專利名稱：2,5－二羥基苯磺酸在制備可應(yīng)用于治療血管依賴型疾病諸如癌癥和銀屑病的藥物中的應(yīng)用的制作方法
發(fā)明范圍本發(fā)明涉及包含2，5-二羥基苯磺酸的藥物組合物，及其在制備藥物中的應(yīng)用，所述藥物用于治療以強(qiáng)烈的細(xì)胞增殖、血管化為特征的疾病(血管依賴型疾病)和更具體地還具有程序性細(xì)胞死亡減少的血管依賴型疾病，如其在例如癌癥或銀屑病中的情形。
背景技術(shù)：
惡性腫瘤的特征，除了不受控制的細(xì)胞增殖外，在于它們侵入正常的腫瘤周圍(peritumoral)組織的能力。腫瘤侵入是復(fù)雜的過程，其按照下述連續(xù)的階段發(fā)展a)腫瘤細(xì)胞附著到細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白上；b)細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白通過蛋白水解酶降解，這產(chǎn)生細(xì)胞外空間，腫瘤細(xì)胞利用所述空間以，c)通過動(dòng)力學(xué)和復(fù)雜的機(jī)制進(jìn)行遷移，所述機(jī)制需要合成新的細(xì)胞質(zhì)膜部分并且再組織細(xì)胞骨架(Giese A，Westphal M.Neurosurgery1996；39235-252)。從腫瘤塊侵入正常的腫瘤周圍組織的細(xì)胞使得它們的細(xì)胞死亡的遺傳程序失去能力，并且因此，遷移以侵入腫瘤周圍完好的組織的腫瘤細(xì)胞避免了程序性細(xì)胞死亡(Mariani I等，Clin Cancer Res72480-2489，2001)。當(dāng)聚集的腫瘤細(xì)胞達(dá)到2-3mm3體積時(shí)，腫瘤細(xì)胞合成大量的生血管因子以抵消該原發(fā)腫瘤的低含氧量狀況(Folkman J.N.Engl J Med2851182-1186，1971；Carmeliet P，Jain RK.Nature407249-257，2000；Yancopoulos GD等.Nature407242-248，2000)，其激活腫瘤周圍的血管，致使它們形成新的血管(血管發(fā)生)，所述新的血管侵入腫瘤以供給氧和養(yǎng)分并消除來自腫瘤分解代謝的產(chǎn)物。腫瘤侵入的過程中發(fā)生的相同的細(xì)胞過程(游動(dòng)性和程序性細(xì)胞死亡的缺乏)集中(centripetally)發(fā)生在腫瘤血管發(fā)生的過程中。因此，抑制腫瘤細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的侵入能力應(yīng)該通過抑制腫瘤擴(kuò)散、減少血管發(fā)生和促進(jìn)程序性細(xì)胞死亡而在腫瘤生長(zhǎng)中產(chǎn)生延遲。因此，有效的抗癌治療應(yīng)該抑制遷移、血管發(fā)生并增加程序性細(xì)胞死亡而不會(huì)在正常細(xì)胞中產(chǎn)生這些效果。
在腫瘤學(xué)臨床開發(fā)的不同階段有許多抗腫瘤和抗血管形成藥劑(Brem S.Cancer Control 6436-458，1999)，其中顯著數(shù)目的藥劑是身體用來抵消血管發(fā)生的正調(diào)節(jié)劑作用的肽(Hagerdom M，Bikfalvi A.Crit RevOnc Hemat 3489-110，2000)。然而，當(dāng)這些肽與具有顯著更低的分子量的化合物相比較時(shí)，它們的藥理學(xué)不便之處就變得明顯起來。在另一方面，已證明在它們的分子結(jié)構(gòu)中含有芳香環(huán)并作用為由生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)的促有絲分裂活性的抑制劑的不同的合成化合物，對(duì)休眠的或非腫瘤細(xì)胞具有細(xì)胞毒性(Lozano RM J Mol Biol 281899-9115，1998)。因此，還需要發(fā)現(xiàn)具有抗腫瘤、抗血管發(fā)生和前調(diào)亡(proapoptotic)活性并且對(duì)完整的、休眠的、非腫瘤細(xì)胞具有低毒性的化合物。目前存在對(duì)于為老藥物尋找新的治療啟示的極大興趣。在這種背景下，近來已經(jīng)證明不同的抗生素除了它們的抗微生物活性外，還具有抗增殖的作用，如在雷帕霉素的情形中(MoriceMC等.N Engl J Med 3461773-1780，2002)，或在新霉素的情形中(CuevasP.等.Neurol Res 224389-391，2002)；或有效用作抗焦慮藥的，諸如諾氟沙星(氟喹諾酮)(Johnstone TB等.Nat Med 10；31-32，2004)。
銀屑病是一種血管依賴型的慢性疾病，其影響2-3％的世界人口，并且其特征在于表皮超常增生、炎癥細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞的真皮-表皮浸潤(rùn)，和非常明顯的血管化的發(fā)展，以及由程序性細(xì)胞死亡引起的細(xì)胞死亡的減少(Kocak M等.Int J Dermatol 42789-793，2003)。目前，對(duì)銀屑病還沒有有療效的治療?？广y屑病的治療可以是局部的或全身性的，其取決于疾病的擴(kuò)展和嚴(yán)重性。主要應(yīng)用的抗銀屑病局部治療由不同類型的皮質(zhì)激素類組成，然而，這些化合物的長(zhǎng)期使用與皮膚萎縮、牽張痕(strech marks)和毛細(xì)管擴(kuò)張相關(guān)(Baker BS，F(xiàn)ry L. Cutis 1999；64315-318)。使用免疫抑制藥物的全身性治療與非常嚴(yán)重的副作用相關(guān)(Wolina V.等.ClinRheumatol 200120406-410)。例如，使用環(huán)胞菌素用于治療銀屑病可以產(chǎn)生腎毒性(間質(zhì)纖維樣變性和管狀萎縮)、高血壓、高鎂血癥、高鈣血癥和肝功能紊亂(Travis L，Weinberg JM.Drugs of Today 2002；38847-865)。另一種用于治療銀屑病的免疫抑制劑藥物，他克莫司，的持續(xù)應(yīng)用可以產(chǎn)生高血壓、腎毒性和免疫抑制(Jegasothy BV等.Arch Dermatol 1992；128781-785)。最近已描述他克莫司免疫抑制劑的局部應(yīng)用(topic application)加速鼠皮膚中的癌發(fā)生(Niwa Y，Terashima T，Sumi H.B J Dermatol 2003；149960-967)。因此，存在對(duì)于新的抗銀屑病化合物的需要，所述化合物證明是有效的，而不產(chǎn)生明顯的副作用諸如與最常用的抗銀屑病化合物相關(guān)的那些。
2，5-二羥基苯磺酸是2，5-二羥基苯甲酸的衍生物，其在藥理學(xué)上以提供穩(wěn)定性的不同的鹽的形式(主要是鈣、鉀和鎂)開處方。所述的2，5-二羥基苯磺酸從70年代起就已經(jīng)被用作口服親血管(vasculotropic)藥物。
在患有糖尿病性視網(wǎng)膜病的患者中，2，5-二羥基苯磺酸抑制血小板聚集，毛細(xì)管(capilar)滲透性和血液黏度的增加(Bayer J.等.Dtsch.ModWschr 1980；46160-1608；Banarroch I.S.等.Ophthalmic Res 1985；17；131-138；Michal M，Giessinger N.Thromb Res 1988；51593-605)。自從1974年，已知所述化合物在人中的新陳代謝和藥物代謝動(dòng)力學(xué)(Benakis A.等.Thérapie 1974；29211-219)。近來的實(shí)驗(yàn)已證明，2，5-二羥基苯磺酸增加大鼠內(nèi)皮細(xì)胞中的氧化氮合酶內(nèi)皮同工型[內(nèi)皮氧化氮合酶(eNOS)]的活性，而沒有產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用(Suscheck C.等.Bt J Pharmacol 1997；1221502-1508)。另外，2，5-二羥基苯磺酸加強(qiáng)人陰莖動(dòng)脈的體外舒張(AnguloJ等.BrJ Pharmacol 2003；139854-862)。有實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明2，5-二羥基苯磺酸(作為鈣或鎂鹽配制)具有體外抗氧化劑活性(Brunet J等.FundamClin Pharmacol 12205-212，1998)。
本發(fā)明基于這樣的發(fā)現(xiàn)，即2，5-二羥基苯磺酸和/或其鹽的與它們?cè)诜切菝呒?xì)胞中的抗增殖、抗遷移、抗血管發(fā)生和前調(diào)亡能力相關(guān)的新活性，組合的活性證明它們用作治療血管依賴型疾病諸如癌癥病例的有用的化合物的應(yīng)用，而不會(huì)引起對(duì)非腫瘤的完整或休眠細(xì)胞的毒性，所述血管依賴型疾病的特征在于過度增殖、細(xì)胞入侵及過量的血管發(fā)生、以及由于程序性細(xì)胞死亡引起的細(xì)胞死亡的缺陷。由于神經(jīng)膠質(zhì)瘤是具有顯著的生血管能力和顯著的程序性細(xì)胞死亡缺陷的非常具有侵入性的腫瘤，已經(jīng)將神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)中(Merzak A，Pilkington GJ.Cancer Metastasis Rev16155-177，1997)。
本發(fā)明還基于已證明的事實(shí)，即2，5-二羥基苯磺酸和/或其鹽以組合的形式具有抗增殖、抗血管發(fā)生、和前調(diào)亡作用，并且因此，其治療功效已經(jīng)在慢性銀屑病斑塊中進(jìn)行了評(píng)價(jià)，所述慢性銀屑病斑塊的特征在于表皮過度增生、急性真皮血管發(fā)生和程序性細(xì)胞死亡缺陷(Karasek MA，Cutis64319-322，1999)。
接著，本發(fā)明涉及尋找用于癌癥和其它血管依賴型疾病的新療法，并且其基于這樣的事實(shí)，即2，5-二羥基苯磺酸和/或其鹽已證明它們?cè)隗w外腫瘤細(xì)胞中抑制生長(zhǎng)和遷移并誘導(dǎo)程序性細(xì)胞死亡的能力，以及抑制由成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)誘導(dǎo)的體內(nèi)血管發(fā)生的能力。因此，由于這些能力的組合，所提及的化合物對(duì)于治療惡性腫瘤和血液腫瘤性轉(zhuǎn)化疾病以及治療其它嚴(yán)重的血管化相關(guān)的病理(pathology)(血管依賴型疾病)是有用的。
發(fā)明描述以鹽的形式配制的2，5-二羥基苯磺酸是一種商業(yè)產(chǎn)品(例如，鉀鹽可以獲得于Merck Farma y Química SA，Mollet del Vallés，Barcelona)，其具有下面的分子式 其中Met＝金屬(Metal)，n是該鹽中所用的金屬化合價(jià)的函數(shù)(function)。一般地，對(duì)于鹽的金屬陽離子模型，一價(jià)的(K)或二價(jià)的(CaóMg)，n01或2。
因?yàn)橐匀魏嘻}配制的2，5-二羥基苯磺酸在抑制細(xì)胞增殖、遷移和血管發(fā)生中具有相似的作用，2，5-二羥基苯磺酸的新的生物活性不依賴鍵合到苯環(huán)上的陽離子。本發(fā)明只描述配制成鉀和鈣鹽的2，5-二羥基苯磺酸的活性，但是不要忘記該化合物的任何藥用鹽都是在本發(fā)明范圍內(nèi)。術(shù)語“藥用鹽”包括可用在藥物形式中的金屬鹽或加成鹽。2，5-二羥基苯磺酸的藥用鹽可以從有機(jī)或無機(jī)酸或堿通過常規(guī)方法獲得，其通過使適宜的酸或堿與該化合物反應(yīng)而進(jìn)行。
含有2，5-二羥基苯磺酸的藥物組合物可以以任何適當(dāng)?shù)慕o藥形式，例如，全身性的、口服的、腸胃外的、尿道的、直腸的或局部給藥形式存在，對(duì)于此必要的藥用賦形劑將被包含在內(nèi)以用于配制所需的給藥形式。
下面的實(shí)施例舉例說明并支持本發(fā)明，并且其不應(yīng)該被認(rèn)為是對(duì)本發(fā)明范圍的限制。
實(shí)施例12，5-二羥基苯磺酸的抗增殖能力的例證性測(cè)定.
該體外研究使用大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞(C6品系)在3個(gè)不同的三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行。將所述細(xì)胞在由DMEM Dulbecco’改進(jìn)的Eagle’培養(yǎng)基(Gibco.Paisley UK)、7，5％的胎兒血清(Gibco)、10單位/ml的青霉素(Gibco)和10μg/ml的鏈霉素(Gibco)形成的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。將所述培養(yǎng)物放置在37℃的濕潤(rùn)的氛圍中。為評(píng)估2，5-二羥基苯磺酸對(duì)細(xì)胞增殖的影響，在24孔(15mm的直徑)板中接種每孔2×104個(gè)C6細(xì)胞。將實(shí)驗(yàn)的培養(yǎng)物在48小時(shí)的時(shí)間內(nèi)用不同微摩爾濃度(μM)的該化合物(2，5-二羥基苯磺酸的鈣或鉀鹽)處理。對(duì)照培養(yǎng)物生長(zhǎng)48小時(shí)，而不加入該化合物。48小時(shí)后，應(yīng)用倒置顯微鏡拍取培養(yǎng)物的照片，然后，將培養(yǎng)物用結(jié)晶紫(Merck Farma y Química SA.Mollet del Vallés，Barcelona)著色，并進(jìn)行處理以使用分光光度方法測(cè)定每孔細(xì)胞數(shù)目。如圖1所示，用不同濃度的化合物處理產(chǎn)生細(xì)胞增殖的劑量-依賴型抑制，使用濃度為100μM的2，5-二羥基苯磺酸的鈣鹽獲得88％的抑制(A)。使用相同濃度的2，5-二羥基苯磺酸的鉀鹽，獲得74％的抑制(B)。IC50對(duì)鈣鹽接近25μM，對(duì)鉀鹽在40-50μM之間。比較圖1A和圖1B，觀察到為了獲得與使用該化合物的鈣鹽處理后對(duì)細(xì)胞增殖的相同百分比的抑制，需要使用雙倍濃度的鉀鹽以獲得同樣的效果。這是由于該化合物的鈣鹽在水溶液中含有從鹽上分離出來的2個(gè)有效成分摩爾(2，5-二羥基苯磺酸)的事實(shí)。圖2顯示未經(jīng)處理的48小時(shí)后C6細(xì)胞培養(yǎng)物的圖像(A)，另一張圖像對(duì)應(yīng)使用濃度為50μM的2，5-二羥基苯磺酸的鈣鹽處理48小時(shí)的C6細(xì)胞培養(yǎng)物(B)，和第三張圖像對(duì)應(yīng)使用100μM的該酸的鉀鹽在48小時(shí)過程中處理的C6細(xì)胞的培養(yǎng)物(C)。該研究表明使用該化合物的處理抑制腫瘤性轉(zhuǎn)化細(xì)胞中的增殖，并且確證了該化合物在被促有絲分裂因子體外刺激的正常血管平滑肌細(xì)胞中觀察到的抗增殖作用(Parés-Herbute N等.Int J Angiol8S5-S10，1999)。為了辨別2，5-二羥基苯磺酸的抗增殖活性是由細(xì)胞毒性還是由前調(diào)亡作用所調(diào)節(jié)，我們進(jìn)行了不同的實(shí)驗(yàn)，其在下面的實(shí)施例中詳細(xì)描述實(shí)施例22，5-二羥基苯磺酸的前調(diào)亡能力的例證性測(cè)定.
該測(cè)定使用C6細(xì)胞按照實(shí)施例1中所描述的方法進(jìn)行。為了證明所分析的化合物的前調(diào)亡作用，我們使用了檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)DNA斷裂和調(diào)亡核團(tuán)的2種不同的方法。
細(xì)胞內(nèi)DNA斷裂的檢測(cè)可以認(rèn)為量化與組蛋白相關(guān)的DNA片段的酶免疫測(cè)定方法適合于測(cè)定程序性細(xì)胞死亡的發(fā)作(Aragane Y等.J Cell Biol 1998；140171-182)。該方法允許區(qū)分由于壞死引起的死亡和由于程序性細(xì)胞死亡引起的死亡，由于在壞死中，細(xì)胞質(zhì)膜是成碎片的并且DNA出現(xiàn)在培養(yǎng)基中，而在程序性細(xì)胞死亡中，因?yàn)橘|(zhì)膜保持完整，斷裂的DNA仍保留在細(xì)胞內(nèi)部(Aragane Y等.J Cell Biol 140171-182，1998)。
按照生產(chǎn)者的說明書使用細(xì)胞死亡檢測(cè)ELISAPlus試劑盒(BoehringerMannheim，Mannheim，Germany)，我們已測(cè)定了在4，16，24和48小時(shí)的C6(2×103)細(xì)胞培養(yǎng)物中的DNA斷裂。對(duì)照的培養(yǎng)物沒有受到任何處理，而在實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)物中添加50-200μM(圖3A)的2，5-二羥基苯磺酸的鉀鹽。還進(jìn)行了添加25-100μM的2，5-二羥基苯磺酸的鈣鹽的實(shí)驗(yàn)(圖3B)。所有的實(shí)驗(yàn)都在3個(gè)不同的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行3次重復(fù)。
圖3A和3B表明下述a)2，5-二羥基苯磺酸的抗增殖作用主要由前調(diào)亡活性介導(dǎo)；b)由于使用所述化合物的鈣鹽或鉀鹽的前調(diào)亡作用是相似的，鍵合到所述分子上的陽離子不決定所述化合物的活性；c)最高前調(diào)亡作用在使用所述化合物在48小時(shí)的過程中處理的細(xì)胞中獲得；d)最大作用在使用濃度為25μM的鈣鹽和50μM的鉀鹽時(shí)獲得，這與細(xì)胞增殖研究中的IC50一致。一旦證明2，5-二羥基苯磺酸的抗增殖機(jī)制參與由程序性細(xì)胞死亡引起的細(xì)胞死亡，我們就通過對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的顯微鏡研究定量地評(píng)估了這種作用，其應(yīng)用下述技術(shù)調(diào)亡核團(tuán)的原位檢測(cè)(TUNEL技術(shù))實(shí)行3個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)，重復(fù)3次。將來自對(duì)照培養(yǎng)物的C6細(xì)胞和來自使用(分別為50μM和100μM的鈣鹽和鉀鹽)在24小時(shí)過程中處理的培養(yǎng)物的那些附著到玻璃載玻片上，并用4％低聚甲醛緩沖溶液(pH7.4)在實(shí)驗(yàn)室溫度下固定1小時(shí)。然后，洗滌所述細(xì)胞并用0.1％的Triton X-100溶液滲透。然后在應(yīng)用TUNEL技術(shù)[(末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)-調(diào)控的dUTP切口和標(biāo)記(Gavrieli Y，Sherman Y，Bensasson SA.J Cell Biol 119493-501，1992)前洗滌所述細(xì)胞。使用用于調(diào)亡核團(tuán)的原位檢測(cè)的試劑盒(In situCell Death Detection Kit Boehringer Mannheim，Mannheim，德國(guó))。按照試劑盒生產(chǎn)者的說明書遵循所述技術(shù)的不同的步驟。最后，將細(xì)胞用綠光(Fluka，AG，Switzerland)著色。TUNEL反應(yīng)只出現(xiàn)在調(diào)亡核團(tuán)中。
盡管使用本發(fā)明目標(biāo)化合物的鈣和鉀鹽獲得了非常相似的結(jié)果，但是僅僅顯示了使用所述化合物的鉀鹽獲得的結(jié)果。在12塊載玻片的6個(gè)不同的視野計(jì)數(shù)細(xì)胞，所述載玻片附著了來自6個(gè)對(duì)照培養(yǎng)物和6個(gè)使用2，5-二羥基苯磺酸(100μM)處理的培養(yǎng)物的細(xì)胞。非調(diào)亡和調(diào)亡細(xì)胞的全部數(shù)目如下
由于所述化合物的抗增殖作用，處理的細(xì)胞的總數(shù)低于對(duì)照細(xì)胞的總數(shù)。
圖4的圖像顯示對(duì)照培養(yǎng)物的(A和B)和使用所述化合物處理的另一種培養(yǎng)物(C和D)的實(shí)驗(yàn)區(qū)域，在其中利用了TUNEL技術(shù)。如在圖像中所示，在對(duì)照細(xì)胞上只觀察到2個(gè)調(diào)亡核團(tuán)，而在使用本發(fā)明目標(biāo)化合物處理的細(xì)胞中有107個(gè)調(diào)亡核團(tuán)且只有8個(gè)正常核團(tuán)(非調(diào)亡的)。
這些數(shù)據(jù)顯示2，5-二羥基苯磺酸是一種具有重要的前調(diào)亡活性的化合物，所述前調(diào)亡活性用于誘導(dǎo)腫瘤程序性細(xì)胞死亡。假設(shè)已經(jīng)證明2，5-二羥基苯磺酸在正常的人細(xì)胞中抑制調(diào)亡(Braber R，F(xiàn)arine JC，Lora GA.Apoptosis44111-49，1998)，那么該化合物是治療癌癥的強(qiáng)分子候選物。
涉及化學(xué)療法和放療的治療失敗中的機(jī)制之一是這些治療誘導(dǎo)由程序性細(xì)胞死亡引起的細(xì)胞死亡的無效性，主要是由于腫瘤細(xì)胞中抗調(diào)亡蛋白的超表達(dá)(Sellers WR，F(xiàn)isher DE.J Clin Invest1041655-1661，1999；Branch P.等.Oncogene193138-3145，2000)。因此，所述前調(diào)亡化合物可以作為化學(xué)療法和放療治療中的佐劑具有很大的臨床應(yīng)用。
一旦證明了2，5-二羥基苯磺酸的前調(diào)亡作用，我們對(duì)該化合物增加不同的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制藥物的抗增殖作用的能力進(jìn)行了評(píng)估。下述實(shí)施例證明2，5-二羥基苯磺酸怎樣能夠增加用于腫瘤學(xué)的不同的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制化合物的治療功效，所述的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制化合物諸如順鉑、長(zhǎng)春新堿、紫杉醇和5-氟尿嘧啶。
實(shí)施例32，5-二羥基苯磺酸在增強(qiáng)化學(xué)療法中的能力的例證性測(cè)定對(duì)于該研究，我們使用在實(shí)施例1所描述的同樣條件下體外培養(yǎng)的C6細(xì)胞。在24孔板中每孔培養(yǎng)1×103個(gè)細(xì)胞。進(jìn)行3種類型的處理a)接種后24小時(shí)，將所述細(xì)胞分別用每一種下述藥物處理順鉑(5μg/ml)、長(zhǎng)春新堿(0，1μg/ml)、紫杉醇(5μg/ml)和5-氟尿嘧啶(100μg/ml)；b)接種后24小時(shí)，將所述細(xì)胞用2，5-二羥基苯磺酸(鉀鹽，100μM)和下述藥物的每一種進(jìn)行聯(lián)合處理；順鉑(5μg/ml)長(zhǎng)春新堿(0，1μg/ml)、紫杉醇(5μg/ml)和5-氟尿嘧啶(100μg/ml)；c)在接種時(shí)(第0日)，將所述細(xì)胞用2，5-二羥基苯磺酸(鉀鹽，100μM)進(jìn)行預(yù)處理。次日還將培養(yǎng)物用下述藥物中的每一種進(jìn)行處理順鉑(5μg/ml)、長(zhǎng)春新堿(0，1μg/ml)、紫杉醇(5μg/ml)和5-氟尿嘧啶(100μg/ml)。對(duì)照培養(yǎng)物不受處理達(dá)2天。48小時(shí)后(第2日)，將形態(tài)與實(shí)施例1中所用的細(xì)胞相同的細(xì)胞在所有培養(yǎng)物中進(jìn)行評(píng)估。該研究在重復(fù)3次的三次重復(fù)(triplicate)的獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行。
圖5(A，B，C和D)顯示為評(píng)估2，5-二羥基苯磺酸在增強(qiáng)不同的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制藥物中的作用而進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)的柱狀圖。使用順鉑、長(zhǎng)春新堿和5-氟尿嘧啶的處理在C6細(xì)胞的增殖中產(chǎn)生50％的抑制，而使用紫杉醇的處理獲得對(duì)細(xì)胞增殖的67％的抑制。2，5-二羥基苯磺酸+細(xì)胞生長(zhǎng)抑制藥物(順鉑、長(zhǎng)春新堿和5-氟尿嘧啶)的聯(lián)合處理在細(xì)胞增殖中產(chǎn)生84％的抑制。2，5-二羥基苯磺酸+紫杉醇的聯(lián)合處理在細(xì)胞增殖中產(chǎn)生86％的抑制。當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)物用2，5-二羥基苯磺酸進(jìn)行預(yù)處理然后使用下述細(xì)胞生長(zhǎng)抑制藥物順鉑、長(zhǎng)春新堿和5-氟尿嘧啶，在細(xì)胞增殖中獲得90％的抑制。當(dāng)使用紫杉醇時(shí)，細(xì)胞增殖中的抑制達(dá)到多至92％。
上述提到的結(jié)果證明2，5-二羥基苯磺酸與所述化療劑的同時(shí)治療增加了它們的治療功效，并且除此之外，當(dāng)所述細(xì)胞使用2，5-二羥基苯磺酸進(jìn)行預(yù)處理時(shí)，化學(xué)增強(qiáng)作用更高。這些數(shù)據(jù)支持將2，5-二羥基苯磺酸作為佐劑用在與化學(xué)治療和放療相關(guān)的治療中的應(yīng)用。
實(shí)施例42，5-二羥基苯磺酸的抗遷移能力的例證性測(cè)定該測(cè)定在3個(gè)不同的三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行。為了評(píng)估2，5-二羥基苯磺酸在抑制細(xì)胞遷移中的能力，使用在20mm板上體外培養(yǎng)的C6 2×105個(gè)細(xì)胞。用無菌的微吸管在對(duì)照培養(yǎng)物和使用100μM的2，5-二羥基苯磺酸的鉀鹽處理的培養(yǎng)物中形成縱向損害(第0日)。使用與發(fā)光顯微鏡相連接的照相系統(tǒng)拍攝數(shù)碼照片，并應(yīng)用計(jì)算機(jī)化的形態(tài)度量程序(Moticam.Motic.Barcelona)對(duì)損害的區(qū)域進(jìn)行劃界。24小時(shí)后再次拍攝照片，并且標(biāo)記出損害的邊界，將最初的2張照片(第0日)與24小時(shí)后獲得的那些重疊，以計(jì)算被遷移細(xì)胞覆蓋的損害區(qū)域的百分比。這些值代表用所述處理獲得的再次產(chǎn)生的百分比。圖6顯示對(duì)照實(shí)驗(yàn)(A)和其中所述細(xì)胞用本發(fā)明的目標(biāo)化合物在24小時(shí)過程中處理的另一個(gè)實(shí)驗(yàn)(B)的典型實(shí)例。如在該圖中所觀察到的，未處理的細(xì)胞完全再次產(chǎn)生了所述損害(圖6A)，而用所述化合物處理的細(xì)胞不能遷移并覆蓋損害的全部區(qū)域(圖6B)。代表所有實(shí)驗(yàn)的百分比數(shù)據(jù)的圖7顯示2，5-二羥基苯磺酸抑制腫瘤細(xì)胞的遷移多至64％。
實(shí)施例52，5-二羥基苯磺酸的抗生血管能力的例證性測(cè)定對(duì)于該測(cè)定，我們使用雞胚的尿囊絨膜用于測(cè)試體內(nèi)抗生血管物質(zhì)的活性(Zilberberg L.等.J Biol Chem2003；27835564-35573)。我們使用前生血管化合物，成纖維生長(zhǎng)因子的基本形式(bFGF)(Meghna U等.Blood2003；1022108-2114)。
將受精的雞蛋放置在具有80％濕度的37℃培養(yǎng)箱中。4天后，在蛋殼的最窄端開一個(gè)洞，以收集1ml清蛋白。然后，將洞用石蠟?zāi)?Parafilm MLaboratory Film Chicago IL.USA)覆蓋。該步驟允許產(chǎn)生一個(gè)氣室，其防止胚胎附著到殼的上部。在孵化的第13日，在氣室水平上將殼裂開，以進(jìn)行處理。將20個(gè)胚胎用浸濕在硝酸纖維素紙圓片中的5μl的3μg bFGF+0.1％肝素的溶液處理。然后，用石蠟?zāi)っ芊?。次日，在一半胚?n＝10)中，將殼打開，從而再一次將所述硝酸纖維素紙圓片用100μM溶解在生理鹽水(5μl)中的2，5-二羥基苯磺酸的鉀鹽浸濕。然后將殼中的洞再一次用石蠟?zāi)じ采w。在第17日，實(shí)驗(yàn)結(jié)束，拍攝硝酸纖維素片的照片用于比較研究。
圖8表示對(duì)應(yīng)于用3μg bFGF+0,1％肝素處理的胚胎(A)和次日被添加100μM的2，5-二羥基苯磺酸的鉀鹽溶液的另一胚胎(B)的兩張圖像。圖像A顯示硝酸纖維素圓片怎樣被血管侵入，而圖像B顯示在所述圓片中很少有血管侵入。應(yīng)用計(jì)算機(jī)化系統(tǒng)(Moticam Motic.Barcelona)對(duì)硝酸纖維素圓片圖像的形態(tài)度量量化顯示所述化合物的抗生血管作用(在用bFGF+肝素處理的胚胎中被血管覆蓋的圓片面積＝35±8.6％對(duì)比在用bFGF+肝素+2，5-二羥基苯磺酸的鉀鹽處理的胚胎中被血管覆蓋的圓片面積＝2±1，5％；p＜0,0001；不成雙的斯氏t-檢驗(yàn))。使用50μM的所述化合物的鈣鹽獲得了相似的效果。該實(shí)驗(yàn)表明本發(fā)明的化合物目標(biāo)具有能夠中和由bFGF誘導(dǎo)的生血管作用的抗生血管活性。
實(shí)施例6對(duì)銀屑病病變的測(cè)定對(duì)于該研究，我們使用配制成2，5和5％的霜?jiǎng)┑?，5-二羥基苯磺酸的鉀鹽，原因在于這種類型的制劑是用于皮膚病局部治療的常用方法。2，5-二羥基苯磺酸鹽的選定濃度在用于治療糖尿病性視網(wǎng)膜病的濃度范圍內(nèi)每日6片的500mg的2，5-二羥基苯磺酸的鈣鹽(Benakis A等Thérapie1974；29211-219)。我們使用蒸餾水作為霜?jiǎng)┑乃唷Ｖ嗫梢杂绍浿?、硬脂醇或凡士林?gòu)成。司盤(span)在霜?jiǎng)┲苽渲惺且环N有效的乳化劑。盡管產(chǎn)品的兩種制劑(2，5和5％)都顯示為臨床有效的，但是最好的治療益處是使用5％的濃度獲得的。因此，我們給出使用以5％的霜?jiǎng)┡渲频乃鏊岫@得的結(jié)果。下述實(shí)施例舉例說明用于銀屑病局部治療的有效霜?jiǎng)┑呐渲?，其通過實(shí)施例的方式，但并不限制本發(fā)明的范圍。
I.-活性部分(5，6％的2，5-二羥基苯磺酸的鉀鹽)II.-非活性部分(作為賦形劑的軟脂醇(2，5％)、硬脂醇(2，5％)、液態(tài)凡士林(30％)、白色軟石蠟(20％)、油酸山梨坦(5％)和蒸餾水(c.s.p.100g))。
治療的臨床功效按照量化脫皮體征(D)、紅斑(E)和浸潤(rùn)(I)的指標(biāo)進(jìn)行評(píng)估，對(duì)于其，指定下列評(píng)估(0)缺乏；(1)輕微；(2)中等和(3)嚴(yán)重(Freeman AK等.J Am.Acad Dermat2003；48564-568)。圖9顯示3幅圖像治療前，使用5％的2，5-二羥基苯磺酸的鉀鹽治療的位于左肘伸展區(qū)域的相同慢性銀屑病斑塊在治療6天和13天后。如可以觀察到的，使用含有2，5-二羥基苯磺酸的鉀鹽的霜?jiǎng)┟咳諆纱蔚木植恐委煯a(chǎn)生早期(6日)非常明顯的斑塊“清除”，其中角化過度癥幾乎完全消失。所述霜?jiǎng)┑闹委煿πг谥委煹牡诙艿哪┢诟用黠@。所述治療產(chǎn)生DEI指標(biāo)的總值(globalvalue)的顯著的減少(治療前DEI總值＝6±1,57對(duì)比治療后DEI總值＝1±0,58；p＜0,0001；不成雙的斯氏t-檢驗(yàn))。


1.顯示在C6細(xì)胞培養(yǎng)物中使用不同濃度的2，5-二羥基苯磺酸的(A)鈣鹽和(B)鉀鹽處理在處理48小時(shí)后的抗增殖作用的柱狀圖?？v坐標(biāo)595nm處的吸光度；橫坐標(biāo)濃度μM。
2.圖A顯示48小時(shí)后的C6細(xì)胞對(duì)照培養(yǎng)物的外觀。圖B顯示使用50μM2，5-二羥基苯磺酸(鈣鹽)在48小時(shí)過程中處理的C6細(xì)胞培養(yǎng)物的圖像。圖C顯示使用100μM的2，5-二羥基苯磺酸的鉀鹽在48小時(shí)過程中處理的C6的培養(yǎng)物。
3.在其中觀察到2，5-二羥基苯磺酸的抗增殖作用不是由于壞死引起(白色柱狀圖)而是由于程序性細(xì)胞死亡引起(線條柱狀圖)的代表性柱狀圖。A使用2，5-二羥基苯磺酸的鈣鹽處理。B使用2，5-二羥基苯磺酸的鉀鹽處理?？v坐標(biāo)405nm處的吸光度；橫坐標(biāo)以小時(shí)計(jì)算的時(shí)間。
4.使用用于原位檢測(cè)調(diào)亡細(xì)胞的TUNEL技術(shù)處理的神經(jīng)膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞的圖像。調(diào)亡核團(tuán)顯示為暗色，并且非調(diào)亡細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)顯示為亮色。箭頭指示調(diào)亡核團(tuán)。A和B對(duì)照細(xì)胞，C和D用2，5-二羥基苯磺酸處理的細(xì)胞。照片B和D分別對(duì)應(yīng)于A和C照片的長(zhǎng)方形框的放大。
5.證明2，5-二羥基苯磺酸與不同的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制化合物A)順鉑(5μg/ml)；B)長(zhǎng)春新堿(0.1μl/ml)；C)紫杉醇(5Ug/ml)和D)5-氟尿嘧啶(100μg/ml)對(duì)化學(xué)治療的加強(qiáng)作用(評(píng)估為抗增殖作用)的柱狀圖?？v坐標(biāo)595nm處的吸光度；橫坐標(biāo)白色柱狀圖(對(duì)照)；點(diǎn)圖(細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑，第1日)；線條柱狀圖(2，5-二羥基苯磺酸+細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑；第1日)；平方柱狀圖(2，5-二羥基苯磺酸(第0日)+細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑；第1日)。
6.對(duì)照實(shí)驗(yàn)和使用2，5-二羥基苯磺酸處理細(xì)胞的其它實(shí)驗(yàn)(B)中的細(xì)胞遷移照相圖像。對(duì)照細(xì)胞完全再次產(chǎn)生了在培養(yǎng)過程中形成的損害，而使用2，5-二羥基苯磺酸處理的細(xì)胞的細(xì)胞遷移不能夠完全覆蓋培養(yǎng)物的受影響區(qū)。水平線劃定在培養(yǎng)物中形成的最初的縱向損害的界限。
7.代表在對(duì)照培養(yǎng)物(白色柱狀圖)和使用2，5-二羥基苯磺酸處理的培養(yǎng)物(黑色柱狀圖)中的C6細(xì)胞的遷移能力的柱狀圖。將遷移能力表示為再次產(chǎn)生的百分比(培養(yǎng)物中形成的縱向損害被覆蓋的面積的百分比)(縱坐標(biāo))。
8.孵化17日的2個(gè)雞胚的圖像。圖A對(duì)應(yīng)于使用3μg的bFGF+0，1％肝素處理的胚胎。圖B顯示使用3μg bFGF+0.1％肝素+100μM的2，5-二羥基苯磺酸的鉀鹽處理的胚胎的外觀。圖A顯示由于用作物質(zhì)釋放載體的硝酸纖維素圓片幾乎沒有出現(xiàn)任何血管，2，5-二羥基苯磺酸的抗生血管作用。
9.位于左肘后部的角化過度性銀屑病斑塊的圖像。圖像A表示在開始治療前的銀屑病斑塊的外觀。圖像B是使用5％的霜?jiǎng)┲委?日后的相同斑塊的外觀，所述霜?jiǎng)┌?，5-二羥基苯磺酸的鉀鹽作活性成分。圖像C顯示使用以5％配制的2，5-二羥基苯磺酸的鉀鹽治療2周后的銀屑病斑塊的外觀。圖像中顯示的數(shù)字對(duì)應(yīng)照片拍攝的日期。
權(quán)利要求
1.-2，5-二羥基苯磺酸或其藥用鹽的任一種用于制備可應(yīng)用于治療血管依賴型疾病的藥物的應(yīng)用。
2.-按照權(quán)利要求1的應(yīng)用，其中所述血管依賴型疾病還表現(xiàn)為程序性細(xì)胞死亡的減少。
3.-按照權(quán)利要求1或2任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中所述制備的藥物用于癌癥治療中的應(yīng)用。
4.-按照權(quán)利要求3的應(yīng)用，其特征在于所述制備的藥物用于增加細(xì)胞生長(zhǎng)抑制藥物在癌癥治療中的抗增殖作用。
5.-按照權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的應(yīng)用，其特征在于優(yōu)選用于制備所述藥物的鹽是2，5-二羥基苯磺酸的鉀鹽。
6.-按照權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的應(yīng)用，其特征在于優(yōu)選用于生產(chǎn)所述藥物的鹽是2，5-二羥基苯磺酸的鈣鹽。
7.-按照上述權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中所述制備的藥物還包括足夠量的至少一種藥用賦形劑。
8.-按照權(quán)利要求1的應(yīng)用，其中所述制備的藥物用于在銀屑病治療中的應(yīng)用。
9.-按照權(quán)利要求8的應(yīng)用，其特征在于優(yōu)選用于生產(chǎn)所述藥物的鹽是2，5-二羥基苯磺酸的鉀鹽。
10.-按照權(quán)利要求8的應(yīng)用，其特征在于優(yōu)選用于制備所述藥物的鹽是2，5-二羥基苯磺酸的鈣鹽。
11.-按照上述權(quán)利要求8-10任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中所述制備的藥物還包括足夠量的至少一種藥用賦形劑。
12.-按照權(quán)利要求8-11的任一項(xiàng)的應(yīng)用，其特征在于所述藥物由局部應(yīng)用的制劑組成(consist on)。
13.-按照權(quán)利要求12的應(yīng)用，其特征在于所述藥物是霜?jiǎng)┗蜍浉鄤?，其組成包括·藥用有效量的2，5-二羥基苯磺酸或其藥用鹽的任一種；·藥用量的至少一種醇；·藥用量的至少一種乳化劑；·藥用量的至少一種賦形劑；·藥用量的至少一種賦形劑，其包括脂質(zhì)相，特別是凡士林；·蒸餾水。
14.-按照權(quán)利要求13的應(yīng)用，其特征在于所述藥物是霜?jiǎng)┗蜍浉鄤浯戆ㄏ铝懈黜?xiàng)的組合物·5％的2，5-二羥基苯磺酸的鉀鹽；·2，5％的軟脂醇；·2，5％的硬脂醇；·30％的液態(tài)凡士林；·30％的白色軟石蠟；·5％的司盤(油酸山梨坦)·足量100g蒸餾水。
全文摘要
本發(fā)明涉及2，5－二羥基苯磺酸在生產(chǎn)用于治療血管依賴型疾病的藥物中的應(yīng)用。更具體地，本發(fā)明涉及上述化合物，具體地，其鈣或鉀鹽的用于治療兩種血管依賴型疾病的應(yīng)用，所述血管依賴型疾病即癌癥和銀屑病，表現(xiàn)為程序性細(xì)胞死亡的減少。本發(fā)明還公開所述化合物家族在非休眠細(xì)胞中的抗增殖、抗遷移、抗生血管和前調(diào)亡能力。另外，本發(fā)明詳述所述化合物在治療腫瘤和特別是神經(jīng)膠質(zhì)瘤中對(duì)已知細(xì)胞生長(zhǎng)抑制藥物的增強(qiáng)作用。本發(fā)明還涉及所述化合物在治療慢性銀屑病斑塊中的治療功效，其基于所述化合物的聯(lián)合的抗增殖、抗生血管和前調(diào)亡能力。
文檔編號(hào)A61P35/00GK101014330SQ200580005187
公開日2007年8月8日 申請(qǐng)日期2005年2月16日 優(yōu)先權(quán)日2004年2月17日
發(fā)明者P·奎瓦斯桑切斯, A·羅梅羅加里多, R·M·洛薩諾普埃爾托, G·希門尼斯加列戈斯, S·巴爾韋德洛佩斯 申請(qǐng)人:活性藥物公司