專利名稱：含有細菌鞭毛蛋白作為活性成分的粘膜疫苗佐劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及含有鞭毛蛋白作為活性成分的粘膜疫苗佐劑，鞭毛蛋白是細菌鞭毛的結(jié)構(gòu)成分，該細菌鞭毛蛋白源自創(chuàng)傷弧菌(Vibrio vulnificus)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)和單核細胞增生利斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)。
背景技術(shù)：
創(chuàng)傷弧菌或其縮寫“V.vulnificus”引起的傳染病具有較短的歷史，但世界范圍內(nèi)已經(jīng)連續(xù)報道了其臨床病例，而且這種疾病是新觀察到的疾病之一。雖然該疾病臨床病例的絕對數(shù)目比霍亂或沙門氏菌食物中毒的病例數(shù)目少，但由于其高死亡率和災難性的臨床表現(xiàn)而成為一個重要的社會問題。
美國疾病控制中心(Centers for Disease Control in USA，CDC)的hollis等人在對從人分離出的嗜鹽致病弧菌的細菌學特性研究11年后，于1976年首次報道了創(chuàng)傷弧菌，并由于該菌的乳糖發(fā)酵特征而命名為乳糖發(fā)酵弧菌或Lac(+)。1979年，CDC的Blake等人根據(jù)通過流行病學分析的臨床表現(xiàn)將CDC報道的39名患者分為初級敗血癥和創(chuàng)傷感染組(Blake，P.A.，MersonM.H.，Weaver，R.E.，Hollis，D.G.，Heublin，P.C.，N.Engl.J. Med.3001-6，1979)。同年，F(xiàn)armer將該菌作為新種類命名為創(chuàng)傷弧菌(vulnus＝創(chuàng)傷，ficus＝形成)(Farmer，J.J.III，lancet 2903，1979)。
致病細菌和病毒的傳染主要經(jīng)由吸氣、口服和性傳播等通過粘膜途徑進行。成人體內(nèi)，呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)和泌尿生殖系統(tǒng)由粘膜表面覆蓋的表面積約為400平方米。抵抗常規(guī)菌群和源于外部環(huán)境的病毒和細菌入侵的初級防御系統(tǒng)主要涉及粘膜免疫應答。與全身免疫相比，主要關(guān)于粘膜表面的粘膜免疫仍然沒有得到深入研究，但無需懷疑其重要性。最近，日本東京大學(Tokyo University)的kiyono教授等人已經(jīng)對此進行了集中研究。通常已知的是，在通過粘膜途徑接種疫苗的情況下，與通過皮內(nèi)或皮下途徑接種疫苗相比，更有效地誘導粘膜免疫應答，而且粘膜免疫應答主要通過免疫球蛋白-A(IgA)來介導。
經(jīng)由粘膜途徑的接種疫苗的優(yōu)點是不僅增強全身免疫應答而且同時還增強粘膜免疫應答。因此，擴大了對誘導粘膜組織內(nèi)有效免疫應答的預防性疫苗開發(fā)研究的關(guān)注。然而，與經(jīng)由全身途徑的給藥相比，經(jīng)由粘膜途徑的蛋白質(zhì)抗原給藥具有免疫原性降低的缺點。因此，粘膜疫苗開發(fā)中最重要的因素是開發(fā)可以與疫苗抗原一起安全給藥的有效粘膜佐劑。
疫苗佐劑最重要的因素之一是具有免疫控制功能，如控制抗原遞呈細胞的共刺激分子的表達和由抗原特異性T細胞誘導作用誘導的細胞因子分泌。目前使用的或相關(guān)的作為疫苗佐劑的物質(zhì)是無機鹽如氫氧化鋁凝膠、表面活性劑、源自細菌的物質(zhì)、細胞因子、激素、聚陰離子、聚丙烯(polyacryls)、利用載體(carrier)和病毒的活載體(living vector)，以及諸如礦物油或脂質(zhì)體的媒介物(vehicle)。其中，研究最積極和引人注意的疫苗佐劑是源自蛋白的粘膜疫苗佐劑，如來自霍亂弧菌(Vibrio cholerae)的霍亂毒素(choleratoxin，CT)和來自埃希氏菌屬大腸桿菌(Escherichia coli)的熱不穩(wěn)定性毒素(heat-labile toxin，LT)。據(jù)報道，這些疫苗佐劑經(jīng)由粘膜組織途徑的給藥誘導血清和粘膜組織中產(chǎn)生抗原特異性抗體，并促進由抗原遞呈細胞表面上B7-2表達誘導的T-細胞的共刺激信號(Boyaka，P.N.，Jackson，R.J.，Kiyoni，H.，Yuki，Y.，McGhee，J.R.Immunol.170454-462，2003；Kweon，M.N.，Yamamoto，M.，Watanabe，F(xiàn).，Tamura，S.，Van Ginkel，F(xiàn).W.，Miyauchi，A.，Takagi，H.，Takeda，Y.，Hamabata，T.，F(xiàn)ujihashi，K.，McGhee，J.R.，Kiyono，H.J.Infect.Dis.1861261-1269，2002)。然而，這些佐劑是具有高腸毒素毒性的外毒素，因此不適于直接用于人類?，F(xiàn)今世界范圍內(nèi)正在進行的研究的目的是制備毒性更低但佐劑活性更高的佐劑。

發(fā)明內(nèi)容
在這些情況下，本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)創(chuàng)傷弧菌的鞭毛蛋白是TLR-5的激動劑，刺激上皮細胞、成熟人樹突細胞產(chǎn)生白細胞介素-8(IL-8)，在與破傷風類毒素混合，并用其經(jīng)由鼻內(nèi)途徑對小鼠免疫3次的情況下，與只給予破傷風類毒素的情況相比，顯示出顯著增多的粘膜IgA，還發(fā)現(xiàn)這保護了小鼠使其完全免受破傷風類毒素致死量的影響。另外，本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)上述效果并不限于創(chuàng)傷弧菌的鞭毛蛋白，而且在鼠傷寒沙門氏菌的鞭毛蛋白和單核細胞增生利斯特氏菌的鞭毛蛋白中發(fā)現(xiàn)了相同的保護性免疫效果，所述鼠傷寒沙門氏菌為革蘭氏陰性菌且在單個細菌中具有許多鞭毛，所述單核細胞增生利斯特氏菌為革蘭氏陽性菌；并因此完成本發(fā)明。
因此，本發(fā)明的目的是提供含有鞭毛蛋白作為活性成分的粘膜疫苗佐劑，所述鞭毛蛋白為細菌鞭毛的成分，該佐劑對于開發(fā)多種有效疫苗如用于傳染病、抗癌和避孕等的疫苗是必需的。


圖1顯示了創(chuàng)傷弧菌鞭毛蛋白基因的兩個操縱子結(jié)構(gòu)之一的基因座1；圖2顯示了創(chuàng)傷弧菌鞭毛蛋白基因的兩個操縱子結(jié)構(gòu)之一的基因座2；圖3顯示了用與破傷風類毒素混合的1微克、5微克和15微克FlaB經(jīng)鼠鼻途徑免疫后，完全保護宿主免受破傷風類毒素致死量影響的結(jié)果；圖4顯示了用與破傷風類毒素混合的1微克、5微克和15微克FlaB經(jīng)鼠鼻途徑免疫后，通過酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)方法，使用取樣的鼠血清和各種粘液樣品來測量抗原特異性免疫應答的結(jié)果；
圖5顯示了用與破傷風類毒素混合的利斯特氏菌FlaA、創(chuàng)傷弧菌FlaB、沙門氏菌FliC經(jīng)鼠鼻途徑免疫后，通過ELISA方法，使用鼠血清來測量抗原特異性免疫應答的結(jié)果；圖6顯示了將重組FlaB給予上皮細胞后，白細胞介素-8(IL-8)以劑量依賴性方式從上皮細胞分泌；圖7顯示了將重組FlaB給予表達人體TLR-5和IL-8轉(zhuǎn)錄報告基因(transcriptional reporter)的細胞，或給予表達人體TLR-5和核因子κB的細胞時，IL-8和核因子κB的轉(zhuǎn)錄激活；圖8顯示了將谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶和6個鞭毛蛋白(創(chuàng)傷弧菌鞭毛的結(jié)構(gòu)成分)的融合蛋白給予表達人TLR-5和IL-8轉(zhuǎn)錄報告基因的細胞時，IL-8的轉(zhuǎn)錄激活；圖9顯示了將重組創(chuàng)傷弧菌FlaB與重組沙門氏菌FliC給予人樹突細胞時，樹突細胞成熟的誘導。
具體實施例方式
本發(fā)明的發(fā)明人分離了鞭毛蛋白，并給小鼠皮下注射(自動免疫接種)來證實防御性免疫力，并觀察皮下注射有鞭毛蛋白的小鼠皮膚組織中形成肉芽腫損害(granulomatous lesion)。結(jié)果，我們證實鞭毛蛋白起到了疫苗佐劑的作用。
鞭毛，決定細菌活動性的重要因素，一般由鉤形鞘(hook)、基體和鞭毛絲(filament)構(gòu)成。已知鞭毛具有多種功能，如細菌的泳動活動性或爬動活動性，決定細菌的趨向性，形成生物膜和決定細菌的粘附性(McCarter，L.L.，Microbiol Mol Biol Rev.65445-62，2001；Kim，Y.K.，McCarter，L.L.，JBacteriol.1823693-704，2000；McCarter，L. L.，J Bacteriol.1771595-609，1995；Boles，B.R.，McCarter，L.L.J Bacteriol.1821035-45，2000；Prouty，M.G.，Correa，N.E.，Klose，K.E.Mol Microbiol.2001 Mar；39(6)1595-609，2001)。創(chuàng)傷弧菌具有極性鞭毛(McCarter，L.L.，Microbiol Mol Biol Rev.65445-62，2001)。鞭毛的結(jié)構(gòu)成分稱為鞭毛蛋白，且該鞭毛蛋白形成規(guī)則排列的鞭毛絲。根據(jù)最近的研究結(jié)果，已知哺乳動物鐘樣受體-5(Toll-likereceptor-5，TLR-5)識別革蘭氏陰性和革蘭氏陽性細菌的鞭毛蛋白，并隨后激活宿主細胞的NF-kB途徑(Hayashi，F(xiàn).，Smith，K.D.，Ozinsky，A.，Hwan，T.R.，Yi，E.C.，Goodlett，D.R.，Eng，J.K.，Akira，S.，Underhill，D.M.，Aderem，A.，Nature 4101099-1103，2001)。TLR，識別與病原體相關(guān)的分子模型的受體，作為抵抗各種傳染病原體的第一防線天然免疫系統(tǒng)的主要成分，而且是與有效適應性免疫應答的刺激相關(guān)的細胞受體(Akira，S.，Hemmi，H.，Immunol.Lett.8585-95，2003)。因此，TLR激動劑可以是開發(fā)各種疫苗佐劑的靶標。
根據(jù)本發(fā)明的發(fā)明人的研究，構(gòu)成創(chuàng)傷弧菌鞭毛的基因包括DNA序列編號1表達的或氨基酸序列編號2的flaA，DNA序列編號3表達的或氨基酸序列編號4的flaB，DNA序列編號5表達的或氨基酸序列編號6的flaF，DNA序列編號7表達的或氨基酸序列編號8的flaC，DNA序列編號9表達的或氨基酸序列編號10的flaD，DNA序列編號11表達的或氨基酸序列編號12的flaE；每個基因的組成與副溶血弧菌(Vibrio parahemolyticus)的基因的組成相似，且它們的同源性也很高。
證明根據(jù)本發(fā)明的含有鞭毛蛋白(細菌鞭毛的結(jié)構(gòu)成分)的疫苗佐劑效果的方法如下1)制備和分離重組鞭毛蛋白；2)用混合的重組鞭毛蛋白和破傷風類毒素鼻內(nèi)免疫后，測量抗原特異性免疫應答的水平；3)用混合的重組鞭毛蛋白和破傷風類毒素鼻內(nèi)免疫小鼠后，測量宿主對破傷風毒素的防御能力；
4)證實重組鞭毛蛋白提高了上皮細胞IL-8的產(chǎn)生；5)證實重組鞭毛蛋白和TLR-5結(jié)合后誘導了胞內(nèi)信號傳導；6)觀察重組鞭毛蛋白誘導人樹突狀細胞(dendritic cell，DC)成熟。
因此，本發(fā)明涉及含有鞭毛蛋白(細菌鞭毛的結(jié)構(gòu)成分)作為活性成分的疫苗佐劑。
另外，本發(fā)明涉及制備具有受鞭毛蛋白誘導的佐劑活性的重組免疫原的方法，該方法包括用編碼各種免疫原抗原決定部位的基因來替代結(jié)合TLR-5的細菌鞭毛蛋白的結(jié)構(gòu)基因的N-端和C-端之間存在的部分基因。
更具體地，可以通過用編碼蛋白抗原決定部位的基因替代SEQ ID NO1至SEQ ID NO12中所示的創(chuàng)傷弧菌的結(jié)構(gòu)成分中FlaA的氨基酸序列1-191、FlaB的氨基酸序列1-191、FlaF的氨基酸序列1-191、FlaC的氨基酸序列1-191、FlaD的氨基酸序列1-191和FlaE的氨基酸序列1-189的N-端區(qū)域與FlaA的氨基酸序列277-376、FlaB的氨基酸序列278-377、FlaF的氨基酸序列278-377、FlaC的氨基酸序列285-385、FlaD的氨基酸序列278-377和FlaE氨基酸序列276-375的C-端區(qū)域之間的堿基序列來制備具有通過鞭毛蛋白誘導的佐劑活性的重組免疫原。
本發(fā)明的蛋白抗原決定部位是破傷風類毒素、流感病毒的免疫原抗原決定部位(immunogenic epitope)、肺炎球菌表面蛋白A(pneumococcal surfaceproteinA，PspA)的特異性抗原和肺炎球菌的雄配子(sperm)等。
可以將本發(fā)明的疫苗佐劑配制成口服形式，如水溶劑或油溶劑的溶液、懸浮液、或者乳劑形式，或者使用前為無菌形態(tài)的干粉型，而使用時溶解于無熱原的水中，或者可以配制成非口服給藥(例如，皮下注射、靜脈注射或肌肉注射)。
口服制劑中，可以通過常規(guī)方法使用載體或成形劑(forming agent)制成各種劑型，例如，片劑、錠劑、水乳劑或油乳劑、可以噴霧的粉劑或顆粒、乳劑、軟膠囊或硬膠囊、糖漿或酏劑，可以根據(jù)單位劑量或劑型選擇。
可以通過懸浮于無毒可用的稀釋劑或溶劑如1，2-丁二醇中的無菌注射溶液或乳劑的形式注射非口服制劑?？梢允褂玫南♂寗┗蛉軇┑膶嵗秊樗⒘指袷弦?Ringer solution)和等滲生理鹽水，也可以使用常規(guī)的溶劑如乙醇、聚乙二醇(polyethileneglycol)和聚丙二醇。無菌揮發(fā)油可以用作溶劑或乳化性溶劑。栓劑形式中，將藥物和無刺激性賦形劑混合后，通過直腸內(nèi)途徑給予藥物，無刺激性賦形劑例如是常溫下為固體而在直腸溫度下為液體的可可脂或聚乙二醇。
本發(fā)明的疫苗佐劑的實例是對抗破傷風等的抗毒素疫苗，對抗霍亂，傷寒等的減毒活疫苗或滅活疫苗；對抗流感，非典型肺炎(Severe AcuteRespiratory Syndrome，SARS)等的抗病毒疫苗；對抗子宮宮頸癌等的抗癌疫苗；抗精子的避孕疫苗；以及用于重組疫苗的佐劑，然而，不受限于這些實例。
此外，本發(fā)明并不受限于創(chuàng)傷弧菌的鞭毛蛋白，適用于具有與創(chuàng)傷弧菌相似的由鞭毛蛋白基因編碼的鞭毛蛋白的其他有鞭毛細菌。
以下更詳細地充分解釋了本發(fā)明，但本發(fā)明不受限于這些實施例。
表1中描述了本發(fā)明中所用菌株和質(zhì)粒的特征。在相應的實施例和實驗實施例中描述了每個菌株或質(zhì)粒的詳細特征和制造方法表1

<每種菌株的培養(yǎng)與保存>
以下實施例和實驗中，LB(Luria Bertani)培養(yǎng)基(Difco Co.)用于大腸桿菌、沙門氏菌和利斯特氏菌的菌株，心臟浸出液(heart infusion，HI)培養(yǎng)基(Difco Co.)用于培養(yǎng)創(chuàng)傷弧菌。這些菌株培養(yǎng)后，加入甘油，成為50％的溶液并且在深凍冰箱中-80℃保存。
實施例1 轉(zhuǎn)座子文庫的構(gòu)建將創(chuàng)傷弧菌MO6-24/O型菌株(從美國馬里蘭大學醫(yī)學院醫(yī)院流行病學部的J.Glenn Morris處獲得)和包括E.coli SM10λpir的mini-Tn5 lacZ1菌株(從德國Braunschweig，GBF National Research Center for Biotechnology，Kenneth N.Timmis處獲得)在37℃，210轉(zhuǎn)/分鐘的搖床中培養(yǎng)，兩種菌分別在10毫升的2.5HI(2.5％NaCl心臟浸出液)肉湯培養(yǎng)基和20毫升的LB(含有100微克/毫升的氨芐青霉素和100微克/毫升卡那霉素)肉湯培養(yǎng)基中接種單個菌落。
第二天將上述接種培養(yǎng)物離心，并用無抗生素的LB肉湯培養(yǎng)基清洗和離心兩次，然后懸浮在100微升的新LB肉湯培養(yǎng)基中。將大腸桿菌和創(chuàng)傷弧菌的單一細菌懸浮液混合在一起并滴在LB瓊脂平板上。37℃培養(yǎng)過夜后，將800微升新的2.5HI肉湯培養(yǎng)基加入到LB瓊脂平板上生長的菌落中，使用滅菌的玻璃棒將生長的菌落小心刮下。將該細菌懸浮液轉(zhuǎn)移至1.5毫升的塑料試管中并懸浮直至變成均質(zhì)狀態(tài)。將該懸浮液稀釋至1/10和1/100，然后停止稀釋，將稀釋液滴至含有200微克/毫升卡那霉素的硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖(thiosulfate citrate bile sucrose，TCBS)瓊脂平板上，涂覆直到充分滲透，在37℃下培養(yǎng)過夜。
接下來一天只取在TCBS瓊脂平板上生長的弧菌菌落，并用牙簽將其接種于含有300微克/毫升卡那霉素的瓊脂平板上，并在37℃下培養(yǎng)過夜。第二天將生長的弧菌菌落接種于含有200微克/毫升卡那霉素的100微升2.5HI的96孔培養(yǎng)板上，并在37℃下培養(yǎng)過夜，沒有振蕩。接下來一天，將80微升50％的甘油加入含有生長細菌的每個孔中，儲存于-80℃的深度冷凍冰箱中。當用于實驗時，將這些接種于2.5HI肉湯培養(yǎng)基并按需要培養(yǎng)。
實施例2 失去運動性的轉(zhuǎn)座子突變菌落的篩選將實施例1中制得的創(chuàng)傷弧菌MO6-24/O轉(zhuǎn)座子文庫的每個克隆(clone)在37℃下培養(yǎng)過夜，然后使用滅菌的牙簽接種于含有0.3％瓊脂的半固態(tài)HI(心臟浸出液)瓊脂平板，并在37℃下培養(yǎng)6小時。然后通過測量細菌生長后的移動范圍來測定細菌的運動性程度。
通過篩選步驟選擇幾乎完全失去運動性的3個轉(zhuǎn)座子突變克隆，并進行鑒定插入轉(zhuǎn)座子的突變基因的實驗。
實施例3 鞭毛蛋白操縱子基因的鑒定通過篩選粘?；蛭膸靵磉M行轉(zhuǎn)座子插入?yún)^(qū)域附近的基因克隆，使用DNA片段作為隨機聚合酶鏈反應(Polymerase Chain Reaction，PCR)方法擴增的引物。使用兩步PCR擴增方法來擴增轉(zhuǎn)座子插入位點附近的DNA片段。第一步PCR中，使用序列編號13的隨機引物1(5-GGCCACGCGTCGACTAGTCANNNNNNNNNNACGCCC-3)，和序列編號14的mini-Tn5 lacZ1特異性引物1(5-TTCTTCACGAGGCAGACCTCAGCGC-3)。第一步PCR設(shè)置如下94℃變性30秒，30℃退火30秒，然后在72℃延伸1分30秒，5個循環(huán)；然后通過94℃變性30秒，45℃退火30秒，72℃延伸2分鐘，30個循環(huán)，再進行30個循環(huán)的PCR反應。使用第一步PCR的產(chǎn)物作為模板進行第二步PCR反應。第二步PCR中，使用序列編號15的隨機引物2(5-GGCCAAGAGTCGACTAGTCA-3)和序列編號16的mini-Tn5 lacZ1特異性引物2(5-CCGCACTTGTGTATAAGAGTCAG-3)。反應條件為94℃變性30秒，72℃退火30秒，72℃延伸1分30秒，30個循環(huán)。將這些PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠中電泳，從凝膠中分離出擴增的DNA片段，并確定它們的堿基序列。結(jié)果，上述的PCR反應擴增了3種特異性的DNA片段。
測定擴增的DNA片段、并用美國國家生物信息中心的GeneBank數(shù)據(jù)庫中記錄的基因進行的BLAST分析的結(jié)果，表明了與副溶血弧菌的bcr，cheR和flgG基因的同一性。根據(jù)本發(fā)明的發(fā)明人對創(chuàng)傷弧菌的基因組序列分析的完全譯碼的結(jié)果，所述的基因位于極性鞭毛的鞭毛蛋白操縱子中，如圖1和2所示。
實施例4 重組鞭毛蛋白的制備和純化將分別含有創(chuàng)傷弧菌flaB基因、沙門氏菌fliC基因(序列編號18)和利斯特氏菌flaA基因(序列編號17)的開放讀碼框(Open Reading Frame，ORF)的DNA片段連接至為蛋白內(nèi)含子(intein)融合表達載體的pTYB12載體中(New England Biolabs Inc.)，來產(chǎn)生各自的質(zhì)粒pCMM250、pCMM251、pCMM252。通過電穿孔將每種質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coli ER2566中，并通過加入0.5mM 5-溴-吲哚-3-氯-異丙基-β-D-半乳糖吡喃糖苷(5-bormo-indol-3-chloro-isopropyl-β-D-galactopyranoside，ITPG)來誘導表達。根據(jù)制造商(New England Biolabs Inc.)的說明，使用幾丁質(zhì)珠層析柱(Chitin bead column)和1，4-二硫蘇糖醇(1，4-dithiothreiol)從蛋白內(nèi)含子融合蛋白中純化Flab、FliC和FlaA蛋白質(zhì)。使用親和性PakTM DetoxigelTM內(nèi)毒素去除凝膠(Pirece Inc.Rockgord，IL)除去包含在分離的FlaB、FliC和FlaA蛋白質(zhì)中的內(nèi)毒素。
使用上述的方法將創(chuàng)傷弧菌flaA、flaB、flaF、flaC、flaD和flaE基因的ORF連接至pGEX4T-1載體中(pCMM244-flaB、pCMM245-flaA、pCMM247-flaD、pCMM248-flaE、pCMM249-flaF)。根據(jù)制造商(AmershamPharmacia)的說明，純化谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶融合蛋白質(zhì)。
實驗實施例1 重組鞭毛蛋白的粘膜免疫佐劑活性的實驗每隔7天，用20微升的PBS(磷酸鹽緩沖鹽水)、單獨3微克的破傷風類毒素、或者3微克的破傷風類毒素分別與1微克、5微克和15微克的創(chuàng)傷弧菌FlaB的組合，向7周大的雌性Balb/c小鼠鼻內(nèi)免疫3次。最后一次免疫后7天，從免疫的小鼠中收集唾液、陰道洗出物和血清樣品來測定破傷風類毒素(TT)-特異性全身免疫應答和粘膜免疫應答。通過酶聯(lián)免疫吸附測試(Enzyme linked immuno sorbant assay，ELISA)方法測量這些應答，將之前接種3次疫苗的小鼠，在全身給藥最少200倍破傷風類毒素致死量后，觀察7天。結(jié)果顯示于圖3和圖4中。
如圖3所示的，僅用PBS免疫的對照組小鼠在24小時內(nèi)全部死亡(100％)，只用破傷風類毒素(TT)鼻內(nèi)免疫的組中僅有17％存活。然而，用破傷風類毒素和1微克、5微克或15微克的創(chuàng)傷弧菌FlaB的組合(TT+Vv-FlaB)免疫的小鼠有100％的存活。TT組存活的小鼠顯示了強直性麻痹，但TT+Vv-FlaB的組存活的小鼠顯示出與正常小鼠同樣的特征。
如圖4所示，就抗原特異性全身免疫應答和粘膜免疫應答的程度而言，TT+Vv-FlaB組高于僅用PBS或TT的組。
為了證實這些疫苗的佐劑活性中哪些對于其它非-創(chuàng)傷弧菌鞭毛的鞭毛蛋白是普通的，用純化的FlaA重組蛋白和FliC重組蛋白進行了相同的實驗，所述FlaA重組蛋白是單核細胞增生利斯特氏菌的鞭毛蛋白結(jié)構(gòu)成分，單核細胞增生利斯特氏菌是革蘭氏(+)細菌，所述FliC重組蛋白是鼠傷寒沙門氏菌的鞭毛蛋白結(jié)構(gòu)成分，鼠傷寒沙門氏菌是革蘭氏(-)細菌。結(jié)果顯示于表2和圖5中。
表2

表2的數(shù)據(jù)是用利斯特氏菌的FlaA、創(chuàng)傷弧菌的FlaB和沙門氏菌的FliC分別與破傷風類毒素組合進行鼻內(nèi)免疫后，給藥破傷風類毒素的結(jié)果。表明這些鞭毛蛋白結(jié)構(gòu)成分蛋白質(zhì)完全保護了宿主免受破傷風類毒素致死量的影響。
表2和圖5的結(jié)果中，觀察到上述3種類型菌株的鞭毛蛋白與疫苗佐劑具有相同的效用。
圖3、圖4、圖5和表2的結(jié)果表明，重組鞭毛蛋白起著有效疫苗佐劑的作用。
實驗實施例2 鞭毛蛋白對上皮細胞的應答將Caco-2細胞以2.0×105/孔接種于24孔平板中，并在補充10％胎牛血清(FCS)的達爾伯克氏改良伊格爾氏培養(yǎng)基(DMEM)中維持過夜。第二天用無胎牛血清的DMEM清洗兩次，并用沒有補充FCS的不同濃度的重組Vv-FlaB處理3小時，使用ELISA試劑盒(R&D系統(tǒng)Co.)測量釋放至上清液的IL-8水平。通過實時逆轉(zhuǎn)錄-PCR分析來分析由Vv-FlaB處理的Caco-2細胞中的IL-8表達。從由Vv-FlaB處理的細胞中分離總RNA。結(jié)果顯示于圖6中。圖6中，顯示了重組FlaB結(jié)合Caco-2細胞表面的受體和傳導胞內(nèi)信號，并以劑量依賴性的方式促進IL-8，所述IL-8誘導嗜中性粒細胞分泌重要的炎癥介質(zhì)。
實驗實施例3 調(diào)控TLR-5介導的鞭毛蛋白的IL-8表達用合適量的表達質(zhì)粒、報告基因pIL-8-Luc或pNF-κB-Luc(從Hanyang大學醫(yī)學院的Kim，Jeong Mok教授處獲得)和編碼TLR-5基因的p3Xflag-hTLR5(從美國Wake Forest大學醫(yī)學院微生物和免疫系的Steven B.Mizel處獲得)來轉(zhuǎn)染以2.0×105/孔接種于24孔平板中的Caco-2細胞。使用對照表達質(zhì)粒pCMV-β-ga(9BD Biosciences Clontech，Palo Alto，CA)將熒光素酶的活性水平規(guī)范成lacZsd表達。通過加入適量空白載體來保持表達載體總數(shù)的恒定。轉(zhuǎn)染后24小時，用新鮮培養(yǎng)基來替代培養(yǎng)物，每種所述培養(yǎng)基含有創(chuàng)傷弧菌的重組FlaB、沙門氏菌的重組FliC和利斯特氏菌的重組FlaA，以及通過MPACT-CNTM系統(tǒng)純化的創(chuàng)傷弧菌FlaA、FlaB、FlaF、FlaC、FlaD和FlaE之一，并且和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶融合蛋白共同給藥。給藥后幾小時，通過照度計(luminometer)(MicroLumatPlus LB 96V，Berthold，Wilbad，德國)測定熒光素酶的活性來測量IL-8的表達，結(jié)果顯示于圖7和圖8中。
重組FlaB以劑量依賴性的方式激活了IL-8和pNF-κB的表達。還表明了創(chuàng)傷弧菌的其他鞭毛結(jié)構(gòu)成分FlaA、FlaF、FlaC、FlaD和FlaE具有一定程度的不同。
實驗實施例4 重組FlaB對人外周血樹突細胞的應答使用Ficoll Paque PLUS(Amersham Inc.)通過離心從人外周血分離外周血單核細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)。將識別PBMC中骨髓細胞上選擇性表達的CD14的磁珠在6-12℃反應20分鐘。通過磁性細胞分選器來分離CD14陽性細胞。將CD14陽性細胞加入含有10％FCS的RPMI培養(yǎng)基中，并共同給予50納克/毫升粒-巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)及50納克/毫升白細胞介素-4(IL-4)，培養(yǎng)6天以分化為不成熟的樹突細胞。分化后，用實施例4中制得的重組FlaB和沙門氏菌鞭毛蛋白FliC以6nM濃度的劑量處理，并培養(yǎng)24小時。觀察FlaB和FliC對人樹突細胞分化的影響。給予FliC的原因是用來確定本發(fā)明是否可以廣泛應用。
對識別樹突細胞表面上選擇性表達的CD80、CD83和CD86并結(jié)合異硫氰酸熒光素(fluorescein isothicyanate，F(xiàn)ITC)或藻紅蛋白(phycoerythrin，PE)的單克隆抗體進行處理。使用流式細胞計來測量顯示陽性信號的細胞組的表達水平。圖9顯示了結(jié)果。
用創(chuàng)傷弧菌的重組FlaB來處理人樹突細胞時，意味著樹突細胞成熟的CD80、CD83和CD86陽性的百分比水平分別增長了67.3％、23.57％和43.29％。這些水平的增長速率比對照組中的15.29％、0.82％和1.5％高得多。然而，在骨髓細胞上選擇地表達的CD14成熟水平降低更多。沙門氏菌的鞭毛蛋白FliC顯示出相似的表現(xiàn)。
工業(yè)實用性如以上結(jié)果所示，創(chuàng)傷弧菌鞭毛蛋白的結(jié)構(gòu)成分FlaA、FlaB、FlaF、FlaC、FlaD和FlaE，以及沙門氏菌鞭毛蛋白的結(jié)構(gòu)成分FliC和利斯特氏菌鞭毛蛋白的結(jié)構(gòu)成分FlaA刺激上皮細胞的IL-8釋放和樹突細胞的成熟。還提高了宿主對用作疫苗的免疫刺激劑的抗原特異性免疫應答。
與沒有給予鞭毛蛋白作為佐劑的對照組相比，用破傷風類毒素和提及的鞭毛蛋白通過鼻內(nèi)途徑將小鼠免疫時，顯示出對抗抗原的IgA水平的顯著提高。此外，宿主完全受到保護免受破傷風類毒素的影響。尤其是在陰道洗出物中，IgA水平極大增加，因此可以用作對精子選擇性的避孕疫苗的佐劑。
本發(fā)明的重組細胞鞭毛蛋白還可以用作對抗其它傳染病和抗癌治療疫苗的有效佐劑。
序列表<110>全南大學校<120>含有細菌鞭毛蛋白作為活性成分的粘膜疫苗佐劑<130>P6525YOL<150>KR10-2004-0001974<151>2004-01-12<160>18<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1131<212>DNA<213>創(chuàng)傷弧菌(Vibrio vulnificus)<400>1atggctatca atgtaaacac taacgtgtca gcaatgaccg cacagcgtta cctaaaccag 60gccgctgaag gtcaacaaaa atcaatggag cgtttgtctt cgggctataa aatcaatagc120gcgaaagatg atgctgcagg tctacaaatt tctaaccgtt tgaactcgca aagccgtggt180ctcgacatgg cggttaaaaa tgccaacgat ggtatctcta ttgcacagac tgctgaaggt240gcaatgacag agaccaccaa catcctacaa cgtatgcgtg accttgcctt gcaatcgtct300aacggttcga actctcgttc tgaacgcgtg gcgattcaag aagaagtgtc agcgttgaac360caagaactta accgtatcgc agagacaacc tcttttggtg gtaacaaact ccttaacggt420acgtacggtt ctcaatcttt ccaaatcggt gctgactctg gtgaagctgt gatgctttct480atgggtaacc ttcgttcaga tacagacgcg atgggcggct tgagctacaa atctgaagaa540ggcgtaggcg cagattggcg tgtaagcgac aacactgact tcacgatgtc ttatgtgaat600aagcaaggtg aagaaaaaga gatcacagtc aacgccaaag cgggtgacga tcttgaagaa660
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Thr Thr Ser Phe Gly Gly Asn Lys Leu Leu Asn Gly Thr Tyr Gly Thr130 135 140Lys Ala Met Gln Ile Gly Ala Asp Asn Gly Glu Ala Val Met Leu Ser145 150 155 160Leu Lys Asp Met Arg Ser Asp Asn Val Met Met Gly Gly Val Ser Tyr165 170 175Gln Ala Glu Glu Gly Lys Asp Lys Asn Trp Asn Val Ala Ala Gly Asp180 185 190Asn Asp Leu Thr Ile Ala Leu Thr Asp Ser Phe Gly Asn Glu Gln Glu195 200 205Ile Glu Ile Asn Ala Lys Ala Gly Asp Asp Ile Glu Glu Leu Ala Thr210 215 220Tyr Ile Asn Gly Gln Thr Asp Leu Val Lys Ala Ser Val Gly Glu Gly225 230 235 240Gly Lys Leu Gln Ile Phe Ala Gly Asn Asn Lys Val Gln Gly Glu Ile245 250 255Ala Phe Ser Gly Ser Leu Ala Gly Glu Leu Gly Leu Gly Glu Gly Lys260 265 270Asn Val Thr Val Asp Thr Ile Asp Val Thr Thr Val Gln Gly Ala Gln275 280 285Glu Ser Val Ala Ile Val Asp Ala Ala Leu Lys Tyr Val Asp Ser His290 295 300Arg Ala Glu Leu Gly Ala Phe Gln Asn Arg Phe Asn His Ala Ile Ser305 310 315 320Asn Leu Asp Asn Ile Asn Glu Asn Val Asn Ala Ser Lys Ser Arg Ile325 330 335Lys Asp Thr Asp Phe Ala Lys Glu Thr Thr Gln Leu Thr Lys Thr Gln340 345 350
Ile Leu Ser Gln Ala Ser Ser Ser Ile Leu Ala Gln Ala Lys Gln Ala355 360 365Pro Asn Ser Ala Leu Ser Leu Leu Gly370 375<210>11<211>1127<212>DNA<213>創(chuàng)傷弧菌(Vibrio vulnificus)<400>11atggtttcac tcaataccaa cgtgtctgcg atggtcgctc agaggcatct gagcacagcg 60gcaagtcagg tagctgaaac ccaaaaaaat ctaagttccg gattccgaat taatagtgcc120agcgatgatg ccgctggaat gcagatagcg aatacgcttc acgtccaaac ccgtggtttg180gatgtggcat taactaacgc tcatagtgct tatgctgttg cagaaacagc ggaaggggcg240ttggaagagg gcagtgaaat actgcagaga ttgcgatctc tttctcttca agccgcaaac300ggatcgaatt ctgatgagga tcggcaaagt ttgcagttgg aagtggtggt attgaaagat360gaagtggaaa gaatagccag gacaaccaca tttgcgggta aaaatctgtt tgatggaagt420tatggttcaa aaagttttca tcttggggca aattctaatt ccatttcttt gcaactcaaa480aacatgcgga ctcacgttcc tgagatgggc gggtatcatt accttgcctc ggagccagcg540gatgaggatt ggcaagttga caaggaatca aggcaactta gctttacttt tcgagatagc600gaaggggatg atcaatccat taagatctcg cttaagcctg gagacagtct cgaagaagtc660gctacgtata tcaattcaca gcaaaatgtt gtggagtcct cggtgacgga tgatcggcga720ttgcagtttt atgtcgctaa tcgtcacgct cctgatggtt taaatatctc aggaagcttg780gagggagagc tagactttga accgcaagga caagtgacgc tcgatgaact cgatatcagt840agtgtgggtg gtgctcaatt ggcgattgct gttgttgata ctgcaattca atatctggat900
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Ser Phe His Leu Gly Ala Asn Ser Asn Ser Ile Ser Leu Gln Leu Lys145 150 155 160Asn Met Arg Thr His Val Pro Glu Met Gly Gly Tyr His Tyr Leu Ala165 170 175Ser Glu Pro Ala Asp Glu Asp Trp Gln Val Asp Lys Glu Ser Arg Gln180 185 190Leu Ser Phe Thr Phe Arg Asp Ser Glu Gly Asp Asp Gln Ser Ile Lys195 200 205Ile Ser Leu Lys Pro Gly Asp Ser Leu Glu Glu Val Ala Thr Tyr Ile210 215 220Asn Ser Gln Gln Asn Val Val Glu Ser Ser Val Thr Asp Asp Arg Arg225 230 235 240Leu Gln Phe Tyr Val Ala Asn Arg His Ala Pro Asp Gly Leu Asn Ile245 250 255Ser Gly Ser Leu Glu Gly Glu Leu Asp Phe Glu Pro Gln Gly Gln Val260 265 270Thr Leu Asp Glu Leu Asp Ile Ser Ser Val Gly Gly Ala Gln Leu Ala275 280 285Ile Ala Val Val Asp Thr Ala Ile Gln Tyr Leu Asp Ser His Arg Ser290 295 300Glu Ile Gly Ser Phe Gln Asn Arg Val Glu Gly Thr Met Asp Asn Leu305 310 315 320Gln Ser Ile Asn Arg Asn Val Thr Glu Ser Lys Gly Arg Ile Trp Asp325 330 335Thr Asp Phe Ala Lys Ala Ser Thr Ala Leu Val Lys Ser Gln Val Leu340 345 350Gln Gln Ala Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gln Ala Lys Gln Ala Pro Gly355 360 365
Ser Ala Ile Gly Leu Leu Ser370 375<210>13<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>隨機引物1(arbitrary primer 1)<400>13ggccacgcgt cgactagtca nnnnnnnnnn acgccc 36<210>14<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>特異性引物1(specific primer 1)<400>14ttcttcacga ggcagacctc agcgc 25<210>15<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>隨機引物2(arbitrary primer 2)<400>15ggccaagagt cgactagtca20
<210>16<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>特異性引物2(specific primer 2)<400>16ccgcacttgt gtataagagt cag 23<210>17<211>864<212>DNA<213>單核細胞增生利斯特氏菌(Listeria monocytogenes)flaA<400>17atgaaagtaa atactaatat cattagcttg aaaacacaag aatatcttcg taaaaataac 60gaaggcatga ctcaagcgca agaacgtttg gcatctggta aacgtattaa cagttctctt120gatgacgctg ctggtcttgc agttgttact cgtatgaacg ttaaatctac aggcttagat180gcagcaagca aaaactcatc catgggtatt gacttgttac aaacagcgga ttcagctctt240agctccatga gttcaatctt gcaacgtatg cgtcaattag cagtacaatc ttctaacggt300tcattcagtg acgaagatcg taaacaatac actgctgaat tcggtagctt gatcaaagaa360cttgatcacg ttgctgacac tactaactac aacaacatca aattactaga tcaaactgct420acaggtgctg ctactcaagt aagcatccaa gcgtctgata aagctaatga cttaatcaat480atcgatcttt tcaatgcgaa aggtctttct gctggaacaa tcactttagg tagtggttct540acagttgctg gttatagtgc attatctgtt gctgatgctg attcttctca agaagcaacg600gaagctattg atgaattaat caataacatc tctaacggtc gtgcacttct aggtgctggt660atgagtcgcc ttagctacaa tgtatctaac gtgaacaacc aatccatcgc aactaaagca720tctgcttcct ctattgaaga tgcagatatg gctgctgaaa tgtccgaaat gactaaatac780
aaaattctta cacaaacatc tatcagcatg ctttctcaag caaaccaaac accgcaaatg840ttaactcaat taattaacag ctaa 864<210>18<211>1488<212>DNA<213>鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)fliC<400>18atggcacaag tcattaatac aaacagcctg tcgctgttga cccagaataa cctgaacaaa 60tcccagtccg ctctgggcac cgctatcgag cgtctgtctt ccggtctgcg tatcaacagc120gcgaaagacg atgcggcagg tcaggcgatt gctaaccgtt ttaccgcgaa catcaaaggt180ctgactcagg cttcccgtaa cgctaacgac ggtatctcca ttgcgcagac cactgaaggc240gcgctgaacg aaatcaacaa caacctgcag cgtgtgcgtg aactggcggt tcagtctgct300aacagcacca actcccagtc tgacctcgac tccatccagg ctgaaatcac ccagcgcctg360aacgaaatcg accgtgtatc cggccagact cagttcaacg gcgtgaaagt cctggcgcag420gacaacaccc tgaccatcca ggttggtgcc aacgacggtg aaactatcga tatcgatctg480aagcagatca actctcagac cctgggtctg gatacgctga atgtgcaaca aaaatataag540gtcagcgata cggctgcaac tgttacagga tatgccgata ctacgattgc tttagacaat600agtactttta aagcctcggc tactggtctt ggtggtactg accagaaaat tgatggcgat660ttaaaatttg atgatacgac tggaaaatat tacgccaaag ttaccgttac ggggggaact720ggtaaagatg gctattatga agtttccgtt gataagacga acggtgaggt gactcttgct780ggcggtgcga cttccccgct tacaggtgga ctacctgcga cagcaactga ggatgtgaaa840aatgtacaag ttgcaaatgc tgatttgaca gaggctaaag ccgcattgac agcagcaggt900
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權(quán)利要求
1.一種粘膜疫苗佐劑，該佐劑含有作為活性成分的細菌鞭毛蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的粘膜疫苗佐劑，其中，所述鞭毛蛋白來源于創(chuàng)傷弧菌、鼠傷寒沙門氏菌、單核細胞增生利斯特氏菌。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的粘膜疫苗佐劑，其中，所述鞭毛蛋白是選自由以下序列編碼的創(chuàng)傷弧菌鞭毛蛋白中的一種或多種DNA SEQ ID NO1或氨基酸SEQ ID NO2所示的flaA，DNA SEQ ID NO3或氨基酸SEQ ID NO4所示的flaB，DNA SEQ ID NO5或氨基酸SEQ ID NO6所示的flaF，DNA SEQ ID NO7或氨基酸SEQ ID NO8所示的flaC，DNA SEQ ID NO9或氨基酸SEQ ID NO10所示的flaD，和DNA SEQ ID NO11或氨基酸SEQ ID NO12所示的flaE。
4.一種通過鞭毛蛋白制造具有佐劑活性的免疫原的方法，該方法包括用編碼蛋白抗原決定部位的基因來替代SEQ ID NO1至SEQ ID NO12中所示的創(chuàng)傷弧菌的結(jié)構(gòu)成分中FlaA的氨基酸序列1-191、FlaB的氨基酸序列1-191、FlaF的氨基酸序列1-191、FlaC的氨基酸序列1-191、FlaD的氨基酸序列1-191和FlaE的氨基酸序列1-189的N-端區(qū)域與FlaA的氨基酸序列277-376、FlaB的氨基酸序列278-377、FlaF的氨基酸序列278-377、FlaC的氨基酸序列285-385、FlaD的氨基酸序列278-377和FlaE的氨基酸序列276-375的C-端區(qū)域之間的基因。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中，所述蛋白抗原決定部位為破傷風類毒素、流感病毒的免疫原抗原決定部位、誘導子宮宮頸癌癥的人乳頭狀瘤病毒的免疫原抗原決定部位、肺炎球菌抗原肺炎球菌表面蛋白A或精子。
6.一種粘膜疫苗佐劑，該佐劑含有由權(quán)利要求4的方法制得的免疫原作為活性成分。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-3和6中任意一項所述的粘膜疫苗佐劑，其中，所述疫苗佐劑為下列疫苗的佐劑對抗破傷風類毒素等的抗毒素疫苗；對抗霍亂、傷寒等的減毒活疫苗或滅活疫苗；抵抗流感、非典型肺炎等的抗病毒疫苗；抵抗子宮宮頸癌等的抗癌疫苗；抗精子的避孕疫苗；或重組蛋白或多肽疫苗。
全文摘要
本發(fā)明涉及含有來自創(chuàng)傷弧菌(Vibriovulnificus)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)和單核細胞增生利斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)的鞭毛蛋白(鞭毛的結(jié)構(gòu)成分)作為活性成分的粘膜疫苗佐劑。
文檔編號A61K39/39GK1909924SQ200580002321
公開日2007年2月7日 申請日期2005年1月12日 優(yōu)先權(quán)日2004年1月12日
發(fā)明者李浚行, 李施恩, 金守永 申請人:全南大學校產(chǎn)學協(xié)力團