專利名稱：促進hgf產(chǎn)生的含肝素類寡糖的藥劑的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種促進HGF產(chǎn)生的藥劑，該藥劑包括具有肝素結構的糖鏈化合物如低分子量寡糖、或其鹽。
背景技術：
對HGF(肝細胞生長因子)作為再生因子或治療因子給予了很大關注。HGF是基于其對肝細胞的促有絲分裂活性而發(fā)現(xiàn)的一種蛋白質(zhì)，但是，后來的研究表明，除肝細胞外，HGF還對許多上皮細胞和一些種類的間充質(zhì)細胞具有促有絲分裂活性。
還知道HGF不僅具有促有絲分裂活性，而且還具有各種活性如動力產(chǎn)生(motogenic)、形態(tài)發(fā)生(morphogenic)、抗凋亡和新血管形成的活性(Matsumoto，K等人，Kidney Int.，2001，vol.59，2023-2038頁)。根據(jù)HGF的這些藥理作用，已期望將它開發(fā)為以下藥劑肝硬變治療藥、腎病治療藥、上皮細胞生長促進藥、抗癌藥、癌癥治療中的副作用預防藥、肺病治療藥、胃或十二指腸損傷治療藥、腦神經(jīng)病治療藥、免疫抑制的副作用預防藥、膠原降解促進藥、軟骨病治療藥、動脈病治療藥、肺纖維化治療藥、肝病治療藥、血液凝固異常治療藥、血漿低蛋白治療藥、傷口愈合藥、神經(jīng)病改善藥、造血干細胞增加藥或毛發(fā)生長促進藥(參見JP-A-18028/1992、JP-A-49246/1992、EP-A-492614、JP-A-25010/1994、WO 03/8821、JP-A-172207/1994、JP-A-89869/1995、JP-A-40934/1994、WO 94/2165、JP-A-40935/1994、JP-A-56692/1994、JP-A-41429/1995、WO 93/3061和JP-A-213721/1993)。
HGF主要由間充質(zhì)細胞產(chǎn)生，它的產(chǎn)生量隨器官損害而增加。例如，當損傷發(fā)生在肝臟中時，HGF產(chǎn)生量在肝血管內(nèi)皮細胞和非肝細胞如Kupffer細胞和Ito細胞中增加。另一方面，此時，HGF的表達量也在其它器官如未損傷的肺、脾和腎中增加，因此血液中的HGF水平增加。這意味著在血液中存在響應器官損傷來誘導HGF表達的因子，這種因子被共同命名為“損傷因子(injurin)”(Matsumoto，K等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，1992，vol.89，3800-3804頁)。
損傷因子不是單一物質(zhì)，例如，細胞因子如白細胞介素-1、FGF(成纖維細胞生長因子)和PDGF(血小板衍生生長因子)和自身活性物質(zhì)如前列腺素都被確定為損傷因子。這些因子通過增加HGF mRNA的表達來促進HGF產(chǎn)生。另一方面，在損傷因子的研究過程中，發(fā)現(xiàn)肝素和硫酸乙酰肝素也對促進HGF產(chǎn)生有活性(Matsumoto，K.等人，J.Biochem.，1993，vol.114，820-826頁)。
據(jù)認為，肝素和硫酸乙酰肝素不會增加HGF mRNA的表達，但對轉(zhuǎn)錄過程后的步驟起作用。但是，詳細的機理是未知的。
肝素和硫酸乙酰肝素是被稱為糖胺聚糖(GAG)的多糖族的成員。肝素和硫酸乙酰肝素為通過重復二糖單元構建的多糖，所述二糖單元由D-葡糖胺和糖醛酸組成(Sugahara，K等人，IUBMB Life，2002，vol.54，163-175頁)。
肝素和硫酸乙酰肝素的分子量不是一致的，其中分子量為大約5000至30000的物質(zhì)以混合形式存在。D-葡糖胺殘基的6-位碳原子部分地發(fā)生O-硫酸化，D-葡糖胺殘基的氨基可發(fā)生N-乙?；騈-硫酸化。糖醛酸殘基以L-艾杜糖醛酸或D-葡糖醛酸存在。大多數(shù)糖醛酸殘基在肝素中以L-艾杜糖醛酸存在，而在硫酸乙酰肝素中，大多數(shù)糖醛酸殘基以D-葡糖醛酸存在。糖醛酸殘基的2-位碳原子部分地進行O-硫酸化。另外，硫酸化有時發(fā)生在另一部位，發(fā)生硫酸化的位置的這種多樣性提供了分子的結構多樣性。肝素總體上以比硫酸乙酰肝素高的程度進行硫酸化。但是，從組織中提取的肝素和硫酸乙酰肝素制備物是不一致的，這使得難以在兩個種類之間區(qū)分。
肝素在臨床上主要用作抗凝血藥。例如，肝素用于預防體外血液循環(huán)中的凝血，或用于治療或預防血栓形成疾病，包括彌漫性血管內(nèi)凝血綜合癥(DIC)和心肌梗死。肝素本身沒有抗凝血活性，但是，通過結合到抗凝血酶III(ATIII)或肝素輔因子II，它使用作凝血因子的各種絲氨酸蛋白酶失去活性，從而強烈抑制了凝血(Bourin，M.C.等人，Biochem.J.，1993，vol.289(Pt2)，313-330頁)。
盡管肝素已被用作類似這樣的藥物，但希望其另外用作促進HGF產(chǎn)生的藥劑(JP-A-312941/1994)。
如果肝素可用作促進HGF產(chǎn)生的藥劑，則通過HGF的上述藥理作用可預計到對各種疾病的治療效果。但是，當肝素用于促進HGF產(chǎn)生時，以前利用的肝素的抗凝血活性將導致出血傾向，這可能導致副作用。當對人施用肝素時，必須通過監(jiān)測抗凝血活性來小心地控制劑量，以預防在給藥過程中出血。特別地，由于未分級的高分子量肝素具有很強的抗凝血活性，因此在使用時應給予最小心的注意。因此，當用作促進HGF產(chǎn)生的藥劑時，肝素的抗凝血活性是一個缺陷。
另外，肝素還具有通過釋放血管壁中存在的LPL來增加脂蛋白脂肪酶(LPL)的活性(Olivecrona，T.等人，Haemostasis，1993，vol.23(Suppl.1)，150-160頁)。
LPL活性的增加通過脂肪降解來促進血液澄清，但LPL活性的持續(xù)增加提高了血液中的游離脂肪酸水平，并可能導致心律失常。
因此，強烈需要一種制備無抗凝血活性和LPL釋放活性、而只具有促進HGF產(chǎn)生活性的肝素或硫酸乙酰肝素的方法。
作為降低肝素抗凝血活性的方法，將肝素解聚至低分子量片段是已知的(Linhardt，R.J.等人，Semin.Thromb.Hemost.，1999，vol.25，Suppl.3，5-16頁)。如上所述，未分級的高分子量肝素具有很強的抗凝血活性，對于其實際使用需要小心注意。為了克服高分子量肝素的這種缺陷，使用低分子量肝素。如上所述，肝素的抗凝血活性歸因于肝素-ATIII復合物的形成。肝素-ATIII復合物結合到凝血酶(凝血因子IIa)或其它凝血因子(Xa、XIIa、XIa、IXa等)上，并使它們失去活性。為了抑制因子IIa，需要不小于十八糖的肝素分子大小。因此，高分子量肝素的主要作用特別歸因于因子IIa的失活，但也涉及到反因子Xa的作用。另一方面，當肝素被解聚至不大于十六糖的低分子大小時，已知抗凝血活性降低，因為在不小于十八糖的多糖中觀察到的反因子IIa活性被降低。(Holmer，E.等人，Haemostasis，1986，vol.16，Suppl.2，1-7頁；和Lane D.A.等人，Biochem.J.，1984，vol.218，725-732頁)。
另外，在低分子量肝素中，還已知LPL釋放活性被降低(Nasstrom，B.et al.，J.Lab.Clin.Med.，2003，vol.142，90-99頁)。
象這樣，通過將肝素解聚至低分子大小，可以降低抗凝血活性和LPL釋放活性，但本文中，如果肝素被解聚至低分子大小，則能否保持促進HGF產(chǎn)生的活性是未知的。已知被稱為低分子量肝素的達肝素鈉(Fragmin靜脈內(nèi)注射；Kissei Pharmaceutical Co.，Ltd.)具有HGF產(chǎn)生促進活性(Matsumoto，K.等人，J.Biochem.，1993，vol.114，820-826頁)。
但是，達肝素鈉具有5000的平均分子量、和從2000到9000的分子量分布。其中，造成促進HGF產(chǎn)生活性的分子大小是未知的。特別地，分子大小不大于十六糖(分子量為5000或更小)的寡糖是否能保持促進HGF產(chǎn)生活性是重要的，但這一點是完全未知的。
此外，還沒有已知的方法能降低肝素的抗凝血活性和LPL釋放活性，而不會將肝素解聚至低分子大小，且同時保持HGF產(chǎn)生促進活性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一種促進HGF產(chǎn)生的藥劑，該藥劑包括具有肝素結構但沒有或具有降低的肝素或肝素硫酸鹽抗凝血活性和LPL釋放活性的糖鏈化合物如寡糖、或其鹽。
為了解決上述問題，本發(fā)明人對肝素和硫酸乙酰肝素促進HGF產(chǎn)生的作用進行了深入研究。
結果，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，具有如下結構的二至十六糖的寡糖具有促進HGF產(chǎn)生的活性，在所述結構中通過α1，4-糖苷鍵或β1，4-糖苷鍵交替并重復地連接糖醛酸殘基和葡糖胺殘基，可通過將肝素或硫酸乙酰肝素解聚至低分子大小而得到所述寡糖。
另外，本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，上述寡糖的抗凝血活性和脂蛋白釋放活性降低。
迄今為止，根本不知道在肝素或硫酸乙酰肝素被解聚成不大于十六糖的低分子寡糖時是否能保持促進HGF產(chǎn)生的活性。尤其令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，甚至由通過α1，4-糖苷鍵或β1，4-糖苷鍵連接的糖醛酸殘基和葡糖胺殘基組成的二糖化合物也具有促進HGF產(chǎn)生的活性。本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，肝素或硫酸乙酰肝素中葡糖胺殘基6-位羥基或葡糖胺殘基2-位氨基的硫酸化增強了促進HGF產(chǎn)生的活性。因此，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，當改變肝素或肝素硫酸鹽的結構使得僅僅葡糖胺殘基6-位羥基被硫酸化或使得僅僅葡糖胺殘基2-位氨基被硫酸化時，抗凝血活性和LPL釋放活性就會降低，而不用將肝素或硫酸乙酰肝素解聚至低分子大小，同時保持了HGF產(chǎn)生促進活性。基于這些發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明人進一步擴展了研究并完成了本發(fā)明。
也就是說，本發(fā)明涉及(1)一種促進HGF產(chǎn)生的藥劑，該藥劑包括二糖或具有如下結構的三糖至十六糖或其鹽作為有效成分，其中所述二糖由通過α1，4-糖苷鍵或β1，4-糖苷鍵連接的糖醛酸殘基(其中糖醛酸是指艾杜糖醛酸或葡糖醛酸，并在下文中具有相同的含義)和葡糖胺殘基組成，在所述結構中通過α1，4-糖苷鍵或β1，4-糖苷鍵交替并重復地連接糖醛酸殘基和葡糖胺殘基，其中糖醛酸殘基和/或葡糖胺殘基的至少一個羥基可被硫酸化、烷基化、酰化或胺化，和/或至少一個葡糖胺殘基的2-位氨基可被硫酸化、烷基化或?；?2)如上面(1)所述的促進HGF產(chǎn)生的藥劑，其中至少一個糖醛酸殘基的2-位羥基和/或至少一個葡糖胺殘基的3-位和/或6-位羥基可被硫酸化；(3)如上面(1)或(2)所述的促進HGF產(chǎn)生的藥劑，其中至少一個葡糖胺殘基的6-位羥基和/或2-位氨基被硫酸化，(4)如上面(1)至(3)中任一項所述的促進HGF產(chǎn)生的藥劑，其中寡糖為二糖至十糖；(5)如上面(1)至(4)中任一項所述的促進HGF產(chǎn)生的藥劑，其中寡糖為通過用肝素酶或乙酰肝素酶(heparitinase)消化高分子量肝素或高分子量硫酸乙酰肝素而制得的降解產(chǎn)物；(6)如上面(1)至(4)中任一項所述的促進HGF產(chǎn)生的藥劑，其中寡糖為通過用亞硝酸降解、過氧化氫降解或β-消除中的任意一種方式消化高分子量肝素或高分子量硫酸乙酰肝素而制得的降解產(chǎn)物；(7)如上面(1)所述的促進HGF產(chǎn)生的藥劑，其中寡糖為用下面(a)至(h)表示的化合物中的任意一種
(a)式(I) 其中R1表示氫、硫酸基、烷基、?；蛉芜x取代的氨基，R2表示氫、硫酸基、烷基或?；?，R3和R4彼此不同，并表示氫或任選取代的羧基，n表示0至7，(b)式(II) 其中所有符號分別與上面的定義相同，(c)式(III) 其中所有符號分別與上面的定義相同，(d)式(IV) 其中所有符號分別與上面的定義相同，
(e)式(V) 其中m表示0至6，R1、R2、R3和R4分別與上面的定義相同，(f)式(VI) 其中m表示0至6，R1、R2、R3和R4分別與上面的定義相同，(g)式(VII) 其中m表示0至6，R1、R2、R3和R4分別與上面的定義相同，(h)式(VIII) 其中m表示0至6，R1、R2、R3和R4分別與上面的定義相同，(8)一種促進HGF產(chǎn)生的藥劑，該藥劑包括具有如下結構的糖鏈化合物或其鹽作為有效成分，在所述結構中通過α1，4-糖苷鍵或β1，4-糖苷鍵交替并重復地連接糖醛酸殘基和葡糖胺殘基，其中至少一個葡糖胺殘基的6-位羥基被硫酸化；
(9)一種促進HGF產(chǎn)生的藥劑，該藥劑包括具有如下結構的糖鏈化合物或其鹽作為有效成分，在所述結構中通過α1，4-糖苷鍵或β1，4-糖苷鍵交替并重復地連接糖醛酸殘基和葡糖胺殘基，其中至少一個葡糖胺殘基的2-位氨基被硫酸化；(10)一種促進HGF產(chǎn)生的藥劑，該藥劑包括二糖化合物或其鹽作為有效成分，所述二糖化合物由通過α1，4-糖苷鍵或β1，4-糖苷鍵連接的糖醛酸殘基和葡糖胺殘基組成，其中葡糖胺殘基的6-位羥基和/或葡糖胺殘基的2-位氨基被硫酸化；和(11)如上面(1)至(10)中任一項所述的促進HGF產(chǎn)生的藥劑，其中糖鏈化合物或其鹽沒有或具有降低的抗凝血活性和/或脂蛋白脂酶釋放活性。
另外，本發(fā)明涉及(12)一種促進HGF產(chǎn)生的方法，其特征在于，對哺乳動物施用有效量的二糖或具有如下結構的三糖至十六糖或其鹽，其中所述二糖由通過α1，4-糖苷鍵或β1，4-糖苷鍵連接的糖醛酸殘基(其中糖醛酸是指艾杜糖醛酸或葡糖醛酸，并在下文中具有相同的含義)和葡糖胺殘基組成，在所述結構中通過α1，4-糖苷鍵或β1，4-糖苷鍵交替并重復地連接糖醛酸殘基和葡糖胺殘基，其中糖醛酸殘基和/或葡糖胺殘基的至少一個羥基可被硫酸化、烷基化、?；虬坊?，和/或至少一個葡糖胺殘基的2-位氨基可被硫酸化、烷基化或?；?；(13)如上面(12)所述的促進HGF產(chǎn)生的方法，其中至少一個糖醛酸殘基的2-位羥基和/或至少一個葡糖胺殘基的3-位和/或6-位羥基可被硫酸化；(14)如上面(12)所述的促進HGF產(chǎn)生的方法，其中至少一個葡糖胺殘基的6-位羥基和/或2-位氨基被硫酸化；
(15)如上面(12)所述的促進HGF產(chǎn)生的方法，其中寡糖為二糖至十糖；(16)如上面(12)所述的促進HGF產(chǎn)生的方法，其中寡糖為通過用肝素酶或乙酰肝素酶消化高分子量肝素或高分子量硫酸乙酰肝素而制得的降解產(chǎn)物；(17)如上面(12)所述的促進HGF產(chǎn)生的方法，其中寡糖為通過用亞硝酸降解、過氧化氫降解或β-消除中的任意一種方式處理高分子量肝素或高分子量硫酸乙酰肝素而制得的降解產(chǎn)物；(18)如上面(12)所述的促進HGF產(chǎn)生的方法，其中寡糖為用下面(a)至(h)表示的化合物中的任意一種(a)式(I) 其中R1表示氫、硫酸基、烷基、酰基或任選取代的氨基，R2表示氫、硫酸基、烷基或酰基，R3和R4彼此不同，表示氫或任選取代的羧基，n表示0至7，(b)式(II) 其中所有符號分別與上面的定義相同，
(c)式(III) 其中所有符號分別與上面的定義相同，(d)式(IV) 其中所有符號分別與上面的定義相同，(e)式(V) 其中m表示0至6，R1、R2、R3和R4分別與上面的定義相同，(f)式(VI) 其中m表示0至6，R1、R2、R3和R4分別與上面的定義相同，
(g)式(VII) 其中m表示0至6，R1、R2、R3和R4分別與上面的定義相同，(h)式(VIII) 其中m表示0至6，R1、R2、R3和R4分別與上面的定義相同；(19)一種促進HGF產(chǎn)生的方法，其特征在于，對哺乳動物施用有效量的具有如下結構的糖鏈化合物或其鹽，在所述結構中通過α1，4-糖苷鍵或β1，4-糖苷鍵交替并重復地連接糖醛酸殘基和葡糖胺殘基，其中至少一個葡糖胺殘基的6-位羥基被硫酸化；(20)一種促進HGF產(chǎn)生的方法，其特征在于，對哺乳動物施用有效量的具有如下結構的糖鏈化合物或其鹽，在所述結構中通過α1，4-糖苷鍵或β1，4-糖苷鍵交替并重復地連接糖醛酸殘基和葡糖胺殘基，其中至少一個葡糖胺殘基的2-位氨基被硫酸化；(21)一種促進HGF產(chǎn)生的方法，其特征在于，對哺乳動物施用有效量的二糖化合物或其鹽，所述二糖化合物由通過α1，4-糖苷鍵或β1，4-糖苷鍵連接的糖醛酸殘基和葡糖胺殘基組成，其中葡糖胺殘基的6-位羥基和/或2-位氨基被硫酸化；和(22)如上面(12)至(21)中任一項所述的促進HGF產(chǎn)生的方法，其中糖鏈化合物或其鹽沒有或具有降低的抗凝血活性和/或脂蛋白脂酶釋放活性。
此外，本發(fā)明涉及(23)二糖或具有如下結構的三糖至十六糖或其鹽在制備促進HGF產(chǎn)生的藥物中的用途，其中所述二糖由通過α1，4-糖苷鍵或β1，4-糖苷鍵連接的糖醛酸殘基(其中糖醛酸是指艾杜糖醛酸或葡糖醛酸，并在下文中具有相同的含義)和葡糖胺殘基組成，在所述結構中通過α1，4-糖苷鍵或β1，4-糖苷鍵交替并重復地連接糖醛酸殘基和葡糖胺殘基，其中糖醛酸殘基和/或葡糖胺殘基的至少一個羥基可被硫酸化、烷基化、酰化或胺化，和/或至少一個葡糖胺殘基的2-位氨基可被硫酸化、烷基化或?；?；(24)如上面(23)所述的用途，其中至少一個糖醛酸殘基的2-位羥基和/或至少一個葡糖胺殘基的3-位和/或6-位羥基可被硫酸化；(25)如上面(23)所述的用途，其中至少一個葡糖胺殘基的6-位羥基和/或2-位氨基被硫酸化；(26)如上面(23)所述的用途，其中寡糖為二糖至十糖；(27)如上面(23)所述的用途，其中寡糖為通過用肝素酶或乙酰肝素酶消化高分子量肝素或高分子量硫酸乙酰肝素而制得的降解產(chǎn)物；(28)如上面(23)所述的用途，其中寡糖為通過用亞硝酸降解、過氧化氫降解或β-消除中的任意一種方式處理高分子量肝素或高分子量硫酸乙酰肝素而制得的降解產(chǎn)物；(29)如上面(23)所述的用途，其中寡糖為用下面(a)至(h)表示的化合物中的任意一種
(a)式(I) 其中R1表示氫、硫酸基、烷基、?；蛉芜x取代的氨基，R2表示氫、硫酸基、烷基或?；琑3和R4彼此不同，并表示氫或任選取代的羧基，n表示0至7，(b)式(II) 其中所有符號分別與上面的定義相同，(c)式(III) 其中所有符號分別與上面的定義相同，(d)式(IV) 其中所有符號分別與上面的定義相同，
(e)式(V) 其中m表示0至6，R1、R2、R3和R4分別與上面的定義相同，(f)式(VI) 其中m表示0至6，R1、R2、R3和R4分別與上面的定義相同，(g)式(VII) 其中m表示0至6，R1、R2、R3和R4分別與上面的定義相同，和(h)式(VIII) 其中m表示0至6，R1、R2、R3和R4分別與上面的定義相同；(30)具有如下結構的糖鏈化合物或其鹽在制備促進HGF產(chǎn)生的藥物中的用途，在所述結構中通過α1，4-糖苷鍵或β1，4-糖苷鍵交替并重復地連接糖醛酸殘基和葡糖胺殘基，其中至少一個葡糖胺殘基的6-位羥基被硫酸化；
(31)具有如下結構的糖鏈化合物或其鹽在制備促進HGF產(chǎn)生的藥物中的用途，在所述結構中通過α1，4-糖苷鍵或β1，4-糖苷鍵交替并重復地連接糖醛酸殘基和葡糖胺殘基，其中葡糖胺殘基的至少一個2-位氨基被硫酸化；(32)二糖化合物或其鹽在制備促進HGF產(chǎn)生的藥物中的用途，所述二糖化合物由通過α1，4-糖苷鍵或β1，4-糖苷鍵連接的糖醛酸殘基和葡糖胺殘基組成，其中葡糖胺殘基的6-位羥基和/或2-位氨基被硫酸化；和(33)如上面(23)至(32)中任一項所述的用途，其中糖鏈化合物或其鹽沒有或具有降低的抗凝血活性和/或脂蛋白脂酶釋放活性。
盡管在本發(fā)明的促進HGF產(chǎn)生的藥劑中使用的糖鏈化合物如寡糖具有由重復二糖構建的肝素結構，所述二糖由通過α1，4-糖苷鍵或β1，4-糖苷鍵連接的糖醛酸殘基和葡糖胺殘基組成，但它們可促進HGF產(chǎn)生，且沒有或具有很少的出血傾向副作用。糖鏈化合物具有促進活體的組織和器官損傷愈合的作用。更具體地說，糖鏈化合物可用于治療肝病、腎病、皮膚病、血液病、眼病、肺病、胃或十二指腸病、癌癥和其相關病癥、骨病和中樞病。
附圖簡述

圖1顯示了凝膠過濾柱上解聚肝素產(chǎn)物的分離圖。
圖2顯示了肝素片段促進HGF產(chǎn)生的活性。
圖3顯示了陰離子交換柱上肝素十糖片段的分離圖。
圖4顯示了通過陰離子交換色譜法分離的肝素十糖片段的HGF產(chǎn)生促進活性。
圖5顯示了通過陰離子交換色譜法分離的肝素十糖片段的MALDI-TOF/MS分析的結果。
圖6顯示了在不同位置被硫酸化的各種二糖的HGF產(chǎn)生促進活性。
圖7顯示了肝素片段的抗凝血活性，其通過活化部分凝血活酶時間(下文中縮寫為APTT)來評價。
圖8顯示了肝素片段的LPL釋放活性。
圖9顯示了在不同位置硫酸化的各種二糖化合物的抗凝血活性，其用APTT評價。
圖10顯示了在不同位置硫酸化的各種二糖化合物的脂蛋白脂酶(下文中縮寫為LPL)釋放活性。
圖11顯示了其中只有葡糖胺殘基的2-位氨基被硫酸化的修飾肝素的HGF產(chǎn)生促進活性。
圖12顯示了其中只有葡糖胺殘基的2-位氨基被硫酸化的修飾肝素的抗凝血活性。
本發(fā)明的最佳實施方式在本發(fā)明中，肝素結構是指在該結構中，用α1，4-糖苷鍵或β1，4-糖苷鍵交替并重復地連接糖醛酸殘基和葡糖胺殘基。
糖醛酸殘基可以是L-艾杜糖醛酸殘基(以下簡寫為IdoA)或D-葡糖醛酸殘基(以下簡寫為GlcA)。糖醛酸殘基可以僅作為IdoA或僅作為GlcA存在，或者作為IdoA和GlcA兩者存在，對IdoA和GlcA的比例沒有具體限定。
而且，本發(fā)明的寡糖是指由糖醛酸和葡糖胺兩種不同糖組成的雜寡糖，具體為由用α1，4-糖苷鍵或β1，4-糖苷鍵連接的糖醛酸殘基和葡糖胺殘基組成的二糖化合物；由用α1，4-糖苷鍵或β1，4-糖苷鍵連接的糖醛酸殘基或葡糖胺殘基與所述二糖化合物組成的三糖化合物；或具有如下結構的四糖至十六糖的糖鏈化合物，在該結構中，用α1，4-糖苷鍵或β1，4-糖苷鍵交替并重復地連接糖醛酸殘基和葡糖胺殘基。
此外，在本發(fā)明中，烷基化是指用烷基、優(yōu)選低碳烷基取代糖醛酸殘基中羥基的氫，或/和取代葡糖胺殘基中羥基或/和氨基的氫。
?；侵赣檬?(C＝O)-R5、-(C＝O)-OR5、-(C＝O)-NR5R6、-(C＝S)-NHR5、-SO-R5、-SO2-R5或-SO2-NHR5(其中R5和R6表示氫原子或烴基)表示的酰基取代糖醛酸殘基中羥基的氫，或/和取代葡糖胺殘基中羥基或/和氨基的氫。在上述式中，由R5和R6表示的烴基例子包括鏈烴基(例如烷基、烯基、炔基等)。對于烷基，優(yōu)選低碳烷基。對于烯基，優(yōu)選例如C2-6烯基(例如乙烯基、烯丙基、異丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、3-丁烯基、2-甲基-2-丙烯基、1-甲基-2-丙烯基、2-甲基-1-丙烯基等)。對于炔基，優(yōu)選例如C2-6炔基(例如乙炔基、炔丙基、1-丁炔基、2-丁炔基、3-丁炔基、1-己炔基等)。
氨基化是指用氨基取代糖醛酸殘基中羥基的氫，或/和取代葡糖胺殘基中羥基的氫。可以進一步用硫酸基、烷基或酰基取代氨基。
在本發(fā)明中，“低碳烷基”是指具有1至6個碳原子的烷基，例如甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、己基等。
在構成糖鏈化合物如用于本發(fā)明藥劑的寡糖的糖醛酸殘基中，可以將2-位和3-位的至少一個羥基硫酸化、烷基化、酰化或胺化。優(yōu)選硫酸化，特別優(yōu)選將2-位羥基硫酸化。
在構成糖鏈化合物如用于本發(fā)明藥劑的寡糖的葡糖胺殘基中，可以將2-位氨基硫酸化、烷基化或?；?，優(yōu)選硫酸化或?；鼉?yōu)選硫酸化。在酰化時，更優(yōu)選用-(C＝O)-R5酰化，特別是，用乙酰基?；翘貏e優(yōu)選的。
此外，在葡糖胺殘基中，可以將3-位和6-位的至少一個羥基硫酸化、烷基化或?；?，優(yōu)選硫酸化。特別優(yōu)選將6-位羥基硫酸化。
隨著由糖醛酸殘基和葡糖胺殘基組成的二糖的重復數(shù)量增加，促進HGF產(chǎn)生的本發(fā)明寡糖的活性也增加。另一方面，隨著二糖重復數(shù)量減少，抗凝血活性和LPL釋放活性也降低?？紤]這些事實，從能夠促進HGF產(chǎn)生，且沒有或具有更少的抗凝血活性和LPL釋放活性副作用的觀點，在本發(fā)明中使用二糖至十六糖，優(yōu)選二糖至十糖。
關于本發(fā)明的促進HGF產(chǎn)生的藥劑中所使用的二糖至十六糖，促進HGF產(chǎn)生的活性隨著每分子硫酸化程度的增加而增加。優(yōu)選的硫酸化程度為每兩個糖殘基約1至3個硫酸基。
雖然對二糖至十六糖中硫酸基的位置沒有限定，但優(yōu)選將糖鏈化合物中至少一個葡糖胺殘基的6-位羥基和/或2-位氨基硫酸化。當象這樣硫酸化糖鏈化合物時，可以不必在糖鏈化合物的其它位置硫酸化。對于二糖化合物，優(yōu)選將葡糖胺殘基中6-位羥基和/或2-位氨基中的至少一個硫酸化。
對于本發(fā)明的促進HGF產(chǎn)生的藥劑中所使用的寡糖，其優(yōu)選例子包括下面所示的化合物和其鹽。
(a)式(I) (其中R1表示氫、硫酸基、烷基、?；蛉芜x取代的氨基，R2表示氫、硫酸基、烷基或?；琑3和R4彼此不同，表示氫或任選取代的羧基，n表示0至7)；
(b)式(II) (其中所有符號分別與上面定義的相同)；(c)式(III) (其中所有符號分別與上面定義的相同)；(d)式(IV) (其中所有符號分別與上面定義的相同)；(e)式(V) (其中m表示0至6，R1、R2、R3和R4分別與上面定義的相同)；
(f)式(VI) (其中m表示0至6，R1、R2、R3和R4分別與上面定義的相同)；(g)式(VII) (其中m表示0至6，R1、R2、R3和R4分別與上面定義的相同)；(h)式(VIII) (其中m表示0至6，R1、R2、R3和R4分別與上面定義的相同)；(i)由用α1，4-糖苷鍵或β1，4-糖苷鍵連接的糖醛酸殘基和葡糖胺殘基組成的二糖化合物，其中僅葡糖胺殘基的6-位羥基被硫酸化；(j)由用α1，4-糖苷鍵或β1，4-糖苷鍵連接的糖醛酸殘基和葡糖胺殘基組成的二糖化合物，其中僅葡糖胺殘基的2-位氨基被硫酸化。
對于上述式(I)至(VIII)中所示由R1和R2表示的烷基，優(yōu)選具有1至6個碳原子的低碳烷基，其例子包括甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、己基等。由R1和R2表示的?；影ㄓ墒?(C＝O)-R3、-(C＝O)-OR3、-(C＝O)-NR3R4、-(C＝S)-NHR3、-SO-R5、-SO2-R5或-SOX-NHR3(其中R3和R4分別表示氫原子或烴基，R4表示氫原子或具有1至6個碳原子的低碳烷基，R5表示任選地具有取代基的烴基)表示的那些。在?；?，優(yōu)選-(C＝O)-R3，特別優(yōu)選乙?；Ｔ谏鲜鍪街?，由R3和R5表示的烴基例子包括鏈烴基(例如烷基、烯基、炔基等)。對于烷基，優(yōu)選具有1至6個碳原子的低碳烷基(例如甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、己基等)。對于烯基，優(yōu)選例如C2-6烯基(例如乙烯基、烯丙基、異丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、3-丁烯基、2-甲基-2-丙烯基、1-甲基-2-丙烯基、2-甲基-1-丙烯基等)。對于炔基，優(yōu)選例如C2-6炔基(例如乙炔基、炔丙基、1-丁炔基、2-丁炔基、3-丁炔基、1-己炔基等)。
可取代在式(I)至(VIII)中所示的R2中所用的氨基的取代基例子包括硫酸基、烷基和?；?，優(yōu)選硫酸基和酰基，更優(yōu)選硫酸基。對于?；?，更優(yōu)選-(C＝O)-R5，特別優(yōu)選乙酰基。烷基和?；侵概c關于在R1和R2使用的烷基和?；鱿嗤娜〈?。
作為R1和R2的優(yōu)選組合，R1為氫或硫酸基，R2為氫、硫酸基或?；?。在這種情況下，作為?；?，優(yōu)選-(C＝O)-R3，特別優(yōu)選乙酰基。
n為0至7，優(yōu)選0至4，m為0至6，優(yōu)選0至4。
作為上述寡糖如由式(I)至(VIII)表示的化合物的鹽，包括堿金屬鹽如鋰鹽、鈉鹽和鉀鹽；堿土金屬鹽如鈣鹽；酸的鹽如無機酸鹽(例如鹽酸鹽、硫酸鹽、氫溴酸鹽、磷酸鹽等)和有機酸鹽(例如乙酸鹽、三氟乙酸鹽、琥珀酸鹽、馬來酸鹽、延胡索酸鹽、丙酸鹽、檸檬酸鹽、酒石酸鹽、乳酸鹽、草酸鹽、甲磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽等)。
通?？梢杂筛嗡鼗蛄蛩嵋阴８嗡刂苽湓诒景l(fā)明的促進HGF產(chǎn)生的藥劑中所使用的寡糖或其鹽。肝素可以是高分子量肝素或低分子量肝素，硫酸乙酰肝素可以是高分子量硫酸乙酰肝素或低分子量硫酸乙酰肝素?？梢酝ㄟ^碎裂高分子量肝素或高分子量硫酸乙酰肝素來獲得用于本發(fā)明的寡糖或其鹽。起始高分子量肝素或高分子量硫酸乙酰肝素可以是從生物材料中提取獲得的那些，或通過化學合成制備的那些或其類似物。
為了通過從生物材料中提取來產(chǎn)生高分子量肝素或高分子量硫酸乙酰肝素作為原材料，可以使用包括人體組織在內(nèi)的各種哺乳動物組織(例如脾、肺、肌肉等)，通常，使用源自豬或綿羊的腸粘膜或源自牛肺的那些組織。肝素的優(yōu)選來源是豬的腸粘膜。通常，可以按如下所述從經(jīng)選擇的組織來源中制備肝素。使組織材料自溶，從中用堿制備組織提取物，使蛋白質(zhì)凝固，通過氧化從上清液中沉淀肝素-蛋白質(zhì)復合物。使用極性非水溶劑如乙醇、丙酮及其混合物，通過再沉淀回收該復合物，用有機溶劑如乙醇通過提取除去脂肪。然后用蛋白酶如胰蛋白酶處理復合物，以除去蛋白質(zhì)。制備肝素的方法描述于例如日本藥典(第十四版)或Charles，A.F.等人的論文(Biochem.J.，1936，vol.30，p.1927-1933)中，改進方法也是已知的，如“肝素的化學和生物學”(Chemistry and Biology of Heparin)(1981)(由Lundblad，R.L.等人編輯，Elsevier Publishers，North Holland，New York)中所公開的。通常，可以用常規(guī)方法從組織中獲得高分子量肝素或高分子量硫酸乙酰肝素，通過該方法將肝素制成為抗凝血藥(Linhardt，R.J.等人，Semin.Thromb.Hemost.，1999，vol.25，Suppl.3，p.5至16)。
如上所述，通過從生物材料提取而獲得的高分子量肝素或高分子量硫酸乙酰肝素是由作為構成單元的二糖重復組成的多糖，該二糖包括糖醛酸(IdoA或GlcA)和葡糖胺。在肝素和硫酸乙酰肝素兩者中都存在GlcA和IdoA。在肝素中更富含IdoA作為糖醛酸，而硫酸乙酰肝素中富含GlcA。GlcA和IdoA作為混合物存在，因為GlcA殘基的5-位碳原子發(fā)生了部份差向異構化，因此使GlcA轉(zhuǎn)化為IdoA。相應地，隨著硫酸乙酰肝素變得更類似肝素，IdoA/GlcA的比率增加。
或者，可以化學合成高分子量肝素或高分子量硫酸乙酰肝素或它們的類似物作為原材料。在這種情況下，它們的組成可以不等于上述天然產(chǎn)物的組成，但是，通常所稱的“肝素”或“硫酸乙酰肝素”或它們的類似物可以用作寡糖或其鹽的原材料，所述寡糖或其鹽用于本發(fā)明的促進HGF產(chǎn)生的藥劑中。
此外，在本發(fā)明中，可以使用分子量為3000至6000的低分子量肝素或低分子量硫酸乙酰肝素作為原材料。在分子量為3000至6000的低分子量肝素中，抗Xa因子的活性很強，而其抗凝血酶活性很弱，因為其出血的危險較小，所以在臨床上使用這種低分子量肝素。分子量為3000至6000的低分子量肝素的血小板聚集作用很弱，從血管壁釋放LPL等的作用也很弱。此外，低分子量肝素顯示了通過皮下注射可被充分吸收。由于這些因素，近年來開發(fā)了對低分子量肝素的利用。在在本發(fā)明的促進HGF產(chǎn)生的藥劑中使用的寡糖或其鹽的分子大小可以進一步低于分子量為3000至6000的低分子量肝素或低分子量硫酸乙酰肝素的分子大小。因此，即使通常稱為低分子量肝素或低分子量硫酸乙酰肝素的那些物質(zhì)也可以用作在本發(fā)明的促進HGF產(chǎn)生的藥劑中寡糖或其鹽的原材料。
為了使高分子量肝素或高分子量硫酸乙酰肝素或分子量為3000至6000的低分子量肝素片段化，使用酶方法或化學方法裂解糖苷鍵。對于酶消化，使用酶如肝素酶和乙酰肝素酶。例如，可以通過使用能將肝素解聚為低分子片段的肝素降解酶如乙酰肝素酶I、乙酰肝素酶II和肝素酶，來降解高分子量肝素或高分子量硫酸乙酰肝素，從而制備本發(fā)明的寡糖。通常，酶促反應在約20℃至45℃、優(yōu)選約30℃至40℃下進行3小時或更長時間，優(yōu)選6小時或更長時間，更優(yōu)選約8小時至12小時，每100mg起始高分子量肝素或高分子量硫酸乙酰肝素的酶用量為約0.02U至2.0U，優(yōu)選約0.1U至1.0U。但是，反應條件不限于上述條件，而是可以適當改變。對于化學降解，可以使用已知方法如硝酸降解法、過氧化氫降解法、和β-消除法(Linhardt，R.J.等人，Semin.Thromb.Hemost.，1999，vol.25，Suppl.3，p5至16)。
為了從分級的高分子量肝素或高分子量硫酸乙酰肝素的混合物中獲得和純化用于本發(fā)明的寡糖或其鹽，可以單獨或組合使用凝膠過濾色譜法和離子交換色譜法。例如，當在凝膠過濾色譜法中使用由Amersham Bioscience制造的Superdex 30pg色譜柱(色譜柱1.6cm×60cm，流速0.4ml/min)時，可以在約135分鐘至138分鐘洗脫十六糖級分，在約140分鐘至144分鐘洗脫十四糖級分，在約146分鐘至151分鐘洗脫十二糖級分，在約154分鐘至161分鐘洗脫十糖級分，在約163分鐘至172分鐘洗脫八糖級分，在約175分鐘至188分鐘洗脫六糖級分，在約190分鐘至209分鐘洗脫四糖級分，在約216分鐘至249分鐘洗脫二糖級分。通過離子交換色譜法進一步分離上述分級獲得的寡糖，可以獲得包括具有均勻結構的物質(zhì)的級分。當使用離子交換色譜法時，優(yōu)選通過常規(guī)方法將所得級分除鹽，因為級分的鹽濃度經(jīng)常變得很高。
在純化過程中優(yōu)選包括使用結合抗凝血酶III的樹脂的柱色譜法步驟。因為，當包括該步驟時，可以通過回收沒有被吸附到色譜柱上的級分來獲得沒有抗Xa因子活性的寡糖。因此，可以獲得完全除去抗凝血活性的寡糖。因為流過抗凝血酶III色譜柱的寡糖保留了促進HGF產(chǎn)生的活性，所以可以將它們應用于本發(fā)明。
此外，可以用已知方法將通過上述方法獲得的寡糖硫酸化、烷基化、?；虬坊?br> 可以通過化學合成來人工合成在本發(fā)明的促進HGF產(chǎn)生的藥劑中使用的寡糖或其鹽。例如，可以通過從IdoA或GlcA或其衍生物、和葡糖胺或其衍生物中合成二糖單元，并聚合這些二糖單元，從而制得上述寡糖或其鹽(Karst，N.A.and Linhardt，R.J.，Curr.Med.Chem.，2003，vol.10，p.1993-2031，Lee，J.C.，J.Am.Chem.Soc.，2004，vol.126，p.476-7)。或者，可以使用組合了化學反應和酶促反應的化學酶促合成來獲得這些寡糖(Kuberan，B.等人，J.Biol.Chem.，2003，vol.278，p.52613-21)。上述那些化學合成和化學酶促合成對于選擇性地硫酸化葡糖胺殘基的6-位羥基和/或2-位氨基特別有效。
此外，本發(fā)明的促進HGF產(chǎn)生的藥劑不限于上述獲得的寡糖。
具有如下結構的不小于十七糖的糖鏈化合物可以促進HGF產(chǎn)生的藥劑，在該結構中，用α1，4-糖苷鍵或β1，4-糖苷鍵交替并重復地連接糖醛酸殘基和葡糖胺殘基，其中至少一個葡糖胺殘基的6-位羥基或至少一個葡糖胺殘基的2-位氨基被硫酸化，其它羥基或其它氨基未被硫酸化，因為與肝素相比，所述糖鏈化合物具有更低的抗凝血活性和更低的LPL釋放活性，同時保留了促進HGF產(chǎn)生的活性?？梢酝ㄟ^例如化學修飾上述肝素或硫酸乙酰肝素來制備這種糖鏈化合物。
不小于十七糖的糖鏈化合物的糖鏈長度通常不大于500糖，優(yōu)選不大于300糖，更優(yōu)選不大于200糖。
不小于十七糖的糖鏈化合物鹽的例子包括以上述寡糖的鹽為例子的鹽。
可以通過比較在產(chǎn)生HGF的細胞培養(yǎng)基中添加與不添加糖鏈化合物如寡糖或其鹽時HGF的濃度，來測定本發(fā)明藥劑促進HGF產(chǎn)生的活性，其中可以通過ELISA測定HGF的濃度。作為產(chǎn)生HGF的細胞，可以使用MRC-5細胞和MRC-9細胞、人胎肺成纖維細胞。
可以按照用于測定低分子量肝素抗凝血活性的已知方法，通過測定活化部分凝血活酶時間(APTT)或抗Xa因子活性，來評價本發(fā)明的促進HGF產(chǎn)生的藥劑中所用的糖鏈化合物如寡糖或其鹽的抗凝血活性。
可以通過將糖鏈化合物或其鹽施用至小鼠或大鼠，在一定時間后取出血漿，并測定血漿中LPL的量，來評價在本發(fā)明的促進HGF產(chǎn)生的藥劑中所使用的糖鏈化合物如寡糖或其鹽的LPL釋放活性?？梢酝ㄟ^測定LPL活性、或用ELISA測定LPL蛋白質(zhì)的質(zhì)量來確定血漿中LPL的量。
因為本發(fā)明的藥劑能促進HGF的產(chǎn)生，所以它能通過HGF的藥理作用有效地防止或治療各種疾病。本發(fā)明的促進HGF產(chǎn)生的藥劑具有各種用途，例如作為肝疾病治療劑、腎疾病治療劑、傷口愈合劑、皮膚潰瘍治療劑、毛根細胞增殖劑、抗癌劑、肺損傷治療劑、和癌癥治療中的副作用防止劑。更具體地，本發(fā)明的藥劑可用于防止或治療如下疾病，例如肝疾病(例如肝炎、肝硬化、肝衰竭、外科手術后的肝再生等)、腎疾病(例如腎小球腎炎、腎功能不全、腎貧血、糖尿病性腎病、給藥后的腎損傷等)、皮膚疾病(例如白斑、燒傷、褥瘡、皮膚潰瘍、脫發(fā)等)、血液疾病(例如血小板減少癥、骨髓移植等)、眼疾病(例如角膜潰瘍等)、肺疾病(例如肺炎、肺氣腫、肺結核、慢性阻塞性肺疾病、塵肺、肺纖維癥等)、胃或十二脂腸疾病(例如胃炎、胃潰瘍、十二脂腸潰瘍等)、癌癥疾病和相關疾病(例如各種癌癥、癌癥治療中的副作用例如肝毒性、腎毒性、惡心、嘔吐、血小板減少、脫發(fā)等)、骨疾病(例如骨質(zhì)疏松、骨發(fā)育不良、骨關節(jié)炎等)、和中樞疾病(例如神經(jīng)分化異常癥等)。
本發(fā)明的促進HGF產(chǎn)生的藥劑可以采用各種制劑形式(例如注射劑、固體制劑、膠囊等)，優(yōu)選將寡糖或其鹽與常規(guī)載體一起制成為注射劑?？梢酝ㄟ^常規(guī)方法制備注射劑，可以在約0.0001w/v％至5w/v％的范圍內(nèi)適當調(diào)整注射劑中寡糖或其鹽的濃度?？梢酝ㄟ^例如將寡糖或其鹽溶于合適的溶劑(例如無菌水、緩沖液、生理鹽水等)中，在無菌條件下用過濾器過濾溶液，將溶液裝入到無菌容器中，從而制得該注射劑。優(yōu)選的常規(guī)載體包括穩(wěn)定劑如清蛋白、球蛋白、明膠、甘露醇、葡萄糖、右旋糖苷、乙二醇等。此外，可以將寡糖或其鹽溶于溶液中，該溶液包含制劑所必需的可藥用添加劑，例如等張劑(例如氯化鈉、氯化鉀、甘油、甘露醇、山梨醇、硼酸、硼砂、丙二醇等)、緩沖液(例如磷酸緩沖液、乙酸緩沖液、硼酸緩沖液、碳酸緩沖液、檸檬酸緩沖液、三羥甲基氨基甲烷緩沖液、谷氨酸緩沖液、ε-氨基己酸緩沖液等)、防腐劑(對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯、對羥基苯甲酸丁酯、氯代丁醇、苯甲醇、苯扎氯銨、脫氫醋酸鈉、依地酸鈉、硼酸、硼砂等)、增稠劑(羥乙基纖維素、羥丙基纖維素、聚乙烯醇、聚乙二醇等)、穩(wěn)定劑(亞硫酸氫鈉、硫代硫酸鈉、依地酸鈉、檸檬酸鈉、抗壞血酸、二丁基羥基甲苯等)、或pH調(diào)節(jié)劑(鹽酸、氫氧化鈉、磷酸、乙酸等)，在無菌條件下用過濾器過濾所得溶液，然后裝入到無菌容器中。此外，可以使用適當?shù)脑鋈軇┤绱?例如乙醇等)、多元醇(例如丙二醇、聚乙二醇等)、和非離子型表面活性劑(例如聚山梨酯80、聚氧乙烯硬化的蓖麻油50等)。通常將配制的注射用溶液裝入到合適的安瓿或小瓶中。希望在冷凍條件或凍干條件下貯藏液體制劑如注射劑。在使用前可以將凍干制劑再溶于注射用蒸餾水中。
此外，可以以軟膏、凝膠或液體的形式，將本發(fā)明的促進HGF產(chǎn)生的藥劑制成為外用制劑。可以通過例如將寡糖或其鹽捏合到軟膏基質(zhì)(例如吸收性軟膏、親水軟膏、聚乙二醇、純化羊毛脂等)中來制備外用制劑。而且，在制備這些外用制劑時，可以使用硬化劑(例如十六醇、十八醇等)，在凝膠制劑的情況下，可以使用增稠劑(例如羧甲基纖維素、羥丙基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮等)?？梢愿鶕?jù)疾病的種類和外用藥劑的應用位置等，將外用制劑中有效成分的含量適當調(diào)整到約0.0001w/w％至5w/w％。
可以根據(jù)本發(fā)明的促進HGF產(chǎn)生的藥劑的劑型，通過合適的途徑來施用它們。例如，可以通過靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、皮下或肌內(nèi)途徑等施用注射劑?？梢愿鶕?jù)患者的病癥、年齡、和體重等適當調(diào)整注射劑量。注射劑量通常為0.0001mg至500mg，優(yōu)選0.01mg至100mg，每天適當施用一次或以分量方式每天施用幾次，但是可以根據(jù)患者的病癥、年齡、和體重等適當調(diào)整注射劑量。
本發(fā)明的促進HGF產(chǎn)生的藥劑可以是糖鏈化合物如寡糖或其鹽與HGF的混合制劑。因為已知當HGF作為與肝素或硫酸乙酰肝素的復合物形式施用到活體體內(nèi)時，HGF的血漿半衰期會延長(Kato，Y.等人，Hepatology，1994，vol.20，p.417至424)，所以將糖鏈化合物如寡糖或其鹽與HGF制成混合制劑，這能延長混合制劑中所含HGF的血漿半衰期。在這種情況下，寡糖或其鹽與HGF的混合比通常為0.00002(w/w)至50,000(w/w)(寡糖/HGF)，優(yōu)選0.01(w/w)至500(w/w)。于是，因為制劑中的糖鏈化合物如寡糖或其鹽同時促進了活體中內(nèi)源性HGF的產(chǎn)生，所以能更有效地通過HGF的作用治療或防止疾病。由于相同的原因，當將本發(fā)明的促進HGF產(chǎn)生的藥劑施用到活體體內(nèi)時，還可以同時施用作為另一種制劑的HGF。
下列實施例進一步更詳細地說明了本發(fā)明，但本發(fā)明根本不被這些實施例所限制。
實施例中所用各個簡寫的含義如下HGF肝細胞生長因子FCS胎牛血清DMEM培養(yǎng)基Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基PBS磷酸緩沖鹽水ELISA酶聯(lián)免疫吸附測定MALDI-TOF/MS基質(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時間質(zhì)譜法LPL脂蛋白脂肪酶APTT活化部分凝血活酶時間UA糖醛酸殘基GlcN葡糖胺殘基Ac乙酰基Arg精氨酸Gly甘氨酸Sac糖
2S2-O-硫酸6S6-O-硫酸NSN-硫酸實施例1將100mg高分子量肝素鈉(Scientific Protein Laboratories Inc.)溶于2mL 50mM乙酸鈉緩沖液(包含3mM乙酸鈣)(pH7.0)中，向混合物中添加0.5單位肝素酶(SEIKAGAKU CORPORATION)，使它們在37℃反應10小時。在100℃將反應混合物加熱2分鐘，使反應停止。將0.3ml反應混合物上清液供應到Superdex 30pg色譜柱(φ1.6cm×60cm)(Amersham Bioscience)，進行凝膠過濾色譜法。使用200mM碳酸氫銨水溶液作為流動相，使溶液以0.4ml/min的流速通過色譜柱。監(jiān)測洗出液在230nm處的吸光度，將洗脫液分級?；诜肿哟笮矸蛛x和回收肝素片段。所得肝素片段為二糖、四糖、六糖、八糖、十糖、十二糖、十四糖和十六糖的寡糖級分(圖1)。
實施例2使用MRC-9細胞、人胎肺成纖維細胞來測定實施例1獲得的肝素片段(寡糖)促進HGF產(chǎn)生的活性。用肝素片段(寡糖)培養(yǎng)細胞，分析細胞產(chǎn)生的HGF量。首先，以5×104個細胞/cm2的密度將MRC-9細胞接種到48孔平板上，在包含10％FCS的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)一天。除去培養(yǎng)基后，用0.5mL PBS將細胞洗滌兩次，將培養(yǎng)基更換為包含1％FCS的DMEM培養(yǎng)基。然后，繼續(xù)培養(yǎng)。此時，以最終濃度1μg/ml將實施例1中獲得的肝素片段添加到培養(yǎng)基中。24小時后，回收培養(yǎng)基上清液，通過ELISA方法測定分泌到培養(yǎng)基中的HGF量。當添加市售低分子量肝素(Fragmin，Kissei Pharmaceutical Co.，Ltd.)時，細胞產(chǎn)生的HGF量相當于添加高分子量肝素情況下產(chǎn)生的HGF量，HGF產(chǎn)生水平比沒有肝素時高出約5倍。而且，當添加實施例1中制備的不大于十六糖的肝素片段時，與不添加肝素相比，在不小于六糖的肝素片段中產(chǎn)生的HGF增加(圖2)。
實施例3將實施例1獲得的肝素片段的十糖級分(以下稱為肝素十糖片段)凍干，再溶于水中。將所得溶液供應到MiniQ4.5/50色譜柱(AmershamBioscience)，用陰離子交換色譜法作進一步分離。通過線性梯度洗脫法洗脫肝素十糖片段，其中用含水NaCl作為洗脫液(流速0.5ml/min)，將NaCl的濃度從0M線性增加到1M。監(jiān)測洗脫液在230nm處的吸光度并分級(圖3)。據(jù)推測，因為硫酸基數(shù)量和位置的變化，使肝素十糖片段分離為許多峰，回收各個峰。將回收的級分編號為1至38，用與實施例2相似的方法測定每個峰促進HGF產(chǎn)生的活性(圖4)。結果顯示，大多數(shù)級分具有促進HGF產(chǎn)生的活性。從這些結果中可知，在展示促進HGF產(chǎn)生的活性時，肝素十糖片段中的一些特定結構不太可能具有重要作用，因此可以認為，在由重復的糖醛酸和葡糖胺組成的肝素十糖片段的基本結構中，在合適位置上存在的硫酸基是充足的。但是，據(jù)認為，促進HGF產(chǎn)生的活性隨著硫酸基數(shù)量的增加而增加，因為后面級分(級分編號24至36)促進HGF產(chǎn)生的活性傾向于更高。
使用質(zhì)譜儀(UltraFlex；Bruker Daltonics)，通過MALDI-TOF/MS分析來估計級分編號24、26、28、31和33中所含的肝素十糖片段內(nèi)硫酸基的數(shù)量。通過用透析膜(截止分子量1000)透析每個級分，使其脫鹽，凍干并再溶于水中，以制得樣品。為了中和肝素片段中硫酸基所致的副電荷，在樣品中混合堿性肽(Arg-Gly)19Arg([M+H]+＝4226.8(理論值))，使用咖啡酸作為基質(zhì)，進行MALDI-TOF/MS分析(圖5)。因為在該分析中，檢測到肝素片段為與(Arg-Gly)19Arg的復合物，所以可以通過從m/z(質(zhì)量/電荷)檢測值中減去(Arg-Gly)19Arg的分子量來計算肝素片段的分子量。在所有級分中都檢測到多個m/z信號，這顯示多種組分共存于級分中。隨著級分編號增加(從24至33)，m/z信號模式移向更高分子一側(cè)，因此可以證實，在編號數(shù)更大的級分內(nèi)，寡糖具有更多的硫酸基。從分子量估計級分編號24至33的組成，示于表1中。
表1

實施例4測定在不同位置被硫酸化的下列二糖化合物促進HGF產(chǎn)生的活性2-Sac-2S(肝素二糖III-H；由Sigma制造)、2-Sac-6S(ΔDiHS-6S；由SEIKAGAKU CORPORATION制造)和2-Sac-NS(ΔDiHS-NS；由SEIKAGAKU CORPORATION制造)(表2)(圖6)。使用MRC-9細胞，按實施例2所述測定它們促進HGF產(chǎn)生的活性。此時，二糖化合物的濃度從0變至50μg/ml。
結果證明，所有二糖化合物都具有促進HGF產(chǎn)生的活性，雖然活性根據(jù)硫酸基的位置而改變，而且為了展示促進HGF產(chǎn)生的效果，與未分級肝素相比，需要以更高的濃度添加它們。證明2-Sac-6S和2-Sac-NS具有比2-Sac-2S高的促進HGF產(chǎn)生的活性，這說明，將葡糖胺殘基的6-位羥基和/或2-位氨基硫酸化對于展示促進HGF產(chǎn)生的活性很重要。
表2 實施例5對于實施例1獲得的肝素片段(寡糖)，測定其抗凝血活性和LPL釋放活性。通過比較活化部分凝血活酶時間(APTT)來評估抗凝血活性。使用取自Wister大鼠(雄性)的新鮮血漿和通過鞣花酸來利用活化的Dataφ·APTT試劑盒(Sysmex)測定APTT。以9μg/mL或3μg/mL的濃度將肝素片段添加到大鼠血漿中，比較APTT值(第二個值)。
APTT測定結果示于圖7中。當添加生理鹽水代替肝素時，血漿迅速凝固，APTT為約20秒。當以9μg/mL的濃度將未消化的高分子量肝素添加到血漿中時，血漿凝固被抑制，APTT延長到200秒或更長時間。而且，當以3μg/mL的濃度添加高分子量肝素時，APTT為160秒或更長時間，在很大程度上抑制了血漿凝固。與高分子量肝素相比，對于市售低分子量肝素(Fragmin，Kissei Pharmaceutical Co.，Ltd.)，APTT的延長被抑制，但APTT的延長仍具有顯著的水平。當以9μg/mL的濃度添加實施例1的十六糖肝素片段時，APTT為約46秒。因此，與不添加肝素時相比，APTT延長，但APTT延長的程度顯著短于Fragmin，這說明抗凝固活性在很大程度上減少了。此外，隨著分子大小減少，APTT縮短。在9μg/mL或3μg/mL的濃度下，不大于四糖的寡糖的APTT相當于添加生理鹽水時的APTT。
為了測定LPL釋放活性，以0.3μg/克體重將肝素片段通過尾靜脈施用到Wister大鼠(3-周大，雄性)體內(nèi)，10分鐘后，從腋窩靜脈叢取血，通過ELISA(Daiichi Pure Chemicals Co.，Ltd)測定所得血漿中的LPL量。所釋放LPL量的測定結果示于圖8中。在高分子量肝素中，釋放了約250ng/mL LPL，而在低分子量肝素(Fragmin，Kissei PharmaceuticalCo.，Ltd.)中，所釋放的LPL量減至高分子量肝素情況下的約30％。在實施例1制備的肝素片段中，所釋放的LPL量也隨著肝素片段分子大小的減少而減少。尤其是，在不大于八糖的寡糖中，所釋放的LPL量顯著減少。
實施例6為了進一步檢查實施例1中所得肝素十糖片段的抗凝血活性，測定抗Xa因子活性和抗IIa因子活性。
為了測定抗Xa因子活性，將2.5μL抗凝血酶III(2.5U)溶液添加到22.5μL樣品溶液中，在37℃下將混合物培育3分鐘，向其中添加12.5μL抗凝血因子Xa溶液(7.1nkat S-2222/mL)。向混合溶液中添加2.5μLS-2222溶液(0.75mg/mL)(Daiichi Pure Chemicals Co.，Ltd)，它是Xa因子的底物，在37℃下使混合物反應3分鐘，通過添加37.5μL 50v/v％含水乙酸停止反應。通過分析405nm處的吸光度來測定顏色強度。因為S-2222與Xa因子反應而釋放出對硝基苯胺，從而產(chǎn)生了顏色。與不包含具有抗Xa因子活性的物質(zhì)的樣品相比，包含具有抗Xa因子活性的物質(zhì)的樣品的顏色強度減少，這意味著，顏色強度的這種減少(ΔA405)反映了樣品中的抗Xa因子活性。用標準低分子量肝素(抗Xa因子活性175U/mg，抗IIa因子活性69U/mg；National Institute of Health Science)制備抗Xa因子活性對ΔA405的校正曲線，基于校正曲線確定受試樣品的抗Xa因子活性。用S-1127(0.625mg/ml；Daiichi Pure Chemicals Co.，Ltd)、抗凝血因子IIa(0.4U/ml)和0.01M檸檬酸分別取代S-2222、Xa因子和50％(v/v)含水乙酸，類似地測定抗IIa因子活性。
抗Xa因子活性和抗IIa因子活性的測定結果示于表3中。市售低分子量肝素Fragmin的抗Xa因子活性和抗IIa因子活性分別減至未分級肝素的75％和32％。另一方面，肝素十糖片段的抗Xa因子活性和抗IIa因子活性分別顯著減至未分級肝素的12％和4％。
表3

實施例7對于實施例4所述的在不同位置被硫酸化的二糖化合物如2-Sac-2S(Sigma)、2-Sac-6S(SEIKAGAKU CORPORATION)、和2-Sac-NS(SEIKAGAKU CORPORATION)，通過與實施例5相似的方法測定它們的抗凝血活性和LPL釋放活性(圖9和圖10)。在所有二糖化合物中，均未檢測到抗凝血活性和LPL釋放活性。
實施例8對于其中僅葡糖胺的2-位氨基被硫酸化(僅N-硫酸化)的修飾肝素(CDSNS-肝素，由SEIKAGAKU CORPORATION制造)，通過與實施例2相似的方法，用MRC-9細胞測定其促進HGF產(chǎn)生的活性(圖11)。在該測定中，其中僅葡糖胺的2-位氨基被硫酸化的修飾肝素的濃度在0至50μg/mL的范圍內(nèi)變化。雖然其中僅葡糖胺的2-位氨基被硫酸化的修飾肝素促進HGF產(chǎn)生的活性稍弱于未分級肝素，但其最大活性幾乎等于普通未分級肝素的最大活性。
此外，為了檢查其中僅葡糖胺的2-位氨基被硫酸化的修飾肝素的抗凝血活性，通過與實施例5相似的方法測定APTT(圖12)。在其中僅葡糖胺的2-位氨基被硫酸化的修飾肝素中，APTT沒有延長，因此沒有檢測到抗凝血活性。
工業(yè)應用性本發(fā)明的促進HGF產(chǎn)生的藥劑可以促進HGF的產(chǎn)生，并抑制出血傾向的副作用，可用于促進活體內(nèi)受損的組織或器官的治愈。
權利要求
1.一種促進HGF產(chǎn)生的藥劑，該藥劑包括二糖或具有如下結構的三糖至十六糖或其鹽作為有效成分，所述二糖由通過α1，4-糖苷鍵或β1，4-糖苷鍵連接的糖醛酸殘基(其中糖醛酸是指艾杜糖醛酸或葡糖醛酸，并在下文中具有相同的含義)和葡糖胺殘基組成，在所述結構中通過α1，4-糖苷鍵或β1，4-糖苷鍵交替并重復地連接糖醛酸殘基和葡糖胺殘基，其中糖醛酸殘基和/或葡糖胺殘基的至少一個羥基可被硫酸化、烷基化、?；虬坊?，和/或至少一個葡糖胺殘基的2-位氨基可被硫酸化、烷基化或?；?br> 2.如權利要求1所述的促進HGF產(chǎn)生的藥劑，其中至少一個糖醛酸殘基的2-位羥基和/或至少一個葡糖胺殘基的3-位和/或6-位羥基可被硫酸化。
3.如權利要求1或2所述的促進HGF產(chǎn)生的藥劑，其中至少一個葡糖胺殘基的6-位羥基和/或2-位氨基被硫酸化。
4.如權利要求1至3中任一項所述的促進HGF產(chǎn)生的藥劑，其中寡糖為二糖至十糖。
5.如權利要求1至4中任一項所述的促進HGF產(chǎn)生的藥劑，其中寡糖為通過用肝素酶或乙酰肝素酶消化高分子量肝素或高分子量硫酸乙酰肝素而制得的降解產(chǎn)物。
6.如權利要求1至4中任一項所述的促進HGF產(chǎn)生的藥劑，其中寡糖為通過用亞硝酸降解、過氧化氫降解或β-消除中的任意一種方式消化高分子量肝素或高分子量硫酸乙酰肝素而制得的降解產(chǎn)物。
7.如權利要求1所述的促進HGF產(chǎn)生的藥劑，其中寡糖為用下面(a)至(h)表示的化合物中的任意一種(a)式(I) 其中R1表示氫、硫酸基、烷基、酰基或任選取代的氨基，R2表示氫、硫酸基、烷基或?；?，R3和R4彼此不同，并表示氫或任選取代的羧基，n表示0至7，(b)式(II) 其中所有符號分別與上面的定義相同，(c)式(III) 其中所有符號分別與上面的定義相同，(d)式(IV) 其中所有符號分別與上面的定義相同，(e)式(V) 其中m表示0至6，R1、R2、R3和R4分別與上面的定義相同，(f)式(VI) 其中m表示0至6，R1、R2、R3和R4分別與上面的定義相同，(g)式(VII) 其中m表示0至6，R1、R2、R3和R4分別與上面的定義相同，和(h)式(VIII) 其中m表示0至6，R1、R2、R3和R4分別與上面的定義相同。
8.一種促進HGF產(chǎn)生的藥劑，該藥劑包括具有如下結構的糖鏈化合物或其鹽作為有效成分，在所述結構中通過α1，4-糖苷鍵或β1，4-糖苷鍵交替并重復地連接糖醛酸殘基和葡糖胺殘基，其中至少一個葡糖胺殘基的6-位羥基被硫酸化。
9.一種促進HGF產(chǎn)生的藥劑，該藥劑包括具有如下結構的糖鏈化合物或其鹽作為有效成分，在所述結構中通過α1，4-糖苷鍵或β1，4-糖苷鍵交替并重復地連接糖醛酸殘基和葡糖胺殘基，其中至少一個葡糖胺殘基的2-位氨基被硫酸化。
10.一種促進HGF產(chǎn)生的藥劑，該藥劑包括二糖化合物或其鹽作為有效成分，所述二糖化合物由通過α1，4-糖苷鍵或β1，4-糖苷鍵連接的糖醛酸殘基和葡糖胺殘基組成，其中葡糖胺殘基的6-位羥基和/或葡糖胺殘基的2-位氨基被硫酸化。
11.如權利要求1至10中任一項所述的促進HGF產(chǎn)生的藥劑，其中糖鏈化合物或其鹽沒有或具有降低的抗凝血活性和/或脂蛋白脂酶釋放活性。
12.一種促進HGF產(chǎn)生的方法，其特征在于，對哺乳動物施用有效量的二糖或具有如下結構的三糖至十六糖或其鹽，所述二糖由通過α1，4-糖苷鍵或β1，4-糖苷鍵連接的糖醛酸殘基(其中糖醛酸是指艾杜糖醛酸或葡糖醛酸，并在下文中具有相同的含義)和葡糖胺殘基組成，在所述結構中通過α1，4-糖苷鍵或β1，4-糖苷鍵交替并重復地連接糖醛酸殘基和葡糖胺殘基，其中糖醛酸殘基和/或葡糖胺殘基的至少一個羥基可被硫酸化、烷基化、酰化或胺化，和/或至少一個葡糖胺殘基的2-位氨基可被硫酸化、烷基化或?；?br> 13.如權利要求12所述的促進HGF產(chǎn)生的方法，其中至少一個糖醛酸殘基的2-位羥基和/或至少一個葡糖胺殘基的3-位和/或6-位羥基可被硫酸化。
14.如權利要求12所述的促進HGF產(chǎn)生的方法，其中至少一個葡糖胺殘基的6-位羥基和/或2-位氨基被硫酸化。
15.如權利要求12所述的促進HGF產(chǎn)生的方法，其中寡糖為二糖至十糖。
16.如權利要求12所述的促進HGF產(chǎn)生的方法，其中寡糖為通過用肝素酶或乙酰肝素酶消化高分子量肝素或高分子量硫酸乙酰肝素而制得的降解產(chǎn)物。
17.如權利要求12所述的促進HGF產(chǎn)生的方法，其中寡糖為通過用亞硝酸降解、過氧化氫降解或β-消除中的任意一種方式處理高分子量肝素或高分子量硫酸乙酰肝素而制得的降解產(chǎn)物。
18.如權利要求12所述的促進HGF產(chǎn)生的方法，其中寡糖為用下面(a)至(h)表示的化合物中的任意一種(a)式(I) 其中R1表示氫、硫酸基、烷基、酰基或任選取代的氨基，R2表示氫、硫酸基、烷基或?；琑3和R4彼此不同，并表示氫或任選取代的羧基，n表示0至7，(b)式(II) 其中所有符號分別與上面的定義相同，(c)式(III) 其中所有符號分別與上面的定義相同，(d)式(IV) 其中所有符號分別與上面的定義相同，(e)式(V) 其中m表示0至6，R1、R2、R3和R4分別與上面的定義相同，(f)式(VI) 其中m表示0至6，R1、R2、R3和R4分別與上面的定義相同，(g)式(VII) 其中m表示0至6，R1、R2、R3和R4分別與上面的定義相同，(h)式(VIII) 其中m表示0至6，R1、R2、R3和R4分別與上面的定義相同。
19.一種促進HGF產(chǎn)生的方法，其特征在于，對哺乳動物施用有效量的具有如下結構的糖鏈化合物或其鹽，在所述結構中通過α1，4-糖苷鍵或β1，4-糖苷鍵交替并重復地連接糖醛酸殘基和葡糖胺殘基，其中至少一個葡糖胺殘基的6-位羥基被硫酸化。
20.一種促進HGF產(chǎn)生的方法，其特征在于，對哺乳動物施用有效量的具有如下結構的糖鏈化合物或其鹽，在所述結構中通過α1，4-糖苷鍵或β1，4-糖苷鍵交替并重復地連接糖醛酸殘基和葡糖胺殘基，其中至少一個葡糖胺殘基的2-位氨基被硫酸化。
21.一種促進HGF產(chǎn)生的方法，其特征在于，對哺乳動物施用有效量的二糖化合物或其鹽，所述二糖化合物由通過α1，4-糖苷鍵或β1，4-糖苷鍵連接的糖醛酸殘基和葡糖胺殘基組成，其中葡糖胺殘基的6-位羥基和/或2-位氨基被硫酸化。
22.如權利要求12至21中任一項所述的促進HGF產(chǎn)生的方法，其中糖鏈化合物或其鹽沒有或具有降低的抗凝血活性和/或脂蛋白脂酶釋放活性。
23.二糖或具有如下結構的三糖至十六糖或其鹽在制備促進HGF產(chǎn)生的藥物中的用途，所述二糖由通過α1，4-糖苷鍵或β1，4-糖苷鍵連接的糖醛酸殘基(其中糖醛酸是指艾杜糖醛酸或葡糖醛酸，并在下文中具有相同的含義)和葡糖胺殘基組成，在所述結構中通過α1，4-糖苷鍵或β1，4-糖苷鍵交替并重復地連接糖醛酸殘基和葡糖胺殘基，其中糖醛酸殘基和/或葡糖胺殘基的至少一個羥基可被硫酸化、烷基化、?；虬坊?，和/或至少一個葡糖胺殘基的2-位氨基可被硫酸化、烷基化或?；?。
24.如權利要求23所述的用途，其中至少一個糖醛酸殘基的2-位羥基和/或至少一個葡糖胺殘基的3-位和/或6-位羥基可被硫酸化。
25.如權利要求23所述的用途，其中至少一個葡糖胺殘基的6-位羥基和/或2-位氨基被硫酸化。
26.如權利要求23所述的用途，其中寡糖為二糖至十糖。
27.如權利要求23所述的用途，其中寡糖為通過用肝素酶或乙酰肝素酶消化高分子量肝素或高分子量硫酸乙酰肝素而制得的降解產(chǎn)物。
28.如權利要求23所述的用途，其中寡糖為通過用亞硝酸降解、過氧化氫降解或β-消除中的任意一種方式處理高分子量肝素或高分子量硫酸乙酰肝素而制得的降解產(chǎn)物。
29.如權利要求23所述的用途，其中寡糖為用下面(a)至(h)表示的化合物中的任意一種(a)式(I) 其中R1表示氫、硫酸基、烷基、?；蛉芜x取代的氨基，R2表示氫、硫酸基、烷基或酰基，R3和R4彼此不同，并表示氫或任選取代的羧基，n表示0至7，(b)式(II) 其中所有符號分別與上面的定義相同，(c)式(III) 其中所有符號分別與上面的定義相同，(d)式(IV) 其中所有符號分別與上面的定義相同，(e)式(V) 其中m表示0至6，R1、R2、R3和R4分別與上面的定義相同，(f)式(VI) 其中m表示0至6，R1、R2、R3和R4分別與上面的定義相同，(g)式(VII) 其中m表示0至6，R1、R2、R3和R4分別與上面的定義相同，(h)式(VIII) 其中m表示0至6，R1、R2、R3和R4分別與上面的定義相同。
30.具有如下結構的糖鏈化合物或其鹽在制備促進HGF產(chǎn)生的藥物中的用途，在所述結構中通過α1，4-糖苷鍵或β1，4-糖苷鍵交替并重復地連接糖醛酸殘基和葡糖胺殘基，其中至少一個葡糖胺殘基的6-位羥基被硫酸化。
31.具有如下結構的糖鏈化合物或其鹽在制備促進HGF產(chǎn)生的藥物中的用途，在所述結構中通過α1，4-糖苷鍵或β1，4-糖苷鍵交替并重復地連接糖醛酸殘基和葡糖胺殘基，其中葡糖胺殘基的至少一個2-位氨基被硫酸化。
32.二糖化合物或其鹽在制備促進HGF產(chǎn)生的藥物中的用途，所述二糖化合物由通過α1，4-糖苷鍵或β1，4-糖苷鍵連接的糖醛酸殘基和葡糖胺殘基組成，其中葡糖胺殘基的6-位羥基和/或2-位氨基被硫酸化。
33.如權利要求23至32中任一項所述的用途，其中糖鏈化合物或其鹽沒有或具有降低的抗凝血活性和/或脂蛋白脂酶釋放活性。
全文摘要
本發(fā)明的目的在于提供一種促進HGF產(chǎn)生的藥劑，該藥劑包括二糖或具有如下結構的三糖至十六糖的寡糖或其鹽作為有效成分，所述二糖由通過α1，4－糖苷鍵或β1，4－糖苷鍵連接的糖醛酸殘基(其中糖醛酸是指艾杜糖醛酸或葡糖醛酸，并在下文中具有相同的含義)和葡糖胺殘基組成，在所述結構中通過α1，4－糖苷鍵或β1，4－糖苷鍵交替并重復地連接糖醛酸殘基和葡糖胺殘基，其中糖醛酸殘基和/或葡糖胺殘基的至少一個羥基可被硫酸化、烷基化、?；虬坊?或至少一個葡糖胺殘基的2－位氨基可被硫酸化、烷基化或?；１景l(fā)明的促進HGF產(chǎn)生的藥劑可用于促進活體的受損組織或器官的愈合。
文檔編號A61P1/16GK1819833SQ20058000070
公開日2006年8月16日 申請日期2005年3月28日 優(yōu)先權日2004年3月29日
發(fā)明者中村敏一, 松本邦夫, 福田一弘 申請人:克霖固魯制藥股份有限公司, 中村敏一