專利名稱：：作為給藥系統(tǒng)的抗體交聯(lián)的陽性乳液的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種給藥系統(tǒng)和一種生產(chǎn)該藥物靶向系統(tǒng)的方法。本發(fā)明還涉及一種有用的在哺乳動物體內(nèi)確定靶向和將藥物、診斷劑以及其它生理上有效的物質(zhì)運(yùn)送到靶點(diǎn)的方法。
背景技術(shù)：
：癌癥是世界上的主要致死因素，并且是美國的第二大致死因素。在諸多癌癥疾病中，乳腺癌是除黑色素瘤皮膚癌外在婦女中最常見的癌癥。胰腺癌是美國癌癥致死中的第四大主要原因，且據(jù)估計(jì)結(jié)腸直腸癌在2003年造成57000人死亡。傳統(tǒng)的癌癥療法是攻擊性的，引發(fā)顯著的副作用并且甚至?xí)p害與待治療的惡化器官鄰近的健康組織。對增加抗癌劑特異性達(dá)到靶向腫瘤的需求導(dǎo)致產(chǎn)生了大量新型的治療策略。最近，隨著單克隆抗體(MAb)被批準(zhǔn)用于治療性用途特別是癌癥[1]，新的且令人興奮的生物技術(shù)時代出現(xiàn)了。過去20年中已經(jīng)觀察到，癌癥的發(fā)展通常伴有一種或幾種被稱為腫瘤抗原的蛋白的過度表達(dá)[2]。已經(jīng)開發(fā)了一種靶向?qū)筽185HER2(HER2)受體酪氨酸激酶，曲妥單抗的代表性MAb。HER-2在乳腺癌，肺癌，卵巢癌以及其它癌癥的發(fā)病機(jī)理中起重要作用[3]，并且在所述腫瘤中過度表達(dá)。HER-2過度表達(dá)顯然與乳腺癌的不良預(yù)后(prognosis)有關(guān)[4，5]。因此，使用單克隆抗體治療癌癥已經(jīng)作為靶向癌細(xì)胞的方法，同時不傷害正常細(xì)胞。市售MAbs中，美羅華和曲妥單抗(分別為Rituxan和Herceptin)在治療癌癥中展示出充滿希望和令人鼓舞的結(jié)果，并且持續(xù)顯著擴(kuò)展[6]。有時，以單一藥物形式使用MAb不足以產(chǎn)生令人滿意的治療性應(yīng)答。此外，在用腫瘤細(xì)胞系進(jìn)行的臨床前研究中，發(fā)現(xiàn)曲妥單抗與某些化療藥物具有輔助和協(xié)同作用[2，7]。對曲妥單抗與各種化療試劑特別是紫杉醇聯(lián)合使用的臨床試驗(yàn)研究已經(jīng)在肺癌中進(jìn)行了[8]。研究者利用MAbs對腫瘤組織的高度親和性，并且通過將MAb偶聯(lián)至毒素或通過輻射破壞抗原攜帶細(xì)胞的放射性同位素(放射免疫療法)設(shè)計(jì)了創(chuàng)新的且有效的治療性策略[9]。最近，大量臨床研究報(bào)道，雖然存在與惡性細(xì)胞中H-鐵蛋白過度表達(dá)的矛盾數(shù)據(jù)[11]，但對患有復(fù)發(fā)性何杰金氏病(HD)的患者治療性使用釔標(biāo)記的多克隆抗鐵蛋白得到了滿意效果[10]。由此，為了得到更有效的腫瘤藥物靶向，將單克隆抗體與能包埋有效親水性和/或親脂性藥物的膠態(tài)載體偶聯(lián)，所述膠態(tài)載體為脂質(zhì)體(免疫脂質(zhì)體)、納米顆粒和乳液(免疫乳液)。這些免疫交聯(lián)物應(yīng)該確?？贵w對抗原位點(diǎn)的特異性識別，以及確保膠體給藥系統(tǒng)釋放不同的細(xì)胞毒素試劑，所述膠體給藥系統(tǒng)靠近難以接近的病理靶組織，所述病理靶組織可能位于過度表達(dá)所述腫瘤抗原的乳腺或結(jié)腸或胰腺中。實(shí)際上，正如近來報(bào)道，免疫脂質(zhì)體代表一種新穎的和充滿希望的增強(qiáng)腫瘤靶向給藥的策略[12-19]。此外，已經(jīng)表明，帶有聚乙二醇偶聯(lián)的Fab′片段的免疫脂質(zhì)體在體內(nèi)顯示出延長的循環(huán)時間和高度外滲進(jìn)入目標(biāo)實(shí)體瘤[15]。然而，上述敏感性脂質(zhì)體制劑眾所周知的物理化學(xué)不穩(wěn)定性形成一種障礙，如果意欲最終銷售有活性的產(chǎn)品則需克服所述障礙。此外，大部分所述脂質(zhì)體載體不能結(jié)合顯著劑量的親脂性/疏水性活性成分例如紫杉醇(這是治療各種癌癥實(shí)體瘤最有希望的細(xì)胞毒類藥物之一)，所述的不能結(jié)合限制了他們潛在的臨床效果，而乳液可以結(jié)合顯著量的疏水性藥物特別是紫杉醇[20]，則顯示了其強(qiáng)于脂質(zhì)體的優(yōu)點(diǎn)。Lundbergetal.[21]偶聯(lián)了用聚乙二醇穩(wěn)定的磷脂酰乙醇胺改性的帶負(fù)電長循環(huán)亞微粒乳液和抗B細(xì)胞淋巴瘤MAbLL2。它們顯示，結(jié)合物(conjugate)可能是一種有用的藥物載體系統(tǒng)，用于更特異性地向B細(xì)胞惡性腫瘤釋放抗腫瘤藥物。目前還沒有體內(nèi)數(shù)據(jù)，所述研究仍然處于初級階段。本發(fā)明人開發(fā)和研究的陽離子亞微粒乳液在生理性陽離子的存在下是穩(wěn)定的，并且可以在體內(nèi)與帶負(fù)電的生物膜相互作用，同時避免被RES吸收[22]。此外，細(xì)胞培養(yǎng)研究已經(jīng)顯示，陽離子乳液增強(qiáng)治療劑的細(xì)胞內(nèi)滲透[23，24]。對于基于免疫學(xué)的抗癌療法來說，HER-2蛋白代表一種有吸引力的的靶向，這是由于它在非惡性組織中的限制性表達(dá)及其對轉(zhuǎn)化細(xì)胞惡性表型的影響。以HER-2/nue為靶向的與化療結(jié)合的曲妥單抗有利于患有過度表達(dá)HER-2的轉(zhuǎn)移性乳腺癌的患者的存活，提高可類似地表達(dá)HER-2的其它類型惡性腫瘤利于治療的可能性。此外，已經(jīng)證明曲妥單抗在其它癌癥中作為單一藥物無效。AMB8LK抗體對H-鐵蛋白顯示高度親和性。鐵蛋白是一種由大多數(shù)人類細(xì)胞表達(dá)的蛋白質(zhì)，且其用于細(xì)胞內(nèi)鐵貯存。該分子的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)顯示，它是由被稱為去鐵鐵蛋白的含有一個金屬鐵原子核的糖蛋白外殼組成的大分子。去鐵鐵蛋白的分子量為440kD。具有兩種類型的亞基，被稱為H和L，以可變的比例組合。根據(jù)亞基類型，鐵蛋白分為酸性的或者堿性的。雖然大家熟知堿性鐵蛋白的作用，但僅僅近來才逐漸闡明酸性鐵蛋白的確切作用。對鐵蛋白和癌癥關(guān)系的早期觀點(diǎn)所源自的研究表明，患有各種惡性腫瘤患者的血清中總鐵蛋白增加并向酸性(富含H)鐵蛋白轉(zhuǎn)移[26]。隨后對腫瘤組織本身中鐵蛋白濃度的評價顯示了一個復(fù)雜的，也許是疾病特異性的景象例如已經(jīng)報(bào)道，某些情況下例如在結(jié)腸癌[27]、睪丸精原細(xì)胞瘤[28]以及乳腺癌[29-30]中，與可比較的正常組織相對，腫瘤組織中鐵蛋白增加。Vriensendorp和Quadri近來報(bào)道[10]，在何杰金氏病中，循環(huán)鐵蛋白量為500ng/ml。隨機(jī)研究指出，靜脈注射2.5mg兔抗人鐵蛋白IgG會在循環(huán)中主要形成一對一免疫復(fù)合物[31]。該抗原抗體復(fù)合物不干擾腫瘤靶向或引起免疫復(fù)合物疾病。此外，Vriesendorp和Coll.[32]在臨床研究中證明，在復(fù)發(fā)性HD患者中，放射性同位素標(biāo)記的抗鐵蛋白靶向腫瘤間質(zhì)并且通過放療而不是通過免疫作用來縮小腫瘤。在HD患者的尿中，小于5％的經(jīng)注射的放射性同位素標(biāo)記的抗鐵蛋白被消除。此外，血液放射性的40小時有效第二半衰期和α∶β比例低于2.5表明，經(jīng)放射性同位素標(biāo)記的兔抗鐵蛋白在體內(nèi)是穩(wěn)定的[33，34]。最后，抗鐵蛋白還靶向在正常睪丸和血液中發(fā)現(xiàn)的鐵蛋白，但是已經(jīng)觀察到HD患者中，血池放射性與血液毒性呈良好的相關(guān)性，所述血液毒性通常在10-16周后自發(fā)消失。HD患者中未發(fā)現(xiàn)急性副反應(yīng)[10，31]。應(yīng)該強(qiáng)調(diào)的是，用于早期臨床研究的抗體是多克隆兔抗人鐵蛋白。AMB8LK，公開于WO01/52889中的由MonoclonalAntibodiesTherapeutics(MAT)Ltd.Evry，F(xiàn)rance制備的單克隆抗體識別所有異鐵蛋白(酸性的和堿性的)的共同表位。AMB8LK已經(jīng)被證明對特定器官具有顯著的親和性，并且與同位素偶聯(lián)之后，其可以用于何杰金氏病以及其它腫瘤如胰腺癌和肺(NSCLC)癌的診斷和治療。最后，OrphanDrugStatus已經(jīng)于近日被ECOrphanMedicinalProductsCommittee批準(zhǔn)可將抗鐵蛋白多克隆抗體偶聯(lián)至釔90，以治療頑固性何杰金氏病(MAT，ltd.，EvryFrance)。所述識別提供令人信服的證據(jù)，及抗鐵蛋白可以被HD患者的腫瘤優(yōu)先吸收。需要通過特異性配體來選擇性地靶向負(fù)載有抗癌藥物的乳液以對抗表達(dá)在惡性細(xì)胞上的抗原，從而增強(qiáng)所述免疫乳液制品的療效以及降低與化療相關(guān)的不良副作用。
發(fā)明內(nèi)容因此，本發(fā)明的一個目的是提供組合物和靶向藥物的方法。本發(fā)明涉及一種包括陽性水包油乳液和一種抗體的組合產(chǎn)品，其中所述乳液含有在其自然狀態(tài)和在油水界面具有游離NH2基團(tuán)的化合物，其中所述化合物通過異雙功能交聯(lián)劑連接至所述抗體上，將所述NH2基團(tuán)連接至抗體絞鏈區(qū)上的SH基團(tuán)上。本發(fā)明更具體地涉及一種組合產(chǎn)品，其中所述產(chǎn)品具有正ζ電荷。本發(fā)明還涉及一種組合產(chǎn)品，其中所述具有NH2自由基團(tuán)的化合物是選自下列的至少一種陽離子脂質(zhì)C10-C24烷基胺、C10-C24烷醇胺或膽甾醇酯。本發(fā)明還涉及一種組合產(chǎn)品，其中所述具有NH2自由基團(tuán)的化合物是硬脂酰胺或油胺。此外，本發(fā)明涉及一種組合產(chǎn)品，其中所述乳液包括具有由界面膜包圍的油性中心的膠體微粒，其中所述界面膜包括在其自然狀態(tài)具有自由NH2的化合物、非離子表面活性劑和一種陰離子表面活化劑或陰離子脂質(zhì)，其中所述膠體微粒具有正ζ電位(potential)。所述乳液公開于國際申請WO03/053405中。更特別地，本發(fā)明公開了一種組合產(chǎn)品，其中所述乳液含有一種藥理學(xué)活性物質(zhì)。本發(fā)明還涉及一種組合產(chǎn)品，其中所述抗體選自多克隆抗體或單克隆抗體。所述單克隆抗體可以自然形式、合成形式、嵌合形式或人源化形式使用。更特別地，在根據(jù)本發(fā)明的組合產(chǎn)品中，所述抗體靶向存在病理細(xì)胞表面上的抗原。更具體地說，在根據(jù)本發(fā)明的組合產(chǎn)品中，所述抗體靶向的蛋白選自HER-2、H-鐵蛋白、前列腺特異性膜抗原(PSMA)或粘蛋白(以高度糖基化為特征的高分子量糖蛋白。MUC1是迄今為止九個克隆的粘蛋白中表征最好的。MUC1在前列腺癌和轉(zhuǎn)移性前列腺癌中過度表達(dá))，CD44(在所有七個AML(急性粒細(xì)胞性白血病)亞型的白血病細(xì)胞上表達(dá)的細(xì)胞表面抗原)和視黃醛S-抗原(通過雜交瘤制備的單克隆抗體，所述雜交瘤由視黃醛S-抗原(S-Ag)產(chǎn)生)，對所有受試種(人類，牛，豚鼠和大鼠)的視黃醛Muller細(xì)胞顯示出強(qiáng)特異性結(jié)合，[35]。更具體地說，所述抗體是AMB8LK抗體，更具體地說，是經(jīng)胃蛋白酶消化后得到的片段形式F(ab)2。本發(fā)明還涉及一種組合產(chǎn)品，其中所述異雙功能交聯(lián)劑選自N-1硬脂酰-馬來酰亞胺(SM)、油烯基馬來酰亞胺(oleylmaleimide)、琥珀酰亞胺反式-4-(馬來酰亞胺甲基)-環(huán)己烷-1-羧酸酯(SMCC)或琥珀酰亞胺3-(2-吡啶二硫基)丙酸酯(SPDP)。此外，本發(fā)明涉及一種制備之前公開的組合產(chǎn)品的方法，所述方法包括下列步驟a)任選地還原一種抗體以在其絞鏈區(qū)得到自由SH基團(tuán)，b)混合一種陽性乳液和具有自由SH基團(tuán)的抗體以得到所述組合產(chǎn)品，其中所述陽性乳液含有一種在其自然狀態(tài)含有自由NH2基團(tuán)的化合物，其中所述化合物通過所述NH2基團(tuán)連接至異雙功能交聯(lián)劑上。根據(jù)已知技術(shù)手段實(shí)現(xiàn)步驟a)，例如由Hermanson公開的技術(shù)[36]。更特別地，本發(fā)明公開了一種方法，其中步驟b)所述陽性乳液通過如下獲得i.將交聯(lián)劑連接至天然存在于化合物上的自由NH2基團(tuán)以得到經(jīng)修飾的化合物，所述化合物用于獲得陽性乳液，ii.混合所述在其自然狀態(tài)具有自由NH2基團(tuán)的經(jīng)修飾的化合物和另一種得到乳液所必需的產(chǎn)品，以得到陽性乳液。本發(fā)明還涉及一種方法，其中步驟b)所述陽性乳液通過如下獲得i.混合在其自然狀態(tài)具有自由NH2基團(tuán)的化合物和另一種為得到乳液所必需的產(chǎn)品，以得到陽性乳液，ii.將交聯(lián)劑連接至天然存在于所述化合物上的自由NH2基團(tuán)上，以得到在所述陽性乳液內(nèi)的經(jīng)修飾的化合物。絞鏈區(qū)的反應(yīng)性巰基用于和帶有馬來酰亞胺基團(tuán)例如SMCC的巰基反應(yīng)性交聯(lián)試劑的結(jié)合方案。合成新型交聯(lián)試劑的原理是通過混合化學(xué)結(jié)構(gòu)與母體陽離子脂質(zhì)非常類似的新型交聯(lián)劑，即在乳液制備過程中分別為硬脂酰胺或油胺的交聯(lián)劑來促進(jìn)免疫乳液的形成并增加反應(yīng)結(jié)合物的產(chǎn)量。通過選擇性結(jié)合4種不同表面活性劑(分別為磷脂，泊洛沙姆，硬脂酰胺和烷基馬來酰亞胺或油胺和油烯基馬來酰亞胺)，在O/W界面制備混合的乳化界面膜。此外，由于在抗體偶聯(lián)之前不必再將交聯(lián)劑與預(yù)先形成的乳液反應(yīng)，而是直接將還原的抗體結(jié)合至包括已經(jīng)位于O/W界面的包含交聯(lián)劑的乳液，可以省略結(jié)合反應(yīng)中的一個重要步驟。然后期望不發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)(在油滴和交聯(lián)劑或抗體分子之間)，同時由于還原的抗體在乳液的O/W界面直接面對反應(yīng)性部分，因此交聯(lián)反應(yīng)的特異性和產(chǎn)量明顯增加。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語藥理學(xué)活性物質(zhì)包括治療劑和診斷劑，其可以用于熱血動物，特別是哺乳動物包括人類，獸類或家畜。根據(jù)本發(fā)明，藥物靶向系統(tǒng)可能包括一種藥理學(xué)活性物質(zhì)或多種藥理學(xué)活性物質(zhì)乃至更多種藥理學(xué)活性物質(zhì)，只要它們在同一藥物靶向系統(tǒng)中相容。在本發(fā)明藥物靶向系統(tǒng)的一個優(yōu)選實(shí)施方案中，藥學(xué)上有效物質(zhì)是親脂性藥物，選自吉西他濱、米托蒽醌、絲裂霉素、長春新堿、表柔比星、氨甲喋呤、鬼臼亞乙苷、亞德利亞霉素、嘌呤或核苷、博來霉素、絲裂霉素、BCNU、紫杉酚、多西紫杉醇或其它紫杉烷衍生物，更具體地說是紫杉醇油酸鹽或棕櫚酸鹽、喜樹堿、N4-?；?1-β-D-阿拉伯糖胞嘧啶(arabinofuranosylcystosines)、地塞米松、棕櫚酸鹽、氟羥脫氫皮醇(上述兩種用于眼部應(yīng)用)、環(huán)孢素、他克莫司或西羅莫司(具有確定的P-gp抑制作用的免疫抑制劑，其能降低多藥耐藥性)。所有上述藥物應(yīng)該溶于油滴中心中。在一個更加優(yōu)選的實(shí)施方案中，上述藥理學(xué)活性物質(zhì)是活性細(xì)胞毒素物質(zhì)，所述活性細(xì)胞毒素物質(zhì)在與抗體結(jié)合之前結(jié)合入所述乳液中，例如非水溶性藥物如紫杉醇、紫杉醇油酸鹽或吉西他濱堿單獨(dú)或與環(huán)孢素A或他克莫司結(jié)合。將含有紫杉醇或吉西他濱的陽離子(cationic)乳液與抗體例如曲妥單抗或AMB8LK偶聯(lián)的優(yōu)點(diǎn)是多重的，所述抗體例如曲妥單抗或AMB8LK可以特異性識別分別過度表達(dá)HER-2或H-鐵蛋白的乳腺癌，結(jié)腸癌和胰腺癌癥腫瘤，或MUC1抗體或者能識別轉(zhuǎn)移性前列腺癌的PMSAMAb，上述優(yōu)點(diǎn)包括通過轉(zhuǎn)移抗體特異性至乳液界面的免疫靶向；延長生物體中的停留時間；在通過抗體確認(rèn)的腫瘤位點(diǎn)釋放大細(xì)胞毒劑量，以及抗體從乳液界面生物降解之后細(xì)胞毒類藥物在腫瘤中較好地內(nèi)化，以及回收負(fù)載藥物的帶正電荷的乳液，該乳液經(jīng)證明可增強(qiáng)各種組織中的藥物滲透。根據(jù)本發(fā)明的組合物一方面確?？贵w能特異性識別抗原位點(diǎn)或受體；另一方面通過靠近目標(biāo)病理組織的膠體給藥系統(tǒng)釋放不同親脂性細(xì)胞毒試劑。所述藥物釋放是由免疫乳液和腫瘤細(xì)胞的相互作用引發(fā)的。治療劑被預(yù)期選擇性地轉(zhuǎn)移至細(xì)胞表面，并且隨后通過原生質(zhì)膜的結(jié)構(gòu)性內(nèi)吞或胞飲內(nèi)陷而內(nèi)化，最終將細(xì)胞毒試劑傳遞至其作用位點(diǎn)，所述位點(diǎn)對于大多數(shù)抗癌藥是在細(xì)胞內(nèi)的。上述給藥途徑可以是全身性途徑(非腸道、靜脈注射、腹膜內(nèi)、脊柱內(nèi)、腫瘤內(nèi))，眼部或局部途徑。根據(jù)本發(fā)明的有效給藥系統(tǒng)顯著地降低與不良耐受的非選擇性分布和潛在的細(xì)胞毒試劑相關(guān)的副作用。將含有選擇性細(xì)胞毒類藥物的帶正電荷乳液和抗體偶聯(lián)在腫瘤學(xué)中的優(yōu)越性是多重，其包括-通過轉(zhuǎn)移抗體特異性至乳液界面進(jìn)行免疫靶向，-延長在生物體中的保留時間，-在抗體識別的腫瘤位點(diǎn)釋放大細(xì)胞毒劑量，-減少乳液的正電荷及肺向性，-在抗體從乳液界面生物降解之后，細(xì)胞毒類藥物在腫瘤中較好地內(nèi)化，以及回收經(jīng)證明能增強(qiáng)各種組織中藥物滲透的負(fù)載藥物的帶正電荷乳液。通過下列實(shí)施例和附圖進(jìn)一步舉例說明本發(fā)明。附圖1表示結(jié)合至油滴乳液的抗體的百分比，以初始比值為45曲妥單抗分子/油滴作為增加陽離子乳液中交聯(lián)劑SM的濃度的函數(shù)。附圖2是帶正電荷亞微粒乳液與單克隆抗體通過SMCC技術(shù)偶聯(lián)的原理圖。附圖3是帶正電荷亞微粒乳液與單克隆抗體通過SPDP技術(shù)偶聯(lián)的原理圖。附圖4表示Capan-1細(xì)胞對不同乳液制品的吸收。上述免疫乳液的密度為100Ab/微滴。實(shí)施例1原料和方法1.1.制備陽離子乳液陽離子空白乳液由水相和油相組成，水相包括蒸餾水，泊洛沙姆188(Poloxamer188)(非離子表面活性劑)，甘油(滲透劑)，油相含有MCT(中鏈甘油三酯)，硬脂酰胺(陽離子脂質(zhì))，α-生育酚(抗氧化劑)和類脂E-80(磷脂混合物)。所述類脂E-80，維生素E和硬脂酰胺直接溶于油相，而泊洛沙姆和甘油直接溶于水相。兩相分別加熱至70℃。將水相緩慢混入油相并用磁性攪拌器混合。所得混合物進(jìn)一步加熱至85℃。使用高剪切Polytron混合器(Kinematica，Luzern，Switzerland)將得到的粗制乳液乳化5分鐘以上，然后迅速冷卻至20℃以下。在冰浴中冷卻后，乳液使用兩級均化閥裝置(Gaulinhomogenizer，APVGaulin，Hilversum，TheNetherlands)以9000psi均化5分鐘。進(jìn)一步快速冷卻至低于20℃之后，使用0.1N鹽酸調(diào)節(jié)pH值至7.0。然后通過孔徑0.45μm的TE膜濾器(Schleicher&Schuell，Dassel，Germany)過濾所得乳液。最后，在氮?dú)猸h(huán)境中用硅化玻璃瓶包裝乳液并使用高壓滅菌器在121℃滅菌15分鐘。典型的配方是由下述組成的(w/w％)MCT(5)，泊洛沙姆188(1)，甘油(2.25)，類脂E80(1)，硬脂酰胺(0.25)，α-生育酚(0.01)和水(直至100)。對于免疫乳液制品，添加0.02％合成的交聯(lián)劑，得到4000交聯(lián)劑/微滴。對于流細(xì)胞計(jì)數(shù)法、熒光和共焦顯微學(xué)分析，使用以相對于乳液MCT含量的以1∶200的摩爾比溶于四氫呋喃(THF)的香豆素6制備熒光標(biāo)記的乳液(香豆素最終濃度490μM或0.17mg/ml)。2小時適度加熱后，香豆素平衡并滲透入乳液中，同時通過蒸發(fā)除去THF。使用SephadexG-25柱除去未負(fù)載標(biāo)記。1.2.乳液特征1.2.1.粒徑分析使用ALV非擴(kuò)散性背散射高性能顆粒填料器(ALV-NIBSHPPS，Langen，Germany)在25℃測定液滴尺寸，并使用水(折射率1.332；粘度0.894543)作為溶劑。使用波長為632nm的激光束。靈敏度范圍是0.5nm～5μm。1.2.2.測量ζ電位使用Malvernzetasizer(Malvern，UK)測定在10mMNaCl(150mV)中稀釋的乳液的ζ電位。1.3.制備陰離子乳液使用與Levy和Coll.[37]所描述相同的方法，用油酸代替硬脂酰胺制備陰離子乳液。確切的配方是MCT6.6％，油酸2.3％，類脂E801％，維生素E0.01％，甘油2.25％，普盧蘭尼克F-681％和DDW100％。2.制備抗體片段根據(jù)已知的赫爾曼森(Hermanson)[36]方法還原曲妥單抗和AMB8LKF(ab)2片段。在37℃，通過2-半胱胺(MEA，最終濃度0.05M)還原純化的曲妥單抗和AMB8LKF(ab)2抗體(4mg/ml)90min，以制備用于與乳液結(jié)合的巰基基團(tuán)。一旦被2-半胱胺還原，免疫球蛋白就裂成兩部分，形成兩個MW75000-80000的重鏈-輕鏈分子，并且每個含有一個抗原結(jié)合位點(diǎn)(應(yīng)該強(qiáng)調(diào)，該方法不引起蛋白質(zhì)變性)。類似地，F(xiàn)(ab′)2片段可以被還原產(chǎn)生兩個Fab′片段，每個含有一個抗原結(jié)合位點(diǎn)。在SephadexG-25柱上洗脫溶液，以1ml餾分收集Fab′片段級分。使用280nm處的UV測定含有Fab′的級分，并合并收集液。4℃氮?dú)猸h(huán)境中保存Fab′片段(50kD)直至偶聯(lián)至乳液。通過SDS-PAGE確定Fab′片段的產(chǎn)生，并且通過夾心ELISA證實(shí)其抗原特異性。3.偶聯(lián)反應(yīng)使用1NHCl將根據(jù)1新鮮制備的乳液的pH值調(diào)至6.5，并且在4℃連續(xù)攪動和氮?dú)猸h(huán)境下與AMB8LKFab′片段(最終濃度0.1-0.5mg/ml)培養(yǎng)過夜。通過與2-巰基乙醇(2mM)培養(yǎng)30分鐘來封閉未反應(yīng)的馬來酰亞胺基團(tuán)。通過SepharoseCL-4B柱凝膠過濾，將未結(jié)合的抗體和2-巰基乙醇從免疫乳液中分離出來。通過共焦顯微鏡和射電顯微術(shù)(TEM)，分別使用FITC或黃金標(biāo)記的羊抗-小鼠/人IgG，對最終的免疫乳液進(jìn)行形態(tài)學(xué)評價。通過ELISA測定與乳液結(jié)合的Fab′片段總數(shù)。對于使用不同量的結(jié)合抗體制備免疫乳液來說，F(xiàn)ab′對馬來酰亞胺-活化的乳液的初始比例是不同的。4.藥物摻入在與抗體結(jié)合之前，將經(jīng)選擇的親脂性或疏水性細(xì)胞毒藥物例如環(huán)孢素A首先溶于乳液的油相中，以制備有效治療腫瘤細(xì)胞的負(fù)載藥物的免疫乳液，而這些腫瘤細(xì)胞通過常規(guī)化療難于接近。5.乳液-抗體結(jié)合物的穩(wěn)定性研究體外通過促進(jìn)試驗(yàn)例如升溫、攪拌以及使用長期儲存評價來研究經(jīng)偶聯(lián)的乳液的穩(wěn)定性。檢驗(yàn)下列性質(zhì)液滴尺寸分布，ζ電位，pH值和使用HPLC測定的藥物含量[36]。6.體外藥物釋放動力學(xué)評價使用超濾技術(shù)在低壓下對從陽離子乳液中的體外藥物釋放分布特征的測定如下所述將0.4ml含藥乳液(含有1mg環(huán)孢素A)直接置于含有100ml釋放介質(zhì)(維持下沉條件)的Amicon8200攪拌容器中(Amicon，Danvers，MA，U.S.A)。在給定時間間隔下，在低壓條件下(小于7.25psi)使用氮?dú)猓ㄟ^YM-100超濾膜過濾釋放介質(zhì)。使用HPLC測定1ml等分澄清濾液的紫杉醇含量[38]。必須考慮膜吸附和排斥，以準(zhǔn)確地測量藥物中的水量，從而在使用超濾技術(shù)之前進(jìn)行證實(shí)。7.細(xì)胞培養(yǎng)研究免疫染色以用于測定H-鐵蛋白和HER-2過度表達(dá)。在不同癌細(xì)胞系(用于胰腺癌的CAPAN-1，用于結(jié)腸癌的Caco-2和用于乳腺癌的SK-BR-3)和非癌細(xì)胞例如成纖維細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞中測定H-鐵蛋白的過度表達(dá)。細(xì)胞融合之后用胰酶消化并轉(zhuǎn)移(每孔105細(xì)胞)入覆蓋有18mm蓋玻片的16孔板中。細(xì)胞在37℃，5％CO2條件下，在蓋玻片上粘附24小時。棄去培養(yǎng)基并且使用新鮮的4％多聚甲醛固定10分鐘。用PBS洗滌細(xì)胞并且用50mMNH4Cl及隨后用5％BSA阻斷自身熒光。洗滌細(xì)胞并且在4℃用AMB8LK1∶50稀釋物培養(yǎng)過夜。洗滌細(xì)胞并且在室溫下用FITC1∶50稀釋物結(jié)合山羊抗小鼠IgG1小時。用PBS洗滌第二抗體5次，隨后封片，接著使用熒光顯微鏡或共焦顯微鏡觀察細(xì)胞。使用相同過程測定HER-2，使用曲妥單抗和FITC結(jié)合的山羊抗人IgG作為第二抗體。8.AMB8LK-免疫乳液的體外結(jié)合分析將用香豆素6標(biāo)記的AMB8LK-免疫乳液和對照乳液(沒有結(jié)合AMB8LK的陽離子乳液和陰離子乳液)添加至1×106CAPAN-1細(xì)胞中，并在4℃培養(yǎng)30分鐘。用1ml免疫熒光(IF)緩沖液(PBS中1％(w/v)BSA，pH值7.4)洗滌細(xì)胞。此后，將已經(jīng)與用熒光標(biāo)記的乳液培養(yǎng)過的細(xì)胞再次懸浮于500ulIF-緩沖液中，并通過流細(xì)胞計(jì)數(shù)法分析。9.免疫乳液的細(xì)胞吸收的共焦激光掃描顯微學(xué)(CLSM)分析CAPAN-1細(xì)胞在蓋玻片上生長至亞融合。將細(xì)胞與香豆素6標(biāo)記的乳液(陽離子乳液和AMB8LK免疫乳液)在補(bǔ)充血清的生長培養(yǎng)基中在37℃條件下培養(yǎng)0分鐘，30分鐘和1小時，用PBS充分洗滌，在甘油中封片并用共焦顯微鏡觀察。10.測定細(xì)胞對AMB8LK-免疫乳液和藥物的吸收CAPAN-1在24孔板上生長至亞融合。細(xì)胞與香豆素6標(biāo)記的乳液(陽離子乳液，陰離子乳液和AMB8LK免疫乳液)，在PBS中37℃條件下培養(yǎng)1小時，并用PBS充分洗滌。使用BMGLabtechnologies的FluoStar-Galaxy測定平板的熒光，激發(fā)波長485nm且發(fā)射波長520nm。每個平板讀數(shù)4次并計(jì)算平均值。沒有經(jīng)洗滌并與相同樣品培養(yǎng)的孔作為總熒光的參照。實(shí)施例1B結(jié)果1.1.AMB8LKFah′產(chǎn)生通過SDS-PAGE確定AMB8LKFab′片段的產(chǎn)生，證實(shí)F(ab)2通過半胱胺(MEA)的適度還原裂解為Fab′片段。使用鐵蛋白作為包被抗原的夾心ELISA證實(shí)了AMB8LKFab′的抗原特異性。以半胱氨酸作為標(biāo)準(zhǔn)，通過監(jiān)控343nm處吸光度的改變，用Aldrithiol測定自由巰基基團(tuán)。經(jīng)該步驟后，抗體暴露3個自由巰基基團(tuán)。1.2.AMB8LK-免疫乳液特征使用O/W界面的不同抗體密度(從10多至100抗體分子/油滴)以檢驗(yàn)其對乳液最終液滴尺寸和ζ電位的影響。有人指出，抗體密度對液滴尺寸和ζ電位沒有影響，分別是110-130nm和+35mV。通過ELISA測定的偶聯(lián)效率也未受表面抗體密度的影響。不管起始Ab/液滴比例是多少，除去未反應(yīng)的Ab后測量到的效率范圍是55～63％。共焦顯微鏡和TEM觀察進(jìn)一步證實(shí)上述情況，分別通過它們可以明顯地推論出，大部分Ab分子在O/W界面附著于油滴，而自由Ab分子集中于外部水介質(zhì)中。與使用完整的IgG分子得到的結(jié)果相比，這些發(fā)現(xiàn)說明了明顯的改進(jìn)。效率從25％增加至63％，而AMB8LK片段的密度進(jìn)一步從40Ab分子/液滴增加至100Ab分子/液滴。該觀察指出與Ab分子尺寸相關(guān)的立體位阻效應(yīng)的重要性。由此，與MW150000的IgG相比，用Fab′AMB8LK片段(MW50000)可以實(shí)現(xiàn)最高密度?？梢酝茢?，隨著MAb片段的分子量降低，偶聯(lián)效率增加。1.3.H-鐵蛋白的免疫染色為了測定在不同癌細(xì)胞系中例如CAPAN-1(胰腺癌細(xì)胞)，SK-BR-3(乳腺癌細(xì)胞)，Caco-2(結(jié)腸癌細(xì)胞)和兩種對照正常細(xì)胞系例如成纖維細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞中H-鐵蛋白的過度表達(dá)而進(jìn)行免疫染色。將細(xì)胞與AMB8LKFab2片段培養(yǎng)以檢測H-鐵蛋白的過度表達(dá)。將不與AMB8LKFab2片段培養(yǎng)的而僅僅與第二抗體培養(yǎng)的細(xì)胞作為對照。僅僅在癌癥細(xì)胞中觀察到清楚的熒光說明了鐵蛋白的表達(dá)，而正常細(xì)胞不顯示熒光則證實(shí)不存在鐵蛋白。因此，似乎可以證實(shí)H-鐵蛋白分子能被用作乳腺癌，結(jié)腸癌和胰腺癌療法靶分子的假設(shè)，并進(jìn)一步研究其優(yōu)點(diǎn)。1.4.使用流細(xì)胞計(jì)數(shù)法進(jìn)行的體外結(jié)合分析FACS分析揭示，與由于其負(fù)電荷性質(zhì)而不與細(xì)胞結(jié)合的陰離子乳液相比，AMB8LK-免疫乳液和陽離子乳液與CAPAN-1細(xì)胞系結(jié)合。1.5.通過共焦顯微鏡顯示的體外吸收與空白陽離子乳液相比較，AMB8LK免疫乳液制劑會更迅速且有效地定性結(jié)合至Capan-1細(xì)胞系上。1.6.測定定量吸收與使用陰離子乳液(34％)相比較，使用陽離子乳液時，包含于滲透入細(xì)胞內(nèi)的乳液中的熒光親脂性探針的份額更高(42.7％)，這證實(shí)了先前的結(jié)果，該結(jié)果已經(jīng)證明與陰離子乳液相比，陽離子乳液會增強(qiáng)不同親脂性藥物對不同組織和器官的滲透，與給藥途徑無關(guān)[22]?？梢酝茢啵珹MB8LK偶聯(lián)至酸性乳液不僅不阻止或降低熒光探針的吸收，反而使其顯著增加(增加50％)。探針滲透性增強(qiáng)清楚地表明，內(nèi)化過程不僅被陽離子油滴的靜電效應(yīng)調(diào)節(jié)，還可能被細(xì)胞-受體調(diào)節(jié)的內(nèi)吞作用調(diào)節(jié)，所述內(nèi)吞作用通過受到AMB8LKMAb影響的細(xì)胞表面內(nèi)化受體配體進(jìn)行。實(shí)施例2使用N-(l-硬脂酰)-馬來酰亞胺的結(jié)合方法2.1.合成交聯(lián)劑N-(1-硬脂酰)-馬來酰亞胺(SM)在室溫下，攪拌在氯仿(10ml)中的硬脂酰胺(0.01摩爾)和馬來酐(0.01摩爾)的混合物超過3小時。濾出沉淀的晶體，用少量的氯仿洗滌以得到純N-(1-硬脂酰)馬來酸。在乙酸酐(30ml)中回流后一化合物(4毫摩爾)和醋酸鈉(0.03g，相當(dāng)于0.3毫摩爾)超過30分鐘，然后立即在冰浴中冷卻。收集沉淀的晶體并用水洗滌以得到標(biāo)題化合物N-(1-硬脂酰)-馬來酰亞胺，收率為85％(流程圖-1)。流程圖12.2.曲妥單抗抗體通過硫醚方法結(jié)合至乳液2.2.1.曲妥單抗的硫醇化抗體使用2-亞胺巰醇(Traut′sreagent，AldrichChemicalsco.MilwaukeeWisconsin)進(jìn)行硫醇化。將抗體溶于由50mMTris，1mMEDTA和150mMNaCl組成的pH值為8.5的緩沖溶液中。然后以相對于抗體600∶1的分子比添加2-亞胺巰醇，然后在室溫下培養(yǎng)超過45分鐘。反應(yīng)混合物上HiTrapTM脫鹽柱(AmershamBioscience，Uppsala，Sweden)以除去過量的2-亞胺巰醇。使用Traut′s試劑修飾抗體不影響其特異性識別SK-BR3細(xì)胞上過度表達(dá)的抗原HER2的能力。不存在曲妥單抗時沒有熒光，而存在曲妥單抗時記錄到顯著的細(xì)胞表面熒光。2.2.2.結(jié)合方法將硫醇化的抗體立即添加至含有N-(1-硬脂酰)-馬來酰亞胺(SM)交聯(lián)劑的酸性乳液(pH值6.5)中。反應(yīng)混合物室溫下過夜，同時混合并處于氮?dú)猸h(huán)境下。使用1.5×25cmSepharoseCL-4B柱(AmershamBioscience，Uppsala，Sweden)，用水洗脫混合物以除去未結(jié)合的抗體。2.3.對結(jié)合反應(yīng)效果的評價2.3.1.ELISA根據(jù)下列方案的半定量ELISA方法(酶聯(lián)免疫吸收測定)，以新型交聯(lián)劑N-(1-硬脂酰)-馬來酰亞胺(SM)的濃度為函數(shù)來評價結(jié)合效率(抗體結(jié)合到乳液的百分比)·用免疫乳液或空白乳液(在包覆緩沖液pH值9.5中稀釋)包覆小孔，·37℃培養(yǎng)過夜，·用PBS-Tween洗滌20×3，·通過2％BSA阻斷非特異性結(jié)合超過1.5小時，·用PBS-Tween洗滌20×3，·添加第二抗體(Horseraddish結(jié)合的抗人IgG，JacksonImmunoresearchLtd.，WestGrove，Pennsylvania，USA)并培養(yǎng)2小時RT，·用PBS-Tween洗滌20×3，·添加底物(TMB/E，SingleOakDrive-Temecula，California)，·使用熒光分光計(jì)讀取展開顏色在650nm的UV吸光度。結(jié)合效率隨乳液制品中SM交聯(lián)劑量的增加而增加，初始比例45曲妥單抗分子/油滴時幾乎達(dá)到30％結(jié)合。2.3.2.免疫金染色使用其它作者之前報(bào)道的技術(shù)(6)，用12nm黃金結(jié)合的第二抗人IgG抗體(JacksonImmunoresearchLtd.，WestGrove，.Pennsylvania，USA)檢測乳液油滴上的曲妥單抗。在曲妥單抗和黃金第二抗體之間的免疫反應(yīng)之后，就可以看見實(shí)際上是黃金納米微粒的黑點(diǎn)并使用射電顯微術(shù)進(jìn)行局部化。可以明顯地注意到，曲妥單抗位于乳液的油滴上。而且，單一油滴上的黑點(diǎn)數(shù)目接近多至5-6Ab分子/液滴。此外，乳液的外部水相中幾乎沒有自由黑點(diǎn)并且發(fā)生隨機(jī)結(jié)合。該結(jié)果證實(shí)ELISA發(fā)現(xiàn)。實(shí)施例3活性測定3.1.細(xì)胞培養(yǎng)研究在研究的全過程使用已知會過度表達(dá)HER2抗原的乳腺癌細(xì)胞，SK-BR3細(xì)胞(ATCC，Manassas，Virginia，USA)的沿用已久的細(xì)胞系模型以在評估曲妥單抗親和性和免疫乳液制品的比活性。3.2.結(jié)合研究將細(xì)胞固定于蓋玻片上，用5％BSA阻斷非特異性結(jié)合。然后，細(xì)胞與空白乳液或者免疫乳液(最終稀釋度1∶1000)培養(yǎng)過夜。使用PBS連續(xù)洗液3次以除去未結(jié)合的油滴，然后添加FITC-結(jié)合的抗人抗體(最終稀釋度1∶50)以檢測曲妥單抗。進(jìn)行一次額外的洗滌。使用Zeiss共焦顯微鏡檢驗(yàn)熒光。將抗體附著于乳液上并與細(xì)胞結(jié)合。此外，由于第二抗體識別曲妥單抗，表明制備過程之后曲妥單抗沒有變性。然而，為了使空白乳液也顯相，還用親脂性熒光探針香豆素-6(PolyscienceInc，Warrington，Pennsylvania)以油相中香豆素對類脂E801∶1000的比例標(biāo)記乳液(7)。將細(xì)胞固定于蓋玻片上，用5％BSA阻斷非特異性結(jié)合。在室溫下與標(biāo)記的空白乳液和免疫乳液(最終稀釋度1∶1000)培養(yǎng)超過1小時。用PBS連續(xù)洗滌細(xì)胞3次，然后使用共焦顯微鏡觀察。觀察到空白乳液和免疫乳液與SK-BR3細(xì)胞結(jié)合的定性顯著差異，其反映為熒光密度上的差異。可以明顯看出，免疫乳液廣泛地結(jié)合于細(xì)胞上，而在室溫下培養(yǎng)超過1小時后空白乳液的結(jié)合最低。為了證明，使用FACS分析(熒光激活細(xì)胞分類分析)進(jìn)行額外的研究。將細(xì)胞固定，單獨(dú)用曲妥單抗或者與免疫乳液(兩個樣品中曲妥單抗?jié)舛认嗤?培養(yǎng)超過1小時。用PBS連續(xù)洗滌細(xì)胞3次，然后添加FITC-結(jié)合的第二抗體(最終稀釋度1∶50)。再次用PBS洗滌細(xì)胞，然后通過FACS分析。顯然，與相同量的自由抗體相比，免疫乳液的親和程度為約5％。然而，與對照相比，發(fā)生顯著的油滴結(jié)合，并且可以促進(jìn)負(fù)載于陽離子油滴的顯著藥物用量的內(nèi)化。3.3.吸收研究將SK-BR3細(xì)胞在37℃與空白乳液或用香豆素-6標(biāo)記的免疫乳液培養(yǎng)不同時間5，15，30分鐘。用PBS連續(xù)洗滌細(xì)胞3次，然后固定并用Zeiss共焦顯微鏡檢測。可以明顯記錄到，空白乳液以最低程度與細(xì)胞結(jié)合，然而定性地免疫乳液更強(qiáng)烈地與細(xì)胞結(jié)合并且結(jié)合程度隨時間更加顯著。實(shí)施例4使用SMCC進(jìn)行的結(jié)合方法附圖2.說明，可以使用兩種不同方法將SMCC偶聯(lián)至硬脂酰胺(SA)上。首先制備乳液，并且將SMCC添加至乳液中，所以反應(yīng)會在O/W界面發(fā)生?；蛘?，SMCC可以首先附著于天然SA上，在乳液形成之前將新型偶聯(lián)劑摻入油相中。在第二階段中，1，4-二硫赤蘚糖醇(DTT)存在時在溫和條件下還原抗體。室溫下，2mg/mlPBS緩沖液中的抗體溶液與20mMDTT培養(yǎng)30分鐘，或與50nM半胱胺在37℃攪拌下培養(yǎng)1小時。然后，使用SephadexG25對部分還原的抗體溶液進(jìn)行凝膠過濾，以除去過量未反應(yīng)的DTT，并且用2.25％甘油溶液(不含PBS)替換溶液介質(zhì)。然后，將100g上述還原的抗體添加至10ml馬來酰亞胺衍生的乳液(活化的乳液)中，室溫下恒定攪拌過夜。實(shí)施例5使用SPDP進(jìn)行的結(jié)合方法附圖3.說明，首先將SPDP添加至乳液中，在O/W界面與SA的NH2部分反應(yīng)，形成二硫鍵。然后，所得的混合的二硫鍵與還原劑(DTT)反應(yīng)超過2小時，導(dǎo)致釋放吡啶二硫代丙酰結(jié)合物并且在液滴表面形成自由SH基團(tuán)。該過程結(jié)束后，進(jìn)行vivaspin20(10kDa)透析，以除去吡啶二硫代丙酰副產(chǎn)物、未反應(yīng)的DTT和任何可能過量的SPDP。然后所得乳液(具有自由SH基團(tuán))與活化的抗體(與SMCC反應(yīng)的IgG)培養(yǎng)，以產(chǎn)生最終的抗體-乳液結(jié)合物。實(shí)施例6ANB8LK的結(jié)合6.1.1.制備乳液如前所述制備AMB8LK免疫乳液。使用香豆素6探針制備熒光乳液。以1∶200的摩爾比將探針摻入乳液中。由于MCT濃度是5％(～97.6μmol/ml)，添加的香豆素6劑量是0.488μmol/ml。簡要地，SepharoseCL-4B分離之后，將4μl9.3mM香豆素6四氫呋喃(THF)溶液添加至500μl乳液中。混合物渦流并在37℃培養(yǎng)2小時。6.1.2.FACS分析對于FACS分析，Capan-1細(xì)胞系生長至融合。細(xì)胞用胰酶消化并以1200rpm離心5分鐘。除去上清液并添加1mlFACS緩沖液。整個過程中細(xì)胞始終置于冰上。洗滌FACS管中的1-2×105細(xì)胞并再次離心，然后將每個色斑置于100μlFACS緩沖液中，所述緩沖液以1∶1000的稀釋度含有不同乳液配方。在冰上培養(yǎng)30分鐘。再次洗滌細(xì)胞，離心并懸浮于0.5-1mlFACS緩沖液中。然后進(jìn)行FACS分析。6.1.3.熒光顯微學(xué)分析Capan-1細(xì)胞達(dá)到融合之后用胰酶消化，并且轉(zhuǎn)移(每孔105細(xì)胞)至用18mm蓋玻片覆蓋的16孔板上。將細(xì)胞粘附于蓋玻片24小時，37℃，5％CO2。24小時之后，棄去培養(yǎng)基，37℃下細(xì)胞與標(biāo)記的乳液對PBS1∶1000培養(yǎng)0，30和60分鐘。之后，使用新鮮的4％多聚甲醛固定10分鐘。棄去多聚甲醛并用PBS×3洗滌細(xì)胞。用50mMNH4ClPBS阻斷自身熒光5分鐘。再次用PBS×3洗滌細(xì)胞，并用熒光顯微鏡和共焦顯微鏡觀察。6.1.4.定量分析Capan-1細(xì)胞達(dá)到融合之后用胰酶消化，并且轉(zhuǎn)移(每孔105細(xì)胞)至24孔板上。37℃且5％CO2條件下，將細(xì)胞附著于平板直至達(dá)到融合。下一步，用各種標(biāo)記的乳液樣品與細(xì)胞(PBS中1∶1000)37℃培養(yǎng)超過45分鐘。用PBS×3洗滌細(xì)胞樣品，而不洗滌對照。使用BMGLabtechnologies的FluoStar-Galaxy測定平板的熒光，激發(fā)波長485nm且發(fā)射波長520nm。每個平板讀數(shù)4次并計(jì)算平均值。6.2.結(jié)果6.2.1.標(biāo)記乳液共焦顯微學(xué)觀察得出結(jié)論，即用香豆素6標(biāo)記油滴。6.2.2.比較AMB8LK免疫乳液和陽離子乳液(標(biāo)記的制劑)37℃時，它們與Capan-1細(xì)胞培養(yǎng)不同時間間隔0，30和60分鐘。使用共焦和熒光顯微鏡對兩種制劑進(jìn)行比較。6.2.3.陽離子乳液，陰離子乳液和免疫乳液的結(jié)合研究還使用FACS分析(4℃，30分鐘)研究不同乳液制劑的結(jié)合。所有制劑，除陰離子乳液之外，在4℃與Capan-1細(xì)胞系結(jié)合30分鐘。當(dāng)在37℃培養(yǎng)1小時時，可更好地觀察到陽離子乳液和AMB8LK免疫乳液之間差異。6.2.4.吸收研究使用FlouStar-Galaxy進(jìn)行熒光測定，以測定Capan-1細(xì)胞對乳液樣品的定量吸收。可以從附圖4的數(shù)據(jù)得知，與陰離子乳液相比較，滲透入細(xì)胞內(nèi)的乳液所包含的熒光親脂性探針的份額對于陽離子乳液更高。AMB8LK偶聯(lián)至陽離子乳液，不僅不阻止或降低熒光探針的吸收，反而顯著地增強(qiáng)(50％)探針的滲透，這清楚地表明內(nèi)化過程不僅僅被陽離子油滴的靜電效應(yīng)調(diào)節(jié)，而且被細(xì)胞受體調(diào)節(jié)的內(nèi)吞作用調(diào)節(jié)，所述內(nèi)吞作用是通過受AMB8LK單克隆抗體影響的細(xì)胞表面內(nèi)化受體配體進(jìn)行的。參考1.AllenTM.Ligand-targetedtherapeuticsinanticancertherapy.NatRevCancer.2002Oct；2(10)750-63.2.FarahRA，ClinchyB，HerreraL，VitettaES.Thedevelopmentofmonoclonalantibodiesforthetherapyofcancer，CritRevEukaryotGeneExpr.1998；8(3-4)321-56.3.OlayioyeMA.UpdateonHER-2asatargetforcancertherapyIntracellularsignalingpathwaysofErbB2/HER-2andfamilymembers.BreastCancerRes.2001；3(6)385-9.4.SlamonDJ，ClarkGM，WongSG，LevinWJ，UllrichA，McGuireWL.HumanbreastcancercorrelationofrelapseandsurvivalwithamplificationoftheHER-2andneuoncogene.Science，1987Jan.9；235(4785)177-82.5.SlamonDJ，GodolphinW，JonesLA，HoltJA，WongSG，keithDE，LevinWJ，StuartSG，UdoveJ，UllrichA，etal.StudiesoftheHER-2/neuproto-oncogeneinhumanbreastandovariancancer.Science.1989May12；244(4905)707-12.6.RossJS，GrayK，GrayGS，WorlandPJ，RolfeM.Anticancerantibodies，AmJClinPathol.2003Apr；119(4)472-85.7.MerlinJL，Barberi-HeyobM，Invitrocomparativeevaluationoftrastuzumab(Herceptin)combinedwithpaclitaxel(Taxol)ordocetaxel(Taxotere)inHER2-expressinghumanbreastcancercelllines.AnnOncol.2002；13(11)1743-8.8.NishimuraR，NagaoK，MiyayamaH，OkazakiS，NakagawaK，F(xiàn)ujimuraY.AcaseofrecurrentbreastcancerwithlungmetastasisandoverexpressionofHER2thatrespondedtoUFTandcyclophosphamidecombinationtherapyaftersequentialtreatmentswithepirubicin，taxanes，andtrastuzumab，GanToKagakuRyoho.2003Jun；30(6)879-82.9.KadoucheJ，LevyR.Utilisationd’anticorpsmonoclonauxanti-ferritiensdansletraitementdecertainscancers.2002.FR0000718.10.VriesendorpHM，QuadriSM.Radiolabeledimmunoglobulintherapyoldbarriersandnewopportunities.ExpertRevAnticancerTher.2001Oct；1(3)461-78.11.AlanR，etal.DistributionofmonoclonalantiferritinantibodyinKaposi’ssarcoma，Hodjkin’sdiseaseandhepatocellularcareinoma.HumanPathology.2003April；34381-84.12.ParkJW，KirpotinDB，HongK，ShalabyR，ShaoY，NielsenUB，MarksJD，PapahadjopoulosD，BenzCC.Tumortargetingusinganti-her2immunoliposomes.JControlRelease.2001Jul6；74(1-3)95-113.13.ParkJW，HongK，KirpotinDB，ColbernG，ShalabyR，BaselgaJ，ShaoY，NielsenUB，MarksJD，MooreD，PapahadjopoulosD，BenzCC.Anti-HER2immunoliposomesenhancedefficacyattributabletotargeteddelivery.ClincancerRes.2002Apr；8(4)1172-81.14.NamSM，KimHS，AhnWS，ParkYS.Stericallystabilizedanti-G(M3)，anti-Le(X)immunoliposomestargetingtoB16BL6，HRT-18cancercells.OncolRes.1999；11(1)9-16.15.MaruyamaK，TakahashiN，TagawaT，NagaikeK，IwatsuruM.Immunoliposomesbearingpolyethyleneglycol-coupledFab’fragmentshowprolongedcirculationtimeandhighextravasationintotargetedsolidtumorsinvivo.FEBSLett.1997Aug11；413(1)177-80.16.KoningGA，MorseltHW，VelinovaMJ，DongaJ，GorterA，AllenTM，ZalipskyS，KampsJA，ScherphofGL.Selectivatransferofalipophilicprodrugof5-fluorodeoxyuridinefromimmunoliposomestocoloncancercells.BiochimBiophysActa.1999Aug20；1420(1-2)153-67.17.LopesdeMenezesDE，PilarskiLM，AllenTM.InvitroandinvivotargetingofimmunoliposomaldoxorubicintohumanB-celllymphoma，CancerRes.1998Aug1；58(15)3320-30.18.MastrobattistaE，StormG，vanBlooisL，ReszkaR，BloemenPG，CrommelinDJ，HenricksPA.Cellularuptakeofliposomestargetedtointercellularadhesionmolecule-1(ICAM-1)onbronchialepithelialcells.BiochimBiophysActa.1999Jul15；1419(2)353-63.19.MastrobattistaE，KoningGA，StormG.Immunoli[osomesforthetargeteddeliveryofantitumordrugs.AdvDrugDelivRev.1999Nov10；40(1-2)103-127.20.ConstantinidesPP，LambertKJ，TustianAK，SchneiderB，LaljiS，MaW，WentzelB，KesslerD，WorahD，QuaySC.Formulationdevelopmentandantitumoractivityofafilter-sterilizableemulsionofpaclitaxel.PharmRes.2000Feb；17(2)175-82.21.LundbergBB，GriffithsG，HansenHJ.Conjugationofananti-B-celllymphomamonoclonalantibody，LL2，tolong-circulatingdrug-carrierlipidemulsions.JPharmPharmacol.1999Oct；51(10)1099-105.22.ShiChengYang，SimonBenita.Enhancedabsorptionanddrugtargetingbypositivelychargedsubmicronemulsions，DrugDev.Res.2000.50476-486.23.BenitaS.Preventionoftopicalandocularoxidativestressbypositivelychargedsubmicronemulsion.Biomedpharmacother.1999May；53(4)193-206.24.EzraR，BenitaS，GinsburgI，KohenR.Preventionofoxidativedamageinfibroblastcellculturesandratskinbypositively-chargedsubmicronemulsionofα-tocopherol.Eur.J.Pharm.Biopharm.1996；42(4)291-298.25.HewittRE，PoweDG，CarterGI，TurnerDR，PriceJE.Basementmembranecollagen-IVsynthesisincolorectaltumours.IntJCancer.1992Jun19；51(4)530-6.26.HazardJT，DrysdaleJW.Ferritinaemiaincancer.Nature，1977Feb24；265(5596)755-6.27.VaughnGB，WeinsteinR，BondB，RiceR，VaughnRW，McKendrickA，AyadG，RockwellMA，RocchioR.Ferritincontentinhumancancerousandnoncancerouscolonictissue.CancerInvest.1987；5(1)7-10.28.CohenC，ShulmanG，BudgeonLR，Immunohistochemicalferritinintesticularseminoma.Cancer.1984Nov15；54(10)2190-4.29.GunerG，KirkaliG，Yenisey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