.5與小檗堿或其鹽99.5～0.5進(jìn)行混合制備而成。它的制備方法人工合成或從植物，如從中藥吳茱萸、黃連等中分離純化、制備得到的去氫吳茱萸堿及其鹽和小檗堿及其鹽，將得到的去氫吳茱萸堿及其鹽和小檗堿及其鹽采取機(jī)械攪拌的方法或者是用水、乙醇、乙酸乙酯等溶劑溶解后，去除溶劑得到的均勻混合物的方法制備具有乙酰膽堿酯酶抑制活性組合物。從中藥材中制備該組合物原料的具體方法中藥吳茱萸干燥近成熟果實經(jīng)乙醇回流提取，除去溶劑，得到粗提物，粗提物再經(jīng)硅膠柱層析，以以氯仿-甲醇為洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫，得到富含去氫吳茱萸堿的部位，該部位再經(jīng)中壓柱層析(硅膠)后，得到高含去氫吳茱萸堿的粗品，經(jīng)重結(jié)晶后，即可的純品去氫吳茱萸堿；將黃連的塊根粉粹后，用酒精熱提取，得到的提取物用稀鹽酸溶解，除雜后的母液酸水層經(jīng)堿化后，析出沉淀，過濾沉淀，水洗后，再重結(jié)晶，可得純品小檗堿，經(jīng)相應(yīng)的酸中和成鹽可制得小檗堿的鹽；將原料氫吳茱萸堿或其鹽和小檗堿或其鹽分別粉粹，過80～120目篩網(wǎng)，按需要比例進(jìn)行機(jī)械攪拌均勻混合后，必要時添加輔料，制備成適宜的給藥劑型膠囊、片劑、針劑、注射劑等；也可以用溶劑水、乙醇或乙酸乙酯等溶解后，去除溶劑得到的均勻混合物原料，必要時添加輔料，制備成適宜的給藥劑型。具有乙酰膽堿酯酶抑制活性組合物的應(yīng)用這種組合物對乙酰膽堿酯酶有顯著的抑制活性。具體的說應(yīng)用在制備預(yù)防和治療老年性癡呆癥、血管性癡呆、中風(fēng)、學(xué)習(xí)記憶功能障礙等疾病的藥物中。
在本發(fā)明中還可以采用人工合成的方法制備去氫吳茱萸堿及其鹽人工合成方法參照文獻(xiàn)i)Jan Bergman，Solveig Bergman，Studies ofRutaecarpine and Related Quinazolinocarboline Alkaloids，J.Org.Chem.，1985，501246～1255；ii)Tatsuo Nakasato，Shozo Asada and Keiko Marui，Dehydroevodiamine，Main Alkaloid from the Leaves of Evodia rutaecarpa Hookerfil.Et Thomson，Yakugaku Zasshi，1962，82619~626，得到如下技術(shù)方案合成路線為
Isotoic anhydride(1)溶于吡啶中，加入三氟乙酸酐，回流后冷至室溫，加入色胺，在回流反應(yīng)結(jié)束后，加入乙酸和鹽酸混合溶液處理可得中間體(2)。中間體(2)在強(qiáng)堿的作用下，得到吳茱萸次堿(3)。吳茱萸次堿(3)經(jīng)氮甲基化可得去氫吳茱萸堿(4)，其鹽(4’)是與相應(yīng)的反應(yīng)后得到。
組合物的乙酰膽堿酯酶抑制活性測試對通過本發(fā)明的技術(shù)方法獲得的組合物進(jìn)行生物活性測試。
(1)方法a.藥品與試劑乙酰膽堿系Fluka公司產(chǎn)品，乙酰膽堿酯酶和他克林系SIGMA公司產(chǎn)品，5，5-二硫雙硝基苯甲酸(DTNB)系A(chǔ)CROS公司產(chǎn)品，其他試劑均為分析純。
b.實驗儀器Bio-RAD 550酶標(biāo)儀為美國伯樂公司產(chǎn)品c.將樣品加入含有酶和DTNB的體系中，37℃孵育一段時間。加入乙酰膽堿，37℃再孵育一段時間。加入十二烷基磺酸鈉(SDS)終止反應(yīng)。在450nm處測定光密度值。試驗同時設(shè)有空白對照、標(biāo)準(zhǔn)對照、陽性對照、樣品顏色對照。按如下公式計算抑制率抑制率＝(標(biāo)準(zhǔn)對照光密度值-樣品光密度值)/標(biāo)準(zhǔn)對照光密度值×100(2)樣品編號及比例a去氫吳茱萸堿；b小檗堿；c鹽酸小檗堿ab11∶a/b＝1∶1(重量比)；ab12∶a/b＝1∶2(重量比)；ab15∶a/b＝1∶5(重量比)；ab110∶a/b＝1∶10(重量比)；ab21∶a/b＝2∶1(重量比)；ab51∶a/b＝5∶1(重量比)；
ac11∶a/c＝1∶1(重量比)；ac31∶a/b＝3∶1(重量比)；(3)結(jié)果通過對乙酰膽堿酯酶抑制活性的研究發(fā)現(xiàn)，依據(jù)本發(fā)明提供的技術(shù)獲得的組合物具有顯著的活性(結(jié)果見表1)，表現(xiàn)在i)與組合物的組成原料去氫吳茱萸堿(a)相比，所有組合物的活性均比其高(IC50值為2～5倍)。ii)組合物ab11、ab12、ab15、ab110、ab21和ac11的IC50值與小檗堿(b)的IC50值相當(dāng)，組合物ab51和ac31的抑制活性較小檗堿差(2倍左右)；iii)所有組合物及其組合物的組成原料的體外乙酰膽堿酯酶抑制活性均較陽性對照物Tacrine低。
表1不同比例組合物對乙酰膽堿酯酶的抑制效果(3次平均值)

通過實驗證明本發(fā)明提供的組合物具有顯著的乙酰膽堿酯酶抑制活性，所有組合物的活性比組成組合物的原料去氫吳茱萸堿(a)的活性高，大部分組合物的活性與小檗堿的活性相當(dāng)，特別是ab11組合物中，劑量減少了一半，其活性是組成原料去氫吳茱萸堿(a)的4倍。雖然本發(fā)明提供的組合物、組成原料去氫吳茱萸堿(a)和小檗堿(b)的體外乙酰膽堿酯酶抑制活性沒有陽性對照物Tacrine強(qiáng)，但在體動物實驗已經(jīng)證明去氫吳茱萸堿(a)的抗老年癡呆癥效果比Tacrine好，所以，本發(fā)明提供的組合物可應(yīng)用在制備預(yù)防和治療老年癡呆癥、血管性癡呆、學(xué)習(xí)記憶障礙、兒童智力低下、中風(fēng)等疾病的藥物中。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果在于1)本發(fā)明提供了一種新的組合物。
2)本發(fā)明提供的組合物的組成原料來源豐富，制備工藝合理、可行，適于擴(kuò)大規(guī)模，易于實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化的目的。
3)本發(fā)明提供的組合物具有顯著的乙酰膽堿酯酶抑制活性，其組份之間有協(xié)同作用，此研究結(jié)果在此前尚未見報道；本組合物可以用在制備預(yù)防和治療老年性癡呆癥、血管性癡呆、中風(fēng)、學(xué)習(xí)記憶功能障礙等疾病的藥物中。
具體實施例方式本發(fā)明通過以下實施例進(jìn)行進(jìn)一步闡明，但并不限于本發(fā)明的內(nèi)容。
本發(fā)明的實施例1去氫吳茱萸堿及其鹽的制備1、人工合成Isotoic anhydride(1)(580mg，3.56mmol)溶于15mL吡啶中，攪拌下滴加三氟乙酸酐1.5g(7.12mmol)，回流15min后，冷卻至室溫，加入色胺570mg(3.56mmol)，在回流30min，反應(yīng)結(jié)束后(TLC跟蹤反應(yīng)進(jìn)程)，減壓除去溶劑，得殘留物，在殘留物中加入乙酸(12mL)和濃鹽酸(2mL)混合溶液，回流30min，減壓除去酸液，加入適量水分配，用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯層經(jīng)無水硫酸鎂干燥后，減壓除去溶劑，得到的粗品經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑為氯仿∶甲醇40∶1)純化得到中間體(2)1.2g(94％)。
取中間體(2)500mg溶于KOH(0.8g)，水(3mL)和乙醇(10mL)組成的溶液中，回流30min后，加壓出去溶劑，加水分配后，經(jīng)乙酸乙酯萃取得到粗品，粗品經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑為氯仿∶二乙胺100∶1)的所需物吳茱萸次堿(3)332mg(79.3％)。
將30mg吳茱萸次堿(3)置于25ml反應(yīng)瓶中，加入15ml苯溶解，在加入0.3ml硫酸二甲酯回流6h后，再添加0.2ml硫酸二甲酯，在回流12h(TLC跟蹤反應(yīng)進(jìn)程)，減壓除去溶劑，得到的粗品，經(jīng)PTLC純化，得產(chǎn)物去氫吳茱萸堿(4)20mg(63％)。
在甲醇或乙醇中溶解去氫吳茱萸堿(4)，通入鹽酸蒸汽，可制得去氫吳茱萸堿(4)的鹽酸鹽(4’)；其他鹽可參照此法制備。
2、從吳茱萸中分離純化中藥吳茱萸干燥近成熟果實(5kg)經(jīng)85％乙醇回流提取(3次)，減壓除去溶劑，得到粗提物(300g)，粗提物再經(jīng)硅膠柱層析，以氯仿/甲醇20∶1、10∶1、5∶1為洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫，得到富含去氫吳茱萸堿的部位，該部位再經(jīng)中壓柱層析(硅膠)(洗脫劑為為石油醚∶丙酮∶二乙胺＝5∶1∶0.1)后，得到高含去氫吳茱萸堿的粗品，經(jīng)甲醇重結(jié)晶后，即可的純品去氫吳茱萸堿(4g)。
本發(fā)明實施例2小檗堿及其鹽原料的制備將5kg黃連(塊根)粉粹后，用75％酒精熱提取，得到的提取物用稀鹽酸溶解，除雜后的母液(酸水層)經(jīng)堿化后，析出沉淀，過濾沉淀，水洗后，再經(jīng)乙醇重結(jié)晶，可得純品小檗堿。小檗堿經(jīng)相應(yīng)的酸中和成鹽可制得小檗堿的鹽(重結(jié)晶用70％為溶劑)。
本發(fā)明實施例3將原料去氫吳茱萸堿和小檗堿分別粉粹，過80目篩網(wǎng)，按去氫吳茱萸堿0.5公斤與小檗堿99.5公斤的比例進(jìn)行機(jī)械攪拌均勻混合后，即得組合物，制備成常規(guī)片劑?？诜?，一日三次，每次2片。
本發(fā)明實施例4將原料去氫吳茱萸堿的鹽和小檗堿的鹽分別粉粹，過120目篩網(wǎng)，按去氫吳茱萸堿的鹽99.5公斤與小檗堿的鹽0.5公斤的比例進(jìn)行機(jī)械攪拌均勻混合后，即得組合物；添加常用的輔料，制備成注射劑。
本發(fā)明實施例5將原料去氫吳茱萸堿和小檗堿分別粉粹，過100目篩網(wǎng)，按去氫吳茱萸堿50公斤與小檗堿50公斤的比例用乙醇(也可以用乙酸乙酯等溶劑)溶解后，去除溶劑得到的均勻混合物原料，即組合物，直接灌裝、制備成膠囊劑。
本發(fā)明實施例6將原料去氫吳茱萸堿的鹽和小檗堿的鹽分別粉粹，過90目篩網(wǎng)，按去氫吳茱萸堿的鹽70公斤與小檗堿的鹽30公斤的比例用水(或酒精)溶解后，去除溶劑得到的均勻混合物原料，即組合物，添加常規(guī)的輔料，制備成凍干粉針劑。
權(quán)利要求
1.一種具有乙酰膽堿酯酶抑制活性的組合物，其特征在于去氫吳茱萸堿(dehydroevodiamine)與小檗堿(berberine)組方，以及它們的鹽酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽等組方，形成的組合物。
2.按照權(quán)利要求1所述具有乙酰膽堿酯酶抑制活性的組合物，其特征在于按照重量比，去氫吳茱萸堿或其鹽0.5~99.5與小檗堿或其鹽99.5~0.5進(jìn)行混合制備而成。
3.如權(quán)利要求1或2中所述具有乙酰膽堿酯酶抑制活性組合物的制備方法，其特征在于人工合成或從植物如中藥吳茱萸、黃連中分離純化、制備得到的去氫吳茱萸堿及其鹽和小檗堿及其鹽，將得到的去氫吳茱萸堿及其鹽和小檗堿及其鹽采取機(jī)械攪拌的方法或者是用水、乙醇、乙酸乙酯等溶劑溶解后，去除溶劑得到的均勻混合物的方法制備具有乙酰膽堿酯酶抑制活性組合物。
4.按照權(quán)利要求3中所述具有乙酰膽堿酯酶抑制活性組合物的制備方法，其特征在于中藥吳茱萸干燥近成熟果實經(jīng)乙醇回流提取，除去溶劑，得到粗提物，粗提物再經(jīng)硅膠柱層析，以氯仿-甲醇為洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫，得到富含去氫吳茱萸堿的部位，該部位再經(jīng)中壓柱層析(硅膠)后，得到高含去氫吳茱萸堿的粗品，經(jīng)重結(jié)晶后，即可的純品去氫吳茱萸堿；將黃連的塊根粉粹后，用酒精熱提取，得到的提取物用稀鹽酸溶解，除雜后的母液酸水層經(jīng)堿化后，析出沉淀，過濾沉淀，水洗后，再重結(jié)晶，可得純品小檗堿，經(jīng)相應(yīng)的酸中和成鹽可制得小檗堿的鹽；將原料氫吳茱萸堿或其鹽和小檗堿或其鹽分別粉粹，過80~120目篩網(wǎng)，按需要比例進(jìn)行機(jī)械攪拌均勻混合后，必要時添加輔料，制備成適宜的給藥劑型膠囊、片劑、針劑、注射劑等；也可以用溶劑水、乙醇或乙酸乙酯等溶解后，去除溶劑得到的均勻混合物原料，必要時添加輔料，制備成適宜的給藥劑型。
5.如權(quán)利要求1或2中所述具有乙酰膽堿酯酶抑制活性組合物的應(yīng)用，其特征在于這種組合物對乙酰膽堿酯酶有顯著的抑制活性。
6.按照權(quán)利要求5所述具有乙酰膽堿酯酶抑制活性組合物的應(yīng)用，其特征在于應(yīng)用在制備預(yù)防和治療老年性癡呆癥、血管性癡呆、中風(fēng)、學(xué)習(xí)記憶功能障礙等疾病的藥物中。
全文摘要
本發(fā)明提供一種具有乙酰膽堿酯酶抑制活性組合物及其制備方法和應(yīng)用，通過人工合成或從植物中分離純化得到的去氫吳茱萸堿(或其鹽)與小檗堿(或其鹽)進(jìn)行組方，形成組合物，經(jīng)生物活性測發(fā)現(xiàn)此組合物具有顯著的乙酰膽堿酯酶抑制活性，因此，可將此組合物應(yīng)用在制備預(yù)防和治療老年癡呆癥、血管性癡呆、中風(fēng)、學(xué)習(xí)記憶功能障礙等疾病的藥物中。
文檔編號A61P25/28GK1660106SQ20051020002
公開日2005年8月31日 申請日期2005年1月12日 優(yōu)先權(quán)日2005年1月12日
發(fā)明者楊小生, 趙超, 朱海燕, 孫黔云, 楊付梅 申請人:貴州省中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點實驗室