專利名稱：甘丙肽受體與腦部損傷的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及保護(hù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)免受損傷、損害或疾病的領(lǐng)域。
本發(fā)明特別涉及但不限于保護(hù)或治療腦部免于下列的不良影響(a)栓塞性、血栓性或出血性中風(fēng)；(b)對(duì)腦部或脊髓的直接或間接創(chuàng)傷；(c)對(duì)腦部或脊髓的手術(shù)；(d)由心肺旁路手術(shù)、腎透析引起的腦部缺血性或栓塞性損害和心肌梗塞后的再灌注腦部損害；(e)包含神經(jīng)損害和/或細(xì)胞死亡的腦部疾病，例如阿爾茨海默病(Alzheimer’s Disease)、帕金森病(Parkinson’s Disease)、多發(fā)性硬化(Multiple Sclerosis)、vCJD(可變型克雅病，variantCreutzfeld Jacob Disease)；(f)對(duì)腦部的免疫學(xué)、化學(xué)或輻射損害，例如由細(xì)菌或病毒感染、酒精、腫瘤化療和腫瘤放療引起的損害。
具體而言，本發(fā)明涉及第二甘丙肽受體亞型(GALR2)的配基在腦部損傷、損害或疾病的預(yù)防或治療中的用途。GALR2特異性激動(dòng)劑可以有利地用于防護(hù)或治療一系列的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，并且最小化或避免因GALR3和/或GALR1的激活而產(chǎn)生的潛在副作用。本發(fā)明還涉及確定用于預(yù)防或治療腦部損傷、損害或疾病的候選藥物的藥物開發(fā)方法，本發(fā)明還涉及用于預(yù)防或治療腦部損傷、損害或疾病的藥物組合物。
背景技術(shù)：
中風(fēng)中風(fēng)被定義為一種心血管意外傷害，包括栓塞性、血栓性或出血性發(fā)作，這種發(fā)作可引起大面積腦部缺氧，導(dǎo)致永久性腦損害并關(guān)聯(lián)功能性神經(jīng)損傷。盡管中風(fēng)是西方世界的第三大死亡原因，但是目前對(duì)這種神經(jīng)學(xué)影響仍然沒有令人滿意的治療手段。大量的在老年人群中所見的身體殘疾都是由中風(fēng)造成的，并且多達(dá)30％的中風(fēng)患者在日常生活中需要長期的幫助。在美國每年估計(jì)有超過70萬人發(fā)生中風(fēng)，在英國任一時(shí)刻都有50萬人在他們的一生中某個(gè)時(shí)刻發(fā)生過中風(fēng)。為了將中風(fēng)的影響減到最小開發(fā)了多種神經(jīng)保護(hù)藥劑，但是到目前為止它們?cè)趯?shí)踐中的效果令人失望，并且沒有廣泛的或常規(guī)的應(yīng)用于臨床。這些藥劑包括但不限于鈣通道拮抗劑——Fujisawa公司的尼伐地平(nilvadipine)(Nivadil)和Bayer公司的尼莫地平(nimodipine)(Nimotop)；抗氧化劑——Pharmacia & Upjohn公司的替拉扎特(tirilazad)(Freedox)和Interneuron公司的胞磷膽堿(citicoline)(CerAxon)；和蛋白質(zhì)激酶抑制劑——Asahi公司的法舒地爾(fasudil)(ErilTM)。除鈣通道拮抗劑和自由基清除劑外，開發(fā)中的神經(jīng)保護(hù)藥劑包括N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)拮抗劑，α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異噁唑丙酸鹽(AMPA)拮抗劑，以及其他設(shè)計(jì)為抑制例如谷氨酸和甘氨酸激動(dòng)劑的有毒神經(jīng)遞質(zhì)的釋放的化合物。
創(chuàng)傷或外科腦損傷的形式除中風(fēng)以外還存在很多可能發(fā)生腦損害的狀況，這些狀況包括對(duì)腦部或脊髓的直接或間接創(chuàng)傷或手術(shù)、涉及心肺旁路的手術(shù)、腎透析和心肌梗塞后的再灌注。最常見的狀況發(fā)生于冠狀動(dòng)脈旁路搭橋術(shù)(CABG)的過程中或術(shù)后。每年在美國要進(jìn)行60萬例CABG手術(shù)，并且在所有心肺旁路患者中有25％在術(shù)后3個(gè)月內(nèi)顯示出神經(jīng)學(xué)缺陷。
損害腦部的疾病阿爾茨海默病(AD)是西方世界的一大健康難題。AD是在老年人群中最常見的癡呆形式，目前估計(jì)全世界有2000萬人患有此病。由于老年人口數(shù)量的增加，預(yù)計(jì)AD的發(fā)病率在未來的25年內(nèi)將提高一倍。在英國每年AD患者的護(hù)理費(fèi)用超過55億英鎊。目前此病還沒有發(fā)現(xiàn)治愈的病例，能夠顯著延緩該病進(jìn)程的治療手段也很少(除乙酰膽堿酯酶抑制劑以外)。
多發(fā)性硬化(MS)是年輕成人中最常見的失能性神經(jīng)疾病，在英國約有8萬5千人患病，在西方世界任一時(shí)刻有超過50萬人患病。MS最常確診于20歲至40歲之間的人群中，并且女性的發(fā)病率大約是男性的兩倍。該病似乎優(yōu)先以北歐人的后代為目標(biāo)。MS是一種自身免疫病，其特征為神經(jīng)元周圍髓磷脂鞘的缺失導(dǎo)致進(jìn)行性神經(jīng)功能障礙和神經(jīng)細(xì)胞缺失?；颊邥?huì)面臨很多問題，這些問題可能包括視覺障礙和失明、運(yùn)動(dòng)和/或感覺功能喪失以及腸和泌尿功能的問題。
其他已知會(huì)引起神經(jīng)損害和/或細(xì)胞死亡的疾病包括帕金森病和可變型克雅病。
其他形式的腦部損傷包括免疫學(xué)、化學(xué)或輻射損害，例如由細(xì)菌或病毒感染、酒精、腫瘤化療和腫瘤放療引起的損害。
甘丙肽甘丙肽為29個(gè)氨基酸的神經(jīng)肽(Tatemoto et al.(1983)FEBS Lett.164124-128)，它廣泛表達(dá)于中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)中，并且通過減少多種典型神經(jīng)遞質(zhì)的釋放從而具有對(duì)突觸傳導(dǎo)的強(qiáng)烈抑制作用(Fisoneet al.(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 847339-7343；Misaneet al.(1998)Eur.J.Neurosci.101230-1240；Pieribone et al.(1995)Neurosci.64861-876；Hokfelt et al.(1998)Ann.N.Y.Acad.Sci.863252-263；Kinney et al.(1998)J.Neurosci.183489-3500；Zini et al.(1993)Eur.J.Pharmacol.2451-7)。上述抑制作用產(chǎn)生了各種神經(jīng)學(xué)影響，包括a)工作記憶(Mastropaolo et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 859841-9845)和長時(shí)程增強(qiáng)效應(yīng)(LTP，被認(rèn)為是記憶的電生理學(xué)關(guān)聯(lián))(Sakurai et al.(1996)Neurosci.Lett.21221-24)的損害；b)海馬興奮性下降與對(duì)發(fā)作活性的易感性下降(Mazarati et al.(1992)Brain Res.589164-166)；以及c)在無損傷的動(dòng)物中及神經(jīng)損傷之后，傷害反應(yīng)的明顯抑制(Wiesenfeld et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 893334-3337)。
甘丙肽的這些神經(jīng)調(diào)制作用長期以來被認(rèn)為是該肽在神經(jīng)系統(tǒng)中的主要作用。然而，現(xiàn)在有相當(dāng)多的證據(jù)表明對(duì)很多上述神經(jīng)系統(tǒng)的損傷都顯著地誘導(dǎo)甘丙肽在mRNA和肽水平的表達(dá)。這種損傷研究的實(shí)例包括甘丙肽在下列組織中的上調(diào)a)周圍神經(jīng)切斷后的背根神經(jīng)節(jié)(DRG)(Hokfelt et al.(1987)Neurosci.Lett.83217-220)，b)垂體摘除術(shù)后的下丘腦大細(xì)胞分泌神經(jīng)元(Villar et al.(1990)Neurosci.36181-199)，c)額頂皮質(zhì)摘除(皮質(zhì)剝除術(shù))后的背縫(dorsal raphe)和丘腦(Cortes et al.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 877742-7746)，
d)內(nèi)嗅皮質(zhì)損傷后的海馬分子層(Harrison & Henderson(1999)Neurosci.Lett.26641-44)，以及e)穹窿-海馬傘束(fimbria fornix bundle)橫切后的內(nèi)側(cè)隔核(Medial septum，MS)和斜角帶核垂直支(vertical limbdiagonal-band，vdB)(Brecht et al.(1997)Brain Res.487-16)。
這些研究使很多的研究者推測甘丙肽可能除了其典型的神經(jīng)調(diào)制作用之外還有促進(jìn)細(xì)胞存活或生長的作用。
為驗(yàn)證上述假設(shè)，培育了在甘丙肽基因上有喪失或增強(qiáng)功能的突變的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(Bacon et al.(2002)Neuroreport 132129-2132；Holmes et al.(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9711563-11568；Steiner et al.(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 984184-4189；Blakeman et al.(2001)Neuroreport 12423-425)。甘丙肽基因敲除動(dòng)物的表型分析意外地證實(shí)，這個(gè)肽在發(fā)育中的周圍和中樞神經(jīng)系統(tǒng)作為神經(jīng)元亞群的存活因子(Holmes，2000；O’Meara et al.(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9711569-11574)。最近又證實(shí)了這種神經(jīng)存活作用也與成熟的DRG有關(guān)。感覺神經(jīng)元在損傷后依賴甘丙肽進(jìn)行神經(jīng)突延伸，這是由PKC依賴方式激活第二甘丙肽受體亞型介導(dǎo)的(Mahoney et al.(2003)J.Neurosci.23416-421)。因此推測甘丙肽可能也以類似的方式在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中起作用，減少腦部損傷、損害或疾病的動(dòng)物模型的細(xì)胞死亡。
WO92/12997申請(qǐng)中公開了人類甘丙肽的序列。其他學(xué)者的研究的討論中提及給予大鼠甘丙肽或其N端片段以增強(qiáng)嗎啡的效果。上述申請(qǐng)說明甘丙肽預(yù)計(jì)有止痛效果，所以可以單獨(dú)給予或與其他鎮(zhèn)痛劑一起給予。該申請(qǐng)要求保護(hù)甘丙肽或其類似物治療疼痛的用途和甘丙肽拮抗劑治療某些其他病癥的用途。
WO92/20709申請(qǐng)中公開了許多假定的甘丙肽拮抗劑。所描述的拮抗劑都是以甘丙肽的前12個(gè)氨基酸為基礎(chǔ)，并連有其他肽的部分序列，即為嵌合肽。根據(jù)受體亞型，它們中一些可能為激動(dòng)劑，一些可能為拮抗劑，還有一些可能既是激動(dòng)劑又是拮抗劑。該申請(qǐng)公開該拮抗劑可以用于下列病癥的治療與胰島素、生長激素、乙酰膽堿、多巴胺、P物質(zhì)、促生長素抑制素和去甲腎上腺素相關(guān)的病癥，包括阿爾茨海默性癡呆和腸疾病，以及內(nèi)分泌、食物攝入、神經(jīng)學(xué)和精神病學(xué)領(lǐng)域的病癥。這些拮抗劑可用作鎮(zhèn)痛劑。該申請(qǐng)公開了將其中描述的一些拮抗劑用于各種作用的研究結(jié)果，所述的各種作用例如甘丙肽對(duì)葡萄糖刺激胰島素釋放的抑制、甘丙肽誘導(dǎo)的對(duì)莨菪胺誘導(dǎo)乙酰膽堿(ACh)海馬釋放的抑制、甘丙肽誘導(dǎo)的對(duì)屈肌反射的促進(jìn)、在膜結(jié)合研究中結(jié)合碘化甘丙肽的取代。該申請(qǐng)說明了拮抗劑有可能用作鎮(zhèn)痛劑，但是該申請(qǐng)中沒有公開這一作用的結(jié)果。關(guān)于甘丙肽激動(dòng)劑的用途沒有積極或有益的權(quán)利要求。
Ukai et al.(1995)Peptides 161283-1286中描述了甘丙肽在小鼠體內(nèi)對(duì)記憶過程的作用的研究。研究結(jié)果說明甘丙肽損害記憶及其他認(rèn)知功能，并且中等劑量的甘丙肽就能特異性引發(fā)失憶。關(guān)于甘丙肽激動(dòng)劑的用途沒有做出積極或有益的權(quán)利要求。
JP-A-6172387公開了一種有效的抑制甘丙肽抑制胰島素分泌作用的合成多肽及衍生物，希望可以作為甘丙肽拮抗物質(zhì)而用于阿爾茨海默病的預(yù)防和治療。
Bartfai et al.(1992)TiPS 13312-317是一篇總結(jié)當(dāng)時(shí)關(guān)于甘丙肽作用的知識(shí)的綜述文獻(xiàn)，它描述了一系列的高親和力的甘丙肽拮抗劑。該綜述說明甘丙肽拮抗劑可用于阿爾茨海默病的治療。
Wynick et al.(1993)Nature 364529-532討論了甘丙肽參與基準(zhǔn)水平的和雌激素刺激下的泌乳細(xì)胞的功能和催乳素激素的釋放。
WO92/15681公開了具有人類甘丙肽氨基酸序列的肽以及編碼這個(gè)肽的DNA克隆。該申請(qǐng)說明甘丙肽可能在胰腺活動(dòng)中起作用，并且該申請(qǐng)要求保護(hù)調(diào)節(jié)胰腺活動(dòng)或刺激生長激素產(chǎn)生的方法，所述方法涉及所公開的肽的使用。
WO92/15015公開了編碼人類甘丙肽的DNA和鑒定甘丙肽的拮抗劑的方法。
WO97/26853、US2003/0129702、US2003/0215823和US6,586,191中公開了編碼GALR2(第二甘丙肽受體亞型)的GALR2 cDNA的分離和鑒定特異性結(jié)合GALR2的化合物的方法。在上述文獻(xiàn)中提及GALR2拮抗劑可能在阿爾茨海默病的治療中有效果。但在上述文獻(xiàn)中沒有公開基于化合物是否為GALR2激動(dòng)劑而篩選可用于腦部損傷預(yù)防或治療的化合物的方法。
Crawley(1996)Life Sci.582185-2199是一篇總結(jié)當(dāng)時(shí)甘丙肽作用的知識(shí)的綜述文獻(xiàn)。它表明在大鼠體內(nèi)中樞給藥的甘丙肽會(huì)造成學(xué)習(xí)和記憶能力降低，并且甘丙肽拮抗劑的使用可能在阿爾茨海默病的治療中有效。該文獻(xiàn)沒有提及甘丙肽激動(dòng)劑在治療阿爾茨海默病中的用途。
Liu et al.(1994)J.Neurotrauma 1173-82中描述了在大鼠心室內(nèi)注射甘丙肽對(duì)其中樞液壓沖擊引起的創(chuàng)傷性腦損傷(TBI)程度的影響，并且發(fā)現(xiàn)經(jīng)甘丙肽處理的大鼠在各種感覺運(yùn)動(dòng)能力上明顯增強(qiáng)。該文獻(xiàn)把這些影響歸結(jié)為甘丙肽的神經(jīng)調(diào)制作用，該神經(jīng)調(diào)制作用減少例如谷氨酸的興奮性氨基酸的釋放。然而，在甘丙肽處理組和未處理組的大鼠之間進(jìn)行的記憶測試(Morris水迷宮測試)并沒有發(fā)現(xiàn)二者有差異。
Luo et al.(1995)Neuropeptide 28161-166的研究檢驗(yàn)了銳器切割(acute section)坐骨神經(jīng)對(duì)大腦切除小鼠、僅存脊髓小鼠(spinalised)、未麻醉小鼠的屈肌反射興奮性的影響，并以此作為慢性疼痛狀態(tài)發(fā)展的量度。它發(fā)現(xiàn)甘丙肽可用于抑制疼痛反應(yīng)。在該文獻(xiàn)中沒有提及使用GALR2激動(dòng)劑來預(yù)防或治療腦部損傷、損害或疾病。
EP-A-0918455公開了在缺乏甘丙肽基因小鼠體內(nèi)，擠壓傷的康復(fù)(坐骨神經(jīng)感覺軸突再生能力的指標(biāo))、發(fā)育中的神經(jīng)存活和長時(shí)程增強(qiáng)效應(yīng)(LTP)都比野生型小鼠要弱。由這些結(jié)果推斷甘丙肽激動(dòng)劑可能適用于修復(fù)神經(jīng)損害的藥劑的制備。該文獻(xiàn)還提及甘丙肽激動(dòng)劑可用于阿爾茨海默病及相關(guān)記憶喪失的治療。但是沒有提及甘丙肽受體亞型介導(dǎo)這些效果，也沒有提及甘丙肽激動(dòng)劑在保護(hù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)免于除阿爾茨海默病之外的損傷、損害或疾病方面的效果。
此外，上述專利申請(qǐng)和EP-A-1342410都描述了例如缺乏甘丙肽基因的基因工程哺乳動(dòng)物，尤其是小鼠。
WO02/096934公開了可用于治療例如發(fā)生于癲癇的抽搐發(fā)作的一系列甘丙肽激動(dòng)劑化合物。該文獻(xiàn)提及這些化合物可用于CNS損傷或在心臟直視手術(shù)中防止缺氧損害。然而卻沒有證據(jù)支持這一結(jié)論，因?yàn)閃O02/096934中包括的所有試驗(yàn)結(jié)果都是關(guān)于抽搐發(fā)作治療的。該申請(qǐng)的發(fā)明人的研究小組隨后部分發(fā)表了關(guān)于這些化合物中的一個(gè)的信息，該化合物命名為“galnon”(Wu et al.(2003)Eur.J.Pharmacol.482133-137)。galnon激活GALRl和GALR2，并對(duì)它們具有相等的激活活性。此外，最近的研究顯示這一化合物還可以激活包括神經(jīng)降壓肽受體的許多其他GPCR受體(abstract Wang et al.，F(xiàn)unctionalactivity of galanin peptide analogues.Program No.960.4 2004Abstract Viewer/Itinerary Planner.Washington DCSociety forNeuroscience，2004.Online.(http//sfn.scholarone.com/itin2004/index.html))。因此galnon在甘丙肽受體的激活方面并不是特異性的，也不是GALR2特異性激動(dòng)劑。該專利申請(qǐng)WO02/096934要求保護(hù)galnon在疼痛、癲癇的治療中的用途，但是關(guān)于這類化合物在腦部損傷、創(chuàng)傷或疾病的治療中的用途方面并沒有要求保護(hù)。
Saar et al.(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.997136-7141、Zachariou et al.(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1009028-9033和Abramov et al.(2003)Neuropeptides 3855-61分別討論了galnon在癲癇、鴉片成癮和服用研究中的用途。
甘丙肽受體鑒定了三種G蛋白偶聯(lián)的甘丙肽受體亞型GALR1、GALR2和GALR3(Habert-Ortoli et al.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 919780-9783；Burgevin et al.(1995)J.Mol.Neurosci.633-41；Howard et al.(1997)FEBS Letts.405285-290；Smith et al.(1997)J.Biol.Chem.27224612-24616；Wang et al.(1997a)Mol.Pharmacol.52337-343；Wang et al.(1997b)J.Biol.Chem.27231949-31953；Ahmad et al.(1998)Ann.N.Y.Acad.Sci.863108-119；Bloomquist et al.(1998)Biophys.Res.Commun.243474-479；Kolakowski et al.(1998)J.Neurochem.712239-2251；Smith etal.(1998)J.Biol.Chem.27323321-23326)。甘丙肽與GALR1和GALR3的結(jié)合表明通過與抑制性的G1蛋白偶聯(lián)而抑制腺苷酸環(huán)化酶(Wang，1998；Habert-Ortoli，1994；Smith，1998)。相反地，GALR2的激活通過與Gq/11偶聯(lián)而刺激磷脂酶C和蛋白激酶C的活性(Fathi，1997；Howard，1997；Wang，1997a；Wittau et al.(2000)Oncogene194199-4209)，由此激活細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)級(jí)聯(lián)反應(yīng)。GALR1和GALR3與腺苷酸環(huán)化酶的消極偶聯(lián)預(yù)計(jì)可對(duì)神經(jīng)損傷或疾病后的神經(jīng)功能起抑制作用。所以，這預(yù)計(jì)會(huì)在行為上有消極的和有害的影響，并且抑制或延緩損傷或疾病后的恢復(fù)。而且，GALR1和GALR3在心臟和消化道中均有表達(dá)，GALR1還表達(dá)于肺和膀胱。
由于受體亞型特異性抗血清的缺乏和受體亞型特異性甘丙肽配體資料的缺乏，所以每個(gè)受體的功能作用的分析仍然受到阻礙。這一領(lǐng)域一個(gè)主要的進(jìn)展是發(fā)現(xiàn)了甘丙肽2-11肽(命名為AR-M1896)優(yōu)先結(jié)合GALR2的特異性比結(jié)合GALR1高500倍，并且它幾乎完全喪失了對(duì)GALR1的激活活性(Liu et al.(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 989960-9964；Berger et al.(2004)Endocrinology 145500-507)。沒有發(fā)表過AR-M1896是否結(jié)合或激活GALR3的數(shù)據(jù)。AR-M1896以前被用于證實(shí)了GALR2的激活似乎是甘丙肽刺激神經(jīng)突從周圍神經(jīng)系統(tǒng)的成熟感覺神經(jīng)元向外生長的主要機(jī)制(Mahoney，2003)。甘丙肽1-15肽和甘丙肽1-16肽也已知是可以激活甘丙肽受體的全長甘丙肽神經(jīng)肽中的一部分。
在通篇說明書中使用的術(shù)語“GALR”表示受體GALR1、GALR2和GALR3中的一個(gè)受體。該受體包括但不限于人、大鼠和小鼠的受體。所述受體也可以是嵌合型的(即包括來源于不同種的GALR序列)、截短型的(即比天然GALR序列短)或延長型的(即包括了天然GALR序列以外的附加序列)。受體的激活可以通過例如細(xì)胞外鈣水平的提高來鑒定。
在通篇說明書中使用的術(shù)語“GALR2特異性激動(dòng)劑”表示一種能夠激活GALR2而導(dǎo)致在細(xì)胞中引發(fā)反應(yīng)的物質(zhì)，但是該物質(zhì)不激活(或以較低的活性激活)GALR1和/或GALR3。鑒定一種化合物是否為甘丙肽受體激動(dòng)劑的方法為本領(lǐng)域所熟知，例如可參見于Botella et al.(1995)Gastroenterology 1083-11和Barblivien et al.(1995)Neuroreport 61849-1852。與結(jié)合和激活GALR1相比，GALR2特異性激動(dòng)劑優(yōu)先結(jié)合和激活GALR2的選擇性至少為30倍以上，優(yōu)選地選擇性較GALR1高50倍以上，更優(yōu)選地選擇性較GALR1高100倍以上。與結(jié)合和激活GALR3相比，GALR2特異性激動(dòng)劑優(yōu)先結(jié)合和激活GALR2的選擇性也至少為30倍以上，優(yōu)選地選擇性較GALR3高50倍以上，更優(yōu)選地選擇性較GALR3高100倍以上。

發(fā)明內(nèi)容
根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供GALR2特異性激動(dòng)劑在制備用于預(yù)防或治療腦部損害、損傷或疾病的藥劑中的用途。
使用GALR2特異性激動(dòng)劑可以有利地預(yù)防腦部損害、損傷或疾病，或者改善受上述腦部損害、損傷或疾病侵害的個(gè)體的狀況，這是由于甘丙肽和甘丙肽激動(dòng)劑能夠減少在上述情況下的細(xì)胞死亡。甘丙肽還可作為海馬的內(nèi)源性神經(jīng)保護(hù)因子。由于三種GALR受體每一個(gè)利用不同的信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，所以不激活GALR1和/或GALR3的GALR2特異性激動(dòng)劑有利于治療腦部損傷或疾病，同時(shí)使因激活GALR1或GALR3而產(chǎn)生有害的周圍副作用最小化。
腦部損傷或損害可由下述之一的原因引發(fā)栓塞性、血栓性或出血性中風(fēng)；對(duì)腦部或脊髓的直接或間接創(chuàng)傷或手術(shù)；在心肺旁路手術(shù)或腎透析過程中的腦部缺血性或栓塞性損害；心肌梗塞后的再灌注腦部損害；腦部疾??；免疫學(xué)損害、化學(xué)損害或輻射損害。免疫學(xué)損害可能是由細(xì)菌或病毒感染引起。化學(xué)損害可能是由過量飲酒或給予腫瘤治療的化療藥劑引起。輻射損害可能是由腫瘤治療的放療引起。
腦部疾病優(yōu)選為阿爾茨海默病、帕金森病、多發(fā)性硬化或可變型克雅病。
GALR2特異性激動(dòng)劑可以是包括一部分甘丙肽氨基酸序列的多肽，并且優(yōu)選為AR-M1896。
或者，GALR2特異性激動(dòng)劑可以是非肽類的小分子化學(xué)個(gè)體。
GALR2特異性激動(dòng)劑對(duì)GALR2的結(jié)合親和力為0至100μM，優(yōu)選0至1μM，并且對(duì)GALR2的結(jié)合特異性比對(duì)GALR1的結(jié)合特異性強(qiáng)30倍以上，優(yōu)選強(qiáng)50倍以上，最優(yōu)選強(qiáng)100倍以上。同樣，GALR2特異性激動(dòng)劑對(duì)GALR2的結(jié)合特異性比對(duì)GALR3的結(jié)合特異性強(qiáng)30倍以上，優(yōu)選強(qiáng)50倍以上，最優(yōu)選強(qiáng)100倍以上。
根據(jù)本發(fā)明的第二方面，提供一種預(yù)防或治療腦部損傷、損害或疾病的方法，所述方法包括對(duì)需要這種預(yù)防或治療的個(gè)體給予有效量的GALR2特異性激動(dòng)劑，優(yōu)選的個(gè)體為人類個(gè)體。
腦部損傷或損害可由下述之一的原因引發(fā)栓塞性、血栓性或出血性中風(fēng)；對(duì)腦部或脊髓的直接或間接創(chuàng)傷或手術(shù)；在心肺旁路手術(shù)或腎透析過程中的腦部缺血性或栓塞性損害；心肌梗塞后的再灌注腦部損害；腦部疾??；免疫學(xué)損害、化學(xué)損害或輻射損害。免疫學(xué)損害可能是由細(xì)菌或病毒感染引起?；瘜W(xué)損害可能是由過量飲酒或給予腫瘤治療的化療藥劑引起。輻射損害可能是由腫瘤治療的放療引起。
腦部疾病優(yōu)選為阿爾茨海默病、帕金森病、多發(fā)性硬化或可變型克雅病。
GALR2特異性激動(dòng)劑可以是包括一部分甘丙肽氨基酸序列的多肽，并且優(yōu)選為AR-M1896。
或者，GALR2特異性激動(dòng)劑可以是非肽類的小分子化學(xué)個(gè)體。
GALR2特異性激動(dòng)劑對(duì)GALR2的結(jié)合親和力為0至100μM，優(yōu)選0至1μM，并且對(duì)GALR2的結(jié)合特異性比對(duì)GALR1的結(jié)合特異性強(qiáng)30倍以上，優(yōu)選強(qiáng)50倍以上，最優(yōu)選強(qiáng)100倍以上。同樣，GALR2特異性激動(dòng)劑對(duì)GALR2的結(jié)合特異性比對(duì)GALR3的結(jié)合特異性強(qiáng)30倍以上，優(yōu)選強(qiáng)50倍以上，最優(yōu)選強(qiáng)100倍以上。
根據(jù)本發(fā)明的第三方面，提供一種篩選修復(fù)預(yù)防或治療腦部損傷或損害的候選化合物的方法，所述方法包括測定至少一種待測化合物是否為GALR2特異性激動(dòng)劑，以及如果它是GALR2特異性激動(dòng)劑，則選擇這至少一種待測化合物作為候選化合物。
測定發(fā)現(xiàn)這至少一種待測化合物可以0至100μM(優(yōu)選0至1μM)的結(jié)合親和力結(jié)合GALR2。待測化合物結(jié)合GALR2的選擇性比它對(duì)GALR1的選擇性強(qiáng)30倍以上，優(yōu)選強(qiáng)50倍以上，最優(yōu)選強(qiáng)100倍以上。優(yōu)選地，該待測化合物結(jié)合GALR2的選擇性比它對(duì)GALR3的選擇性強(qiáng)30倍以上，優(yōu)選強(qiáng)50倍以上，最優(yōu)選強(qiáng)100倍以上。
GALR2可包括至少一部分人類GALR2，或可為全長的人類GALR2。
GALR2可包括至少一部分非人類GALR2，優(yōu)選大鼠或小鼠的GALR2，或可為全長的GALR2。
GALR2可為嵌合受體構(gòu)建體。
使用根據(jù)本發(fā)明的這一方面的方法，待測化合物的篩選可在高通量篩選分析中篩選。
根據(jù)本發(fā)明的第四方面，提供用于預(yù)防或治療腦部損傷、損害或疾病的藥物組合物，所述組合物包括a)有效量的至少一種GALR2特異性激動(dòng)劑或其可藥用的鹽，以及b)藥物學(xué)上合適的佐劑、載體或賦形劑。
腦部損傷或損害可由下述之一的原因引發(fā)栓塞性、血栓性或出血性中風(fēng)；對(duì)腦部或脊髓的直接或間接創(chuàng)傷或手術(shù)；在心肺旁路手術(shù)或腎透析過程中的腦部缺血性或栓塞性損害；心肌梗塞后的再灌注腦部損害；腦部疾病；免疫學(xué)損害、化學(xué)損害或輻射損害。免疫學(xué)損害可能是由細(xì)菌或病毒感染引起?；瘜W(xué)損害可能是由過量飲酒或給予腫瘤治療的化療藥劑引起。輻射損害可能是由腫瘤治療的放療引起。
腦部疾病優(yōu)選為阿爾茨海默病、帕金森病、多發(fā)性硬化或可變型克雅病。
GALR2特異性激動(dòng)劑可以是包括一部分甘丙肽氨基酸序列的多肽，并且優(yōu)選為AR-M1896。
或者，GALR2特異性激動(dòng)劑可以是非肽類的小分子化學(xué)個(gè)體。
GALR2特異性激動(dòng)劑對(duì)GALR2的結(jié)合親和力為0至100μM，優(yōu)選0至1μM，并且對(duì)GALR2的結(jié)合特異性比對(duì)GALR1的結(jié)合特異性強(qiáng)30倍以上，優(yōu)選強(qiáng)50倍以上，最優(yōu)選強(qiáng)100倍以上。同樣，GALR2特異性激動(dòng)劑對(duì)GALR2的結(jié)合特異性比對(duì)GALR3的結(jié)合特異性強(qiáng)30倍以上，優(yōu)選強(qiáng)50倍以上，最優(yōu)選強(qiáng)100倍以上。
藥物學(xué)上合適的佐劑、載體或賦形劑可以選自離子交換劑，氧化鋁，硬脂酸鋁，磷脂酰膽堿，諸如人血清白蛋白的血清蛋白，諸如磷酸鹽的緩沖物質(zhì)，甘氨酸，山梨酸，山梨酸鉀，飽和植物脂肪酸的不完全甘油酯混合物，水，鹽或電解質(zhì)，例如魚精蛋白硫酸鹽，磷酸氫二鈉，磷酸氫鉀，氯化鈉，鋅鹽，硅膠，三硅酸鎂，聚乙烯吡咯烷酮，基于纖維素的物質(zhì)，聚乙二醇，羧甲基纖維素鈉，聚丙烯酸酯，蠟類，聚乙烯-聚氧丙烯-嵌段聚合物，聚乙二醇和羊毛脂。
該藥物組合物可以口服或腸胃外給藥，優(yōu)選以口服給藥。
當(dāng)該藥物組合物以口服給藥時(shí)，它可以為膠囊或藥片形式，并可以優(yōu)選包括乳糖和/或玉米淀粉。該藥物組合物還可包括潤滑劑，優(yōu)選硬脂酸鎂。該藥物組合物可以為水懸液或水溶液形式，還可以進(jìn)一步包括乳化劑和/或助懸劑。該藥物組合物可以包括甜味劑、香味劑和/或著色劑。
該藥物組合物也可以通過下述方式給藥注射、使用無針裝置、吸入噴霧劑、局部給藥、直腸給藥、鼻部給藥、口頰給藥、陰道給藥或通過植入的容器給藥。
當(dāng)該藥物組合物以注射或無針裝置給藥時(shí)，它可以為無菌的可注射制劑形式或適合通過無針裝置給藥的形式。該無菌的可注射制劑或適合通過無針裝置給藥的形式可以是水性或油性懸液，或是存在于無毒的適于腸胃外給藥的稀釋劑或溶劑中的懸液。水性懸液可以在甘露醇、水、林格氏液或等滲氯化鈉溶液中制備。油性懸液可以在合成單酰甘油、合成二酰甘油、脂肪酸或天然的可藥用的油中制備。脂肪酸可以是油酸或油酸甘油酯衍生物。天然的可藥用的油可以是橄欖油、蓖麻油，或是聚氧乙烯化的橄欖油或蓖麻油。油性懸液可以包括長鏈醇類稀釋劑或分散劑，優(yōu)選Ph.Helv。
當(dāng)該藥物組合物經(jīng)直腸給藥時(shí)，它可以是直腸給藥的栓劑形式。該栓劑可以包含在室溫下為固體而在直腸溫度下為液體的非刺激性賦形劑。該非刺激性賦形劑可為可可脂、蜂蠟或聚乙二醇中的一種。
當(dāng)該藥物組合物以局部方式給藥時(shí)，它可以是包括選自下列的載體的軟膏劑礦物油、液體石蠟(Liquid petroleum)、白礦脂(whitepetroleum)、丙二醇、聚氧乙烯-聚氧丙烯化合物、乳化蠟和水?；蛘咚梢允前ㄟx自下列載體的洗劑或霜?jiǎng)┑V物油、失水山梨醇單硬脂酸酯、聚山梨醇酯60、十六烷基酯蠟、鯨蠟硬脂醇(cetearyl alcohol)、2-辛基十二烷醇、苯甲醇和水。
當(dāng)該藥物組合物為鼻部給藥時(shí)，它可以以鼻部氣霧劑和/或吸入劑的方式給藥。
根據(jù)本發(fā)明的第五方面，提供一種抑制細(xì)胞死亡的方法，所述方法包括使細(xì)胞與有效抑制該細(xì)胞死亡的量的GALR2特異性激動(dòng)劑接觸。該細(xì)胞可以是神經(jīng)元，優(yōu)選中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元，優(yōu)選海馬或皮層神經(jīng)元。優(yōu)選地，該細(xì)胞為人類細(xì)胞。在本方法中，細(xì)胞的死亡因存在于細(xì)胞內(nèi)的GALR2的激活而被抑制。如果細(xì)胞死亡發(fā)生的概率降低和/或細(xì)胞的壽命延長，即為細(xì)胞的死亡被抑制。


本發(fā)明的實(shí)施方案以實(shí)施例的方式描述，并以附圖1-4為參考，其中圖1顯示的是腹膜內(nèi)給予20mg/kg紅藻氨酸鹽對(duì)體內(nèi)海馬細(xì)胞死亡的影響；
圖2顯示的是與10nM-1μM的十字孢堿(staurosporine，St)共培養(yǎng)之后甘丙肽基因敲除的、甘丙肽過表達(dá)的和野生型的海馬細(xì)胞體外培養(yǎng)物的反應(yīng)；圖3顯示的是共同給予十字孢堿或谷氨酸與甘丙肽或AR-M1896對(duì)甘丙肽野生型海馬細(xì)胞體外培養(yǎng)物的影響；以及圖4顯示的是甘丙肽基因敲除的、甘丙肽過表達(dá)的和野生型的動(dòng)物在MS的實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(Experimental AutoimmuneEncephalomyelitis，EAE)模型中的體內(nèi)反應(yīng)。
具體實(shí)施例方式
方法動(dòng)物所有動(dòng)物任意地喂食標(biāo)準(zhǔn)飼料和水。動(dòng)物的照料和手續(xù)按照英國內(nèi)政部(United Kingdom Home Office)的規(guī)定和指引進(jìn)行。
甘丙肽基因敲除小鼠有關(guān)品系和繁育過程的細(xì)節(jié)已有前人發(fā)表(Wynick et al.(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9512671-12676)。簡而言之，使用E14細(xì)胞系產(chǎn)生了在甘丙肽基因中靶向突變的小鼠純合體。用一個(gè)反向的PGK-Neo盒替換了外顯子1-5，并將突變體繁育至純合體，并保持在12901aHsd品系內(nèi)同系繁殖。在所有實(shí)驗(yàn)中均使用年齡和性別相當(dāng)?shù)囊吧屯麆?dòng)物作為對(duì)照。
甘丙肽過表達(dá)小鼠有關(guān)品種和繁育過程的細(xì)節(jié)已有前人發(fā)表(Bacon et al.(2002)Neuroreport 132129-2132)。簡而言之，甘丙肽過表達(dá)小鼠在CBA/B6F1雜交背景下產(chǎn)生。篩選小鼠129sv粘端質(zhì)?；蚪M文庫，并亞克隆了含有完整鼠類甘丙肽編碼區(qū)域和～20kb的上游序列的～25kb區(qū)域。轉(zhuǎn)基因通過限制性消化切除后被微注射至受精卵中，使其終濃度為5ng/μl。按照前面描述的方法(Bacon et al.(2002)Neuroreport 132129-2132)產(chǎn)生了四個(gè)甘丙肽過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因品系并用免疫細(xì)胞化學(xué)方法測定了在海馬中的甘丙肽的表達(dá)(見下文)。發(fā)現(xiàn)品系46與其他三個(gè)品系及野生型對(duì)照相比，在海馬的CA1和CA3區(qū)域和齒狀回中的甘丙肽表達(dá)量最高。所以在以后的所有實(shí)驗(yàn)中均使用品系46。
器官型海馬培養(yǎng)物按前人描述的方法(Elliott-Hunt et al.(2002)J.Neurochem.80416-425；Stoppini et al.(1991)J.Neurosci.Methods 37173-182)制備了器官型培養(yǎng)物。簡而言之，在解剖顯微鏡下迅速取出5-6日齡的小狗(pup)的海馬，并用McIlwain組織切片機(jī)(MickleLaboratory Engineering Co.Ltd.，Gomshall，UK)以400μm橫向切片。將切片置于微孔跨膜Biopore膜(Millipore，Poole，UK)上，在6孔培養(yǎng)板中、95％空氣和5％CO2、37℃條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)基為50％的含厄爾氏鹽(Earle’s Salts)(Gibco BRL)、不含L-谷氨酰胺的基本必須培養(yǎng)基、50％的漢克平衡鹽液(Gibco BRL)、25％的馬血清(熱滅活；Harlan Serum Labs，Loughborough，UK)、5mg/ml葡萄糖(SigmaChemical Co.，Poole，UK)和1ml谷氨酰胺(Sigma)。
原代神經(jīng)元培養(yǎng)物的制備分離2-3日齡的小狗的海馬，并置于4℃采集緩沖液中，采集緩沖液由在下述溶液中添加0.5％(v/v)牛血清白蛋白(BSA，ICNBiomedicals Inc.，Aurora，Ohio，USA)制備得到，所述溶液100ml中含有漢克平衡鹽液(無鈣、鎂)(Gibco BRL，Paisley，UK)，10％(v/v)N-2-羥乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸(HEPES)(ICN Biomedicals Inc.，Aurora，Ohio，USA)、50U/ml青霉素(Britannia Pharmaceuticals Ltd.，Redhill，Surrey，UK)、0.05mg/ml鏈霉素(Sigma Biomedical Company，Poole，Dorset，UK)。海馬神經(jīng)元的酶消化、分離和培養(yǎng)按前人描述的方法進(jìn)行(McManus & Brewer(1997)Neurosci.Lett.224193-196)。細(xì)胞計(jì)數(shù)后以4×104細(xì)胞/孔將細(xì)胞接種到D-L-多鳥氨酸包被的96孔板中。在24小時(shí)后加入10μg/ml的5’氟2’脫氧尿嘧啶(Sigma；抗有絲分裂試劑)。實(shí)驗(yàn)前在環(huán)境氧氣、5％CO2、37℃的條件下培養(yǎng)9天。第三天后更換培養(yǎng)基，然后每四天更換一次。
免疫組織化學(xué)在小鼠心內(nèi)灌注含4％多聚甲醛/磷酸鹽緩沖液(PBS)。將腦取出并在室溫下后固定4小時(shí)。將腦在20％蔗糖中4℃平衡過夜，并包埋于最適切割溫度(Optimal Cutting Temperature，OCT)化合封固劑(TissueTek Ltd.，Eastbourne，UK)中，在干冰上冷凍并恒冷切片(30μm切片)。將切片用含10％正常山羊血清、0.2％Triton X-100的PBS(PBST)在室溫封閉和透化1小時(shí)。將切片與在PBST中1∶1000稀釋的抗甘丙肽兔多克隆抗體在室溫下孵育過夜，用PBS洗滌三次，每次10分鐘，然后與1∶800稀釋的異硫氰酸熒光素(FITC)-山羊抗兔抗體(The JacksonLaboratory，Westgrove，PA，USA)在室溫下孵育3小時(shí)。洗滌后用VectashieldTM(Vector Laboratories Inc.，Burlington，CA，USA)封片。圖像的采集使用Leica熒光顯微鏡(Leica Microsystems，Milton Keynes，UK)和RT Color Spot照相機(jī)及Spot Advance圖像捕獲系統(tǒng)軟件(Diagnostic Instruments，Sterling Heights，MI，USA)。
還對(duì)分散型海馬神經(jīng)元和器官型培養(yǎng)物進(jìn)行了甘丙肽免疫組織化學(xué)分析，將上述分散海馬神經(jīng)元和器官型培養(yǎng)物在4％多聚甲醛中固定，用Triton X-100透化，然后按上述步驟進(jìn)行分析。
十字孢堿和谷氨酸誘導(dǎo)的海馬損害將14天的器官型海馬培養(yǎng)物置于0.1％BSA的無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)16小時(shí)，然后再與不同濃度的谷氨酸培養(yǎng)3小時(shí)或與不同濃度的十字孢堿培養(yǎng)9小時(shí)。十字孢堿和谷氨酸都已知會(huì)引起這類細(xì)胞培養(yǎng)物的興奮性中毒損害(Prehn et al.(1997)J.Neurochem.681679-1685；Ohmori et al.(1996)Brain Res.743109-115)。將培養(yǎng)物用無血清培養(yǎng)基洗滌，并在成像前再培養(yǎng)24小時(shí)。通過碘化丙錠存在條件下進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)觀察到在器官型培養(yǎng)物中有區(qū)域性神經(jīng)元損傷。在膜損傷后，染料進(jìn)入細(xì)胞，與核酸結(jié)合并累積，使細(xì)胞有明亮的熒光(Vornovet al.(1994)Stroke 25457-465)。在明視野圖像中可以清楚地看到CA1神經(jīng)元子區(qū)域。包含CA1區(qū)域的部分的神經(jīng)元損害使用NIHImage軟件(Scion Image，MD，USA)中的密度Slice函數(shù)進(jìn)行分析，從而確定高于背景的信號(hào)。測量了表現(xiàn)出不含染料碘化丙錠的子區(qū)域的面積，并用其所占明視野圖像測定的子區(qū)域的總面積的百分比表示。此外，使用密度Slice函數(shù)時(shí)為保持精密設(shè)置參數(shù)的一致性，閾值是針對(duì)暴露于10mM谷氨酸的培養(yǎng)物的陽性對(duì)照系列而設(shè)置。
將9天的原代海馬培養(yǎng)物暴露于十字孢堿24小時(shí)。使用存活/死亡試劑盒(Molecular Probes，Lieden，Netherlands)，通過對(duì)存活和死亡的神經(jīng)元進(jìn)行人工計(jì)數(shù)測量了神經(jīng)元的存活力。
處理將器官型和分散型原代海馬培養(yǎng)物培養(yǎng)不同的時(shí)間，培養(yǎng)中加入或不加入下列藥品十字孢堿(Sigma)、L-谷氨酸(Sigma)、甘丙肽(Bachem，Merseyside，UK)、高親和力GALR2特異性激動(dòng)劑AR-M1896[Gal(2-11)-Trp-Thr-Leu-Asn-Ser-Ala-Gly-Tyr-Leu-Leu-NH2](AstraZeneca，Montreal，Quebec，Canada)、淀粉狀蛋白-β(1-42)(Aβ(1-42))和反向Aβ(42-1)肽(American Peptide Company，Sunnyvale，CA93906)。在用于以下的實(shí)驗(yàn)之前，通過在培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)以誘導(dǎo)Aβ形成纖維。具體而言，將0.45mg的Aβ肽溶于20μl的二甲亞砜(DMSO-Sigma)中，在培養(yǎng)基中稀釋為100μM的儲(chǔ)存液，然后在緩慢振蕩條件下室溫培養(yǎng)24小時(shí)。
紅藻氨酸鹽誘導(dǎo)的海馬損傷向8周齡的雌性小鼠腹膜內(nèi)(i.p.)注射紅藻氨酸(20mg/kg)(Tocris Cookson，Bristol，UK)或賦形劑(PBS，1ml/kg)。如前人所述，紅藻氨酸已知可引起海馬損害(Beer et al.(1998)Brain Res.794255-256；Mazarati et al.(2000)J.Neurosci.166276-6281)。通過末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)熒光素-dUTP缺口末端標(biāo)記(TUNEL)方法測量海馬細(xì)胞的死亡。在注射紅藻氨酸或賦形劑后72小時(shí)處死動(dòng)物。在小鼠心內(nèi)灌注含4％多聚甲醛的PBS，將腦迅速取出后室溫下后固定4小時(shí)。將腦在20％蔗糖中4℃平衡過夜，并包埋于OCT封固劑中，在干冰上冷凍。在恒冷切片機(jī)上切片(16μm)，在明膠包被的載玻片上解凍封片，置于-80℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩Ｊ褂迷患?xì)胞檢測試劑盒(Boehringer，Berkshire，UK)評(píng)估了細(xì)胞凋亡。將每六張切片置于一個(gè)濕盒中，用甲醇封閉，triton(0.1％)和檸檬酸鈉(0.1％)透化，然后用熒光素dUTP在37℃標(biāo)記1小時(shí)。然后使切片與辣根過氧化物酶結(jié)合，用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)染色，用haemytoxin復(fù)染。除了標(biāo)記時(shí)不用熒光素dUTP以外，對(duì)照樣本也用同樣方法處理。洗滌后用VectashieldTM封片。細(xì)胞的可視化使用Leica熒光顯微鏡和RT ColorSpot照相機(jī)及Spot Advance圖像捕獲系統(tǒng)軟件(DiagnosticInstruments，Sterling Heights，MI，USA)。
EAE模型MS的標(biāo)準(zhǔn)EAE模型按照前人所述的方法(Radu et al.(2000)Int.Immunol.121553-60)使用。在小鼠的一只后腿使用總量為200μg的MBP1-9(AcASQKRPSQR，由Abimed，Langenfeld，Germany合成)進(jìn)行皮下免疫，MBP1-9用完全弗氏佐劑(Sigma)乳化，還添加了4mg/ml的結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteium tuberculosis)菌株H37RA(Difco，Detroit，MI)。結(jié)核分枝桿菌純化蛋白衍生物從英國中央獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室(UK Central Veterinary Laboratory)(Weybridge，UK)獲得。按照下述指標(biāo)對(duì)小鼠的EAE癥狀進(jìn)行分級(jí)0無癥狀；1尾部無力；2局部后肢麻痹和/或翻正反射受損；3全部后肢麻痹；4后肢加前肢麻痹；5垂死或死亡。
統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)表示為平均值+SEM。使用Student’s t檢驗(yàn)分析了組內(nèi)十字孢堿濃度的差異。因此適當(dāng)?shù)厥褂肁NOVA或非參數(shù)曼-惠特尼U事后檢驗(yàn)來分析基因型和不同配體之間和/或十字孢堿和谷氨酸之間的數(shù)據(jù)點(diǎn)的差異。小于0.05的P值被認(rèn)為是顯著的。
候選化合物篩選方法經(jīng)轉(zhuǎn)染并穩(wěn)定表達(dá)編碼人類GALR1、GALR2或GALR3的cDNA的CHO細(xì)胞從Euroscreen(Brussels，Belgium)獲得。細(xì)胞在Nutrient Mix(HAMS)F12(Gibco BRL，Paisley，UK)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)基中添加10％胎牛血清(Gibco BRL)和0.4mg/ml的G418(Sigma)，將細(xì)胞置于3層培養(yǎng)瓶中于37℃、5％CO2/95％空氣條件下培養(yǎng)。細(xì)胞生長至80％會(huì)合時(shí)在含0.02％EDTA的D-PBS中在37℃分離10分鐘。在實(shí)驗(yàn)當(dāng)天將細(xì)胞以1000rpm離心5分鐘收集，然后在培養(yǎng)基中重懸至所需密度。使用FLIPR384(Molecular Devices Ltd，Wokingham，UK)來測量加入不同化合物后的細(xì)胞反應(yīng)。將細(xì)胞以密度2×104細(xì)胞/30μl重懸于培養(yǎng)基中，并轉(zhuǎn)移至384孔黑色/透明Greiner培養(yǎng)板中(30μl/孔)，于37℃、5％CO2/95％潮濕空氣條件下培養(yǎng)2小時(shí)。每孔加入30μlFluo-4-AM(在分析緩沖液中濃度為4μM，含0.8％多聚醇F-127和1％FBS)對(duì)細(xì)胞染色，并于37℃、5％CO2/95％潮濕空氣條件下培養(yǎng)1小時(shí)。將細(xì)胞用EMBLA培養(yǎng)板洗滌器洗滌(4×80μl)，洗滌液為FLIPR分析緩沖液(無鈣、鎂的HBSS，添加20mM Hepes、1mM MgCl2、2mM CaCl2、2.5mM 4-(二丙基氨磺?；?苯甲酸和0.1％BSA)，這樣在洗滌后每孔中剩余45μl。
使用FLIPR384來測量細(xì)胞對(duì)化合物的反應(yīng)。在加入化合物(5μl；終濃度10μM)之前10秒鐘每秒鐘記錄一次基礎(chǔ)熒光，加入化合物后每秒鐘記錄一次熒光，記錄60次，然后每6秒記錄一次，記錄20次。數(shù)據(jù)按照相對(duì)熒光單位(relative fluorescence units，RFU)記錄，并對(duì)3分鐘內(nèi)輸出的統(tǒng)計(jì)記錄的最大RFU進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)分析使用XLFit3.0。所有數(shù)據(jù)在丟棄之前都使用相關(guān)質(zhì)量控制程序進(jìn)行處理。計(jì)算了每種化合物對(duì)每種GALR表達(dá)細(xì)胞系的EC50，并從這些數(shù)據(jù)中鑒定了GALR2特異性激動(dòng)劑。
結(jié)果實(shí)驗(yàn)1如前人所述(Beer，1998；Mazarati，2000；Tooyama et al.(2002)Epilepsia 43 Suppl 939-43)用腹膜內(nèi)注射20mg/kg的紅藻氨酸誘導(dǎo)興奮性毒性海馬損害。三天之后取腦并通過TUNEL陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)來評(píng)估海馬細(xì)胞死亡。結(jié)果顯示于圖1。甘丙肽基因敲除的動(dòng)物(KO)與相應(yīng)品系的野生型(WT)對(duì)照相比，在CA1和CA3區(qū)域的凋亡神經(jīng)元的數(shù)量顯著提高(圖1)，分別提高了62.9％和44.8％(**p＜0.01，***p＜0.001)。相反地，甘丙肽過表達(dá)的動(dòng)物(OE)與相應(yīng)品系的野生型(WT)對(duì)照相比，在CA1和CA3區(qū)域的細(xì)胞死亡的程度顯著降低(圖1)，分別降低了55.6％和50.4％(p＜0.05)。
實(shí)驗(yàn)2為在一個(gè)更易于處理的體外系統(tǒng)中進(jìn)一步分析甘丙肽的神經(jīng)保護(hù)作用，使用了原代分散型和器官型海馬培養(yǎng)物(Elliott-Hunt，2002)。這兩種技術(shù)是互為補(bǔ)充，因?yàn)榉稚⑿秃ｑR培養(yǎng)物可以確保觀察到的結(jié)果是神經(jīng)元特異性的，而器官型培養(yǎng)物保留了神經(jīng)回路的突觸和解剖學(xué)結(jié)構(gòu)(Elliott-Hunt，2002)，還保留了很多在體內(nèi)的功能性特征(Adamschik，et al.(2000)Brain Res.Prot.5153-158)。研究了十字孢堿及谷氨酸在海馬培養(yǎng)物中對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞死亡的影響(Prehn，1997；Ohmori，1996)。用碘化丙錠染色使細(xì)胞的死亡可視化。結(jié)果表示為表達(dá)熒光的面積占未處理的“對(duì)照組”培養(yǎng)物的百分比。1μM和100nM的十字孢堿在野生型(WT)和甘丙肽基因敲除(KO)的培養(yǎng)物中都造成了顯著而穩(wěn)定水平的神經(jīng)毒性。如圖2A所示，甘丙肽基因敲除的動(dòng)物在兩種劑量時(shí)細(xì)胞死亡百分比均比野生型對(duì)照顯著提高(1μM68±0.5％對(duì)38±8％；100nM65±10％對(duì)40±26％；n＝4，p＜0.05)。類似地，也記錄到甘丙肽基因敲除器官型培養(yǎng)物與野生型對(duì)照相比，在暴露于4mM谷氨酸9小時(shí)后，其細(xì)胞死亡明顯和顯著地超過野生型(85±8.6％對(duì)61±9.3％；n＝4，p＜0.05)。
為保證上述結(jié)果是神經(jīng)元特異性的，還研究了十字孢堿對(duì)分散型原代海馬神經(jīng)元的影響。在10nM-1μM的十字孢堿濃度范圍內(nèi)，同樣觀察到甘丙肽基因敲除培養(yǎng)物中的細(xì)胞死亡明顯超過野生型對(duì)照(n＝4，p＜0.01)(圖2B)。
實(shí)驗(yàn)3已證實(shí)甘丙肽的缺失提高了海馬細(xì)胞死亡的敏感性，還進(jìn)一步對(duì)甘丙肽過表達(dá)小鼠進(jìn)行了研究。在暴露于50nM或100nM的十字孢堿后，在甘丙肽過表達(dá)動(dòng)物(OE)中觀察到的細(xì)胞死亡比相應(yīng)品系的野生型對(duì)照(WT)顯著降低(圖2C；n＝4，**p＜0.01，***p＜0.001)。
實(shí)驗(yàn)4為測試外源性的甘丙肽是否能保護(hù)野生型海馬神經(jīng)元免受損害，將100mM甘丙肽與100nM十字孢堿共同給予野生型器官型培養(yǎng)物。這種共同給予對(duì)這些培養(yǎng)物提供了顯著的神經(jīng)保護(hù)(n＝4，p＜0.05)(圖3A)。類似地，甘丙肽在以10nM-1μM范圍與4mM谷氨酸共同給予野生型器官型培養(yǎng)物時(shí)也具有保護(hù)性(圖3B)。與使用器官性培養(yǎng)物時(shí)的發(fā)現(xiàn)相一致，100nM甘丙肽也可以保護(hù)野生型分散原代海馬神經(jīng)元免受10nM十字孢堿誘導(dǎo)的損害(圖3C；n＝3，p＜0.05)。
實(shí)驗(yàn)5甘丙肽在海馬中的神經(jīng)保護(hù)效果似乎是由三種G-蛋白偶聯(lián)甘丙肽受體亞型(GALR1、GALR2和GALR3)中的一種或多種的激活而介導(dǎo)的。前人曾報(bào)道過GALR2的激活似乎是甘丙肽刺激神經(jīng)突從成熟感覺神經(jīng)元生長的主要機(jī)制(Mahoney，2003)。因此也測試了100nM的AR-M1896(一種高親和力GALR2特異性激動(dòng)劑)與100nM十字孢堿共同給予野生型動(dòng)物器官型培養(yǎng)物的效果。應(yīng)該注意到盡管AR-M1896確實(shí)可以微弱地激活GALR1，但在100nM的情況下也不太可能發(fā)生，因?yàn)镚ALR1的IC50是879nM。AR-M1896在野生型器官型培養(yǎng)物中顯著地減少細(xì)胞死亡的量，細(xì)胞死亡的減少量相當(dāng)于等摩爾濃度的甘丙肽造成的效果(p＜0.05，圖3A)。如同在野生型器官型培養(yǎng)物中觀察到的一樣，AR-M1896的加入在甘丙肽基因敲除培養(yǎng)物中也有效地減少十字孢堿誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡(數(shù)據(jù)未示出)。還使用AR-M1896和十字孢堿處理分散型原代海馬神經(jīng)元，證實(shí)了該肽與全長甘丙肽有相近的保護(hù)效果(圖3C)。在沒有十字孢堿的器官型或原代培養(yǎng)物中沒有記錄到甘丙肽或AR-M1896的明顯效果。
實(shí)驗(yàn)6AD的疾病進(jìn)程與淀粉狀蛋白β纖維在腦部沉積而形成老年斑有關(guān)，老年斑由被α-分泌酶從淀粉狀蛋白前體蛋白切割而產(chǎn)生的肽組成(Gamblin et al.(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.10010032-10037)。纖維狀淀粉狀蛋白β的沉積被認(rèn)為是AD的神經(jīng)病理學(xué)上的起因。為測試外源性甘丙肽是否能夠?qū)w維狀A(yù)β誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性起保護(hù)作用，從甘丙肽基因敲除、甘丙肽過表達(dá)和相應(yīng)品系的野生型對(duì)照的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中取得14日齡的海馬器官型培養(yǎng)物。這些培養(yǎng)物用10μM的纖維狀A(yù)β(1-42)、反向?qū)φ针腁β(42-1)處理最高達(dá)72小時(shí)，并設(shè)不加入肽的組。10μM的纖維狀A(yù)β(1-42)的使用如前人所述(Zheng et al.(2002)Neuroscience 115201-211)。實(shí)驗(yàn)分三份平行進(jìn)行并如上述的方法使用碘化丙錠熒光(PIF)強(qiáng)度來測量細(xì)胞死亡。圖象的捕獲和分析使用Scion Image分析軟件。結(jié)果證實(shí)甘丙肽基因敲除小鼠中纖維狀A(yù)β(1-42)誘導(dǎo)的海馬細(xì)胞死亡數(shù)量在統(tǒng)計(jì)學(xué)上高于野生型對(duì)照。相反地，記錄到甘丙肽過表達(dá)小鼠中纖維狀A(yù)β(1-42)誘導(dǎo)的海馬細(xì)胞死亡數(shù)量顯著低于野生型對(duì)照。
實(shí)驗(yàn)7使用上述如前人所述的EAE模型，在甘丙肽基因敲除、甘丙肽過表達(dá)和相應(yīng)品系的野生型對(duì)照轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中誘導(dǎo)了MS表型。圖4A顯示，甘丙肽基因敲除動(dòng)物與相應(yīng)品系的野生型對(duì)照相比，其疾病形式發(fā)展得更快和更嚴(yán)重(N＝5，P＜0.01)。相反地，甘丙肽過表達(dá)小鼠與相應(yīng)品系的野生型對(duì)照明顯相反，它們未表現(xiàn)出任何疾病癥狀(圖4B；N＝5，P＜0.01)。這些數(shù)據(jù)再一次證實(shí)甘丙肽在中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)損傷的炎癥模型中起到保護(hù)作用。
總結(jié)在許多體內(nèi)和體外損傷模型中證實(shí)了甘丙肽作為海馬的內(nèi)源性保護(hù)因子。而且外源性甘丙肽和前述的高親和力GALR2特異性激動(dòng)劑都可以減少細(xì)胞死亡。因此，GALR2是介導(dǎo)上述保護(hù)性效果的主要受體亞型。上述數(shù)據(jù)說明GALR2特異性激動(dòng)劑可以在不同類型的腦部損傷、損害或疾病的治療或預(yù)防中具有治療用途。
權(quán)利要求
1.GALR2特異性激動(dòng)劑在用于預(yù)防或治療腦部損傷、損害或疾病的藥劑的制備中的用途。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的用途，其中所述腦部損傷或損害由下列之一的原因引起栓塞性、血栓性或出血性中風(fēng)；對(duì)腦部或脊髓的直接或間接創(chuàng)傷或手術(shù)；在心肺旁路手術(shù)或腎透析過程中的腦部缺血性或栓塞性損害；心肌梗塞后的再灌注腦部損害；腦部疾病；免疫學(xué)損害、化學(xué)損害或輻射損害。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的用途，其中所述免疫學(xué)損害是由細(xì)菌或病毒感染引起。
4.根據(jù)權(quán)利要求2的用途，其中所述化學(xué)損害是由過量飲酒或給予腫瘤治療的化療藥劑引起。
5.根據(jù)權(quán)利要求2的用途，其中所述輻射損害是由放療引起。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2的用途，其中所述腦部疾病為阿爾茨海默病、帕金森病、多發(fā)性硬化或可變型克雅病中的一種。
7.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的用途，其中所述GALR2特異性激動(dòng)劑為包括一部分甘丙肽氨基酸序列的多肽。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的用途，其中所述GALR2特異性激動(dòng)劑為AR-M1896。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)的用途，其中所述GALR2特異性激動(dòng)劑為非肽類的小分子化學(xué)個(gè)體。
10.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的用途，其中所述GALR2特異性激動(dòng)劑對(duì)GALR2的結(jié)合親和力為0至100μM，并且對(duì)GALR2的結(jié)合特異性比對(duì)GALR1的結(jié)合特異性強(qiáng)30倍以上。
11.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的用途，其中所述GALR2特異性激動(dòng)劑對(duì)GALR2的結(jié)合親和力為0至100μM，并且對(duì)GALR2的結(jié)合特異性比對(duì)GALR1的結(jié)合特異性強(qiáng)50倍以上。
12.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的用途，其中所述GALR2特異性激動(dòng)劑對(duì)GALR2的結(jié)合親和力為0至100μM，并且對(duì)GALR2的結(jié)合特異性比對(duì)GALR1的結(jié)合特異性強(qiáng)100倍以上。
13.根據(jù)權(quán)利要求10-12任一項(xiàng)的用途，其中所述GALR2特異性激動(dòng)劑對(duì)GALR2的結(jié)合特異性比對(duì)GALR3的結(jié)合特異性強(qiáng)30倍以上。
14.根據(jù)權(quán)利要求10-12任一項(xiàng)的用途，其中所述GALR2特異性激動(dòng)劑對(duì)GALR2的結(jié)合特異性比對(duì)GALR3的結(jié)合特異性強(qiáng)50倍以上。
15.根據(jù)權(quán)利要求10-12任一項(xiàng)的用途，其中所述GALR2特異性激動(dòng)劑對(duì)GALR2的結(jié)合特異性比對(duì)GALR3的結(jié)合特異性強(qiáng)100倍以上。
16.根據(jù)權(quán)利要求10-15任一項(xiàng)的用途，其中所述GALR2特異性激動(dòng)劑對(duì)GALR2的結(jié)合親和力為0至1μM。
17.一種預(yù)防或治療腦部損傷、損害或疾病的方法，包括對(duì)需要這種預(yù)防或治療的個(gè)體給予有效量的GALR2特異性激動(dòng)劑。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中所述腦部損傷或損害由下列之一的原因引起栓塞性、血栓性或出血性中風(fēng)；對(duì)腦部或脊髓的直接或間接創(chuàng)傷或手術(shù)；在心肺旁路手術(shù)或腎透析過程中的腦部缺血性或栓塞性損害；心肌梗塞后的再灌注腦部損害；腦部疾病；免疫學(xué)損害、化學(xué)損害或輻射損害。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中所述免疫學(xué)損害是由細(xì)菌或病毒感染引起。
20.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中所述化學(xué)損害是由過量飲酒或給予腫瘤治療的化療藥劑引起。
21.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中所述輻射損害是由放療引起。
22.根據(jù)權(quán)利要求17或18的方法，其中所述腦部疾病為阿爾茨海默病、帕金森病、多發(fā)性硬化或可變型克雅病中的一種。
23.根據(jù)權(quán)利要求17-22任一項(xiàng)的方法，其中所述GALR2特異性激動(dòng)劑為包括一部分甘丙肽氨基酸序列的多肽。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其中所述GALR2特異性激動(dòng)劑為AR-M1896。
25.根據(jù)權(quán)利要求17-22任一項(xiàng)的方法，其中所述GALR2特異性激動(dòng)劑為非肽類的小分子化學(xué)個(gè)體。
26.根據(jù)權(quán)利要求17-25任一項(xiàng)的方法，其中所述GALR2特異性激動(dòng)劑對(duì)GALR2的結(jié)合親和力為0至100μM，并且對(duì)GALR2的結(jié)合親和力比對(duì)GALR1的結(jié)合親和力強(qiáng)30倍以上。
27.根據(jù)權(quán)利要求17-26任一項(xiàng)的方法，其中所述GALR2特異性激動(dòng)劑對(duì)GALR2的結(jié)合親和力為0至100μM，并且對(duì)GALR2的結(jié)合親和力比對(duì)GALR1的結(jié)合親和力強(qiáng)50倍以上。
28.根據(jù)權(quán)利要求17-27任一項(xiàng)的方法，其中所述GALR2特異性激動(dòng)劑對(duì)GALR2的結(jié)合親和力為0至100μM，并且對(duì)GALR2的結(jié)合親和力比對(duì)GALR1的結(jié)合親和力強(qiáng)100倍以上。
29.根據(jù)權(quán)利要求26-28任一項(xiàng)的方法，其中所述GALR2特異性激動(dòng)劑對(duì)GALR2的結(jié)合親和力比對(duì)GALR3的結(jié)合親和力強(qiáng)30倍以上。
30.根據(jù)權(quán)利要求26-29任一項(xiàng)的方法，其中所述GALR2特異性激動(dòng)劑對(duì)GALR2的結(jié)合親和力比對(duì)GALR3的結(jié)合親和力強(qiáng)50倍以上。
31.根據(jù)權(quán)利要求26-30任一項(xiàng)的方法，其中所述GALR2特異性激動(dòng)劑對(duì)GALR2的結(jié)合親和力比對(duì)GALR3的結(jié)合親和力強(qiáng)100倍以上。
32.根據(jù)權(quán)利要求26-31任一項(xiàng)的方法，其中所述GALR2特異性激動(dòng)劑對(duì)GALR2的結(jié)合親和力為0至1μM。
33.一種篩選修復(fù)預(yù)防或治療腦部損傷或損害的候選化合物的方法，包括測定至少一種待測化合物是否為GALR2特異性激動(dòng)劑，以及如果它是GALR2特異性激動(dòng)劑，則選擇這至少一種待測化合物作為候選化合物。
34.根據(jù)權(quán)利要求33的方法，其中測得這至少一種待測化合物結(jié)合GALR2的結(jié)合親和力為0至100μM，并且該待測化合物對(duì)GALR2的特異性比對(duì)GALR1的特異性強(qiáng)30倍以上。
35.根據(jù)權(quán)利要求33或34的方法，其中測得這至少一種待測化合物結(jié)合GALR2的結(jié)合親和力為0至100μM，并且該待測化合物對(duì)GALR2的特異性比對(duì)GALR1的特異性強(qiáng)50倍以上。
36.根據(jù)權(quán)利要求33、34或35的方法，其中測得這至少一種待測化合物結(jié)合GALR2的結(jié)合親和力為0至100μM，并且該待測化合物對(duì)GALR2的特異性比對(duì)GALR1的特異性強(qiáng)100倍以上。
37.根據(jù)權(quán)利要求34-36任一項(xiàng)的方法，其中測得這至少一種待測化合物結(jié)合GALR2的特異性比對(duì)GALR3的特異性強(qiáng)30倍以上。
38.根據(jù)權(quán)利要求34-37任一項(xiàng)的方法，其中測得這至少一種待測化合物結(jié)合GALR2的特異性比對(duì)GALR3的特異性強(qiáng)50倍以上。
39.根據(jù)權(quán)利要求34-38任一項(xiàng)的方法，其中測得這至少一種待測化合物結(jié)合GALR2的特異性比對(duì)GALR3的特異性強(qiáng)100倍以上。
40.根據(jù)權(quán)利要求34-39任一項(xiàng)的方法，其中測得這至少一種待測化合物結(jié)合GALR2的結(jié)合親和力為0至1μM。
41.根據(jù)權(quán)利要求33-40任一項(xiàng)的方法，其中所述GALR2包括至少一部分的人類GALR2。
42.根據(jù)權(quán)利要求41的方法，其中所述GALR2為全長的人類GALR2。
43.根據(jù)權(quán)利要求33-40任一項(xiàng)的方法，其中所述GALR2包括至少一部分的非人類GALR2。
44.根據(jù)權(quán)利要求43的方法，其中所述GALR2為大鼠或小鼠的GALR2。
45.根據(jù)權(quán)利要求43或44的方法，其中所述GALR2為全長的GALR2。
46.根據(jù)權(quán)利要求33-40任一項(xiàng)的方法，其中所述GALR2為嵌合受體構(gòu)建體。
47.根據(jù)權(quán)利要求33-46任一項(xiàng)的方法，其中所述待測化合物的篩選是在高通量篩選分析中的篩選。
48.一種用于預(yù)防或治療腦部損傷、損害或疾病的藥物組合物，所述組合物包括a)有效量的至少一種GALR2特異性激動(dòng)劑或其可藥用的鹽，以及b)藥物學(xué)上合適的佐劑、載體或賦形劑。
49.根據(jù)權(quán)利要求48的藥物組合物，其中所述腦部損傷或損害由下列之一的原因引起栓塞性、血栓性或出血性中風(fēng)；對(duì)腦部或脊髓的直接或間接創(chuàng)傷或手術(shù)；在心肺旁路手術(shù)或腎透析過程中的腦部缺血性或栓塞性損害；心肌梗塞后的再灌注腦部損害；腦部疾病；免疫學(xué)損害、化學(xué)損害或輻射損害。
50.根據(jù)權(quán)利要求49的藥物組合物，其中所述免疫學(xué)損害是由細(xì)菌或病毒感染引起。
51.根據(jù)權(quán)利要求49的藥物組合物，其中所述化學(xué)損害是由過量飲酒或給予腫瘤治療的化療藥劑引起。
52.根據(jù)權(quán)利要求49的藥物組合物，其中所述輻射損害是由放療引起。
53.根據(jù)權(quán)利要求48或49的藥物組合物，其中所述腦部疾病為阿爾茨海默病、帕金森病、多發(fā)性硬化或可變型克雅病中的一種。
54.根據(jù)權(quán)利要求48-53任一項(xiàng)的藥物組合物，其中所述GALR2特異性激動(dòng)劑為包括一部分甘丙肽氨基酸序列的多肽。
55.根據(jù)權(quán)利要求54的藥物組合物，其中所述GALR2特異性激動(dòng)劑為AR-M1896。
56.根據(jù)權(quán)利要求48-53任一項(xiàng)的藥物組合物，其中所述GALR2特異性激動(dòng)劑為非肽類的小分子化學(xué)個(gè)體。
57.根據(jù)權(quán)利要求48-56任一項(xiàng)的藥物組合物，其中所述GALR2特異性激動(dòng)劑對(duì)GALR2的結(jié)合親和力為0至100μM，并且對(duì)GALR2的結(jié)合特異性比GALR1的結(jié)合特異性強(qiáng)30倍以上。
58.根據(jù)權(quán)利要求48-57任一項(xiàng)的藥物組合物，其中所述GALR2特異性激動(dòng)劑對(duì)GALR2的結(jié)合親和力為0至100μM，并且對(duì)GALR2的結(jié)合特異性比對(duì)GALR1的結(jié)合特異性強(qiáng)50倍以上。
59.根據(jù)權(quán)利要求48-58任一項(xiàng)的藥物組合物，其中所述GALR2特異性激動(dòng)劑對(duì)GALR2的結(jié)合親和力為0至100μM，并且對(duì)GALR2的結(jié)合特異性比對(duì)GALR1的結(jié)合特異性強(qiáng)100倍以上。
60.根據(jù)權(quán)利要求57-59任一項(xiàng)的藥物組合物，其中所述GALR2特異性激動(dòng)劑對(duì)GALR2的結(jié)合特異性比對(duì)GALR3的結(jié)合特異性強(qiáng)30倍以上。
61.根據(jù)權(quán)利要求57-60任一項(xiàng)的藥物組合物，其中所述GALR2特異性激動(dòng)劑對(duì)GALR2的結(jié)合特異性比對(duì)GALR3的結(jié)合特異性強(qiáng)50倍以上。
62.根據(jù)權(quán)利要求57-61任一項(xiàng)的藥物組合物，其中所述GALR2特異性激動(dòng)劑對(duì)GALR2的結(jié)合特異性比對(duì)GALR3的結(jié)合特異性強(qiáng)100倍以上。
63.根據(jù)權(quán)利要求57-62任一項(xiàng)的藥物組合物，其中所述GALR2特異性激動(dòng)劑對(duì)GALR2的結(jié)合親和力為0至1μM。
64.根據(jù)權(quán)利要求48-63任一項(xiàng)的藥物組合物，其中所述藥物學(xué)上合適的佐劑、載體或賦形劑可以選自離子交換劑，氧化鋁，硬脂酸鋁，磷脂酰膽堿，諸如人血清白蛋白的血清蛋白，諸如磷酸鹽的緩沖物質(zhì)，甘氨酸，山梨酸，山梨酸鉀，飽和植物脂肪酸的不完全甘油酯混合物，水，鹽或電解質(zhì)，例如魚精蛋白硫酸鹽，磷酸氫二鈉，磷酸氫鉀，氯化鈉，鋅鹽，硅膠，三硅酸鎂，聚乙烯吡咯烷酮，基于纖維素的物質(zhì)，聚乙二醇，羧甲基纖維素鈉，聚丙烯酸酯，蠟類，聚乙烯-聚氧丙烯-嵌段聚合物，聚乙二醇和羊毛脂。
65.根據(jù)權(quán)利要求48-64任一項(xiàng)的藥物組合物，所述藥物組合物通過口服給藥或腸胃外給藥。
66.根據(jù)權(quán)利要求65的藥物組合物，所述藥物組合物通過口服給藥。
67.根據(jù)權(quán)利要求66的藥物組合物，所述藥物組合物為膠囊或藥片形式。
68.根據(jù)權(quán)利要求67的藥物組合物，所述藥物組合物包括乳糖和/或玉米淀粉。
69.根據(jù)權(quán)利要求68的藥物組合物，所述藥物組合物進(jìn)一步包括潤滑劑。
70.根據(jù)權(quán)利要求69的藥物組合物，其中所述潤滑劑為硬脂酸鎂。
71.根據(jù)權(quán)利要求66的藥物組合物，所述藥物組合物為水性懸液或水性溶液形式。
72.根據(jù)權(quán)利要求71的藥物組合物，所述藥物組合物包括乳化劑和/或助懸劑。
73.根據(jù)權(quán)利要求66-72任一項(xiàng)的藥物組合物，所述藥物組合物包括甜味劑、香味劑和/或著色劑。
74.根據(jù)權(quán)利要求65的藥物組合物，所述藥物組合物通過下述方式給藥注射、使用無針裝置、吸入噴霧劑、局部給藥、直腸給藥、鼻部給藥、口頰給藥、陰道給藥或通過植入的容器給藥。
75.根據(jù)權(quán)利要求74的藥物組合物，所述藥物組合物通過注射給藥。
76.根據(jù)權(quán)利要求75的藥物組合物，所述藥物組合物為無菌的可注射制劑形式。
77.根據(jù)權(quán)利要求76的藥物組合物，其中所述無菌的可注射制劑為水性或油性懸液，或是存在于無毒的適于腸胃外給藥的稀釋劑或溶劑中的懸液。
78.根據(jù)權(quán)利要求74的藥物組合物，所述藥物組合物通過無針裝置給藥。
79.根據(jù)權(quán)利要求78的藥物組合物，所述藥物組合物為適合通過無針裝置給藥的形式。
80.根據(jù)權(quán)利要求79的藥物組合物，其中所述適合通過無針裝置給藥的形式為水性或油性懸液，或是存在于無毒的適于腸胃外給藥的稀釋劑或溶劑中的懸液。
81.根據(jù)權(quán)利要求77至80任一項(xiàng)的藥物組合物，其中所述水性懸液在甘露醇、水、林格氏液或等滲氯化鈉溶液中制備。
82.根據(jù)權(quán)利要求77至80任一項(xiàng)的藥物組合物，其中所述油性懸液在合成單酰甘油、合成二酰甘油、脂肪酸或天然的可藥用的油中制備。
83.根據(jù)權(quán)利要求82的藥物組合物，其中所述脂肪酸為油酸或油酸甘油酯衍生物。
84.根據(jù)權(quán)利要求82的藥物組合物，其中所述天然的可藥用的油為橄欖油、蓖麻油，或聚氧乙烯化的橄欖油或蓖麻油。
85.根據(jù)權(quán)利要求82、83或84的藥物組合物，其中所述油性懸液包括長鏈醇類稀釋劑或分散劑。
86.根據(jù)權(quán)利要求85的藥物組合物，其中所述長鏈醇類稀釋劑或分散劑為Ph.Helv。
87.根據(jù)權(quán)利要求74的藥物組合物，所述藥物組合物通過直腸給藥。
88.根據(jù)權(quán)利要求87的藥物組合物，所述藥物組合物為直腸給藥的栓劑形式。
89.根據(jù)權(quán)利要求88的藥物組合物，其中所述栓劑包含在室溫下為固體而在直腸溫度下為液體的非刺激性賦形劑。
90.根據(jù)權(quán)利要求89的藥物組合物，其中所述非刺激性賦形劑為可可脂、蜂蠟或聚乙二醇中的一種。
91.根據(jù)權(quán)利要求74的藥物組合物，所述藥物組合物通過局部方式給藥。
92.根據(jù)權(quán)利要求91的藥物組合物，所述藥物組合物為包括選自下列載體的軟膏劑礦物油、液體石蠟、白礦脂、丙二醇、聚氧乙烯-聚氧丙烯化合物、乳化蠟和水。
93.根據(jù)權(quán)利要求91的藥物組合物，所述藥物組合物為包括選自下列載體的洗劑或霜?jiǎng)┑V物油、失水山梨醇單硬脂酸酯、聚山梨醇酯60、十六烷基酯蠟、鯨蠟硬脂醇、2-辛基十二烷醇、苯甲醇和水。
94.根據(jù)權(quán)利要求74的藥物組合物，所述藥物組合物通過鼻部給藥。
95.根據(jù)權(quán)利要求94的藥物組合物，所述藥物組合物通過鼻部氣霧劑和/或吸入劑給藥。
96.一種抑制細(xì)胞死亡的方法，包括使細(xì)胞與有效抑制該細(xì)胞死亡的量的GALR2特異性激動(dòng)劑接觸。
97.根據(jù)權(quán)利要求96的方法，其中所述細(xì)胞為神經(jīng)元。
98.根據(jù)權(quán)利要求96或97的方法，其中所述細(xì)胞為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元。
99.根據(jù)權(quán)利要求96、97或98的方法，其中所述細(xì)胞為海馬或皮層神經(jīng)元。
100.根據(jù)權(quán)利要求96至99任一項(xiàng)的方法，其中所述細(xì)胞為人類細(xì)胞。
全文摘要
在此提供GALR2特異性激動(dòng)劑在制備用于預(yù)防或治療腦部損傷、損害或疾病的藥劑中的用途，其中的腦部損傷或損害可由下述之一的原因引起栓塞性、血栓性或出血性中風(fēng)；對(duì)腦部或脊髓的直接或間接創(chuàng)傷或手術(shù)；在心肺旁路手術(shù)或腎透析過程中的腦部缺血性或栓塞性損害；心肌梗塞后的再灌注腦部損害；腦部疾?。挥蛇^量飲酒或給予腫瘤治療的化療藥劑引起的化學(xué)損害；輻射損害；或由細(xì)菌或病毒感染引起的免疫學(xué)損害。腦部疾病可能是阿爾茨海默病、帕金森病、多發(fā)性硬化或可變型克雅病中的一種。
文檔編號(hào)A61K39/00GK1922205SQ200580005194
公開日2007年2月28日 申請(qǐng)日期2005年1月18日 優(yōu)先權(quán)日2004年2月17日
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