專利名稱：脂質(zhì)體制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于給藥系統(tǒng)的脂質(zhì)體制劑。
背景技術(shù)：
近年，正在積極研究將藥物安全且有效率地送達(dá)·分布到目標(biāo)病灶部位的給藥系統(tǒng)(DDS)。作為上述方法之一，研究將脂質(zhì)體、乳劑、脂質(zhì)微球、納米微粒等封閉囊泡用作藥物的搬運體(載體)。但是，使用封閉囊泡的DDS的實用化時存在需要克服的各種問題，其中，回避生物體內(nèi)的異物識別機構(gòu)及控制體內(nèi)動態(tài)是重要的?？傊?，為了將封閉囊泡高選擇性地送達(dá)目標(biāo)部位，必須避免被肝臟、脾臟等的網(wǎng)狀內(nèi)皮組織(RES)捕獲，防止血液中的調(diào)理素蛋白質(zhì)或血漿蛋白質(zhì)等的相互作用(吸附)導(dǎo)致的凝集，提高血中穩(wěn)定性。
作為解決該課題的方法，已知用親水性高分子進(jìn)行膜修飾的方法。被親水性高分子修飾的封閉囊泡、特別是脂質(zhì)體能夠取得較高的血中滯留性，因而能夠被動蓄積在腫瘤組織或炎癥部位等血管透過性亢進(jìn)的組織內(nèi)，該方法已經(jīng)開始實用化(參見專利文獻(xiàn)1～3及非專利文獻(xiàn)3～5等)。作為用親水性高分子進(jìn)行膜修飾時使用的修飾劑，通常優(yōu)選使用在聚乙二醇(PEG)上鍵合有磷脂或膽固醇等脂質(zhì)的聚乙二醇衍生物?？蓮纳虡I(yè)渠道購入的常用修飾劑為鍵合了二?；字Ｒ掖及返攘字木垡叶佳苌?。
實施了上述修飾的脂質(zhì)體為由脂質(zhì)雙層膜形成的封閉囊泡，在上述囊泡空間內(nèi)包含水相(內(nèi)水相)。脂質(zhì)體已知有由脂質(zhì)雙層膜層的單層膜構(gòu)成的單層囊泡(Small Unilamellar Vesicle，SUV、LargeUnilamella Vesicle，LUV)及由多層膜構(gòu)成的多層囊泡(MultilamellarVesicle，MLV)等膜結(jié)構(gòu)。為了抑制內(nèi)包在脂質(zhì)體內(nèi)的藥物泄漏，還提出了將脂質(zhì)體的膜結(jié)構(gòu)制成MLV膜的方案(參見專利文獻(xiàn)4)。
另外，將藥物封入上述脂質(zhì)體內(nèi)的方法各種各樣，但是已知只要采用pH梯度法等離子梯度法(參見專利文獻(xiàn)5～7、非專利文獻(xiàn)6等)即可高濃度地封入藥物。
專利文獻(xiàn)1特表平5-505173號公報專利文獻(xiàn)2特公平7-20857號公報專利文獻(xiàn)3專利第2667051號公報專利文獻(xiàn)4國際公開01/000173號說明書專利文獻(xiàn)5美國專利第5077056號說明書專利文獻(xiàn)6專利第2847065號公報專利文獻(xiàn)7專利第2659136號公報非專利文獻(xiàn)1Cancer Lett.，1997，118(2)，p.153非專利文獻(xiàn)2Br.J.Cancer.，1997，76(1)，p.83非專利文獻(xiàn)3D.D.Lasic 著《LIPOSOMES from Physics toApplications》，Elsevier，1993非專利文獻(xiàn)4Martin C.Woodle，Gerrit Storm編《Long CirculatingLiposomesOld Drugs，New Therapeutics》，Springer，1997非專利文獻(xiàn)5D.D.Lasic、D.Papahadjopoulos 編《MedicalApplications of LIPOSOMES》，Elsevier，1998非專利文獻(xiàn)6G.Gregoriadis編《Liposome Technology LiposomePreparation and Related Techniques》2nd edition，Vol.I-III，CRC Press發(fā)明內(nèi)容上述脂質(zhì)體載帶的藥物中，有在高于中性條件的pH范圍中穩(wěn)定性差的藥物，這種情況下，為了將藥物導(dǎo)入脂質(zhì)雙層膜中、進(jìn)入內(nèi)水相，必須將脂質(zhì)體的內(nèi)水相保持為酸性。另外，利用pH梯度將弱堿性的藥物封入(載帶)到脂質(zhì)體內(nèi)時，使用檸檬酸緩沖液將內(nèi)水相調(diào)節(jié)成pH為4左右的酸性條件，加熱到脂質(zhì)體主膜材的相轉(zhuǎn)移點以上的溫度(例如60℃左右)。但是，如上所述地操作使脂質(zhì)體內(nèi)為酸性條件，根據(jù)需要將其暴露在高溫中，在制造時及保存期間，可能因膜劣化導(dǎo)致穩(wěn)定性降低。著眼于上述問題，針對將必須在酸性中保持的藥物載帶在特別是經(jīng)親水性高分子進(jìn)行了膜修飾的脂質(zhì)體中得到的脂質(zhì)體制劑的保存性進(jìn)行研究時，發(fā)現(xiàn)與未修飾的脂質(zhì)體相比，幾種經(jīng)親水性高分子修飾的脂質(zhì)體在制造時或保存期間所載帶的藥劑容易發(fā)生分解，結(jié)果容易破壞作為脂質(zhì)體制劑的保存穩(wěn)定性。本發(fā)明的目的在于基于上述認(rèn)知提供一種脂質(zhì)體制劑，該脂質(zhì)體制劑在將必須在酸性中保持的藥物或因用于封入藥物的方法導(dǎo)致被保持在酸性條件下的藥物載帶在特別是經(jīng)親水性高分子進(jìn)行了膜修飾的脂質(zhì)體中的情況下，能夠在保持親水性高分子本來的膜修飾效果的同時，具有優(yōu)異的膜穩(wěn)定性和優(yōu)異的保存穩(wěn)定性。
本發(fā)明人鑒于上述情況，進(jìn)一步研究了在以普通的磷脂為主膜材、經(jīng)親水性高分子進(jìn)行了膜修飾的脂質(zhì)體中、將必須在酸性環(huán)境下保持的藥物保持在內(nèi)水相中的脂質(zhì)體制劑，發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)在內(nèi)水相的酸性環(huán)境中水解，結(jié)果容易破壞作為脂質(zhì)體制劑的保存穩(wěn)定性?；谏鲜霭l(fā)現(xiàn)進(jìn)行了進(jìn)一步研究，發(fā)現(xiàn)保存穩(wěn)定性容易被破壞的脂質(zhì)體制劑是膜內(nèi)外表面均被親水性高分子修飾的脂質(zhì)體制劑。由此想到僅將脂質(zhì)體的外表面用親水性高分子修飾即可。進(jìn)而確認(rèn)上述結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)體制劑即使內(nèi)水相為酸性環(huán)境也能夠確保保存穩(wěn)定性。而且，發(fā)現(xiàn)用含有氨基、脒基、胍基等的堿性化合物(陽離子化劑)進(jìn)行膜修飾時，即使內(nèi)水相為酸性環(huán)境也具有穩(wěn)定脂質(zhì)體膜的效果，因此含有上述堿性化合物作為膜成分的脂質(zhì)體制劑的保存穩(wěn)定性優(yōu)異，從而完成了下述的本發(fā)明。
(1)一種脂質(zhì)體制劑，該脂質(zhì)體具有由含有磷脂作為主膜材的脂質(zhì)雙層膜形成的單層囊泡和存在于該囊泡內(nèi)的pH為5以下的內(nèi)水相，并且載帶有藥物，其中，上述囊泡僅外表面被親水性高分子修飾。
(2)上述(1)所述的脂質(zhì)體制劑，其中，上述藥物是在pH大于5的pH范圍內(nèi)不穩(wěn)定的藥物。
(3)上述(1)或(2)所述的脂質(zhì)體制劑，其中，該脂質(zhì)體制劑至少以0.05mol藥物/mol脂質(zhì)的濃度載帶上述藥物。
(4)上述(1)或(2)所述的脂質(zhì)體制劑，其中，該脂質(zhì)體制劑至少以0.1mol藥物/mol脂質(zhì)的濃度載帶上述藥物。
(5)上述(1)～(4)中的任一項所述的脂質(zhì)體制劑，其中，上述主膜材是相轉(zhuǎn)移點為50℃以上的磷脂。
(6)上述(1)～(5)中的任一項所述的脂質(zhì)體制劑，其中，上述磷脂為被氫化的磷脂。
(7)上述(1)～(5)中的任一項所述的脂質(zhì)體制劑，其中，上述磷脂為鞘磷脂。
(8)上述(1)～(7)中的任一項所述的脂質(zhì)體制劑，其中，作為上述脂質(zhì)雙層膜的膜成分，還含有上述磷脂以外的其他脂質(zhì)類。
(9)上述(6)或(7)所述的脂質(zhì)體制劑，其中，作為上述脂質(zhì)雙層膜的膜成分，還含有膽固醇。
(10)上述(1)～(9)中的任一項所述的脂質(zhì)體制劑，其中，作為上述脂質(zhì)雙層膜的膜成分，還含有具有選自氨基、脒基及胍基的基團(tuán)的堿性化合物。
(11)上述(10)所述的脂質(zhì)體制劑，其中，上述堿性化合物為3，5-二(十五烷氧基)芐脒鹽酸鹽。
(12)上述(1)～(11)中的任一項所述的脂質(zhì)體制劑，其中，上述親水性高分子為分子量500～10000道爾頓的聚乙二醇。
(13)上述(1)～(12)中的任一項所述的脂質(zhì)體制劑，其中，上述親水性高分子以親水性高分子的磷脂或膽固醇衍生物的形式導(dǎo)入。
(14)上述(1)～(13)中的任一項所述的脂質(zhì)體制劑，其中，上述脂質(zhì)體制劑的平均粒徑為40～140nm左右。
(15)上述(1)～(13)中的任一項所述的脂質(zhì)體制劑，其中，上述脂質(zhì)體制劑的平均粒徑為50～130nm。
(16)上述(1)～(13)中的任一項所述的脂質(zhì)體制劑，其中，上述脂質(zhì)體制劑的平均粒徑為60～120nm。
(17)上述(1)～(16)中的任一項所述的脂質(zhì)體制劑，其中，內(nèi)水相的pH為2～5。
(18)上述(1)所述的脂質(zhì)體制劑的制造方法，上述脂質(zhì)體制劑的制造方法為調(diào)制含有磷脂的脂質(zhì)雙層膜的單層結(jié)構(gòu)的囊泡，使內(nèi)水相的pH為5以下，然后，添加親水性高分子脂質(zhì)衍生物僅修飾上述囊泡的外表面，在調(diào)制囊泡時在內(nèi)水相中預(yù)先添加藥物、或在調(diào)制囊泡后使藥物從囊泡外通過上述脂質(zhì)雙層膜進(jìn)入囊泡內(nèi)，封入藥物封入藥物，從而使其載帶藥物。
(19)上述(18)所述的脂質(zhì)體制劑的制造方法，其中，在調(diào)制囊泡后，利用離子梯度法使藥物從囊泡外通過上述脂質(zhì)雙層膜進(jìn)入囊泡內(nèi)而封入藥物。
如果采用上述特定結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)體，則與膜內(nèi)外雙方均添加親水性高分子進(jìn)行膜修飾時相比，能夠以整體相對較低的修飾率表現(xiàn)出親水性高分子的效果。即，由于不含有無用的修飾，因此脂質(zhì)體膜的穩(wěn)定性優(yōu)異，另外，能夠抑制酸性環(huán)境下的內(nèi)水相中脂質(zhì)不必要的水解。特別是本發(fā)明的脂質(zhì)體制劑受上述制約使保持在酸性環(huán)境下的內(nèi)水相在制劑的構(gòu)造方面確實地排除了不必要的結(jié)構(gòu)，隨之抑制不必要的脂質(zhì)水解，因而能夠抑制制造時及保存時的分解、高濃度地穩(wěn)定載帶內(nèi)封的藥物，且能夠在保持親水性高分子本來具有的高血中滯留性等膜修飾效果的同時、具有優(yōu)異的保存穩(wěn)定性。由上述特征可知，本發(fā)明的脂質(zhì)體制劑具有治療及/或診斷疾病的效果。
圖1表示親水性高分子脂質(zhì)衍生物(PEG5000-DSPE)的穩(wěn)定試驗后的TLC照片。
圖2表示親水性高分子脂質(zhì)衍生物(PEG5000-DSPE)的穩(wěn)定試驗后的TLC照片。
圖3表示保存試驗中的PEG5000-DSPE的殘留率。
圖4表示保存試驗中的HSPC分解物的比例(％)。
圖5表示保存試驗中的HSPC分解物的比例(％)。
具體實施例方式
下面更詳細(xì)地說明本發(fā)明。
脂質(zhì)體為由磷脂雙層膜構(gòu)成的封閉囊泡，在該囊泡空間內(nèi)含有水相(內(nèi)水相)。脂質(zhì)體制劑是以該脂質(zhì)體為載體、在其中載帶藥物的制劑。如上所述，脂質(zhì)體已知有由單層脂質(zhì)雙層膜構(gòu)成的單層(單張膜)囊泡(SUV、LUV)及由多層脂質(zhì)雙層膜構(gòu)成的多層囊泡(MLV)等，本發(fā)明的脂質(zhì)體為單層膜。其中，特別是LUV(large unilamellarvesicle)脂質(zhì)體。也優(yōu)選SUV(small unilamellar vesicle)。
需要說明的是，本發(fā)明中，構(gòu)成脂質(zhì)體制劑的整個囊泡中，單層囊泡所占的比例用存在比表示為整體的50％以上，優(yōu)選為80％以上。
另外，本發(fā)明中載帶藥劑的脂質(zhì)體含有pH5以下的內(nèi)水相，且單層脂質(zhì)雙層膜如下所述具有僅其外膜表面被親水性高分子選擇性地進(jìn)行了表面修飾的特定膜修飾結(jié)構(gòu)。
上述脂質(zhì)雙層膜至少含有磷脂作為其主膜材。
一般而言，磷脂是分子內(nèi)具有由長鏈烷基構(gòu)成的疏水性基團(tuán)和由磷酸基構(gòu)成的親水性基團(tuán)的兩親性物質(zhì)。作為本發(fā)明中使用的磷脂，可以舉出磷脂酰膽堿(＝卵磷脂)、磷脂酰甘油、磷脂酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰肌醇等甘油磷脂；鞘磷脂(Sphingomyelin)等鞘磷脂類；心磷脂等天然或合成的雙磷脂酰基類磷脂及上述物質(zhì)的衍生物；按常規(guī)方法對上述物質(zhì)進(jìn)行氫化處理得到的物質(zhì)(例如氫化大豆磷脂酰膽堿)等。以下也將上述磷脂稱為“磷脂類”。
其中，優(yōu)選氫化大豆磷脂酰膽堿(HSPC)等氫化磷脂、鞘磷脂(SM)等。
脂質(zhì)體可以含有一種磷脂或多種磷脂作為主膜材。
另外，脂質(zhì)體優(yōu)選使用相轉(zhuǎn)移溫度高于生物體內(nèi)溫度(35～37℃)的磷脂作為主膜材。原因在于通過使用上述磷脂，在保存時或在血液等生物體中，能夠使封入脂質(zhì)體內(nèi)的藥物不易由脂質(zhì)體漏出到外部。上述脂質(zhì)體優(yōu)選在主膜材的相轉(zhuǎn)移溫度以上的溫度下進(jìn)行制造。原因在于在低于主膜材的相轉(zhuǎn)移溫度的溫度下難以控制粒徑。例如，主膜材的相轉(zhuǎn)移溫度為50℃左右時，優(yōu)選在50～80℃左右、更具體而言在60～70℃左右下進(jìn)行制造。
只要是能夠穩(wěn)定地形成本發(fā)明的特定形態(tài)的脂質(zhì)體的物質(zhì)，也可以與上述主膜材一同，含有其他膜成分。例如，優(yōu)選含有磷脂以外的脂質(zhì)或其衍生物(以下也稱為其他脂質(zhì)類)、與上述磷脂一同形成由混合脂質(zhì)構(gòu)成的膜。
作為其他脂質(zhì)類，可以舉出不含磷酸的脂質(zhì)，沒有特別限定，可以舉出甘油糖脂、鞘糖脂及作為穩(wěn)定化劑的后述膽固醇等甾醇等及上述物質(zhì)的氫化物等衍生物。脂質(zhì)體優(yōu)選由含有作為主膜材的磷脂和其他脂質(zhì)類的混合脂質(zhì)形成的膜構(gòu)成。
構(gòu)成脂質(zhì)雙層膜的膜脂質(zhì)整體中，作為主膜材的磷脂的比例通常為20～100mol％，優(yōu)選為40～100mol％。
另外，上述其他脂質(zhì)類在膜脂質(zhì)整體中的比例通常為0～80mol％，優(yōu)選為0～60mol％。
本發(fā)明中，上述脂質(zhì)雙層膜的外膜側(cè)被親水性高分子選擇性地修飾。作為親水性高分子，沒有特別限定，可以舉出聚乙二醇、聚甘油、聚丙二醇、聚蔗糖、聚乙烯醇、苯乙烯-馬來酸酐交替共聚物、二乙烯基醚-馬來酸酐交替共聚物、聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙烯基甲基醚、聚乙烯基甲基噁唑啉、聚乙基噁唑啉、聚羥丙基噁唑啉、聚羥丙基甲基丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、聚二甲基丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸羥丙基酯、聚丙烯酸羥乙基酯、羥甲基纖維素、羥乙基纖維素、聚天冬酰胺、合成聚氨基酸等。
需要說明的是上述親水性高分子未與脂質(zhì)鍵合一側(cè)的末端被烷氧基化(例如甲氧基化、乙氧基化、丙氧基化)的物質(zhì)具有優(yōu)異的保存穩(wěn)定性，故而優(yōu)選。
其中，從具有使制劑具有優(yōu)異的血中滯留性的效果方面考慮，優(yōu)選聚乙二醇(PEG)、聚甘油(PG)、聚丙二醇(PPG)。
PEG的分子量沒有特別限定。PEG的分子量通常為500～10,000道爾頓、優(yōu)選為1,000～7,000道爾頓、更優(yōu)選為2,000～5,000道爾頓。
PG的分子量沒有特別限定。PG的分子量通常為100～10000道爾頓、優(yōu)選為200～7000道爾頓、更優(yōu)選為400～5000道爾頓。
PPG的分子量沒有特別限定。PPG的分子量通常為100～10,000道爾頓、優(yōu)選為200～7,000道爾頓、更優(yōu)選為1,000～5,000道爾頓。
其中，聚乙二醇是最常用的物質(zhì)，具有提高血中滯留性的效果，優(yōu)選使用。
聚乙二醇是具有-(CH2CH2O)n-重復(fù)結(jié)構(gòu)的直鏈狀高分子。聚乙二醇是具有在水中、有機溶劑中均可溶的兩親性(amphipathicproperty)的高分子，且毒性低，因此廣泛用于穩(wěn)定醫(yī)藥品、改善體內(nèi)動態(tài)。在被已知毒性低的聚乙二醇修飾的載體(例如脂質(zhì)體)中載帶藥物得到的藥物載體(例如脂質(zhì)體制劑)的安全性高。
需要說明的是，本發(fā)明中的“血中滯留性”是指在給予了例如藥物載體的宿主中，藥物以內(nèi)封在載體內(nèi)的狀態(tài)存在于血液中的性質(zhì)。
藥物一旦從載體中釋放出來，將迅速從血中消失、暴露。如果血中滯留性良好，則可以更少量地給予藥物。
另外，本發(fā)明中的“暴露”是指釋放到載體外部的藥物作用于外部環(huán)境。具體而言，被釋放出的藥物靠近、接觸目標(biāo)部位，從而發(fā)揮其作用(例如抗腫瘤效果)。藥物作用于目標(biāo)部位，顯示出局部作用于目標(biāo)部位的處于進(jìn)行DNA合成的細(xì)胞周期的細(xì)胞等所期待的效果。
上述脂質(zhì)體如下所述在形成脂質(zhì)雙層膜的單層囊泡的未修飾脂質(zhì)體后，只要利用親水性高分子從外部修飾膜表面，就可以僅對脂質(zhì)雙層膜的外膜進(jìn)行選擇性的表面修飾。此時，如果使用親水性高分子脂質(zhì)衍生物作為用于導(dǎo)入親水性高分子的修飾劑，則由于親水性高分子部分處于向外方突出的狀態(tài)，作為疏水性部分的脂質(zhì)部分進(jìn)入脂質(zhì)體的脂質(zhì)雙層膜中，被穩(wěn)定地保持，因此能夠使與脂質(zhì)鍵合的親水性高分子存在、分布于脂質(zhì)體的脂質(zhì)雙層膜的外膜表面。
上述親水性高分子脂質(zhì)衍生物的脂質(zhì)(疏水性部分)沒有特別限定。例如可以舉出具有疏水性區(qū)域的化合物(疏水性化合物)。作為疏水性化合物，可以舉出下述構(gòu)成混合脂質(zhì)的磷脂、甾醇等其他脂質(zhì)類、或直鏈脂肪醇、直鏈脂肪胺、甘油脂肪酸酯等。其中，磷脂為優(yōu)選方案之一。
上述磷脂中包含的酰基鏈優(yōu)選為飽和脂肪酸。?；湹逆滈L優(yōu)選為C14-C20，進(jìn)一步優(yōu)選為C16-C18。作為?；湥缈梢耘e出二棕櫚酰基、二硬脂酰基、棕櫚酰基硬脂?；?br>
磷脂沒有特別限定。作為磷脂，例如可以使用具有能夠與上述親水性高分子反應(yīng)的官能團(tuán)的磷脂。作為具有能夠與上述親水性高分子反應(yīng)的官能團(tuán)的磷脂的具體例，可以舉出具有氨基的磷脂酰乙醇胺、具有羥基的磷脂酰甘油、具有羧基的磷脂酰絲氨酸。使用上述磷脂酰乙醇胺為優(yōu)選方案之一。
親水性高分子的脂質(zhì)衍生物由上述親水性高分子和上述脂質(zhì)衍生而成。親水性高分子與脂質(zhì)的組合沒有特別限定，可以使用根據(jù)目的適當(dāng)組合的親水性高分子與脂質(zhì)。例如可以舉出從磷脂、甾醇等其他脂質(zhì)類、直鏈脂肪醇、直鏈脂肪胺、甘油脂肪酸酯中選出的至少1種物質(zhì)與從PEG、PG、PPG中選出的至少1種物質(zhì)結(jié)合而成的親水性高分子的衍生物。親水性高分子為PEG時，作為脂質(zhì)，選擇磷脂、膽固醇是優(yōu)選方案之一。作為上述組合得到的PEG的脂質(zhì)衍生物，例如可以舉出PEG的磷脂衍生物或PEG的膽固醇衍生物。
親水性高分子的脂質(zhì)衍生物可以根據(jù)脂質(zhì)的選擇而選擇為正電荷、負(fù)電荷或中性。例如，作為脂質(zhì)選擇DSPE時，得到受磷酸基的影響而顯示負(fù)電荷的脂質(zhì)衍生物，作為脂質(zhì)選擇膽固醇時，得到中性的脂質(zhì)衍生物。脂質(zhì)可以根據(jù)目的進(jìn)行選擇。
本發(fā)明中，上述列舉的親水性高分子的脂質(zhì)衍生物中，可以舉出PEG的磷脂衍生物作為優(yōu)選方案之一。作為PEG的磷脂衍生物的具體例，可以舉出聚乙二醇-二硬脂?；字Ｒ掖及?PEG-DSPE)。PEG-DSPE是常用的化合物，容易購入，故而優(yōu)選。
上述親水性高分子的脂質(zhì)衍生物可以按照現(xiàn)有的公知方法進(jìn)行制備。合成作為親水性高分子的脂質(zhì)衍生物之一例的PEG的磷脂衍生物的方法例如可以舉出使用催化劑使具有能夠與PEG反應(yīng)的官能團(tuán)的磷脂與PEG反應(yīng)的方法。作為該催化劑，例如可以舉出氰尿酰氯、碳二亞胺、酸酐、戊二醛。通過上述反應(yīng)，使上述官能團(tuán)與PEG共價鍵合，可以得到PEG的磷脂衍生物。
本發(fā)明中，脂質(zhì)體可以含有一種上述親水性高分子或親水性高分子的脂質(zhì)衍生物，也可以含有上述物質(zhì)中的2種以上的組合。
上述親水性高分子脂質(zhì)衍生物對膜脂質(zhì)(總脂質(zhì))的修飾率以相對于膜脂質(zhì)的比率表示，通常為0.1～20mol％、優(yōu)選為0.1～5mol％、更優(yōu)選為0.5～5mol％。需要說明的是，內(nèi)封有在肝臟內(nèi)發(fā)揮作用的藥劑等血中滯留性并非特別必要的情況下，以脂質(zhì)體制劑保存時的穩(wěn)定性為主要目的，優(yōu)選將修飾率設(shè)定為0.25～5mol％。
此處的總脂質(zhì)是指親水性高分子脂質(zhì)衍生物以外的構(gòu)成膜的全部脂質(zhì)的總量，具體而言包括磷脂類及其他脂質(zhì)類，還含有其他表面修飾劑時也包括該表面修飾劑。
使用上述親水性高分子的脂質(zhì)衍生物進(jìn)行了表面修飾的脂質(zhì)體能夠防止血漿中的調(diào)理素蛋白質(zhì)等吸附在該脂質(zhì)體的表面，提高該脂質(zhì)體的血中穩(wěn)定性，避免被RES捕捉，能夠提高對作為藥物的送達(dá)目標(biāo)的組織或細(xì)胞的送達(dá)率。
特別是在本發(fā)明中，脂質(zhì)體是在親水性高分子僅分布在脂質(zhì)體外表面的條件下形成的，脂質(zhì)雙層膜的外膜被上述親水性高分子選擇性地修飾。上述脂質(zhì)體中，其外膜表面的親水性高分子鏈朝向脂質(zhì)體外部地分布，而脂質(zhì)雙層膜的內(nèi)水相側(cè)內(nèi)膜未被表面修飾，因此親水性高分子鏈實質(zhì)上未分布在內(nèi)水相中。如果采用上述分布結(jié)構(gòu)，則即使內(nèi)水相為酸性條件，與雙層膜的內(nèi)外膜兩側(cè)均分布有親水性高分子相比，也能夠確保膜的穩(wěn)定性。另外，與雙層膜的內(nèi)外膜兩側(cè)均分布有親水性高分子的脂質(zhì)體相比，以總量較少的親水性高分子即可獲得血中穩(wěn)定性的效果。
本發(fā)明的脂質(zhì)體除上述磷脂、其他脂質(zhì)、親水性高分子及其脂質(zhì)衍生物外，還可以在不影響本發(fā)明目的的范圍內(nèi)含有能夠保持上述膜結(jié)構(gòu)、可以包含在脂質(zhì)體內(nèi)的其他膜成分。
作為其他膜成分，可以舉出用于改變脂質(zhì)的物性、賦予載體的膜成分所希望的特性的上述親水性高分子以外的表面修飾劑。對其他表面修飾劑沒有特別限定，可以舉出在脂質(zhì)上鍵合上述親水性高分子以外的化合物得到的物質(zhì)。
對親水性高分子以外的化合物沒有特別限定，例如可以舉出葡糖醛酸、唾液酸、葡聚糖、茁霉多糖(pullulan)、直鏈淀粉、支鏈淀粉、脫乙酰殼多糖、甘露聚糖、環(huán)糊精、果膠、角叉菜膠等水溶性多糖類；具有酸性官能團(tuán)的化合物；具有氨基、脒基、胍基等堿性官能團(tuán)的堿性化合物等。
特別是在本發(fā)明中可以含有上述化合物中的堿性化合物作為抑制脂質(zhì)水解的物質(zhì)。已知脂質(zhì)通常因溫度、pH而發(fā)生水解。特別是Sn-1和Sn-2位的脂肪酸酯容易水解，分解成溶血脂質(zhì)及脂肪酸(Grit等，Chem.Phys.Lipids 64，3-18，1993)。上述分解物使現(xiàn)有的脂質(zhì)膜組成混亂，導(dǎo)致脂質(zhì)膜的透過性增加，破壞脂質(zhì)體的穩(wěn)定性。
因此，特別是為了將必須在酸性環(huán)境中保持的藥劑保持在內(nèi)水相中，必須提高脂質(zhì)在酸性環(huán)境中的穩(wěn)定性，本發(fā)明中通過使膜中含有堿性化合物，使脂質(zhì)體表面帶正電，從而能夠抑制脂質(zhì)的水解。
對堿性化合物沒有特別限定，可以舉出十八胺(ODA)、N-甲基-正十八胺(MODA)、N，N-二甲基-正十八胺(DMODA)、溴化硬脂酰三甲基銨(TMODA)等胺(也包括銨鹽)化合物。含有TMODA等季銨鹽的脂質(zhì)衍生物在低濃度下即可使脂質(zhì)膜表面帶正電，故優(yōu)選。
另外，作為堿性化合物，還可以舉出特開昭61-161246號中公開的DOTMA、特表平5-508626號中公開的DOTAP、特開平2-292246號中公開的陽離子脂質(zhì)體(Transfectam)、特開平4-108391號中公開的TMAG、國際公開第97/42166號中公開的3，5-二(十五烷氧基)芐脒鹽酸鹽、DOSPA、TfxTM-50、DDAB、DC-CHOL、DMRIE等化合物。
上述其他表面修飾劑是在脂質(zhì)上鍵合了具有堿性官能團(tuán)的化合物的物質(zhì)時，被稱為陽離子化脂質(zhì)。陽離子化脂質(zhì)的脂質(zhì)部分在脂質(zhì)體的脂質(zhì)雙層膜中被穩(wěn)定化，堿性官能團(tuán)部分可以存在于載體的脂質(zhì)雙層的膜表面上(外膜表面上及/或內(nèi)膜表面上)。通過用陽離子化脂質(zhì)對膜進(jìn)行修飾，可以提高脂質(zhì)體膜與細(xì)胞的結(jié)合性等。
本發(fā)明中，上述脂質(zhì)體的內(nèi)水相為pH5以下、優(yōu)選為pH2～pH5、更優(yōu)選為pH3～pH5、特別優(yōu)選為約pH4。由此可以穩(wěn)定地載帶pH超過5時不穩(wěn)定的藥物。內(nèi)水相的pH可以在調(diào)制脂質(zhì)體時用生物體內(nèi)能夠接受的生理性pH緩沖液進(jìn)行調(diào)節(jié)。
可以使上述脂質(zhì)體載帶各種藥物。例如作為用于治療的藥物，具體可以舉出核酸、多核苷酸、基因及其類似物、抗癌劑、抗生素、酶制劑、抗氧化劑、脂質(zhì)攝入抑制劑、激素制劑、抗炎劑、甾族化合物制劑、血管擴(kuò)張劑、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑、血管緊張素受體拮抗劑、平滑肌細(xì)胞的增殖·游走抑制劑、血小板凝集抑制劑、抗凝固劑、化學(xué)介質(zhì)的游離抑制劑、血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖促進(jìn)或抑制劑、醛糖還原酶抑制劑、腎小球膜細(xì)胞增殖抑制劑、脂氧合酶抑制劑、免疫抑制劑、免疫激活劑、抗病毒劑、美拉德反應(yīng)抑制劑、淀粉樣變性病抑制劑、一氧化氮合成抑制劑、AGEs(Advanced glycation endproducts)抑制劑、自由基捕獲基、蛋白質(zhì)、肽、葡糖胺基葡聚糖及其衍生物、寡糖及多糖及其衍生物等。
本發(fā)明的脂質(zhì)體制劑可以特別穩(wěn)定地載帶在pH大于5的pH條件下變得不穩(wěn)定的藥物。作為上述藥物，具體可以舉出鹽酸多巴胺、甲磺酸加貝酯、去甲腎上腺素、鹽酸溴己新、甲氧氯普胺、腎上腺素、維生素B1、維生素B6、卡鉑、鹽酸吉西他賓、酒石酸長春瑞賓、硫酸長春新堿、鹽酸阿霉素、鹽酸表阿霉素、鹽酸柔紅霉素等。
作為用于診斷的藥物，可以舉出X射線造影劑、超聲波診斷劑、放射性同位素標(biāo)記核醫(yī)學(xué)診斷藥、核磁共振診斷用診斷藥等體內(nèi)診斷藥。除此之外，只要是不破壞本發(fā)明的脂質(zhì)體的膜形態(tài)、即使包含在或接觸pH5以下的液體成分也不受影響的藥物、以及適于封入pH5以下的內(nèi)水相的藥物即可，不特別限定于治療用藥物或診斷用藥物，均可載帶。
藥物因其種類不同理想的載帶量各異，通常優(yōu)選為高載帶率。本發(fā)明中，通過使內(nèi)水相的pH為5以下，可以利用離子梯度法高濃度地載帶藥物。
在本發(fā)明的脂質(zhì)體制劑中，優(yōu)選的載藥量用相對于脂質(zhì)體膜的總脂質(zhì)的濃度表示至少為0.05mol藥物/mol脂質(zhì)、更優(yōu)選為至少0.1mol藥物/mol脂質(zhì)。此處的總脂質(zhì)是指親水性高分子脂質(zhì)衍生物以外構(gòu)成膜的全部脂質(zhì)的總量，具體而言包括磷脂類及其他脂質(zhì)類，在還含有其他表面修飾劑的情況下也包括該表面修飾劑。
需要說明的是，本發(fā)明中的“載帶”是指將藥物實質(zhì)上封入脂質(zhì)體(載體)的封閉空間內(nèi)的狀態(tài)，也包括部分藥物包含在膜內(nèi)的狀態(tài)或附著在脂質(zhì)體的外表面的狀態(tài)。
本發(fā)明的脂質(zhì)體制劑根據(jù)給藥途徑還可以含有藥學(xué)上允許的穩(wěn)定化劑及/或抗氧化劑。
對穩(wěn)定化劑沒有特別限定，例如可以舉出甘油、甘露醇、山梨醇、乳糖或蔗糖等糖類。作為膜構(gòu)成成分中的其他脂質(zhì)的上述膽固醇(Cholesterol)等甾醇發(fā)揮穩(wěn)定化劑的作用。
對抗氧化劑沒有特別限定，例如可以舉出抗壞血酸、尿酸、生育酚同系物(例如維生素E)。需要說明的是，生育酚存在α、β、γ、δ這樣4個異構(gòu)體，本發(fā)明中可以使用任一個。使用的穩(wěn)定化劑及/或抗氧化劑根據(jù)劑型從上述物質(zhì)中適當(dāng)選擇，但是并不限定于此。上述穩(wěn)定化劑及抗氧化劑可以分別單獨使用，也可以將2種以上組合使用。另外，從抗氧化方面考慮，優(yōu)選將上述分散體制成充氮包裝。
本發(fā)明的脂質(zhì)體制劑可以根據(jù)給藥途徑進(jìn)一步含有藥學(xué)上允許的添加物。作為上述添加物的例子，可以舉出水、生理鹽水、藥學(xué)上允許的有機溶劑、膠原、聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯烷酮、羧基乙烯基聚合物、羧甲基纖維素鈉、聚丙烯酸鈉、藻酸鈉、水溶性葡聚糖、羧甲基淀粉鈉、果膠、甲基纖維素、乙基纖維素、黃原酸膠、阿拉伯樹膠、酪蛋白、明膠、瓊脂、雙甘油、丙二醇、聚乙二醇、凡士林、石蠟、硬脂醇、硬脂酸、人血清白蛋白(HSA)、甘露醇、山梨醇、乳糖、PBS、生物體內(nèi)分解性聚合物、無血清培養(yǎng)基、可用作醫(yī)藥添加物的表面活性劑、上述可被生物體內(nèi)接受的生理性pH緩沖液等。
添加物可以從上述物質(zhì)中適當(dāng)選擇或?qū)⑸鲜鑫镔|(zhì)組合使用，但是并不限定于上述物質(zhì)。
對本發(fā)明的脂質(zhì)體制劑的大小沒有特別限定，制成球狀或近似球狀的形態(tài)時，粒子外徑的直徑在LUV的情況下為70nm～140nm、優(yōu)選為80nm～130nm、更優(yōu)選為90nm～120nm。SUV的情況下為40nm～140nm、優(yōu)選為50～130nm、更優(yōu)選為60～120nm。
粒子外徑的直徑是指利用動態(tài)光散射法測定的脂質(zhì)體制劑全部粒子直徑的平均值，在本發(fā)明中，具體而言，采用Zetasizer(MalvernInstruments.3000HS或S ZEM 5002)進(jìn)行測定。
脂質(zhì)體制劑的制造中，作為最終滅菌法，使用過濾滅菌法。過濾滅菌法中，由于要求脂質(zhì)體能夠通過、作為指標(biāo)菌使用的缺陷短波單胞菌(Brevundimonas diminuta，尺寸約0.3×0.8μm)不能通過，因此必須為與缺陷短波單胞菌相比足夠小的粒子。即使從更確實地進(jìn)行該過濾滅菌工序方面考慮，粒徑為100nm左右也是重要的。
本發(fā)明中，可以將含有上述添加物的脂質(zhì)體制劑用作醫(yī)藥組合物。本發(fā)明的醫(yī)藥組合物可以按通常的方法、例如在0～8℃下冷藏或在1～30℃的室溫下保存。
下面列舉本發(fā)明的特定結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)體的優(yōu)選制造方法，但是并不限定于此。
例如在燒瓶內(nèi)，將磷脂等膜構(gòu)成成分用氯仿等有機溶劑混合，蒸餾除去有機溶劑后，進(jìn)行真空干燥，由此在燒瓶內(nèi)壁上形成薄膜。然后，在該燒瓶內(nèi)加入內(nèi)水溶液，劇烈攪拌，得到脂質(zhì)體分散液。可以通過將添加的內(nèi)水相溶液根據(jù)需要用pH調(diào)節(jié)劑等調(diào)節(jié)至所希望的pH來調(diào)節(jié)脂質(zhì)體內(nèi)水相的pH。接下來，對得到的脂質(zhì)體分散液進(jìn)行離心分離，傾析上清液，進(jìn)行提純，可以得到脂質(zhì)體分散液。作為用親水性高分子修飾脂質(zhì)體表面的方法，優(yōu)選使用聚乙二醇(PEG)與磷脂或膽固醇等的衍生物，在使用上述方法等得到的脂質(zhì)體分散液中直接添加聚乙二醇衍生物，或?qū)⑵渲瞥伤芤汉筮M(jìn)行添加，制備僅在外表面分布有PEG鏈的脂質(zhì)體。
與上述方法不同，還可以在采用常規(guī)方法制備含有具有反應(yīng)活性的官能團(tuán)的磷脂等膜構(gòu)成脂質(zhì)的脂質(zhì)體后，在脂質(zhì)體外液中添加一側(cè)末端活化的PEG，使其與具有官能團(tuán)的磷脂等膜構(gòu)成脂質(zhì)結(jié)合，制備脂質(zhì)體。
除了上述方法以外，脂質(zhì)體還可以通過混合上述各構(gòu)成成分，用高壓噴出型乳化機使其高壓噴出而制得。該方法具體記載在《生命科學(xué)中的脂質(zhì)體》(寺田、吉村等；Springer-Verlag東京(1992))，引用該記載作為本說明書中記載的內(nèi)容。
上述方法中，為了使脂質(zhì)體具有理想的尺寸，可能利用幾種技術(shù)(G.Gregoriadis 編《Liposome Technology Liposome Preparation andRelated Techniques》2nd edtion，Vol.I-III、CRC Press)。引用該記載作為本說明書中記載的內(nèi)容。
脂質(zhì)體分散液可以使用擠出機，使其強制通過過濾器數(shù)次而進(jìn)行單層化。通常，過濾器使用2種以上具有大于所希望粒徑的孔徑的過濾器、能夠最終得到所希望粒徑的過濾器這樣孔徑不同的過濾器。使用孔徑不同的過濾器，擠出的次數(shù)越多，單層化率越高，可以實質(zhì)上形成單層膜脂質(zhì)體。實質(zhì)上的單層囊泡具體是指構(gòu)成脂質(zhì)體制劑的全部載體(囊泡)中、單層囊泡所占的比例用存在比表示為整體的50％以上，優(yōu)選為80％以上。
為了將藥物載帶在上述脂質(zhì)體中，有下述方法在含有藥物的水溶液中使構(gòu)成脂質(zhì)體的脂質(zhì)膜水合，將藥物載帶在脂質(zhì)體中的方法(被動載藥，Passive loading)；或在脂質(zhì)體膜的內(nèi)側(cè)/外側(cè)形成離子梯度使藥物順著該離子梯度透過脂質(zhì)體膜而被載帶的方法(主動載藥，Remote loading)(參見記載有上述篩分技術(shù)的文獻(xiàn)及美國專利第5192549號、美國專利第5316771號等)。本發(fā)明的脂質(zhì)體制劑的優(yōu)選制造方法為主動載藥法。采用該方法能夠?qū)崿F(xiàn)高藥物/脂質(zhì)，可以得到臨床有效的高載帶率脂質(zhì)體制劑。
主動載藥法可以通過在內(nèi)水相和外水相間形成pH梯度來實現(xiàn)。作為形成pH梯度的方法，可以首先在低pH條件下利用上述方法調(diào)制脂質(zhì)體，然后置換外水相，形成pH梯度。
有使用Na+/K+濃度梯度作為間隔脂質(zhì)體膜形成的梯度的方法。在利用相對于Na+/K+濃度梯度的主動載藥法向預(yù)先形成的脂質(zhì)體中添加藥劑的技術(shù)記載在美國專利第5077056號說明書中，可以參照該說明書進(jìn)行操作。需要說明的是，引用該記載作為本說明書中記載的內(nèi)容。
在脂質(zhì)體的內(nèi)側(cè)和外側(cè)間形成pH梯度的方法可以使用具有內(nèi)側(cè)高/外側(cè)低的銨離子濃度梯度及/或具有能夠質(zhì)子化的氨基的有機化合物濃度梯度。具有能夠質(zhì)子化的氨基的有機化合物優(yōu)選低分子量的化合物，可以舉出甲基胺、乙基胺、丙基胺、二乙基胺、乙二胺、氨基乙醇等，但是并不限定于此。
需要說明的是，在采用相對于銨離子濃度梯度的主動載藥法向預(yù)先形成的脂質(zhì)體中添加藥劑的技術(shù)記載在美國專利5192549號說明書中，可以參照該說明書進(jìn)行操作。另外，可以引用該記載作為本說明書中記載的內(nèi)容。具體而言，在含有0.1～0.3M的銨鹽(例如硫酸銨)的水性緩沖液中預(yù)先形成脂質(zhì)體，將外部介質(zhì)與不含有銨離子的介質(zhì)、例如蔗糖溶液交換，形成銨離子梯度。內(nèi)部銨離子用氨及質(zhì)子平衡，氨透過脂質(zhì)膜進(jìn)行擴(kuò)散，從脂質(zhì)體內(nèi)部消失。伴隨氨的消失，脂質(zhì)體內(nèi)的平衡連續(xù)向質(zhì)子生成的方向移動。結(jié)果質(zhì)子蓄積在脂質(zhì)體內(nèi)，在脂質(zhì)體的內(nèi)側(cè)/外側(cè)形成pH梯度。通過在具有該pH梯度的脂質(zhì)體分散液中添加藥劑，將藥劑內(nèi)封在脂質(zhì)體中。
對形成銨離子梯度的銨鹽沒有特別限定，包括硫酸銨、氫氧化銨、乙酸銨、氯化銨、磷酸銨、檸檬酸銨、琥珀酸銨、乳糖酸銨、碳酸銨、酒石酸銨、及草酸銨。
在脂質(zhì)體的內(nèi)側(cè)和外側(cè)間形成pH梯度的方法還有使用離子載體(Ionophore)的方法。使用離子載體在脂質(zhì)體的內(nèi)側(cè)和外側(cè)間形成pH梯度，利用主動載藥法在脂質(zhì)體中導(dǎo)入藥劑的技術(shù)記載在美國專利第5837282號說明書中，可以參照該說明書進(jìn)行操作。另外，可以引用該記載作為本說明書中記載的內(nèi)容。
在脂質(zhì)體的內(nèi)側(cè)和外側(cè)間形成pH梯度，作為主動載藥法的具體例有以下的方法。
在燒瓶內(nèi)，將磷脂等膜構(gòu)成成分用氯仿等有機溶劑混合，蒸餾除去有機溶劑后，進(jìn)行真空干燥，在燒瓶內(nèi)壁上形成薄膜。接下來，加入酸性緩沖液(例如pH4的緩沖液)，振蕩，得到脂質(zhì)體分散液。再根據(jù)需要對脂質(zhì)體粒徑進(jìn)行篩分，通過采用凝膠過濾等方法將脂質(zhì)體外液置換為pH在中性附近的外水相的方法或用適當(dāng)?shù)膒H調(diào)節(jié)劑將脂質(zhì)體外水相的pH調(diào)節(jié)為中性附近(例如pH7～7.5附近)的方法等形成pH梯度，在該脂質(zhì)體分散液中加入含有藥物的水溶液，將該溶液加熱一段時間，使其載帶藥物。需要說明的是，本發(fā)明中，親水性高分子的修飾只要如上所述在形成脂質(zhì)雙層膜的單層囊泡之后進(jìn)行即可，也可以在藥物載帶操作之前或之后的任一階段進(jìn)行。
作為脂質(zhì)體制劑的非口服給藥途徑，例如可以選擇點滴等靜脈內(nèi)注射(靜注)、肌肉內(nèi)注射、腹腔內(nèi)注射、皮下注射，可以根據(jù)患者的年齡、癥狀選擇適當(dāng)?shù)慕o藥方法。作為脂質(zhì)體制劑的具體給藥方法，可以通過注射器或點滴給予醫(yī)藥組合物。另外，也可以將導(dǎo)管插入患者或宿主體內(nèi)、例如管腔內(nèi)、例如血管內(nèi)，將其前端導(dǎo)入目標(biāo)部位附近，通過該導(dǎo)管，在所希望的目標(biāo)部位或其近傍或可期待血液流向目標(biāo)部位的部位進(jìn)行給藥。
為了治愈或至少部分抑制受疾病困擾的患者的疾病癥狀，給予足夠量的本發(fā)明的脂質(zhì)體制劑。例如封入脂質(zhì)體制劑內(nèi)的藥物的有效給藥量通常在0.01mg～100mg/1kg體重/日的范圍內(nèi)選擇。但是，本發(fā)明的脂質(zhì)體制劑并不限定于上述給藥量。對于給藥時期，可以在患病后開始給藥，或在推測發(fā)病時為了緩解發(fā)病時的癥狀而進(jìn)行預(yù)防性給藥。另外，給藥期間可以根據(jù)患者的年齡、癥狀進(jìn)行適當(dāng)選擇。
實施例下面，列舉實施例、試驗例更詳細(xì)地說明本發(fā)明，但是本發(fā)明并不限定于下述實施例、試驗例。
需要說明的是，各例中使用的成分的分子量如下所示。
氫化大豆卵磷脂(簡記為HSPC、分子量790、Lipoid公司制SPC3)膽固醇(簡記為Chol、分子量386.65、Solvay公司制)鞘磷脂(Sphingomyelin；簡記為SM、分子量703.3、Avanti PolarLipidos公司制)聚乙二醇5000-磷脂酰乙醇胺(簡記為PEG5000-DSPE、分子量6075、日本油脂公司制)3，5-二(十五烷氧基)芐脒鹽酸鹽(分子量609.41)十八胺(Octadecylamine；簡記為ODA)(東京化成分子量269.51)N-甲基-正十八胺(N-Methyl-n-octadecylamine；簡記為MODA)(東京化成分子量283.54)N，N-二甲基-正十八胺(N，N-Dimethyl-n-octadecylamine；簡記為DMODA)(東京化成分子量297.56)溴化硬脂酰三甲基銨(Stearyltrimethylammonium Bromide；簡記為TMODA)(東京化成分子量392.5)阿霉素(鹽酸阿霉素Doxorubicin Hydrochloride USP23(BORYUNG)分子量579.99)(實施例1)內(nèi)封有阿霉素的脂質(zhì)體的制造例實施例1給出本發(fā)明的脂質(zhì)體制劑例。如下所述，向在低pH條件下(pH4)制造的脂質(zhì)體中添加親水性高分子脂質(zhì)衍生物(PEG5000-DSPE分子量5000道爾頓的聚乙二醇的二硬脂?；字Ｒ掖及费苌?，使親水性高分子(PEG鏈)分布在脂質(zhì)體的外膜表面，再利用離子梯度法導(dǎo)入藥物，制成LUV脂質(zhì)體。
以氫化大豆磷脂酰膽堿(HSPC)∶膽固醇(Chol)＝54∶46的摩爾比溶解在叔丁醇中，使其凍干，調(diào)制膜成分的混合脂質(zhì)。
混合300mM的檸檬酸溶液和300mM的檸檬酸三鈉溶液，調(diào)制調(diào)節(jié)成pH4.0的內(nèi)水相溶液和調(diào)節(jié)成pH7.5的外水相溶液。
稱量0.37g上述調(diào)制的混合脂質(zhì)后，加入內(nèi)水相溶液10mL，在68℃的恒溫槽中膨潤15分鐘后，進(jìn)行渦流攪拌，調(diào)制脂質(zhì)體粗分散液。使用加熱到68℃的擠出機(Lipex Biomembranes公司制)，通過孔徑200nm的過濾器5次，更換為孔徑100nm的過濾器后，再進(jìn)行2次同樣的操作(200nm×5、100nm×5、100nm×5)，調(diào)制LUV脂質(zhì)體分散液。將擠出后的樣品冰冷卻。
將上述調(diào)制的脂質(zhì)體分散液用以外水相進(jìn)行了充分置換的凝膠柱(Sepharose 4 Fast Flow)進(jìn)行凝膠過濾，形成pH梯度。將凝膠過濾后的樣品冰冷卻。
對凝膠過濾后的脂質(zhì)體進(jìn)行脂質(zhì)定量(HSPC定量)，基于通過HSPC定量算出的HSPC濃度，加入PEG5000-DSPE(日本油脂公司制)使其達(dá)到1.0mol％，60℃下攪拌30分鐘，導(dǎo)入PEG5000-DSPE。
再基于通過HSPC定量算出的HSPC濃度，按鹽酸阿霉素/HSPC＝0.2(w/w)計算鹽酸阿霉素量，基于計算結(jié)果稱量必要量的鹽酸阿霉素，使用10％蔗糖(pH9.0)溶液，調(diào)制10mg/mL的溶液。在脂質(zhì)體分散液中加入規(guī)定量的鹽酸阿霉素溶液(10mg/mL)，在60℃下攪拌60分鐘，導(dǎo)入鹽酸阿霉素。將導(dǎo)入鹽酸阿霉素后的樣品冰冷卻。使用經(jīng)10％蔗糖(pH6.5)充分置換后的柱(Sepharose 4 Fast Flow，2.8cm×20cm)進(jìn)行凝膠過濾，除去未封入脂質(zhì)體內(nèi)的鹽酸阿霉素。
實施例1中，脂質(zhì)體磷脂使用磷脂C Test Wako(和光純藥公司制)進(jìn)行定量。
另外，封入脂質(zhì)體內(nèi)的阿霉素濃度用在阿霉素脂質(zhì)體40μL中加入甲醇2mL得到的溶液，用分光光度計測定480nm處的吸光度而求出。
粒徑是將脂質(zhì)體分散液20μL用生理鹽水稀釋至3mL，用Zetasizer3000HS(Malvern Instruments.)測定得到的平均粒徑。得到的脂質(zhì)體示于表1。
(比較例1)內(nèi)封有阿霉素的脂質(zhì)體的制造例比較例1給出本發(fā)明范圍外的脂質(zhì)體制劑例。通過在脂質(zhì)體形成時共存親水性高分子脂質(zhì)衍生物(PEG5000-DSPE)，使親水性高分子(PEG鏈)分布在脂質(zhì)體的雙層膜的內(nèi)外膜兩側(cè)，除此之外，使用與實施例1同樣的脂質(zhì)體成分，制造脂質(zhì)體制劑。
即、稱量0.37g與實施例1相同的混合脂質(zhì)(HSPC∶Chol＝54∶46)，然后基于HSPC濃度，秤量0.073gPEG5000-DSPE，使PEG5000-DSPE達(dá)到2.0mol％，加入乙醇1mL，在65℃的恒溫槽內(nèi)溶解30分鐘。確認(rèn)完全溶解后，加入內(nèi)水相10mL，再在65℃下加熱攪拌60分鐘，調(diào)制脂質(zhì)體粗分散液。使用擠出機，進(jìn)行與實施例1相同的操作，將擠出后的樣品冰冷卻。
將調(diào)制成的脂質(zhì)體用經(jīng)外水相充分置換后的凝膠柱(Sepharose 4Fast Flow)進(jìn)行凝膠過濾，與實施例1同樣地形成pH梯度，將凝膠過濾后的樣品冰冷卻。
基于通過凝膠過濾后的脂質(zhì)體的脂質(zhì)定量(HSPC定量)算出的HSPC濃度，按鹽酸阿霉素/HSPC＝0.2(w/w)計算鹽酸阿霉素量，基于計算結(jié)果稱量必要量的鹽酸阿霉素，使用10％蔗糖(pH9.0)溶液調(diào)制10mg/mL的溶液。
在脂質(zhì)體分散液中加入規(guī)定量的鹽酸阿霉素溶液(10mg/mL)，與實施例1同樣地進(jìn)行導(dǎo)入鹽酸阿霉素的操作，除去未封入脂質(zhì)體內(nèi)的鹽酸阿霉素。
與實施例1同樣地進(jìn)行脂質(zhì)體磷脂的定量、測定封入脂質(zhì)體內(nèi)的阿霉素量、粒徑。得到的脂質(zhì)體示于表1。
(實施例2)本發(fā)明的內(nèi)封有阿霉素的脂質(zhì)體的制造例在膜成分中使用鞘磷脂(SM)∶Chol＝55∶45的混合脂質(zhì)，制造本發(fā)明的脂質(zhì)體制劑。將SM∶Chol按55∶45的摩爾比溶解在氯仿/甲醇混合液中，減壓蒸餾除去溶劑，形成薄膜?；旌?00mM的檸檬酸溶液和300mM的檸檬酸三鈉溶液，調(diào)節(jié)成pH4.0，制成內(nèi)水相溶液。稱量混合脂質(zhì)0.30g，加入內(nèi)水相溶液5mL，70℃下進(jìn)行10分鐘水合。不時地使用保溫在55℃的槽式超聲波破碎儀施加超聲波，使脂質(zhì)均勻分散。
用保溫在65℃的擠出機(Lipex Biomembranes公司制)，使得到的脂質(zhì)分散液通過孔徑400nm的過濾器3次，換成孔徑200nm的過濾器后再通過3次，換成孔徑100nm的過濾器后再進(jìn)行同樣的操作2次(400nm×3、200nm×3、100nm×5、100nm×5)。將擠出后的樣品冰冷卻。
將調(diào)制成的脂質(zhì)體用經(jīng)生理鹽水充分置換后的凝膠柱(Sepharose4 Fast Flow)進(jìn)行凝膠過濾。將凝膠過濾后的樣品冰冷卻。
對凝膠過濾后的脂質(zhì)體進(jìn)行脂質(zhì)定量(SM定量)，基于通過SM定量算出的SM濃度加入PEG5000-DSPE使其達(dá)到0.75mol％，60℃下攪拌30分鐘，導(dǎo)入PEG5000-DSPE。
再基于通過SM定量算出的SM濃度，計算相對于脂質(zhì)體的總脂質(zhì)量為20mol％的鹽酸阿霉素量，基于計算結(jié)果稱量必要量的鹽酸阿霉素，使用生理鹽水調(diào)制10mg/mL的溶液。在脂質(zhì)體分散液中加入規(guī)定量的鹽酸阿霉素溶液(10mg/mL)，用1N NaOH或飽和碳酸氫鈉水溶液調(diào)節(jié)成pH7.4后，在65℃下攪拌30分鐘，導(dǎo)入鹽酸阿霉素。將導(dǎo)入鹽酸阿霉素后的樣品冰冷卻。用經(jīng)生理鹽水充分置換后的柱(Sepharose 4 Fast Flow)進(jìn)行凝膠過濾，除去未封入脂質(zhì)體內(nèi)的鹽酸阿霉素。
與實施例1同樣地進(jìn)行脂質(zhì)體磷脂的定量、測定封入脂質(zhì)體內(nèi)的阿霉素量、粒徑。得到的脂質(zhì)體示于表1。
表1
(實施例3)將HSPC∶Chol∶3，5-二(十五烷氧基)芐脒鹽酸鹽按50/42/8的摩爾比溶解在叔丁醇中，使其凍干得到混合脂質(zhì)。
混合300mM的檸檬酸溶液和300mM的檸檬酸三鈉溶液，調(diào)節(jié)成pH4，制成內(nèi)水相溶液。
稱量0.30g混合脂質(zhì)，加入調(diào)節(jié)成pH4的內(nèi)水相溶液5ml，在70℃下水合10分鐘。不時地使用保溫在55℃的槽式超聲波破碎儀施加超聲波，使脂質(zhì)均勻分散。用保溫在73℃的擠出機(Lipex Biomembranes公司制)，使得到的脂質(zhì)分散液通過0.4μm的膜過濾器3次、0.2μm的膜過濾器3次、0.1μm的膜過濾器10次，得到LUV的分散液。得到的脂質(zhì)體的粒徑為111.3nm。
將上述調(diào)制成的脂質(zhì)體分散液添加到柱(Sepharose 4 Fast Flow，1.5cm×25cm)中，用生理鹽水洗脫，進(jìn)行凝膠過濾，將外水相用生理鹽水置換。
將PEG5000-DSPE溶解在生理鹽水中，使?jié)舛葹?0mg/mL，將其加入到外水相中，使相對于脂質(zhì)體的總脂質(zhì)量含有0.75mol％的PEG5000-DSPE，邊攪拌，邊在60℃下培養(yǎng)30分鐘。
將阿霉素溶解在生理鹽水中，使?jié)舛葹?0mg/mL，加入該溶液使相對于脂質(zhì)體的總脂質(zhì)量含有20mol％的阿霉素，用1N NaOH或飽和碳酸氫鈉水溶液調(diào)節(jié)成pH7.4后，在65℃下培養(yǎng)30分鐘。
上述方法中，與實施例1同樣地定量脂質(zhì)體磷脂。
粒徑是將脂質(zhì)體分散液100μL用生理鹽水稀釋至3mL，使用Zetasizer SZEM 5002(Malvern Instruments.)測定的。封入脂質(zhì)體內(nèi)的阿霉素量(載藥量＝藥劑/脂質(zhì))是用分光光度計測定在阿霉素脂質(zhì)體0.1mL中混合1N HCl 0.3mL和異丙醇3.6mL得到的混合液在480nm處的吸光度而求出的。阿霉素量為0.12mol/mol。
(試驗例1)在以下的4種緩沖液中溶解PEG5000-DSPE(日本油脂公司制)，使?jié)舛葹?mg/mL，在65℃下加熱90分鐘。另外，將PEG5000-DSPE溶解在同樣的緩沖液中，使?jié)舛葹?0mg/mL，在40℃下保存1周。
緩沖液(1)硫酸銨(250mM)緩沖液(2)L-組氨酸(10mM)，10％蔗糖pH6.5緩沖液(3)檸檬酸(300mM)pH4.0緩沖液(4)檸檬酸(300mM)pH7.5取10μL保存后的溶液，在距離20cm×20cm的硅膠薄層板的下部1cm處點樣。將硅膠薄層板放置在預(yù)先用氯仿/甲醇/氨水(28)混合液(85∶14∶1)的展開溶劑進(jìn)行了平衡化的玻璃容器中，用展開溶劑展開約15cm，用碘顯色法檢測分解物。該薄層色譜(TLC)示于圖1～2。圖1是將PEG5000-DSPE溶液在65℃下加熱90分鐘后的TLC結(jié)果，圖2是將PEG5000-DSPE溶液在40℃下加熱1周后的TLC結(jié)果。結(jié)果未確認(rèn)溶解在pH5以上的緩沖液中的樣品加溫前后在分解物(溶血物)的位置(參見Lyso-PEG Std的點)的點增大，而明確確認(rèn)溶解在pH4的緩沖液中的樣品的分解物(溶血物)的點增大。
試驗例1給出酸性條件下的親水性高分子脂質(zhì)衍生物(PEG5000-DSPE)的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)。PEG5000-DSPE如果在酸性條件(緩沖液(3)檸檬酸pH4.0)下加熱則發(fā)生分解。即，推測用比較例1列舉的在酸性緩沖液條件下存在PEG5000-DSPE的方法制造的脂質(zhì)體在制造時及保存時PEG5000-DSPE發(fā)生分解。另外，推測用比較例1的方法制造的脂質(zhì)體的內(nèi)水相為酸性，分布在內(nèi)水相側(cè)的PEG5000-DSPE也發(fā)生分解。結(jié)果示于試驗例2。
(試驗例2)實施例1與比較例1的脂質(zhì)體的PEG分解行為比較將實施例1和比較例1中調(diào)制的2種脂質(zhì)體在40℃下保存1周·2周后，使用HPLC法進(jìn)行PEG5000-DSPE定量。結(jié)果用相對于4℃下保存的PEG脂質(zhì)體的PEG5000-DSPE殘留率表示，示于圖3。
試驗例2的結(jié)果為比較例1的脂質(zhì)體的PEG5000-DSPE殘留率降低，表示PEG5000-DSPE發(fā)生分解。而實施例1的本發(fā)明脂質(zhì)體的PEG5000-DSPE殘留率未發(fā)生變化，表示PEG5000-DSPE未發(fā)生分解。
即，通過防止PEG5000-DSPE分解，能夠克服伴隨PEG5000-DSPE分解的脂質(zhì)雙層膜不穩(wěn)定化、脂質(zhì)體載帶的藥劑泄漏、脂質(zhì)體凝集、防止脂質(zhì)體與血漿蛋白或調(diào)理素蛋白發(fā)生吸附的效果降低、破壞脂質(zhì)體在血中的穩(wěn)定性等問題。
(實施例4)按HSPC∶Chol∶堿性脂質(zhì)((1)ODA、(2)MODA、(3)DMODA或(4)TMODA)＝50∶42∶8(mol比)稱量各脂質(zhì)，使其溶于乙醇。確認(rèn)完全溶解后，加入硫酸銨溶液(250mM)9mL，在68℃下進(jìn)行加熱攪拌。加熱攪拌結(jié)束后，使用加熱到68℃的擠出機，在1.0MPa下用孔徑為200nm的過濾器在2.0MPa下通過5次，換成孔徑為100nm的過濾器后再通過5次。再換成孔徑為100nm的過濾器，在2.0MPa下再通過5次。在擠出后的樣品中加入2mL PEG5000-DSPE溶液(36.74mg/mL(RO水))，使PEG5000-DSPE導(dǎo)入率達(dá)到0.75mol％，60℃下加熱攪拌30分鐘，導(dǎo)入PEG5000-DSPE。將導(dǎo)入后的樣品冰冷卻。上述使用的各堿性脂質(zhì)的結(jié)構(gòu)如下所示。
將上述調(diào)制的脂質(zhì)體分散液用經(jīng)10％蔗糖(pH9.0)溶液充分置換后的凝膠柱(Sepharose 4 Fast Flow)進(jìn)行凝膠過濾，形成pH梯度。將凝膠過濾后的樣品冰冷卻。
再基于通過HSPC定量算出的HSPC濃度，按鹽酸阿霉素(Dox)/總脂質(zhì)(Total Lipid)(mol/mol)＝0.16(Dox/Total Lipid(w/w)＝0.18)計算鹽酸阿霉素量?；谟嬎憬Y(jié)果稱量必要量的鹽酸阿霉素，使用10％蔗糖(pH9.0)溶液調(diào)制10mg/mL的溶液。在脂質(zhì)體分散液中加入規(guī)定量的鹽酸阿霉素溶液(10mg/mL)，在60℃下攪拌60分鐘，導(dǎo)入鹽酸阿霉素。將導(dǎo)入鹽酸阿霉素后的樣品冰冷卻。使用經(jīng)10％蔗糖(pH6.5)溶液充分置換后的柱(Sepharose 4 Fast Flow，2.8cm×20cm)進(jìn)行凝膠過濾，除去未封入脂質(zhì)體內(nèi)的鹽酸阿霉素。
定量對應(yīng)于上述各堿性脂質(zhì)得到的脂質(zhì)體制劑(1)～(4)的磷脂、測定粒徑及Zeta電位。
在本實施例中，脂質(zhì)體磷脂使用磷脂C Test Wako(和光純藥公司制)進(jìn)行定量。
粒徑是將脂質(zhì)體分散液20μL用生理鹽水稀釋至3mL，用Zetasizer3000HS(Malvern Instruments.)測定的平均粒徑。粒徑是將脂質(zhì)體分散液20μL用生理鹽水稀釋至3mL，用Zetasizer3000HS(Malvern Instruments.)測定的平均粒徑。
Zeta(Zeta)電位如下所述地測定。
在2.5mL的注射器中量取約2.5mL RO水。邊拉推桿，邊從注射器前端部加入20μL脂質(zhì)體分散液及20μL杜比克氏(Dulbecco’s)PBS，然后，擠壓推桿，推出空氣。顛倒混和，使其均勻分散后，用Zetasizer3000HS進(jìn)行Zeta電位測定。
實施例4的脂質(zhì)體制劑(1)～(4)的測定結(jié)果與實施例1的脂質(zhì)體制劑的測定結(jié)果一同示于表2。
(實施例5)按HSPC∶Chol堿性脂質(zhì)(TMODA)＝((1)53.5∶45.5∶1)、(2)(53∶45∶2)、(3)(52∶44∶4)、(4)(45.4∶38.6∶16)(mol比)秤量各脂質(zhì)，使其溶于乙醇。之后的操作按與(實施例4)同樣的操作順序進(jìn)行調(diào)制。
與實施例4同樣地對對應(yīng)于上述各堿性脂質(zhì)比得到的脂質(zhì)體制劑(1)～(4)的磷脂進(jìn)行定量、測定粒徑及Zeta電位。結(jié)果示于表2。
表2
(試驗例3)脂質(zhì)體制劑中的PEG的分解行為將實施例4及實施例5中調(diào)制的脂質(zhì)體制劑(各實施例的脂質(zhì)體制劑(4))在40℃下保存2周后，采用HPLC法進(jìn)行PEG5000-DSPE定量。與實施例1(無堿性化合物)的脂質(zhì)體制劑的結(jié)果(試驗例2)一同以相對于4℃下保存的PEG脂質(zhì)體的PEG5000-DSPE的殘留率表示，示于表3中。通過含有堿性化合物，能夠依賴于堿性化合物的含量地進(jìn)一步抑制PEG5000-DSPE的含量降低。
表3
(試驗例4)脂質(zhì)體制劑中的HSPC的分解行為將實施例4及實施例1中調(diào)制的脂質(zhì)體制劑在40℃下保存1周/2周后，使用HPLC法定量HSPC的分解物比例(％)。HSPC分解物的比例(％)的計算方法如下所示。
HSPC的分解物比例(％)＝HSPC分解物的總峰面積/(HSPC的總峰面積+HSPC分解物的總峰面積)×100試驗例4的結(jié)果示于圖4及圖5。
如圖4所示，實施例4的脂質(zhì)體制劑與實施例1的脂質(zhì)體相比，HSPC分解物的比例(％)少，表示HSPC的水解被抑制?？芍狧SPC分解物的比例(％)并非在較大程度上依賴于堿性化合物的構(gòu)成。
圖5表示實施例4的脂質(zhì)體制劑在0周、1周、2周(圖中的0W、1W、2W)的各試驗期間相對于堿性化合物(TMODA)的含有率(mol％)的HSPC分解物的比例(％)的結(jié)果。如圖5所示，隨堿性化合物的含有率(mol％)提高，HSPC分解物的比例(％)得到抑制。
如上所述，通過將PEG脂質(zhì)(PEG5000-DSPE)載帶在脂質(zhì)體的脂質(zhì)雙層膜的外側(cè)，可以防止PEG5000-DSPE分解。而且，通過將堿性化合物導(dǎo)入脂質(zhì)膜內(nèi)，可以進(jìn)一步抑制PEG5000-DSPE分解、也可以抑制HSPC水解、即使將必須在酸性環(huán)境下保持的藥物包含在內(nèi)水相的情況下也能夠穩(wěn)定脂質(zhì)體制劑。根據(jù)本發(fā)明，能夠克服脂質(zhì)體制劑中的脂質(zhì)雙層膜的不穩(wěn)定化、脂質(zhì)體載帶的藥劑泄漏、脂質(zhì)體凝集、防止脂質(zhì)體與血漿蛋白或調(diào)理素蛋白發(fā)生吸附的效果降低、破壞脂質(zhì)體在血中穩(wěn)定性等問題。
權(quán)利要求
1.一種脂質(zhì)體制劑，該脂質(zhì)體具備由含有磷脂作為主膜材的脂質(zhì)雙層膜形成的單層囊泡和存在于該囊泡內(nèi)的pH為5以下的內(nèi)水相，并且載帶有藥物，其中，所述囊泡僅外表面被親水性高分子修飾。
2.權(quán)利要求1所述的脂質(zhì)體制劑，其中，所述藥物是在pH大于5的pH范圍內(nèi)不穩(wěn)定的藥物。
3.權(quán)利要求1或2所述的脂質(zhì)體制劑，其中，該脂質(zhì)體制劑以至少為0.05mol藥物/mol脂質(zhì)的濃度載帶所述藥物。
4.權(quán)利要求1或2所述的脂質(zhì)體制劑，其中，該脂質(zhì)體制劑以至少為0.1mol藥物/mol脂質(zhì)的濃度載帶所述藥物。
5.權(quán)利要求1～4中的任一項所述的脂質(zhì)體制劑，其中，所述主膜材為相轉(zhuǎn)移點為50℃以上的磷脂。
6.權(quán)利要求1～5中的任一項所述的脂質(zhì)體制劑，其中，所述磷脂為被氫化的磷脂。
7.權(quán)利要求1～5中的任一項所述的脂質(zhì)體制劑，其中，所述磷脂為鞘磷脂。
8.權(quán)利要求1～7中的任一項所述的脂質(zhì)體制劑，其中，作為所述脂質(zhì)雙層膜的膜成分，還含有所述磷脂以外的其他脂質(zhì)類。
9.權(quán)利要求6或7所述的脂質(zhì)體制劑，其中，作為所述脂質(zhì)雙層膜的膜成分，還含有膽固醇。
10.權(quán)利要求1～9中的任一項所述的脂質(zhì)體制劑，其中，作為所述脂質(zhì)雙層膜的膜成分，進(jìn)一步含有包含選自氨基、脒基及胍基的基團(tuán)的堿性化合物。
11.權(quán)利要求10所述的脂質(zhì)體制劑，其中，所述堿性化合物為3，5-二(十五烷氧基)芐脒鹽酸鹽。
12.權(quán)利要求1～11中的任一項所述的脂質(zhì)體制劑，其中，所述親水性高分子為分子量500～10,000道爾頓的聚乙二醇。
13.權(quán)利要求1～12中的任一項所述的脂質(zhì)體制劑，其中，所述親水性高分子以親水性高分子的磷脂或膽固醇衍生物的形式被導(dǎo)入。
14.權(quán)利要求1～13中的任一項所述的脂質(zhì)體制劑，其中，所述脂質(zhì)體制劑的平均粒徑為40～140nm。
15.權(quán)利要求1～13中的任一項所述的脂質(zhì)體制劑，其中，所述脂質(zhì)體制劑的平均粒徑為50～130nm。
16.權(quán)利要求1～13中的任一項所述的脂質(zhì)體制劑，其中，所述脂質(zhì)體制劑的平均粒徑為60～120nm。
17.權(quán)利要求1～15中的任一項所述的脂質(zhì)體制劑，其中，所述內(nèi)水相的pH為2～5。
18.權(quán)利要求1所述的脂質(zhì)體制劑的制造方法，該方法為調(diào)制由含磷脂的脂質(zhì)雙層膜的單層結(jié)構(gòu)的囊泡，使內(nèi)水相的pH為5以下，然后，添加親水性高分子脂質(zhì)衍生物，僅修飾所述囊泡的外表面，在調(diào)制囊泡時將藥物預(yù)先添加到內(nèi)水相中、或在調(diào)制囊泡后使藥物由囊泡外通過所述脂質(zhì)雙層膜而將藥物封入，從而使藥物被載帶。
全文摘要
本發(fā)明提供一種脂質(zhì)體制劑，所述脂質(zhì)體制劑不破壞用親水性高分子進(jìn)行膜修飾獲得的血中穩(wěn)定性等效果，在可穩(wěn)定地載帶酸性條件下穩(wěn)定性受損的藥物的保存穩(wěn)定性方面效果良好，所述脂質(zhì)體制劑包含由以磷脂作為主膜材的脂質(zhì)雙層膜形成的單層囊泡和存在于該囊泡內(nèi)的pH為5以下的內(nèi)水相，并且載帶藥物，上述囊泡僅外表面被親水性高分子修飾。
文檔編號A61K47/34GK1938048SQ200580009759
公開日2007年3月28日 申請日期2005年3月25日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月26日
發(fā)明者磯崎正史, 吉野敬亮, 田口京子, 近藤真代 申請人:泰爾茂株式會社