專利名稱：一種注射型骨修復(fù)材料的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實用新型屬于生物醫(yī)學(xué)工程中用組織工程方法制備人工器官技術(shù)領(lǐng)域，具體是涉及一種注射型骨修復(fù)材料。
背景技術(shù)：
目前，骨修復(fù)材料大多為支架材料負載細胞生長因子模式。支架材料和生長因子的選擇是組織工程學(xué)研究的重點內(nèi)容。支架材料作為種子細胞載體，有負載細胞和緩釋生長因子的作用，目前常用的支架材料多為固體類材料，其在骨修復(fù)材料的制備中已取得了令人矚目的效果。但是，也不同程度地存在難以塑形、負載生長因子和種子細胞操作復(fù)雜、負載率不高、細胞易流失等缺陷。因此，注射型或水凝膠類材料是目前骨修復(fù)材料研究的熱點。常用于骨修復(fù)材料領(lǐng)域的細胞生長因子有BMP、TGF-β、bFGF、VEGF等，均為外源性蛋白(異種或異體蛋白因子)。從這些生長因子的制備方法分析，包括異體骨提取和基因重組兩種，其制備復(fù)雜、價格昂貴。例如，申請?zhí)枮?2114509.1的中國專利申請“以動物纖維蛋白為載體的注射型多種生物因子復(fù)合骨修復(fù)材料”公開了一種以動物纖維蛋白為載體的注射型多種生物因子復(fù)合骨修復(fù)材料，其采用的就是重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白、成纖維細胞生長因子和β轉(zhuǎn)化生長因子。從免疫學(xué)角度看，目前常用的各類生長因子均為外源性(非自體)蛋白或多肽類，不同程度存在免疫排斥反應(yīng)。研究開發(fā)制備簡單、價格低廉、無免疫排斥的自體生長因子用于骨修復(fù)材料的制備，是骨修復(fù)材料進一步臨床應(yīng)用亟待解決的重要問題。
富血小板血漿(Plate Rich Plasma，PRP)是從全血中分離出來的含高濃度血小板的血漿。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，從自體靜脈血中提取的富血小板血漿(PRP)中含有多種高濃度的有利于促進骨再生的生長因子，如血小板源生長因子(PDGF)、轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)、類胰島素生長因子(IGF)、血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF)、表皮生長因子(EGF)等。當(dāng)PRP與氯化鈣及凝血酶混合后，可促使其中血小板α顆粒釋放出這些生長因子。這些生長因子對骨缺損的愈合有明顯的促進作用。PRP中各種生長因子濃度比例與體內(nèi)正常濃度比例相似，生長因子之間有最佳協(xié)同作用。但單純應(yīng)用PRP于局部，這些生長因子易因血循環(huán)而流失，只能在較短時間內(nèi)起作用。目前，已有將PRP與固體材料如TCP或同種異體骨等復(fù)合用于口腔頜面外科修復(fù)骨缺損的報導(dǎo)。但將PRP與注射型材料復(fù)合用于骨修復(fù)方面則未見報導(dǎo)。
實用新型內(nèi)容針對上述現(xiàn)有技術(shù)狀況，為了克服現(xiàn)有的骨修復(fù)材料難以塑形及操作復(fù)雜及昂貴的外源性細胞因子等不足，本實用新型提供一種注射型骨修復(fù)材料，該骨修復(fù)材料為可注射形材料負載自體PRP再復(fù)合自體骨髓基質(zhì)細胞構(gòu)成，可任意塑形且復(fù)合細胞簡便，且使用自體細胞生長因子，不存在免疫排斥問題。
本實用新型所述的一種注射型骨修復(fù)材料，由纖維蛋白構(gòu)成凝膠狀的載體支架，成纖維網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu)，其上負載有自體富血小板血漿即PRP。
所述的載體支架是由含PRP的纖維蛋白原溶液與氯化鈣-凝血酶混合溶液以體積比為9∶1～1∶1的比例混合后形成的纖維蛋白凝膠。
所述的含PRP的纖維蛋白原溶液是將自體富血小板血漿即PRP與濃度為80-100mg/ml的纖維蛋白原溶液以1∶3～6比例混合形成的。
所述的PRP優(yōu)選是取自自體靜脈血，以二次離心法提取而得的富血小板血漿。
所述溶液一中的纖維蛋白原溶液是以濃度為2000～6000U/ml的抑肽酶溶解纖維蛋白原而得到的。
所述的纖維蛋白原為商品化產(chǎn)品，可購自廣州倍繡生物技術(shù)有限公司或同類公司。
所述的氯化鈣-凝血酶混合溶液中，氯化鈣濃度為40mmol/ml，凝血酶濃度為400～1000U/ml。
本實用新型所述的注射型骨修復(fù)材料的各組分的濃度及比例都是經(jīng)過實驗摸索得到的最佳結(jié)果。
本實用新型所述的注射型骨修復(fù)材料，可用于制備治療骨缺損和骨不連以及促進骨折愈合的移植物，包括直接注入患處，以及復(fù)合種子細胞構(gòu)建組織工程骨。
本實用新型制備簡便，價格低廉。自體PRP中富含多種有利于骨修復(fù)的生長因子如PDGF、TGF-β、VEGF等，均為自體來源，不會產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)和疾病傳播，所制備的注射型骨修復(fù)材料兼有靈活應(yīng)用的注射型材料和自體生長因子二者的優(yōu)點，操作簡單，使用方便，可塑性好，可在體內(nèi)任意塑型成損傷部位的形狀，使新骨形狀完全恢復(fù)成原有的生理狀態(tài)，成骨效果明確，可適用于各種不規(guī)則骨缺損，且可在局部注射應(yīng)用，也可用于非手術(shù)方法治療骨折，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。


圖1為本實用新型所述的注射型骨修復(fù)材料的結(jié)構(gòu)示意圖。
具體實施方式
本實用新型所述的一種注射型骨修復(fù)材料，如圖1所示，由纖維蛋白構(gòu)成凝膠狀的載體支架1，成纖維網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu)，其上負載有自體富血小板血漿2即PRP。圖1為微觀示意圖，其比例不代表實際產(chǎn)品的比例。圖中，所述的注射型骨修復(fù)材料連接于骨斷端3之間。
所述的載體支架1是由含PRP的纖維蛋白原溶液與氯化鈣-凝血酶混合溶液以體積比為9∶1～1∶1的比例混合后形成的纖維蛋白凝膠。
所述的含PRP的纖維蛋白原溶液是將自體富血小板血漿即PRP與濃度為80-100mg/ml的纖維蛋白原溶液以1∶3～6比例混合形成的。
所述的PRP優(yōu)選是取自自體靜脈血，以二次離心法提取而得的富血小板血漿。
所述溶液一中的纖維蛋白原溶液是以濃度為2000～6000U/ml的抑肽酶溶解纖維蛋白原而得到的。
所述的纖維蛋白原為商品化產(chǎn)品，可購自廣州倍繡生物技術(shù)有限公司或同類公司。
所述的氯化鈣-凝血酶混合溶液中，氯化鈣濃度為40mmol/ml，凝血酶濃度為400～1000U/ml。
本實用新型所述的注射型骨修復(fù)材料的制備方法，包括以下步驟A.材料準(zhǔn)備(1)自體RPR取自體靜脈血，以二次離心法提取富血小板血漿即PRP，置-70℃冰箱保存?zhèn)溆?；以抑肽酶溶液溶解纖維蛋白原，使成溶液態(tài)，配制氯化鈣-凝血酶混合溶液，其中，氯化鈣濃度為40mmol/ml，凝血酶濃度為400～1000IU/ml；所述提取自體RPR的二次離心法包括以下步驟將抗凝血于20℃以3000r/min第一次離心10分鐘，吸取上清及白膜層下3mm成分；同樣溫度下以3600r/min第二次離心15分鐘，棄上層3/4上清，剩余部分即為PRP。
(2)纖維蛋白原溶液以抑肽酶溶解纖維蛋白原，使其成溶液態(tài)；(3)氯化鈣-凝血酶混合溶液配置氯化鈣-凝血酶混合溶液，其中，氯化鈣濃度為40mmol/ml，凝血酶濃度為400IU/ml；B.將自體RPR與纖維蛋白原溶液以1∶3～6比例混合，超聲振蕩使混合均勻，得到含PRP的纖維蛋白原溶液；C.以雙聯(lián)注射器分別抽取步驟B獲得的含PRP的纖維蛋白原溶液以及氯化鈣-凝血酶混合溶液，通過混合針頭注射，注射時含PRP的纖維蛋白原溶液與氯化鈣-凝血酶溶液比例為9∶1～1∶1，形成粘著力較強的凝膠，其中PRP所占的體積比為10～30％，即獲得所述的注射型骨修復(fù)材料。
在步驟B獲得的含PRP的纖維蛋白原溶液中加入一定量的種子細胞，再按照步驟C混合注射入體內(nèi)，獲得由注射型骨修復(fù)材料復(fù)合種子細胞的注射型組織工程骨。動物骨缺損修復(fù)試驗實驗設(shè)計取健康新西蘭大白兔，由南方醫(yī)科大學(xué)(原第一軍醫(yī)大學(xué))南方醫(yī)院動物所提供，6個月齡，體重2-3kg，采用速眠新、氯胺酮和阿托品復(fù)合液肌注麻醉。無菌條件下，手術(shù)顯露右側(cè)橈骨中段，連同骨膜切除橈骨1.5cm，造成節(jié)段性骨缺損模型。36只橈骨骨缺損模型新西蘭大白兔，隨機分為A、B、C三組，每組12只。所有動物術(shù)前一周抽取耳背中央動脈血提取自體富血小板血漿(Plate Rich Plasma，PRP)。A組于術(shù)前1～2月制備骨髓基質(zhì)干細胞(MSCs)，術(shù)前30分鐘將消化計數(shù)后的MSCs加入制備的注射型骨修復(fù)材料，植入自體橈骨1.5cm節(jié)段性骨缺損，為實驗組。B、C兩組分別植入PRP+FG、FG于同樣骨缺損處為對照組。纖維蛋白膠(fibrin glue，F(xiàn)G)是將纖維蛋白原與氯化鈣、凝血酶混合后形成的一種凝膠狀物。A、B、C三組逐層縫合切口，術(shù)后三天肌注青霉素40萬u/日。另取4只橈骨同樣部位和大小骨缺損曠置作為空白組，即D組。
術(shù)后4、8、12周時拍攝橈骨正位X線片。用放射影像學(xué)評分和圖像分析X線阻射影比較骨缺損的修復(fù)情況。
檢測方法(1)大體觀察嚴(yán)密觀察新西蘭大白兔術(shù)后的一般情況。術(shù)后4、8、12周每組各處死2只動物取材，觀察骨修復(fù)材料的表面變化、骨痂形成、骨缺損修復(fù)情況及周圍組織反應(yīng)。
(2)放射學(xué)檢查A、B、C三組動物于術(shù)后4、8、12周均攝右橈骨正位x光片(投照距離1m，投照條件46KV，50mA，曝光時間0.14s)，D組于術(shù)后12、16周攝片，觀察骨缺損愈合情況。所有照片依據(jù)Yang等(Yang CY，Simmons DJ，Lozano R.The healing of graftscombining freeze-dried and demineralized allogeneic bone in rabbits.Clin Orthop.1994，298289)的評分標(biāo)準(zhǔn)進行放射學(xué)評分。骨缺損部位x線阻射密度測定參照文獻(陽富春，楊志明等，獼猴組織工程化骨制備及其修復(fù)異體骨缺損的放射學(xué)評估，中國臨床康復(fù)2004；8(2)223-225)。
結(jié)果(1)大體觀察術(shù)后所有兔切口未見紅腫、滲血及濃性分泌物，切口均一期愈合。術(shù)后4周，A組、B組骨缺損處為大量淡紅色質(zhì)硬纖維組織充填，切開纖維組織見其內(nèi)仍有少量膠狀物，橈骨遠近斷端見大量纖維骨痂，A組骨痂多于B組，C組缺損處稍凹陷，為質(zhì)軟纖維組織生長，缺損區(qū)中心部仍有部分FG殘留，未見明顯骨痂。各組骨缺損周圍肌肉均未見水腫。術(shù)后8周，A、B組骨缺損區(qū)均見大量連續(xù)性骨痂，呈膨脹性生長，其直徑超過正常橈骨；兩者無明顯區(qū)別，材料已完全吸收；C組缺損仍為纖維組織充填，見少量散在骨痂生長。各組周圍組織未見異常反應(yīng)。術(shù)后12周，A組兩只兔骨缺損處均完全愈合，局部為正常有骨膜骨組織，塑形良好，難以區(qū)分斷端。B組一只兔缺損完全愈合，塑形好，另一只兔缺損處為新生骨痂充填，斷端模糊。C組見遠近兩斷端各有部分骨痂生長，骨缺損中間部仍為纖維組織。周圍組織正常。D組術(shù)后16周處死時觀察骨缺損大小基本同前，兩骨端硬化，骨髓腔封閉，纖維組織充填髓腔，無明顯骨痂生長。
(2)X片觀測A組術(shù)后4周骨缺損處呈斑片狀阻射影，斷端仍清晰，兩斷端部密度稍高。術(shù)后8周時兩斷端模糊，骨缺損處為連續(xù)性高密度阻射影，橈骨外部骨痂清晰，缺損處內(nèi)側(cè)尺骨皮質(zhì)密度增高。12周時骨缺損處呈均勻一致高密度影，有7只兔橈骨雙側(cè)骨皮質(zhì)連續(xù)，髓腔貫通，說明術(shù)后12周時骨缺損完全愈合。B組術(shù)后4周骨缺損處為連續(xù)性絮狀阻射影，斷端清晰。術(shù)后8周骨缺損區(qū)模糊，為連續(xù)性高密度阻射影，骨痂量增多。12周時骨缺損消失，5只骨皮質(zhì)連續(xù)，塑形好，髓腔復(fù)通。C組術(shù)后4周缺損區(qū)大部呈透光影，僅斷端周圍見絮狀阻射影。8周時見斷端清晰，缺損區(qū)有小片狀阻射影。術(shù)后12周見缺損區(qū)仍清晰，僅見兩端有少量骨痂生長。D組術(shù)后16周骨缺損區(qū)仍呈透亮影，骨斷端硬化、模糊，說明空白組術(shù)后16周骨缺損均無愈合。
(3)X線片影像學(xué)評分結(jié)果A、B、C組正位照片骨缺損修復(fù)評分從表1可看出，A組和B組在4、8、12周均較C組的放射影像學(xué)評分為優(yōu)(P＜0.05)，但A組和B組相比較無明顯差異(P均＞0.05)。正位片骨缺損部位阻射密度測量值從表2可看出，A、B、C組在4、8、12周的骨缺損阻射密度測量值有顯著性差異(P＜0.05)，在新生骨痂形成的多少和密度方面，A＞B＞C。
表1關(guān)于骨缺損修復(fù)的正位照片評分(X±s，n＝8)

表2關(guān)于骨缺損部位阻射密度測量值(X±s，n＝8)

實驗結(jié)果表明A、B組在Yang氏放射學(xué)評分及缺損區(qū)骨痂阻射密度測量方面均優(yōu)于單純FG組，而A、B兩組間雖在放射學(xué)評分上無明顯差別，但在骨痂形成質(zhì)量上，A組優(yōu)于B組。從該結(jié)果分析，PRP有明顯的促進骨缺損修復(fù)作用，而種子細胞的添加對增進骨痂形成起重要作用。
組織學(xué)切片觀察見實驗組為正常骨組織結(jié)構(gòu)，并有髓腔形成，對照組為纖維組織結(jié)構(gòu)，無明顯成骨。
結(jié)論PRP對骨缺損愈合有明顯促進作用，復(fù)合PRP的注射型材料與MSCs制備骨修復(fù)材料可修復(fù)兔橈骨節(jié)段性骨缺損。
權(quán)利要求1.一種注射型骨修復(fù)材料，其特征在于由纖維蛋白構(gòu)成凝膠狀的載體支架(1)，成纖維網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu)，其上負載有自體富血小板血漿(2)即PRP，構(gòu)成連接于骨斷端(3)之間的骨修復(fù)材料。
專利摘要本實用新型公開了一種注射型骨修復(fù)材料。本實用新型所述的注射型骨修復(fù)材料，由纖維蛋白構(gòu)成凝膠狀的載體支架，成纖維網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu)，其上負載有自體富血小板血漿即PRP。本實用新型所述的注射型骨修復(fù)材料兼有靈活應(yīng)用的注射型材料和自體生長因子二者的優(yōu)點，操作簡單，使用方便，可塑性好，可在體內(nèi)任意塑型成損傷部位的形狀，使新骨形狀完全恢復(fù)成原有的生理狀態(tài)，成骨效果明確，可適用于各種不規(guī)則骨缺損，且可在局部注射應(yīng)用，也可用于非手術(shù)方法治療骨折，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。
文檔編號A61L27/50GK2889301SQ200520057020
公開日2007年4月18日 申請日期2005年4月14日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月14日
發(fā)明者裴國獻, 黃愛文, 金丹, 曾憲利, 胡稷杰, 陳書軍, 張元平 申請人:南方醫(yī)院