專利名稱：用于癌癥治療的藥品的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及包含乳鐵蛋白水解產(chǎn)物混合物、從乳鐵蛋白水解產(chǎn)物混合物中分離的乳鐵蛋白的部分肽、或通過(guò)化學(xué)合成制備的乳鐵蛋白的部分肽等等的藥物，其作為活性成分在癌癥的抗體治療中具有增強(qiáng)抗體藥物的細(xì)胞毒活性的作用。更準(zhǔn)確地，本發(fā)明涉及具有增強(qiáng)癌細(xì)胞的抗體藥物敏感性作用的藥物，所述癌細(xì)胞具有抗體藥物抗性。
背景技術(shù)：
抗體識(shí)別特異性抗原和清除機(jī)體的外來(lái)物質(zhì)的機(jī)制已經(jīng)得以研究了很久。已知免疫球蛋白制劑是廣泛用于治療的抗體。然而，它們存在例如滴定度不足和未知傳染源污染的問(wèn)題。
Milstein和Kohler的單克隆抗體制備技術(shù)的發(fā)明在各種抗體技術(shù)中獲得突破。今天，在所謂的后基因組時(shí)代，成功地闡明了腫瘤細(xì)胞的特異性基因和致病因子及其表達(dá)產(chǎn)物。抗體技術(shù)很大程度地歸功于以它們?yōu)槟繕?biāo)的研究方法和利用它們的治療方法的發(fā)展。而且，今后抗體技術(shù)的深入改進(jìn)將得到進(jìn)一步地期待和關(guān)注。
靶向惡性腫瘤的抗體藥物在分子靶向治療領(lǐng)域取得顯著的進(jìn)展。迄今為止，在日本僅僅兩種抗體藥物產(chǎn)品得到批準(zhǔn)。然而，目前已知的抗體藥物至少包括針對(duì)惡性淋巴瘤(CD20，HLA-DR，CD5)、急性骨髓性白血病(CD33，CD66)、慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CD52，CD20)、急性淋巴細(xì)胞性白血病(CD19，CD20，CD22)、多發(fā)性骨髓瘤(Id-獨(dú)特型，HM1.24)、乳腺癌(HER2/neu)、上皮瘤(EGF-R，VEGF)、結(jié)腸癌(17-1A，CEA)、卵巢癌(CA125)等等(例如，參見(jiàn)非專利文獻(xiàn)1)的藥物。
作為這些抗體藥物針對(duì)惡性腫瘤的作用機(jī)制，一般來(lái)說(shuō)認(rèn)為有三種機(jī)制。即，第一種機(jī)制是當(dāng)抗體結(jié)合惡性腫瘤細(xì)胞的表面時(shí)，特定信號(hào)被傳遞到腫瘤細(xì)胞以引起細(xì)胞死亡。第二種機(jī)制是存在于機(jī)體的效應(yīng)細(xì)胞(嗜中性粒細(xì)胞、巨嗜細(xì)胞、NK細(xì)胞等等)通過(guò)抗原-抗體反應(yīng)識(shí)別結(jié)合于腫瘤細(xì)胞的抗體。它們通過(guò)其細(xì)胞毒素活性殺死腫瘤細(xì)胞。第三種機(jī)制是機(jī)體中的補(bǔ)體成分通過(guò)抗原-抗體反應(yīng)識(shí)別結(jié)合于腫瘤細(xì)胞的抗體。它們通過(guò)補(bǔ)體系統(tǒng)的激活途徑中的經(jīng)典途徑誘導(dǎo)細(xì)胞毒作用，以殺死腫瘤細(xì)胞(例如，參見(jiàn)非專利文獻(xiàn)2)。
由于抗體藥物的發(fā)展已使許多癌癥病人得以存活。然而，報(bào)告顯示在實(shí)施治療過(guò)程中，一些使用抗體藥物治療的病例，由于獲得抗體藥物抗性的惡性腫瘤的復(fù)發(fā)，而變得困難。因此，使用化療劑的聯(lián)合治療得到研究。然而，它們存在例如需要預(yù)防副作用而使治療受到限制的問(wèn)題(例如，參見(jiàn)非專利文獻(xiàn)3)。
對(duì)于腫瘤細(xì)胞獲得抗體藥物抗性的機(jī)制，已經(jīng)報(bào)道了一些病例，其中在腫瘤細(xì)胞表面，被稱為補(bǔ)體調(diào)控因子(CD46，CD55，CD59)的分子的表達(dá)有所增加。在上述第三種作用機(jī)制中，它們鈍化了補(bǔ)體的經(jīng)典途徑，導(dǎo)致獲得抗性(例如，參見(jiàn)非專利文獻(xiàn)4)。這暗示補(bǔ)體系統(tǒng)的細(xì)胞毒活性可通過(guò)所述機(jī)制得到降解，導(dǎo)致靶腫瘤細(xì)胞對(duì)抗體藥物的敏感性降低。這樣，期望研制可提高補(bǔ)體系統(tǒng)針對(duì)具有抗體藥物抗性的惡性腫瘤的細(xì)胞毒活性的技術(shù)。
乳鐵蛋白是非血紅素鐵結(jié)合糖蛋白，存在于哺乳動(dòng)物的乳汁、唾液、淚液、精液、各種粘液等等，是具有鐵吸附作用、促細(xì)胞生長(zhǎng)作用、免疫調(diào)節(jié)作用和抗菌作用的多功能蛋白質(zhì)。牛乳鐵蛋白可容易地從乳品工廠中常規(guī)處理的生脫脂乳或干酪乳清中得到大量制備，并容易地作為商業(yè)產(chǎn)品得到利用。
乳鐵蛋白肽(Lactoferricin)(本發(fā)明申請(qǐng)人的注冊(cè)商品名)是本發(fā)明的發(fā)明人第一次從牛乳鐵蛋白的酶促水解產(chǎn)物中分離的新肽(例如，參見(jiàn)專利文獻(xiàn)1)。例如，分離自牛乳鐵蛋白的乳鐵蛋白肽具有例如SEQ ID NO2的氨基酸序列。乳鐵蛋白肽是非常有用的物質(zhì)，其在低濃度時(shí)對(duì)廣范的微生物，例如引起人或其他動(dòng)物各種疾病的革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性菌和酵母表現(xiàn)殺菌作用。包括抗生素在內(nèi)的大多數(shù)其他臨床上使用的抗菌劑對(duì)人和動(dòng)物是外來(lái)化學(xué)物質(zhì)。然而，乳鐵蛋白肽是不含任何化學(xué)物質(zhì)或化學(xué)合成氨基酸衍生物的天然肽，因此它對(duì)人和動(dòng)物是健康安全的。這是因?yàn)槿殍F蛋白肽在人胃中，通過(guò)胃蛋白酶對(duì)在通常攝取的牛乳中經(jīng)常含有的乳鐵蛋白分解，而得以自然產(chǎn)生。因此，乳鐵蛋白可作為安全有效的抗菌劑而用于各種商業(yè)產(chǎn)品中，例如滴眼劑、口腔含化劑、化妝品、潤(rùn)膚液、治療食品和寵物產(chǎn)品，因此具有極大的價(jià)值。
考慮到乳鐵蛋白的抗腫瘤效果，迄今為止已經(jīng)公開(kāi)了抗腫瘤藥(專利文獻(xiàn)2)、腸胃外抗腫瘤藥(專利文獻(xiàn)3)、口服施用的癌轉(zhuǎn)移抑制劑(專利文獻(xiàn)4)等等。這些技術(shù)都利用了乳鐵蛋白直接作用于腫瘤細(xì)胞的效果，這種效果與由于抗體治療中的抗體藥物的細(xì)胞毒活性增強(qiáng)的抗腫瘤效果不同，這在近來(lái)的癌癥治療中引起注意。即，現(xiàn)在不清楚乳鐵蛋白水解產(chǎn)物混合物或乳鐵蛋白的部分肽在癌癥的抗體治療中(具體地，癌耐藥的抗體治療)具有增強(qiáng)抗體藥物的細(xì)胞毒活性的效果。
特許第2818056號(hào)公報(bào)[專利文獻(xiàn)2]特開(kāi)昭第63-51337號(hào)公報(bào)[專利文獻(xiàn)3]特開(kāi)平第7-309771號(hào)公報(bào)[專利文獻(xiàn)4]特開(kāi)平第10-59864號(hào)公報(bào)[非專利文獻(xiàn)1]Niizu Y.& Kato K.，Saishin Igaku，Vol.58，No.12，pp.5-12，2003[非專利文獻(xiàn)2]Koyasu S.ed.，Kinoshita T.，Current ImmunologyIllustrated，pp.35-50，2003[非專利文獻(xiàn)3]Hatake K.，Blood Frontier，Vol.12，No.11，pp.65-71，2002[非專利文獻(xiàn)4]Oncogene，Vol.22，pp.7359-7368，2003發(fā)明概述本發(fā)明的一個(gè)目的是提供在癌癥(特別是耐藥癌)的抗體治療中不引起副作用和具有增強(qiáng)抗體藥物細(xì)胞毒活性作用的高安全藥物、提供含有該藥物的食品或飲料、并提供增強(qiáng)抗體藥物的細(xì)胞毒活性的方法。
在注意到更有效地增強(qiáng)抗體藥物的細(xì)胞毒活性導(dǎo)致提高了治療結(jié)果的技術(shù)的同時(shí)，本發(fā)明的發(fā)明人考慮到，如果我們能增強(qiáng)靶腫瘤細(xì)胞對(duì)抗體藥物的敏感性，即使在患有惡性腫瘤的病人中證實(shí)了抗體藥物的抗性，也可充分發(fā)揮補(bǔ)體系統(tǒng)的細(xì)胞毒活性，并且對(duì)此進(jìn)行了不懈地研究和開(kāi)發(fā)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在由抗體和補(bǔ)體引起的細(xì)胞毒效應(yīng)實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中，乳鐵蛋白水解產(chǎn)物混合物和分離自乳鐵蛋白水解產(chǎn)物混合物中的肽可作用靶腫瘤細(xì)胞，增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)抗體藥物的敏感性，從而完成了本發(fā)明。
即，本發(fā)明涉及基于增強(qiáng)抗體藥物的細(xì)胞毒活性作用的，含有作為活性成分的乳鐵蛋白水解產(chǎn)物混合物、或分離自乳鐵蛋白水解產(chǎn)物混合物的部分肽、或通過(guò)化學(xué)合成制備的乳鐵蛋白的部分肽等等的新藥及其用途，其本質(zhì)上不同于常規(guī)已知的乳鐵蛋白的抗腫瘤作用，在抗體治療中該藥被認(rèn)為對(duì)迄今為止幾乎沒(méi)有發(fā)現(xiàn)任何有效的療法或藥物的癌癥是特別有效的。
實(shí)現(xiàn)上述目的的本發(fā)明第一項(xiàng)發(fā)明是在癌癥的抗體治療中用于增強(qiáng)抗體藥物的細(xì)胞毒活性的藥物，其包含作為活性成分的、通過(guò)用水解酶水解乳鐵蛋白而獲得的乳鐵蛋白水解產(chǎn)物，該產(chǎn)物在癌癥的抗體治療中具有增強(qiáng)抗體藥物的細(xì)胞毒活性的作用。
作為優(yōu)選，上述的第一項(xiàng)發(fā)明具有下述1)至6)的特征1)上述水解酶是胃蛋白酶。
2)上述乳鐵蛋白水解產(chǎn)物的降解率是6至20％。
3)上述乳鐵蛋白水解產(chǎn)物數(shù)平均分子量為500至5000。
4)上述癌是乳腺癌、B細(xì)胞淋巴癌和結(jié)腸癌中任意一種。
5)上述癌是具有抗體藥物抗性的癌。
6)上述增強(qiáng)抗體藥物的細(xì)胞毒活性的作用是提高靶腫瘤細(xì)胞對(duì)抗體藥物敏感性的作用。
上述第一項(xiàng)發(fā)明的另外一個(gè)實(shí)施方案是上述乳鐵蛋白水解產(chǎn)物用于生產(chǎn)上述藥物的用途。此外，上述第一項(xiàng)發(fā)明的另外一個(gè)實(shí)施方案是在使用抗體藥物的癌癥的抗體治療中，用于增強(qiáng)抗體藥物的細(xì)胞毒活性的方法，其中對(duì)病人施用上述乳鐵蛋白水解產(chǎn)物。
實(shí)現(xiàn)上述目的的本發(fā)明第二項(xiàng)發(fā)明是在癌癥的抗體治療中，用于增強(qiáng)抗體藥物的細(xì)胞毒活性的藥物，其包含作為活性成分的下列(a)至(d)的肽中任意一種、或兩種或多種的混合物(a)具有SEQ ID NO2的氨基酸序列的肽；(b)具有在SEQ ID NO1的氨基酸序列中36至60位氨基酸的氨基酸序列、包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失、插入或倒位，且在癌癥的抗體治療中具有增強(qiáng)抗體藥物的細(xì)胞毒活性的作用的肽；(c)具有SEQ ID NO3的氨基酸序列的肽；(d)具有在SEQ ID NO1的氨基酸序列中36至61位氨基酸的氨基酸序列、包括一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失、插入或倒位，并且在癌癥的抗體治療中具有增強(qiáng)抗體藥物的細(xì)胞毒活性的作用的肽。
作為優(yōu)選，上述第二項(xiàng)發(fā)明具有下述7)至9)的特征7)上述癌是乳腺癌、B細(xì)胞淋巴瘤和結(jié)腸癌中的任意一種。
8)上述癌是具有抗體藥物抗性的癌。
9)上述增強(qiáng)抗體藥物的細(xì)胞毒活性的作用是提高靶腫瘤細(xì)胞對(duì)抗體藥物敏感性的作用。
上述第二項(xiàng)發(fā)明的另外一個(gè)實(shí)施方案是上述肽在制備上述藥物中的用途。此外，上述第二項(xiàng)發(fā)明的另外一個(gè)實(shí)施方案是在癌癥的抗體治療中，使用上述抗體藥物以增強(qiáng)抗體藥物的細(xì)胞毒活性的方法，其中對(duì)病人施用上述乳鐵蛋白水解產(chǎn)物。
此外，本發(fā)明提供包含上述第一項(xiàng)或第二項(xiàng)發(fā)明的藥物的食品或飲料。
實(shí)現(xiàn)上述目的的本發(fā)明第三項(xiàng)發(fā)明是包含乳鐵蛋白水解產(chǎn)物的食品或飲料，其附有食品或飲料用于增強(qiáng)癌癥的抗體治療中所使用的抗體藥物的細(xì)胞毒活性的標(biāo)識(shí)(indication)，其中所述乳鐵蛋白水解產(chǎn)物通過(guò)用水解酶水解乳鐵蛋白而得到制備，并在癌癥的抗體治療中具有增強(qiáng)抗體藥物的細(xì)胞毒活性的作用。
實(shí)現(xiàn)上述目的的本發(fā)明第四項(xiàng)發(fā)明是用于癌癥的抗體治療的藥物，其包含作為活性成分的、通過(guò)用水解酶水解乳鐵蛋白而制備的乳鐵蛋白水解產(chǎn)物和抗體藥物。
作為優(yōu)選，上述第四項(xiàng)發(fā)明具有下述10)至14)的特征10)上述水解酶是胃蛋白酶。
11)上述乳鐵蛋白的降解率是6至20％。
12)上述乳鐵蛋白水解產(chǎn)物數(shù)平均分子量為500至5000。
13)上述抗體藥物是抗CD20抗體、抗HER2單克隆抗體或抗17-1A(人腫瘤相關(guān)上皮細(xì)胞粘附因子)抗體。
14)上述癌是具有抗體藥物抗性的癌。
實(shí)現(xiàn)上述目的的本發(fā)明第五項(xiàng)發(fā)明是用于癌癥的抗體治療的藥物，其中包含作為活性成分的、下列(a)至(d)的肽中任意一種、或兩種或多種的混合物以及抗體藥物
(a)具有SEQ ID NO2的氨基酸序列的肽；(b)具有在SEQ ID NO1的氨基酸序列中36至60位氨基酸的氨基酸序列、包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失、插入或倒位，且在癌癥的抗體治療中具有增強(qiáng)抗體藥物的細(xì)胞毒活性的作用的肽；(c)具有SEQ ID NO3的氨基酸序列的肽；(d)具有在SEQ ID NO1的氨基酸序列中36至61位氨基酸的氨基酸序列、包括一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失、插入或倒位，并且在癌癥的抗體治療中具有增強(qiáng)抗體藥物的細(xì)胞毒活性的作用的肽。
作為優(yōu)選，上述第五項(xiàng)發(fā)明具有下述15)至16)的特征15)上述抗體藥物是抗CD20抗體、抗HER2單克隆抗體或抗17-1A(人腫瘤相關(guān)上皮細(xì)胞粘附因子)抗體。
16)上述癌是具有抗體藥物抗性的癌。
本發(fā)明涉及在癌癥的抗體治療中用于增強(qiáng)抗體藥物的細(xì)胞毒活性的藥物，其包含作為活性成分的、乳鐵蛋白水解產(chǎn)物混合物、分離自乳鐵蛋白水解產(chǎn)物混合物的乳鐵蛋白部分肽、或通過(guò)化學(xué)合成制備的乳鐵蛋白部分肽等等，并且通過(guò)增強(qiáng)補(bǔ)體和抗體藥物的細(xì)胞毒活性可使得靶腫瘤細(xì)胞被有效地殺死或殺傷。
此外，本發(fā)明的藥物也具有恢復(fù)補(bǔ)體和抗體藥物的細(xì)胞毒活性的作用，特別是針對(duì)具有抗體藥物抗性的腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒活性。此外，本發(fā)明用于對(duì)具有抗性的癌進(jìn)行治療的藥物活性成分可從相對(duì)廉價(jià)的原料(例如牛奶)中獲得，因此可進(jìn)行大規(guī)模地生產(chǎn)。
此外，當(dāng)其包含于食品或飲料時(shí)，上述活性成分也發(fā)揮與上述藥物相同的作用，并附有食品或飲料用于在癌癥的抗體治療中增強(qiáng)抗體藥物的細(xì)胞毒活性的標(biāo)識(shí)，。
附圖簡(jiǎn)述
圖1顯示本發(fā)明的乳鐵蛋白水解產(chǎn)物混合物和乳鐵蛋白部分肽賦予Rituximab抗Raji細(xì)胞的細(xì)胞毒活性的作用。符號(hào)“*”表示相對(duì)于培養(yǎng)基(培養(yǎng)液)t＜0.001。
實(shí)施發(fā)明的最佳方式下文中，將詳細(xì)闡述本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案。然而，本發(fā)明并不限于以下描述的優(yōu)選實(shí)施方案，并可在本發(fā)明的范圍內(nèi)進(jìn)行任意地修改。在本說(shuō)明書(shū)中，除非另外指明，百分比使用質(zhì)量百分比。
本發(fā)明的在癌癥的抗體治療中增強(qiáng)抗體藥物的細(xì)胞毒活性的藥物、或用于癌癥的抗體治療的藥物(以下也可指簡(jiǎn)稱為“本發(fā)明的藥物”)的活性成分是乳鐵蛋白水解產(chǎn)物或下列(a)至(d)的肽中任意一種、或兩種或多種的混合物(以下也可指“乳鐵蛋白的部分肽”)，所述水解產(chǎn)物可通過(guò)用水解酶水解乳鐵蛋白而得到制備，并在癌癥的抗體治療中具有增強(qiáng)抗體藥物的細(xì)胞毒活性的作用(以下也可指“乳鐵蛋白水解產(chǎn)物混合物”)(a)具有SEQ ID NO2的氨基酸序列的肽；(b)具有在SEQ ID NO1的氨基酸序列中36至60位氨基酸的氨基酸序列、包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失、插入或倒位，且在癌癥的抗體治療中具有增強(qiáng)抗體藥物的細(xì)胞毒活性的作用的肽；(c)具有SEQ ID NO3的氨基酸序列的肽；(d)具有在SEQ ID NO1的氨基酸序列中36至61位氨基酸的氨基酸序列、包括一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失、插入或倒位，并且在癌癥的抗體治療中具有增強(qiáng)抗體藥物的細(xì)胞毒活性的作用的肽。
SEQ ID NO2對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO1中36至60位氨基酸。此外，SEQ ID NO3對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO1中36至61位氨基酸。
在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“用于癌癥的抗體治療的抗體藥物”指含有作為活性成分的、結(jié)合于癌細(xì)胞表面的抗體的藥物，該藥物通過(guò)上述抗體結(jié)合于癌細(xì)胞可殺死或殺傷癌細(xì)胞。抗體藥物的作用包括抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)信號(hào)、通過(guò)激活細(xì)胞凋亡信號(hào)殺死或殺傷癌細(xì)胞、通過(guò)依賴補(bǔ)體的細(xì)胞毒作用或依賴抗體的細(xì)胞毒作用殺死或殺傷癌細(xì)胞，等等。
在本發(fā)明中，除了在癌癥的抗體治療中增強(qiáng)抗體藥物的細(xì)胞毒活性的效果(即增強(qiáng)補(bǔ)體和/或抗體藥物殺死或殺傷靶腫瘤細(xì)胞的作用)之外，表達(dá)術(shù)語(yǔ)“增強(qiáng)細(xì)胞毒活性”包括，提高具有抗體藥物抗性的腫瘤細(xì)胞對(duì)抗體藥物的敏感性(即，恢復(fù)補(bǔ)體和/或抗體藥物的細(xì)胞毒活性)的作用。此外，表達(dá)術(shù)語(yǔ)“具有抗體藥物抗性”指對(duì)可殺死或殺傷腫瘤細(xì)胞(細(xì)胞毒活性)的抗體藥物或補(bǔ)體的作用具有抗性。換句話說(shuō)，這指上述的作用可得到消弱，或腫瘤細(xì)胞不接受這種作用。此外，抗體藥物抗性不限于由補(bǔ)體調(diào)控因子引起的抗性，并包括由其他因子引起的抗體藥物抗性。
作為本發(fā)明藥物的活性成分的乳鐵蛋白水解產(chǎn)物混合物和分離自乳鐵蛋白水解產(chǎn)物的乳鐵蛋白部分肽(乳鐵蛋白部分肽)，可通過(guò)利用乳鐵蛋白作為起始材料得以制備。作為乳鐵蛋白，可使用可商購(gòu)的乳鐵蛋白和從哺乳動(dòng)物，例如，人、牛等等的初乳、過(guò)渡乳、天然乳或末期乳，或這些乳的加工產(chǎn)物，例如脫脂乳和乳清作為原料通過(guò)常規(guī)技術(shù)使用例如離子交換色譜，從上述的原料中得以分離制備乳鐵蛋白。特別優(yōu)選使用以工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)的可商購(gòu)的乳鐵蛋白(例如，Morinaga Milk Industry Co.，Ltd.生產(chǎn)的產(chǎn)品)。此外，也可使用通過(guò)利用遺傳工程技術(shù)通過(guò)微生物、動(dòng)物細(xì)胞、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物等等生產(chǎn)的乳鐵蛋白。
此外，具有類似于分離自乳鐵蛋白水解產(chǎn)物混合物(乳鐵蛋白部分肽)的肽的氨基酸序列的肽，也可通過(guò)化學(xué)合成、遺傳工程技術(shù)等等而得到直接制備。
利用所述的乳鐵蛋白制備作為本發(fā)明的藥物的活性成分的乳鐵蛋白水解產(chǎn)物混合物的方法實(shí)例，包括用水解酶等等以常規(guī)方式水解乳鐵蛋白的方法。就具體方法而言，用于水解乳鐵蛋白的酶可以是任何水解酶，只要它降解乳鐵蛋白以生成在癌癥的抗體治療中具有增強(qiáng)抗體藥物的細(xì)胞毒活性作用的肽或其混合物即可。
水解酶的實(shí)例包括來(lái)源于米曲霉(Aspergillus oryzae)或灰色鏈霉菌(Streptomyces griseus)等等的胃蛋白酶、胰酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、蛋白酶?？墒褂靡环N或多種類型的水解酶。當(dāng)使用兩種或多種類型的酶時(shí)，可同時(shí)或分別實(shí)施酶促反應(yīng)。在本發(fā)明中，特別優(yōu)選使用胃蛋白酶。此外，也能使用內(nèi)型(endo-type)蛋白酶聯(lián)合外型(exo-type)水解酶。當(dāng)監(jiān)控酶促反應(yīng)的降解率時(shí)，優(yōu)選確定水解反應(yīng)時(shí)間以使得可獲得優(yōu)選的降解率。為了獲得乳鐵蛋白水解產(chǎn)物混合物，本發(fā)明的藥物的活性成分，優(yōu)選降解率是6至20％，特別優(yōu)選8至12％。
蛋白質(zhì)的降解率可通過(guò)，例如根據(jù)Kjeldahl的方法(Ed.by TheJapanese Society for Food Science and Technology，“Food AnalysisMethods，”p.102，Korin，1984)測(cè)定樣品的總含氮量、根據(jù)甲醛滴定法測(cè)定樣品的甲醛氮含量(Ed.by Mitsuda等人，“Laboratory Manual ofFood Engineering，”First Volume，p.547，Yokendo Co.，Ltd.，1970)并使用下列方程式中的測(cè)定值而得到計(jì)算降解率(％)＝(甲醛氮含量/總氮含量)×100當(dāng)獲得優(yōu)選的降解率時(shí)，可終止酶促反應(yīng)。酶促反應(yīng)可通過(guò)在水解溶液中失活酶而得以終止，其可通過(guò)以常規(guī)方式熱失活處理而進(jìn)行?？紤]到所用的酶的熱穩(wěn)定性，熱失活處理的加熱溫度和持續(xù)時(shí)間可適宜的選用能有效失活的條件，例如，可在80至130℃溫度范圍中以30分鐘至2秒鐘的持續(xù)時(shí)間進(jìn)行失活。用酸(例如檸檬酸)，將得到的反應(yīng)混合物優(yōu)選調(diào)節(jié)至5.5至7的pH范圍中。當(dāng)乳鐵蛋白水解產(chǎn)物混合物含有不溶性物質(zhì)，它可通過(guò)離心或過(guò)濾得到除去。
在本發(fā)明中，乳鐵蛋白水解產(chǎn)物混合物的數(shù)平均分子量?jī)?yōu)選是500至5000，特別優(yōu)選是1000至4000。
例如，如文獻(xiàn)(The Society of Polymer Science，Japan，ed.，“Fundamentals of Polymer Science”，pp.116-119，Tokyo Kagaku DozinCo.，Ltd.，1978)中描述的，基于以下描述的不同指數(shù)，數(shù)平均分子量代表大分子化合物的平均分子量。
即，大分子化合物(例如蛋白質(zhì)水解酶)是不均一的物質(zhì)，并且單個(gè)分子的分子量具有分布。因此，蛋白質(zhì)水解酶的分子量必須用平均分子量表示，用于物理化學(xué)上進(jìn)行表述。數(shù)平均分子量(文中也可縮寫(xiě)為Mn)是關(guān)于分子個(gè)數(shù)的平均數(shù)。當(dāng)肽鏈i的分子量是Mi時(shí)，其分子量數(shù)是Ni，根據(jù)下列方程式定義Mn方程式1Mn=Σi=1∞MiNi/Σi=1∞Ni]]>如上所述，獲得的乳鐵蛋白水解產(chǎn)物混合物本身可用作本發(fā)明藥物的活性成分，或以常規(guī)方式凍干或噴霧干燥并以粉末狀保存。此外，其可用于生產(chǎn)乳鐵蛋白部分肽，本發(fā)明的藥物的另外一個(gè)活性成分。此外，可通過(guò)將乳鐵蛋白部分肽加入以上得到的乳鐵蛋白產(chǎn)物中制備乳鐵蛋白水解產(chǎn)物混合物。
上述乳鐵蛋白部分肽的具體實(shí)例包括具有如序列表中SEQ IDNO1的氨基酸序列中36至60位氨基酸的氨基酸序列的肽，和具有如序列表中SEQ ID NO1的氨基酸序列中36至61位氨基酸的氨基酸序列(SEQ ID NO2)的肽。下文中，具有36至60位氨基酸的氨基酸序列(SEQ ID NO3)的肽也稱作乳鐵蛋白F36-F60，上述具有36至61位氨基酸的氨基酸序列的肽也稱作乳鐵蛋白F36-A61。
當(dāng)包含乳鐵蛋白F36-F60和乳鐵蛋白F36-A61的肽用作活性成分時(shí)，乳鐵蛋白F36-F60和乳鐵蛋白F36-A61的混合比率優(yōu)選是1∶20至20∶1(乳鐵蛋白F36-F60∶乳鐵蛋白F36-A61)，特別優(yōu)選是1∶10至2∶3(乳鐵蛋白F36-F60∶乳鐵蛋白F36-A61)。
例如，乳鐵蛋白部分肽，特別是乳鐵蛋白F36-F60和/或乳鐵蛋白F36-A61，可根據(jù)特開(kāi)平第5-238948號(hào)公報(bào)中描述的生產(chǎn)乳鐵蛋白肽的方法，以上述制備的乳鐵蛋白水解產(chǎn)物混合物作為起始原料制備。此外，乳鐵蛋白F36-F60和/或乳鐵蛋白F36-A61可以是根據(jù)生產(chǎn)合成肽的方法通過(guò)化學(xué)合成而制備的任何肽，或是根據(jù)生產(chǎn)肽的方法通過(guò)基因重組技術(shù)等遺傳工程技術(shù)合成重組肽而制備的任何肽，只要它是具有在SEQ ID NO1氨基酸序列中36至60位氨基酸和/或36至61位氨基酸的氨基酸序列的肽即可。例如，就使用遺傳工程技術(shù)的方法而言，通過(guò)基于編碼包含目的區(qū)域的氨基酸序列的核苷酸序列而制備合適引物、使用上述引物和包含作為模板的靶核苷酸序列的cDNA并通過(guò)PCR擴(kuò)增核苷酸序列、使用合適的表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)得到的核苷酸序列，從而制備乳鐵蛋白部分肽。
此外，由于種、屬、個(gè)體差異等等，通常的基因含有突變，例如在一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)的一個(gè)或多個(gè)核苷酸的替換、缺失、插入、添加或倒位，并且由具有所述突變的基因編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸殘基也具有突變。用于本發(fā)明的并包含所述突變的乳鐵蛋白F36-F60和乳鐵蛋白F36-A61也落入本發(fā)明的范圍內(nèi)，只要其在具有抗性的癌癥的抗體治療中可增強(qiáng)抗體藥物的細(xì)胞毒活性的作用沒(méi)有受到損害。在乳鐵蛋白F36-F60或乳鐵蛋白F36-A61中包含的替換、缺失、插入、添加或倒位的氨基酸殘基數(shù)，優(yōu)選是1至12，更優(yōu)選是1至8，最優(yōu)選是1至5。此外，氨基酸殘基的替換優(yōu)選是具有相似性質(zhì)的氨基酸替換，即，所謂的保守性替換。如果所述修飾的乳鐵蛋白F36-F60或乳鐵蛋白F36-A61長(zhǎng)于乳鐵蛋白F36-F60或乳鐵蛋白F36-A61，添加的氨基酸優(yōu)選是對(duì)應(yīng)于乳鐵蛋白的從N末端第36位起始的或從C末端第60或61位起始的序列的氨基酸。然而，只要上述修飾的乳鐵蛋白F36-F60或乳鐵蛋白F36-A61具有期望的作用，添加的氨基酸可以是任意的氨基酸。
可用于本發(fā)明的乳鐵蛋白水解產(chǎn)物混合物或乳鐵蛋白部分肽在癌癥的抗體治療中具有增強(qiáng)抗體藥物的細(xì)胞毒活性的作用，并且該作用可根據(jù)使用碘化丙啶的方法(PI，Dojindo，catalog No.P378)[Cytometry，Vol.8，No.4，pp.421-426，1987]或使用鈣素-AM的方法(Dojindo，catalogNo.341-07901)[Apoptosis，Vol.3，No.3，pp.195-202，1998]測(cè)定。在隨后描述的實(shí)例中，將詳細(xì)地闡述測(cè)定方法。
作為本發(fā)明的藥物，乳鐵蛋白水解產(chǎn)物混合物或乳鐵蛋白部分肽可與藥學(xué)上可接受的載體相結(jié)合制備藥物制劑，可經(jīng)口或腸胃外施用給包括人的哺乳動(dòng)物。作為本發(fā)明用于癌癥的抗體治療的藥物，抗體藥物還可結(jié)合上述成分使用。本發(fā)明的藥物劑型沒(méi)有特別地限定，可根據(jù)治療的目的適宜地選擇。其具體實(shí)例包括片劑、丸劑、粉劑、溶液劑、懸浮劑、乳劑、顆粒劑、膠囊劑、糖漿劑、栓劑、針劑、膏劑、貼劑、滴眼劑、滴鼻劑等等。在藥物制劑的生產(chǎn)中，可使用作為藥學(xué)載體的并通常作為普通試劑的添加劑，所述藥學(xué)載體例如賦型劑、粘合劑、崩解劑、潤(rùn)滑劑、穩(wěn)定劑、調(diào)味劑、稀釋劑、表面活性劑和注射用溶劑。
本發(fā)明藥物中乳鐵蛋白水解產(chǎn)物混合物或乳鐵蛋白部分肽的含量沒(méi)有特別地限定，并可適宜地選擇。然而，例如，藥物制劑中含有乳鐵蛋白水解產(chǎn)物混合物的濃度可以是10μg/ml至50mg/ml，優(yōu)選是50μg/ml至10mg/ml，以及制劑中乳鐵蛋白部分肽的濃度可以是0.5至200μg/ml，優(yōu)選是1至100μg/ml。
本發(fā)明藥物的施用時(shí)間沒(méi)有特別地限定，可在施用抗體藥物之前或之后或同時(shí)與抗體藥物施用。施用時(shí)間可根據(jù)用于目的癌癥類型的治療的方法適宜地選擇。施用方法可根據(jù)劑型、年齡、性別或病人的其他條件、病人癥狀的嚴(yán)重程度等等適宜地選擇。
本發(fā)明藥物制劑中含有的活性成分的劑量可根據(jù)施用方法、年齡、性別和病人疾病的嚴(yán)重程度、其他條件等等適宜地選擇。作為指導(dǎo)，作為活性成分的乳鐵蛋白水解產(chǎn)物混合物或乳鐵蛋白部分肽的劑量?jī)?yōu)選在0.001至60mg/kg/天，優(yōu)選是0.01至20mg/kg/天，并且作為分開(kāi)的部分，服藥量可以是一天一次或一天兩次或多次。
本發(fā)明的藥物可用作使用抗體藥物治療癌癥(例如，乳腺癌、B細(xì)胞淋巴瘤和結(jié)腸癌中任意一種)的治療中的治療藥物、增強(qiáng)藥物或輔助醫(yī)療藥物。此外，在本發(fā)明的藥物中，包含帶有乳鐵蛋白水解產(chǎn)物混合物或乳鐵蛋白部分肽的抗體藥物的藥物可用作癌癥的抗體治療藥物。此外，即使在使用本發(fā)明用于癌癥的抗體治療的藥物時(shí)，還可施用用于增強(qiáng)本發(fā)明的抗體藥物的細(xì)胞毒活性的抗體藥物或藥物。本發(fā)明的藥物對(duì)特別是具有抗體藥物抗性的癌癥顯示極其明顯的效果。用于本發(fā)明的抗體藥物的實(shí)例包括抗CD20抗體(rituximab)、抗HER2單克隆抗體(trastuzumab)、抗17-1A(人上皮瘤粘附分子)抗體(edrecolomab)等等。此外，也可使用用于癌癥治療的抗體治療中所用的抗體藥物。此外，不但可使用現(xiàn)在已知的抗體藥物，而且也可使用今后研制的抗體藥物。
本發(fā)明的藥物在抗體治療中優(yōu)選與抗體藥物聯(lián)合使用(并不限制它們是否是同時(shí)施用或單獨(dú)施用)，并且也可與用于上述任意癌癥中的已知預(yù)防藥或治療藥(包括增效藥和輔助藥)聯(lián)合使用。聯(lián)合使用可增強(qiáng)上述癌癥疾病的預(yù)防和治療效果，并可降低上述聯(lián)合使用的預(yù)防藥或治療藥的劑量。此外，用于上述癌癥中聯(lián)合使用的預(yù)防藥或治療藥可作為活性成分包含在本發(fā)明的藥物組合物中，或不包含在本發(fā)明的藥物組合物中，可以單味藥構(gòu)成商品在施用時(shí)聯(lián)合。
本發(fā)明的藥物或乳鐵蛋白水解產(chǎn)物混合物或作為藥物活性成分的乳鐵蛋白部分肽可包含在食品或飲料中。只要活性成分的效果沒(méi)有降解，食品或飲料的形式和性質(zhì)就沒(méi)有特別地限制，并且食品或飲料可經(jīng)口攝入，以及除了加入上述活性成分之外，它們通過(guò)使用通常用于食品或飲料的原料以常規(guī)方式制備。
本發(fā)明的食品或飲料的用途可以是用于增強(qiáng)癌癥的抗體治療所用到的抗體藥物的細(xì)胞毒活性的任何用途。實(shí)例包括，例如，食品或飲料的用途可用于減少或消除癌癥，特別是具有抗體藥物抗性的癌癥的風(fēng)險(xiǎn)因素。
本發(fā)明的食品或飲料也可用于預(yù)防由具有抗體藥物抗性的癌癥所引起的疾病等等。此外，本發(fā)明的食品或飲料可預(yù)防由具有抗體藥物抗性的癌癥所引起的多種疾病及其并發(fā)癥等等，并降低這些疾病及其并發(fā)癥等等的風(fēng)險(xiǎn)。
本發(fā)明的食品或飲料優(yōu)選以附有“用于增強(qiáng)癌癥的抗體治療中所使用的抗體藥物的細(xì)胞毒活性”標(biāo)識(shí)的食品或飲料銷售，例如，“含有用于增強(qiáng)癌癥的抗體治療中使用的抗體藥物的細(xì)胞毒活性的藥物的食品或飲料，其標(biāo)注“用于增強(qiáng)癌癥的抗體治療中使用的抗體藥物的細(xì)胞毒活性”，或“含有標(biāo)注“增強(qiáng)癌癥的抗體治療中使用的抗體藥物的細(xì)胞毒活性”的乳鐵蛋白水解產(chǎn)物混合物或乳鐵蛋白部分肽的食品或飲料”，或“含有用于增強(qiáng)癌癥的抗體治療中使用的抗體藥物的細(xì)胞毒活性效果的化合物的食品或飲料”，或“含有標(biāo)注“用于增強(qiáng)癌癥的抗體治療中使用的抗體藥物的細(xì)胞毒活性”的乳鐵蛋白水解產(chǎn)物的食品或飲料”，或“含有標(biāo)注“用于增強(qiáng)癌癥的抗體治療中使用的抗體藥物的細(xì)胞毒活性”的乳鐵蛋白部分肽的食品或飲料”，或“含有標(biāo)注“用于增強(qiáng)癌癥的抗體治療中使用的抗體藥物的細(xì)胞毒活性”的乳鐵蛋白水解產(chǎn)物的食品或飲料”，或“含有標(biāo)注“用于增強(qiáng)癌癥的抗體治療中使用的抗體藥物的細(xì)胞毒活性”的乳鐵蛋白部分肽的食品或飲料”等等。另外，因?yàn)楸景l(fā)明的化合物、組合物等等具有增強(qiáng)癌癥的抗體治療中使用的抗體藥物的細(xì)胞毒活性的作用，本發(fā)明的食品或飲料可標(biāo)注“用于增強(qiáng)癌癥的抗體治療中使用的抗體藥物的細(xì)胞毒活性”。
用于上述描述的標(biāo)識(shí)的用語(yǔ)不必限于“用于增強(qiáng)癌癥的抗體治療中使用的抗體藥物的細(xì)胞毒活性”的表達(dá)方式，任何用于癌癥的抗體治療中使用的抗體藥物的細(xì)胞毒活性的輔助表達(dá)或增強(qiáng)效果的用語(yǔ)當(dāng)然在本發(fā)明范圍之內(nèi)。如所指的用語(yǔ)，也可能是基于多種用途的標(biāo)識(shí)，使消費(fèi)者認(rèn)識(shí)癌癥的抗體治療中使用的抗體藥物的細(xì)胞毒活性的增強(qiáng)效果、或癌癥的抗體治療中使用的抗體藥物的輔助或增強(qiáng)效果。實(shí)例包括，例如，“用于減少和消除具有抗體藥物抗性的癌癥的風(fēng)險(xiǎn)因素等等”的標(biāo)識(shí)。另外，在上述的標(biāo)識(shí)中，可省略“用于癌癥的抗體治療”的用語(yǔ)。
上述術(shù)語(yǔ)“標(biāo)識(shí)”包括用于告知消費(fèi)者上述用途的所有行為，并且不管標(biāo)識(shí)的目的、內(nèi)容、客觀條款、介質(zhì)等等，任何提醒或類比說(shuō)明上述用途的標(biāo)識(shí)屬于本發(fā)明的“標(biāo)識(shí)”范圍之內(nèi)。然而，標(biāo)識(shí)優(yōu)選以允許消費(fèi)者直接認(rèn)識(shí)上述用途的表達(dá)進(jìn)行闡述。具體實(shí)例包括在涉及本發(fā)明的食品或飲料的商品或商品包裝上指明上述用途的行為，或用于分配或輸送或進(jìn)口所述標(biāo)注了上述用途的商品或商品包裝目的的分配、輸送、顯示行為，或顯示或分配涉及商品的廣告、價(jià)目表或工商業(yè)票據(jù)的行為，或通過(guò)電磁法(互聯(lián)網(wǎng)等)提供包括滿足于標(biāo)注上述用途的那些信息的行為，等等。
標(biāo)識(shí)優(yōu)選是通過(guò)行政部門(mén)等等批準(zhǔn)的標(biāo)識(shí)(例如，基于批準(zhǔn)形式的標(biāo)識(shí)，其由行政部門(mén)提供的任何法律系統(tǒng)認(rèn)可)，具體地優(yōu)選是在包裝、容器、目錄、小冊(cè)和在例如POPs的銷售點(diǎn)的廣告資料、其他文件等等上的標(biāo)識(shí)。
標(biāo)識(shí)的實(shí)例還包括，例如，作為保健食品、功能食品、腸營(yíng)養(yǎng)食品、用于特殊膳食用途的食品、具有營(yíng)養(yǎng)功能聲明(nutrient functionclaims)的食品、準(zhǔn)藥品等等的標(biāo)識(shí)，以及勞動(dòng)福利衛(wèi)生部批準(zhǔn)的標(biāo)識(shí)，例如，根據(jù)用于指定的保健用途的系統(tǒng)和類似系統(tǒng)批準(zhǔn)的標(biāo)識(shí)。后者的實(shí)例包括用于指定的保健用途的食品標(biāo)識(shí)、用于具有合格健康聲明(qualified health claims)的保健用途的食品標(biāo)識(shí)、對(duì)身體結(jié)構(gòu)和功能有影響的標(biāo)識(shí)、降低疾病風(fēng)險(xiǎn)聲明的標(biāo)識(shí)等等，更準(zhǔn)確地，典型實(shí)例包括健康促進(jìn)法實(shí)施細(xì)則(日本勞動(dòng)福利衛(wèi)生部，部級(jí)條例No.86，2003年4月30日)中提供的用于指定保健用途的食品標(biāo)識(shí)(特別是用于保健用途的標(biāo)識(shí))和類似標(biāo)識(shí)。
實(shí)施例下文中，本發(fā)明通過(guò)下列涉及的實(shí)施例進(jìn)一步具體地闡述。然而，本發(fā)明并不限于下列實(shí)施例。
乳鐵蛋白水解產(chǎn)物混合物的制備將總量2.0kg的分離自脫脂乳(Morinaga Milk Industry Co.，Ltd.，純度約90％)的牛乳鐵蛋白以5質(zhì)量％的濃度溶解于蒸餾水中，加入1N鹽酸調(diào)節(jié)溶液至pH3.0。將結(jié)晶胃蛋白酶(Difco)以底物的3質(zhì)量％比例加入，并在37℃水解4小時(shí)。然后，將反應(yīng)混合液在80℃加熱15分鐘以失活胃蛋白酶，并加入1N氫氧化鈉以調(diào)節(jié)反應(yīng)混合液至pH7.0。通過(guò)過(guò)濾除去不可溶性物質(zhì)，并將過(guò)濾液噴霧干燥以制備約1.9kg的粉末狀乳鐵蛋白水解產(chǎn)物。生產(chǎn)的乳鐵蛋白水解產(chǎn)物混合物的分解率是10％。
乳鐵蛋白水解肽的制備以與制備實(shí)施例1中相同方式制備的總量600g的起始原料(乳鐵蛋白水解產(chǎn)物混合物)以5質(zhì)量％的濃度溶解于蒸餾水中。用水充分洗滌，以平衡約3000ml的疏水性載體(Butyl TOYOPERL 650M，商標(biāo)名，TOSOH CORP.)。將起始原料溶液和疏水性載體在裝備有攪拌器的容器中混合，然后分離溶液。將疏水性載體裝填柱(長(zhǎng)10cm，直徑20cm)，并將上述的分離液上柱。然后，用水以400ml/分鐘的流速充分洗柱，直到洗液在280nm的吸光度變成0.06或更低。
隨后，將10mmol鹽酸上柱以洗脫乳鐵蛋白水解肽，將洗脫液和等體積的McIlvaine緩沖液(按177份體積的0.1M乙酸+按823份體積的0.2M磷酸二氫鈉的混合物，pH7.0)混合，肽被吸附在疏水性載體上。將疏水性載體裝填柱，并用6000ml相同的緩沖液洗滌，以及用9000ml的McIlvaine緩沖液(按485份體積的0.1M乙酸+按515份體積的0.2M磷酸二氫鈉的混合物，pH5.0)洗脫乳鐵蛋白水解肽。將10mM鹽酸和水上柱以再生疏水性載體，并用1N氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)洗脫液的pH至7.0。將上述含有乳鐵蛋白水解肽的洗脫液經(jīng)過(guò)該柱，并用30升水洗柱以除去緩沖液的鹽。然后，將10mM鹽酸上柱以洗脫乳鐵蛋白水解肽，其凍干可獲得約10.5g粉末狀乳鐵蛋白水解肽。得到的乳鐵蛋白水解肽的純度通過(guò)HPLC測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)達(dá)到99％。此外，確定乳鐵蛋白水解肽的氨基酸序列，結(jié)果證實(shí)生成的乳鐵蛋白水解肽含有乳鐵蛋白F36-F60和乳鐵蛋白F36-A61的肽。這些肽(乳鐵蛋白F36-F60和乳鐵蛋白F36-A61)的比率是1∶6。
下文中，本發(fā)明根據(jù)下列測(cè)試實(shí)施例詳細(xì)地闡述。
為了檢測(cè)添加乳鐵蛋白水解產(chǎn)物混合物對(duì)補(bǔ)體和抗體藥物的細(xì)胞毒作用的效果而實(shí)施該測(cè)試。
(1)測(cè)試樣品將在制備實(shí)施例1中制備的乳鐵蛋白水解產(chǎn)物混合物，用含有7.5％胎牛血清(Gibco，目錄號(hào)10099-141)和1％青霉素-鏈霉素(Gibco，目錄號(hào)15070-063)的RPMI 1640培養(yǎng)基(Sigma，目錄號(hào)R8758)[下文中，該溶液指的是“稀釋液”]調(diào)節(jié)至1000μg/ml制備測(cè)試樣品1。此外，對(duì)照樣品1通過(guò)用稀釋液將乳鐵蛋白稀釋至1000μg/ml的濃度。
作為用于測(cè)定補(bǔ)體和抗體藥物的細(xì)胞毒作用的靶細(xì)胞，使用人Burkitt淋巴瘤Raji細(xì)胞(ATCC CCL-86，獲得于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(10801 Boulevard大學(xué)，馬納薩斯，VA 20110-2209，美國(guó)))，并使用稀釋液將細(xì)胞以2×106細(xì)胞/ml的密度懸浮以制備Raji細(xì)胞懸浮液。作為抗體藥物溶液，使用可識(shí)別CD20抗原的rituximab(ZenyakuKogyo，日本Roche出售)，并且其可使用稀釋液配制成200μg/ml的濃度。作為補(bǔ)體溶液，使用人血清AB(Cosmobio，目錄號(hào)832000027)。這些抗體藥物溶液和補(bǔ)體溶液也可用于下列描述的測(cè)試實(shí)施例2至5。
通過(guò)使用碘化丙啶(PI，Dojindo，目錄號(hào)P378)的方法[Cytometry，Vol.8，No.4，pp.421-426，1987]或使用鈣素-AM(Dojindo，目錄號(hào)341-07901)的方法[Apoptosis，Vol.3，No.3，pp.195-202，1998]確定細(xì)胞的生存力。
(2)測(cè)試方法將Raji細(xì)胞懸浮液以每孔100μl的體積(每孔2×105細(xì)胞)加到24孔培養(yǎng)板(NUNC，目錄號(hào)143982)中。將24孔分為四組，在其中的一組的孔(6孔)中加入50μl/孔的抗體藥物溶液和250μl/孔的稀釋液，作為“添加抗體藥物”。此外，在另外一組的孔(6孔)中加入100μl補(bǔ)體溶液和200μl稀釋液，作為“添加補(bǔ)體”。此外，在另外一組的孔(6孔)中加入50μl抗體藥物溶液、100μl補(bǔ)體溶液和150μl稀釋液，作為“添加抗體藥物+補(bǔ)體”。在剩下一組的孔(6孔)中，加入300μl稀釋液，作為“未添加”。
對(duì)于上述四組，分別加入上述的100μl/孔的測(cè)試樣品1(4組×2孔)、對(duì)照樣品1(4組×2孔)或稀釋液(4組×2孔)，作為“測(cè)試樣品組1”、“對(duì)照組1”和“陰性組1”。
通過(guò)使用上述制備的24孔板，使用培養(yǎng)箱(Napco，目錄號(hào)5300)將細(xì)胞在37℃和5％二氧化碳(CO2)的條件下溫育1小時(shí)。然后，收集各樣品組的細(xì)胞，并通過(guò)上述使用PI的方法檢測(cè)各組的死細(xì)胞的比率。根據(jù)所有靶細(xì)胞被殺死的情況計(jì)算細(xì)胞毒活性，設(shè)定其為100％。
(3)測(cè)試結(jié)果該測(cè)試結(jié)果如表1所示。從表1顯示的結(jié)果清楚可見(jiàn)，通過(guò)“加入抗體藥物+補(bǔ)體”，確定各樣品組的細(xì)胞毒活性(“測(cè)試樣品組1”45.7％，“對(duì)照樣品組”24.3％，“陰性樣品組1”30.7％)，并且發(fā)現(xiàn)，特別是乳鐵蛋白水解產(chǎn)物混合物(測(cè)試樣品組1)顯著地增強(qiáng)細(xì)胞毒活性(與陰性樣品組1相比，增加約50％)。另一方面，與陰性樣品組相比，對(duì)照樣品組1中細(xì)胞毒活性未增加，因此發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞毒活性的增強(qiáng)是特異于乳鐵蛋白水解產(chǎn)物混合物的活性。
表1
該實(shí)施例為了檢測(cè)在補(bǔ)體和抗體藥物的細(xì)胞毒活性的培養(yǎng)期間的、添加了乳鐵蛋白水解產(chǎn)物混合物培養(yǎng)的靶腫瘤細(xì)胞的敏感性的變化。
(1)測(cè)試樣品通過(guò)測(cè)試實(shí)施例1中用到的稀釋液，將制備實(shí)施例1中制備的乳鐵蛋白水解產(chǎn)物混合物稀釋至1000μg/ml的濃度，以制備測(cè)試樣品2。
(2)測(cè)試方法將人Burkitt淋巴瘤Raji細(xì)胞以2×105細(xì)胞/培養(yǎng)瓶(BD，目錄號(hào)35-3014)的細(xì)胞數(shù)懸浮在6.3ml的稀釋液中。對(duì)于以上懸浮液，分別制備加入了上述的0.7ml測(cè)試樣品2的組(測(cè)試樣品組2)和加入了0.7ml稀釋液的組(陰性樣品組2)，并將細(xì)胞在37℃和5％二氧化碳(CO2)的條件下用培養(yǎng)箱溫育三天。
將兩個(gè)樣品組的細(xì)胞各自重新加入10ml稀釋液，并使用離心機(jī)(KUBOTA，目錄號(hào)5910)離心(1100rpm×6分鐘)以除去上清液。該過(guò)程重復(fù)3次，然后通過(guò)使用如測(cè)試實(shí)施例1中用到“添加抗體藥物+補(bǔ)體”和“未添加”的相同系統(tǒng)檢測(cè)細(xì)胞對(duì)細(xì)胞毒活性的敏感性。
(3)測(cè)試結(jié)果該測(cè)試結(jié)果如表2所示。從表2顯示的結(jié)果清楚可見(jiàn)，與陰性樣品組2相比，在添加了乳鐵蛋白水解產(chǎn)物混合物(測(cè)試樣品組2)培養(yǎng)3天的靶腫瘤細(xì)胞組中，“補(bǔ)體+抗體藥物”提供的對(duì)細(xì)胞毒活性的敏感性明顯地得到提高，因此發(fā)現(xiàn)測(cè)試樣品1中闡述的增強(qiáng)作用對(duì)靶腫瘤細(xì)胞起作用。
表2
該測(cè)試?yán)秊榱藱z測(cè)添加乳鐵蛋白水解肽對(duì)補(bǔ)體和抗體藥物的細(xì)胞毒作用的效果。
(1)測(cè)試樣品使用測(cè)試實(shí)施例1中用到的稀釋液，將制備實(shí)施例1中制備的乳鐵蛋白水解產(chǎn)物混合物稀釋至1000μg/ml的濃度，以制備測(cè)試樣品3。此外，使用相同的稀釋液，將制備實(shí)施例2制備的乳鐵蛋白水解肽稀釋至1000μg/ml的濃度，以制備測(cè)試樣品4。
(2)測(cè)試方法將人Burkitt淋巴瘤Raji細(xì)胞以2×105細(xì)胞/ml的密度懸浮在稀釋液中，以制備細(xì)胞懸浮液，并將該細(xì)胞懸浮液按每孔50μl的體積(每孔1×104細(xì)胞)加入96孔培養(yǎng)板(NUNC，目錄號(hào)167008)中18個(gè)孔中。將18孔分為兩組，在一組的孔(9孔)中加入10μl/孔的抗體藥物溶液、20μl/孔的補(bǔ)體溶液和10μl/孔的稀釋液，作為“添加抗體藥物+補(bǔ)體”。在剩下組的孔(9孔)中，加入40μl的稀釋液，作為“未添加”。對(duì)于上述2組的各個(gè)孔，分別加入上述的10μl/孔的測(cè)試樣品3(2組×3孔)、測(cè)試樣品4(2組×3孔)或稀釋液(2組×3孔)，作為“測(cè)試樣品組3”、“對(duì)照樣品組4”和“陰性樣品組2”。
通過(guò)使用上述制備的96孔板，使用培養(yǎng)箱將細(xì)胞在37℃和5％二氧化碳(CO2)的條件下溫育1小時(shí)。然后，收集各個(gè)樣品組的細(xì)胞，并根據(jù)上述方法使用PI檢測(cè)各組的死細(xì)胞的比率。根據(jù)所有靶細(xì)胞被殺死的情況計(jì)算細(xì)胞毒活性，設(shè)定其為100％。
(3)測(cè)試結(jié)果該測(cè)試結(jié)果如表3所示。從表3顯示的結(jié)果清楚可見(jiàn)，發(fā)現(xiàn)乳鐵蛋白水解肽(測(cè)試樣品組4)也顯著地增強(qiáng)由補(bǔ)體和抗體發(fā)揮的細(xì)胞毒活性(與陰性樣品組2相比，增加約67％)。
表3
在該測(cè)試中，通過(guò)使用對(duì)補(bǔ)體和抗體的細(xì)胞毒活性表現(xiàn)不同敏感度的靶腫瘤細(xì)胞，檢測(cè)乳鐵蛋白水解產(chǎn)物混合物的細(xì)胞毒活性增強(qiáng)作用(敏感性恢復(fù))。
(1)測(cè)試樣品使用測(cè)試實(shí)施例1中用到的稀釋液，將制備實(shí)施例中制備的乳鐵蛋白水解產(chǎn)物混合物稀釋至1000μg/ml的濃度，以制備測(cè)試樣品5。
(2)測(cè)試方法將具有抗體藥物抗性的淋巴瘤衍生的Daudi細(xì)胞(ATCC CCL-213，獲得自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心)、Raji細(xì)胞(ATCC CCL-86，獲得自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心)、SKW6.4細(xì)胞(ATCC TIB-215，獲得自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心)和淋巴瘤衍生的ARH-77細(xì)胞(ATCC CRL-1621，獲得自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心)，按2×106細(xì)胞/ml的細(xì)胞數(shù)各自懸浮在稀釋液中以制備細(xì)胞懸浮液，并將每個(gè)細(xì)胞懸浮液按100μl/孔(每孔2×105細(xì)胞)的體積加入24孔培養(yǎng)板(NUNC，目錄號(hào)143982)中。
根據(jù)如測(cè)試實(shí)施例1的“添加抗體藥物+補(bǔ)體”系統(tǒng)所用到的相同方法，實(shí)施細(xì)胞毒活性的檢測(cè)。即，在加入了細(xì)胞懸浮液中的各個(gè)孔中，分別加入50μl抗體藥物溶液、100μl補(bǔ)體溶液和150μl稀釋液，以及上述的100μl測(cè)試樣品5，或者進(jìn)一步加入稀釋液，作為“測(cè)試樣品組5”和“陰性樣品組3”。
通過(guò)使用上述制備的24孔板，使用培養(yǎng)箱(Napco，目錄號(hào)5300)將細(xì)胞在37℃和5％二氧化碳(CO2)的條件下培養(yǎng)1小時(shí)。然后，收集各樣品組的細(xì)胞，并通過(guò)上述使用PI的方法檢測(cè)各組的死細(xì)胞的比率。根據(jù)所有靶細(xì)胞被殺死的情況計(jì)算細(xì)胞毒活性，設(shè)定其為100％。
(3)測(cè)試結(jié)果該測(cè)試結(jié)果如表4所示。從表4顯示的結(jié)果清楚可見(jiàn)，對(duì)于Daudi細(xì)胞，無(wú)法證實(shí)乳鐵蛋白水解產(chǎn)物混合物降低了補(bǔ)體和抗體的細(xì)胞毒活性的敏感性，其中所述Daudi細(xì)胞具有對(duì)細(xì)胞毒活性的高敏感性。對(duì)于Raji和SKW6.4細(xì)胞，可證實(shí)補(bǔ)體和抗體增強(qiáng)細(xì)胞毒活性的效果。
此外，對(duì)于ARH-77細(xì)胞，其是對(duì)補(bǔ)體和抗體的細(xì)胞毒活性表現(xiàn)抗性的淋巴瘤衍生細(xì)胞(具有抗體藥物抗性)，證實(shí)乳鐵蛋白水解產(chǎn)物混合物消除細(xì)胞毒活性抗性的效果?？梢哉J(rèn)為這是因?yàn)槿殍F蛋白水解產(chǎn)物混合物具有增強(qiáng)有抗體藥物抗性的腫瘤細(xì)胞對(duì)細(xì)胞毒活性的敏感性的效果，并恢復(fù)補(bǔ)體和抗體藥物的細(xì)胞毒活性。
表4
在該測(cè)試中，將作為對(duì)照的乳鐵蛋白水解產(chǎn)物混合物、乳鐵蛋白部分肽和未降解的乳鐵蛋白等等用作樣品，來(lái)檢測(cè)其對(duì)用于人Burkitt淋巴瘤Raji靶細(xì)胞的補(bǔ)體和抗體藥物的細(xì)胞毒活性的效果。
(1)測(cè)試樣品將制備實(shí)施例1中制備的乳鐵蛋白水解產(chǎn)物混合物作為樣品A，并將制備實(shí)施例2中制備的乳鐵蛋白水解肽(乳鐵蛋白部分肽)作為樣品B。此外，作為對(duì)照樣品，將可商購(gòu)的牛乳鐵蛋白(Morinaga MilkIndustry Co.，Ltd.)作為對(duì)照A，并將魚(yú)精蛋白硫酸鹽作為對(duì)照B。
(2)測(cè)試方法將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Raji細(xì)胞作為靶細(xì)胞。將通過(guò)離心細(xì)胞懸浮液而收集的Raji細(xì)胞懸浮于新鮮培養(yǎng)液(RPMI 1640，10％FCS)，計(jì)數(shù)然后按1.0×105細(xì)胞/孔的數(shù)量加入24孔平板中。對(duì)于各孔，加入rituximab(10mg/ml)和終濃度為1.0mg/ml的樣品A、樣品B、對(duì)照A或?qū)φ誃(或培養(yǎng)基[培養(yǎng)液]而不是樣品)，然后以10％的終濃度加入人正常血清(AB型)。然后將細(xì)胞在CO2培養(yǎng)箱中溫育1小時(shí)，在培養(yǎng)的最后15分鐘期間加入PI(碘化丙啶，1mg/ml)。培養(yǎng)結(jié)束后，通過(guò)離心收集全部Raji細(xì)胞以除去上清液，并將細(xì)胞重懸浮于0.5ml PBS(磷酸鹽緩沖液)中。根據(jù)死細(xì)胞在PI核染色中是陽(yáng)性的事實(shí)，通過(guò)用流式細(xì)胞儀(FACScan)分析懸浮液，對(duì)培養(yǎng)期間死亡的Raji細(xì)胞計(jì)數(shù)。
在該測(cè)試中，根據(jù)下列方程式計(jì)算細(xì)胞毒活性。
細(xì)胞毒活性(％)＝(PI陽(yáng)性細(xì)胞數(shù))/(總細(xì)胞數(shù))×100
(3)測(cè)試結(jié)果該測(cè)試結(jié)果如圖1所示。從圖1顯示的結(jié)果清楚可見(jiàn)，當(dāng)對(duì)照A作為樣品時(shí)，細(xì)胞毒活性[死細(xì)胞數(shù)(％)]可與使用培養(yǎng)基(培養(yǎng)液)所觀測(cè)到的活性相同。相反，當(dāng)使用樣品A時(shí)，細(xì)胞毒活性增加，并且此外與使用樣品A所觀測(cè)到的活性相比，當(dāng)使用分離自作為樣品A的乳鐵蛋白水解產(chǎn)物混合物的樣品B時(shí)，觀測(cè)到細(xì)胞毒活性的增加。然而，使用添加了對(duì)照B，未觀測(cè)到該活性的增加。
即，可以證實(shí)樣品B，其是樣品A中含有的組分，也具有增強(qiáng)CDC(依賴補(bǔ)體的細(xì)胞毒作用)的作用。此外，由于使用對(duì)照B不能證實(shí)CDC增強(qiáng)反應(yīng)，其中對(duì)照B是類似于樣品B并富含堿性氨基酸的物質(zhì)，也可說(shuō)明肽的性質(zhì)(堿度)未必影響CDC增強(qiáng)反應(yīng)的作用。根據(jù)這些結(jié)果，可以發(fā)現(xiàn)增強(qiáng)抗體藥物和補(bǔ)體的細(xì)胞毒活性的作用是非常特異于樣品A(乳鐵蛋白水解產(chǎn)物混合物)或樣品B(乳鐵蛋白部分肽)的作用。
利用作為活性成分的乳鐵蛋白水解產(chǎn)物混合物，制備用于癌癥治療的藥物將乳糖(Maigret，600g)、玉米淀粉(Nisshin Flour Milling Co.，Ltd.，400g)、結(jié)晶纖維素(Wako Pure Chemical Industries，400g)和制備實(shí)施例1中生產(chǎn)的乳鐵蛋白水解產(chǎn)物混合物(600g)通過(guò)50目篩(YamatoScientific)篩分，置于0.5mm厚的聚乙烯袋中，倒置混勻，并使用全自動(dòng)膠囊充填機(jī)(Cesere Pedini，壓型)按275mg/膠囊的劑量裝滿膠囊(Japan Elanco，明膠膠囊No.1，Op.Yellow No.6 Body，空重75mg)，獲得7000粒具有增強(qiáng)抗體藥物細(xì)胞毒活性效果的藥物膠囊。
乳鐵蛋白水解肽作為活性成分的，制備用于癌癥治療的藥物將結(jié)晶纖維素(Wako Pure Chemical Industries，20g)放置于體積1000ml的研缽(Nakashima Mfg.Co.，Ltd.)中，加入20ml水并混勻。然后，對(duì)于混合物，加入預(yù)先通過(guò)48目篩(Wakamori)而篩分的25g乳糖(Maigret)，并加入在制備實(shí)施例2中制備的55g乳鐵蛋白水解肽，混合。將得到的濕塊置于20目篩(Wakamori)上并用手在不銹鋼板上擠壓，以干燥并制備顆粒，將顆?？焖俸途鶆虻胤植迹糜诟稍餀C(jī)中，在25℃干燥兩天以獲得細(xì)顆粒。將這些顆粒通過(guò)20目聚乙烯篩(Wakamori)篩分，并將過(guò)篩的顆粒鋪在大紙片上，加入預(yù)先通過(guò)48目篩而篩分的2g硬脂酸鎂(Kanto Kagaku)，混勻。使用直徑8mm的R研杵和設(shè)定用于10個(gè)片劑壓片數(shù)、6.2g片劑重量和3.5至5.0kg的Monsanto硬度條件的壓縮壓力，將顆粒在片劑壓片機(jī)(KimuraSeisakusho，Model KT-2)中制成片劑，以獲得具有增強(qiáng)抗體藥物的細(xì)胞毒活性效果的16個(gè)抗體片劑，其含有約50％的乳鐵蛋白水解肽。
工業(yè)實(shí)用性由于本發(fā)明用到的用于癌癥治療的藥物活性成分可從例如牛乳的相對(duì)廉價(jià)的原料中得到，它可大規(guī)模地生產(chǎn)。此外，通過(guò)使用本發(fā)明藥物來(lái)增強(qiáng)補(bǔ)體和抗體藥物的細(xì)胞毒活性，可有效地殺死或殺傷靶腫瘤細(xì)胞。此外，它也具有使有抗體藥物抗性的腫瘤細(xì)胞的補(bǔ)體和抗體藥物的細(xì)胞毒活性得以恢復(fù)的效果。也就是說(shuō)，即使對(duì)出現(xiàn)了具有抗體藥物抗性的惡性腫瘤復(fù)發(fā)的病人和難以評(píng)價(jià)使用抗體藥物的治療，聯(lián)合使用本發(fā)明藥物的可達(dá)到使用抗體藥物的連續(xù)實(shí)施治療的要求。這顯然提供了用于克服在癌癥治療中抗體藥物抗性的新方向。
序列表<110>Morinaga Milk Industry Co.，Ltd.
<120>治療癌癥的藥物<130>FP1600PC5001<150>JP2004-80454<151>2004-03-19<160>3<170>PatentIn Ver.3.1<210>1<211>708<212>PRT<213>牛(Bos taurus)<220>
<221>sig_肽<222>(1)...(19)<223>乳鐵蛋白<400>1Met Lys Leu Phe Val Pro Ala Leu Leu Ser Leu Gly Ala Leu Gly Leu1 5 10 15Cys Leu Ala Ala Pro Arg Lys Asn Val Arg Trp Cys Thr Ile Ser Gln20 25 30Pro Glu Trp Phe Lys Cys Arg Arg Trp Gln Trp Arg Met Lys Lys Leu35 40 45Gly Ala Pro Ser Ile Thr Cys Val Arg Arg Ala Phe Ala Leu Glu Cys50 55 60Ile Arg Ala Ile Ala Glu Lys Lys Ala Asp Ala Val Thr Leu Asp Gly65 70 75 80Gly Met Val Phe Glu Ala Gly Arg Asp Pro Tyr Lys Leu Arg Pro Val85 90 95Ala Ala Glu Ile Tyr Gly Thr Lys Glu Ser Pro Gln Thr His Tyr Tyr100 105 110Ala Val Ala Val Val Lys Lys Gly Ser Asn Phe Gln Leu Asp Gln Leu115 120 125Gln Gly Arg Lys Ser Cys His Thr Gly Leu Gly Arg Ser Ala 6ly Trp130 135 140
Ile Ile Pro Met Gly Ile Leu Arg Pro Tyr Leu Ser Trp Thr Glu Ser145 150 155 160Leu Glu Pro Leu Gln Gly Ala Val Ala Lys Phe Phe Ser Ala Ser Cys165 170 175Val Pro Cys Ile Asp Arg Gln Ala Tyr Pro Asn Leu Cys Gln Leu Cys180 185 190Lys Gly Glu Gly Glu Asn Gln Cys Ala Cys Ser Ser Arg Glu Pro Tyr195 200 205Phe Gly Tyr Ser Gly Ala Phe Lys Cys Leu Gln Asp Gly Ala Gly Asp210 215 220Val Ala Phe Val Lys Glu Thr Thr Val Phe Glu Asn Leu Pro Glu Lys225 230 235 240Ala Asp Arg Asp Gln Tyr Glu Leu Leu Cys Leu Asn Asn Ser Arg Ala245 250 255Pro Val Asp Ala Phe Lys Glu Cys His Leu Ala Gln Val Pro Ser His260 265 270Ala Val Val Ala Arg Ser Val Asp Gly Lys Glu Asp Leu Ile Trp Lys275 280 285Leu Leu Ser Lys Ala Gln Glu Lys Phe Gly Lys Asn Lys Ser Arg Ser290 295 300Phe Gln Leu Phe Gly Ser Pro Pro Gly Gln Arg Asp Leu Leu Phe Lys305 310 315 320Asp Ser Ala Leu Gly Phe Leu Arg Ile Pro Ser Lys Val Asp Ser Ala325 330 335Leu Tyr Leu Gly Ser Arg Tyr Leu Thr Thr Leu Lys Asn Leu Arg Glu340 345 350Thr Ala Glu Glu Val Lys Ala Arg Tyr Thr Arg Val Val Trp Cys Ala355 360 365Val Gly Pro Glu Glu Gln Lys Lys Cys Gln Gln Trp Ser Gln Gln Ser370 375 380Gly Gln Asn Val Thr Cys Ala Thr Ala Ser Thr Thr Asp Asp Cys Ile385 390 395 400Val Leu Val Leu Lys Gly Glu Ala Asp Ala Leu Asn Leu Asp Gly Gly405 410 415Tyr Ile Tyr Thr Ala Gly Lys Cys Gly Leu Val Pro Val Leu Ala Glu420 425 430Asn Arg Lys Ser Ser Lys His Ser Ser Leu Asp Cys Val Leu Arg Pro435 440 445Thr Glu Gly Tyr Leu Ala Val Ala Val Val Lys Lys Ala Asn Glu Gly450 455 460Leu Thr Trp Asn Ser Leu Lys Asp Lys Lys Ser Cys His Thr Ala Val465 470 475 480Asp Arg Thr Ala Gly Trp Asn Ile Pro Met Gly Leu Ile Val Asn Gln485 490 495
Thr Gly Ser Cys Ala Phe Asp Glu Phe Phe Ser Gln Ser Cys Ala Pro500 505 510Gly Ala Asp Pro Lys Ser Arg Leu Cys Ala Leu Cys Ala Gly Asp Asp515 520 525Gln Gly Leu Asp Lys Cys Val Pro Asn Ser Lys Glu Lys Tyr Tyr Gly530 535 540Tyr Thr Gly Ala Phe Arg Cys Leu Ala Glu Asp Val Gly Asp Val Ala545 550 555 560Phe Val Lys Asn Asp Thr Val Trp Glu Asn Thr Asn Gly Glu Ser Thr565 570 575Ala Asp Trp Ala Lys Asn Leu Asn Arg Glu Asp Phe Arg Leu Leu Cys580 585 590Leu Asp Gly Thr Arg Lys Pro Val Thr Glu Ala Gln Ser Cys His Leu595 600 605Ala Val Ala Pro Asn His Ala Val Val Ser Arg Ser Asp Arg Ala Ala610 615 620His Val Lys Gln Val Leu Leu His Gln Gln Ala Leu Phe Gly Lys Asn625 630 635 640Gly Lys Asn Cys Pro Asp Lys Phe Cys Leu Phe Lys Ser Glu Thr Lys645 650 655Asn Leu Leu Phe Asn Asp Asn Thr Glu Cys Leu Ala Lys Leu Gly Gly660 665 670Arg Pro Thr Tyr Glu Glu Tyr Leu Gly Thr Glu Tyr Val Thr Ala Ile675 680 685Ala Asn Leu Lys Lys Cys Ser Thr Ser Pro Leu Leu Glu Ala Cys Ala690 695 700Phe Leu Thr Arg705<210>2<211>25<212>PRT<213>牛(Bos taurus)<400>2Phe Lys Cys Arg Arg Trp Gln Trp Arg Met Lys Lys Leu Gly Ala Pro1 5 10 15Ser Ile Thr Cys Val Arg Arg Ala Phe20 25<210>3<211>26<212>PRT<213>牛(Bos taurus)
<400>3Phe Lys Cys Arg Arg Trp Gln Trp Arg Met Lys Lys Leu Gly Ala Pro1 5 10 15Ser Ile Thr Cys Val Arg Arg Ala Phe Ala20 2權(quán)利要求
1.—種用于在癌癥的抗體治療中增強(qiáng)抗體藥物的細(xì)胞毒活性的藥物，其包含作為活性成分并具有在癌癥的抗體治療中增強(qiáng)抗體藥物的細(xì)胞毒活性的作用的乳鐵蛋白水解產(chǎn)物，其中所述乳鐵蛋白水解產(chǎn)物可通過(guò)用水解酶水解乳鐵蛋白而得到。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物，其中水解酶是胃蛋白酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的藥物，其中乳鐵蛋白水解產(chǎn)物的降解率是6至20％。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的藥物，其中乳鐵蛋白的數(shù)平均分子量為500至5000。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的藥物，其中癌是乳腺癌、B細(xì)胞淋巴瘤或結(jié)腸癌中任意一種。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的藥物，其中癌是具有抗體藥物抗性的癌癥。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6任一項(xiàng)所述的藥物，其中增強(qiáng)抗體藥物的細(xì)胞毒活性的作用是提高靶細(xì)胞對(duì)抗體藥物敏感性的作用。
8.一種用于在癌癥的抗體治療中增強(qiáng)抗體藥物的細(xì)胞毒活性的藥物，其包含作為活性成分的下列(a)至(d)的肽中任意一種、或兩種或多種的混合物(a)具有SEQ ID NO2的氨基酸序列的肽；(b)具有在SEQ ID NO1的氨基酸序列中36至60位氨基酸的氨基酸序列、包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失、插入或倒位，且在癌癥的抗體治療中具有增強(qiáng)抗體藥物的細(xì)胞毒活性的作用的肽；(c)具有SEQ ID NO3的氨基酸序列的肽；(d)具有在SEQ ID NO1的氨基酸序列中36至61位氨基酸的氨基酸序列、包括一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失、插入或倒位，并且在癌癥的抗體治療中具有增強(qiáng)抗體藥物的細(xì)胞毒活性的作用的肽。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的藥物，其中癌是乳腺癌、B細(xì)胞淋巴瘤或結(jié)腸癌中任意一種。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的藥物，其中癌是具有抗體藥物抗性的癌。
11.根據(jù)權(quán)利要求8至10中任一項(xiàng)所述的藥物，其中增強(qiáng)抗體藥物的細(xì)胞毒活性的作用是提高靶細(xì)胞對(duì)抗體藥物敏感性的作用。
12.包含根據(jù)權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)所述藥物的食品或飲料。
13.包含乳鐵蛋白水解產(chǎn)物的食品或飲料，其附有食品或飲料用于增強(qiáng)癌癥的抗體治療中所用到的抗體藥物的細(xì)胞毒活性的標(biāo)識(shí)，其中該乳鐵蛋白水解產(chǎn)物可通過(guò)用水解酶水解乳鐵蛋白而得到，并具有增強(qiáng)癌癥的抗體治療中所用到的抗體藥物的細(xì)胞毒活性的作用。
14.一種用于癌癥的抗體治療的藥物，其包含作為活性成分的乳鐵蛋白水解產(chǎn)物和抗體藥物，其中該乳鐵蛋白水解產(chǎn)物可通過(guò)用水解酶水解乳鐵蛋白而得到。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的藥物，其中水解酶是胃蛋白酶。
16.根據(jù)權(quán)利要求14或15所述的藥物，其中乳鐵蛋白水解產(chǎn)物的降解率是6至20％。
17.根據(jù)權(quán)利要求14至16中任一項(xiàng)所述的藥物，其中乳鐵蛋白的數(shù)平均分子量為500至5000。
18.根據(jù)權(quán)利要求14至17中任一項(xiàng)所述的藥物，其中抗體是抗CD20抗體、抗HER2單克隆抗體或抗17-1A(人腫瘤相關(guān)上皮細(xì)胞粘附因子)抗體。
19.根據(jù)權(quán)利要求14至18中任一項(xiàng)所述的藥物，其中癌是具有抗體藥物抗性的癌。
20.一種用于癌癥的抗體治療的藥物，其包含作為活性成分的下列(a)至(d)的肽中任意一種、或兩種或多種的混合物(a)具有SEQ ID NO2的氨基酸序列的肽；(b)具有在SEQ ID NO1的氨基酸序列中36至60位氨基酸的氨基酸序列、包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失、插入或倒位，且在癌癥的抗體治療中具有增強(qiáng)抗體藥物的細(xì)胞毒活性的作用的肽；(c)具有SEQ ID NO3的氨基酸序列的肽；(d)具有在SEQ ID NO1的氨基酸序列中36至61位氨基酸的氨基酸序列、包括一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失、插入或倒位，并且在癌癥的抗體治療中具有增強(qiáng)抗體藥物的細(xì)胞毒活性的作用的肽。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的藥物，其中抗體藥物是抗CD20抗體、抗HER2單克隆抗體或抗17-1A(人腫瘤相關(guān)上皮細(xì)胞粘附因子)抗體。
22.根據(jù)權(quán)利要求20或21所述的藥物，其中癌是具有抗體藥物抗性的癌。
23.乳鐵蛋白水解產(chǎn)物在制備在癌癥的抗體治療中增強(qiáng)抗體藥物的細(xì)胞毒活性的藥物中的用途，其中該乳鐵蛋白水解產(chǎn)物可通過(guò)用水解酶水解乳鐵蛋白而得到，并具有在癌癥的抗體治療中增強(qiáng)抗體藥物的細(xì)胞毒活性的作用。
24.下列(a)至(d)的肽中任意一種、或兩種或多種的混合物在生產(chǎn)在癌癥的抗體治療中增強(qiáng)抗體藥物的細(xì)胞毒活性的藥物中的用途(a)具有SEQ ID NO2的氨基酸序列的肽；(b)具有在SEQ ID NO1的氨基酸序列中36至60位氨基酸的氨基酸序列、包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失、插入或倒位，且在癌癥的抗體治療中具有增強(qiáng)抗體藥物的細(xì)胞毒活性的作用的肽；(c)具有SEQ ID NO3的氨基酸序列的肽；(d)具有在SEQ ID NO1的氨基酸序列中36至61位氨基酸的氨基酸序列、包括一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失、插入或倒位，并且在癌癥的抗體治療中具有增強(qiáng)抗體藥物的細(xì)胞毒活性的作用的肽。
25.一種在使用抗體藥物的癌癥的抗體治療中增強(qiáng)抗體藥物的細(xì)胞毒活性的方法，其中對(duì)病人施用乳鐵蛋白水解產(chǎn)物，所述乳鐵蛋白水解產(chǎn)物可通過(guò)用水解酶水解乳鐵蛋白而得到，并具有在癌癥的抗體治療中增強(qiáng)抗體藥物的細(xì)胞毒活性的作用。
26.一種在使用抗體藥物的癌癥的抗體治療中增強(qiáng)抗體藥物的細(xì)胞毒活性的方法，其中對(duì)病人施用下列(a)至(d)的肽中任意一種、或兩種或多種的混合物(a)具有SEQ ID NO2的氨基酸序列的肽；(b)具有在SEQ ID NO1的氨基酸序列中36至60位氨基酸的氨基酸序列、包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失、插入或倒位，且在癌癥的抗體治療中具有增強(qiáng)抗體藥物的細(xì)胞毒活性的作用的肽；(c)具有SEQ ID NO3的氨基酸序列的肽；(d)具有在SEQ ID NO1的氨基酸序列中36至61位氨基酸的氨基酸序列、包括一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失、插入或倒位，并且在癌癥的抗體治療中具有增強(qiáng)抗體藥物的細(xì)胞毒活性的作用的肽。
全文摘要
癌癥的抗體治療中的、并可通過(guò)用水解酶水解乳鐵蛋白而制備的乳鐵蛋白部分肽或乳鐵蛋白水解產(chǎn)物混合物，具有增強(qiáng)抗體藥物的細(xì)胞毒活性的功效。乳鐵蛋白部分肽或乳鐵蛋白水解產(chǎn)物混合物可作為藥品的活性成分，用于在癌癥的抗體治療中增強(qiáng)抗體藥物的細(xì)胞毒活性。
文檔編號(hào)A61K38/00GK1838965SQ200580000799
公開(kāi)日2006年9月27日 申請(qǐng)日期2005年3月9日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月19日
發(fā)明者畠清彥, 照井康仁, 三島雄二, 山田明男, 櫻井琢磨, 伊藤岳人 申請(qǐng)人:森永乳業(yè)株式會(huì)社