專利名稱：抗EpCAM免疫球蛋白的制作方法
A.發(fā)明領域本發(fā)明涉及使用免疫球蛋白分子治療腫瘤疾病的方法。特別是，本發(fā)明涉及包括抗EpCAM免疫球蛋白分子的治療方法。本發(fā)明進一步涉及這種免疫球蛋白在藥物生產(chǎn)中的用途。本發(fā)明進一步涉及能用來治療腫瘤疾病的免疫球蛋白分子以及包含這種免疫球蛋白分子的組合物。
B.相關技術在設計包括施用免疫球蛋白分子的治療方式時，有幾個因素是必須考慮的。一方面，治療性免疫球蛋白必需以足以引發(fā)期望的治療效果的數(shù)量施用給患者。這種效果應該在最初的治療時實現(xiàn)，并且當在兩次連續(xù)施用之間免疫球蛋白逐漸從患者身體清除時應該繼續(xù)實現(xiàn)至盡可能大的程度。另一方面，施用的免疫球蛋白的數(shù)量不能太大而在患者中引起有害和/或有毒的副作用。
因而產(chǎn)生了難題，當可以耐受而不引起副作用的免疫球蛋白的最大劑量(最大耐受劑量，或“MTD”)將免疫球蛋白的量限制到不足以長時間維持的單劑量水平時，需要免疫球蛋白的最低水平來確保持續(xù)的有效性。在這樣的情況下，不可能的是維持確保持續(xù)的治療效果所需的“血清波谷水平”直到下一次免疫球蛋白的施用。藥物的“血清波谷水平”一般是指藥物在患者的血液中在任何時間容許達到的而不喪失治療效果的最低濃度。因而，它代表了藥物的最低量，為了任何要實現(xiàn)的治療益處，該量必需總是存在于患者的血液中。
現(xiàn)有一些用于維持治療性免疫球蛋白的期望血清波谷水平的方法。一種方法是增加給患者的免疫球蛋白的初始劑量。然而，這種方法具有的缺點是，可能超過了對于患者是安全的治療性免疫球蛋白水平，患者可能因而經(jīng)歷有害和/或有毒的副作用。
另一種方法是增加治療性免疫球蛋白的施用頻率。然而，增加的施用頻率嚴重地降低了患者的生活質(zhì)量，因為需要多次、頻繁地造訪患者。特別是要治療的疾病仍處在早期階段的情況時，患者將不能過上正常的生活。
進一步地，增加的應用頻率意味著整個治療方式所需的更大的治療性免疫球蛋白總量。因而，與較低頻率施用治療性免疫球蛋白的治療方式相比，增加的應用頻率意味著與給定治療方式相關的更高的總成本。
在要施用的治療性免疫球蛋白是特異于在健康和疾病組織中都存在的抗原，而所述抗原在疾病組織中比在健康組織中更普遍的情況下，開發(fā)考慮到以上因素的治療方式變得至關重要。在此，特別大的危險是過高和過頻繁的給藥將引起治療性免疫球蛋白和該治療性免疫球蛋白特異結合的抗原之間不希望的相互作用。這些免疫球蛋白一健康組織的相互作用引起了有害和/或有毒的副作用，其可能使得使用免疫球蛋白的治療方式復雜化。
在健康和患病的人類組織中都存在的一種這樣的抗原是上皮細胞粘附分子(“EpCAM”，也稱為17-1A抗原、KSA、EGP40、GA733-2、ks 1-4和esa)。EpCAM是由單層上皮的細胞和由此衍生的腫瘤細胞表達的表面糖蛋白。盡管EpCAM分子在來自健康組織的細胞的表面上呈現(xiàn)，但它在惡性組織中的表達是上調(diào)的。EpCAM以定向和高度有序的方式附著于上皮細胞(Litvinov，J Cell Biol.1997，139，1337-1348)。來自在它們的上皮細胞上表達人類EpCAM的轉(zhuǎn)基因小鼠和大鼠實驗的數(shù)據(jù)表明，正常組織上的EpCAM可能不能接近全身施用的抗體(McLaughlin，Cancer Immunol.Immunother.，1999，48，303-311)。在上皮細胞的惡性轉(zhuǎn)化時，迅速生長的腫瘤細胞放棄了上皮細胞的高度細胞秩序。因而，EpCAM的表面分布變得較少地受到限制，該分子更好地暴露在腫瘤細胞上。由于它們的上皮細胞來源，來自大多數(shù)癌的腫瘤細胞仍然在它們的表面表達EpCAM。
過去，已經(jīng)證明了EpCAM是癌癥的單克隆免疫球蛋白治療的有利靶點，特別是在具有可引起以后的實體轉(zhuǎn)移因而惡化患者的預后的散布腫瘤細胞、具有最小的殘余疾病的患者中。在具有最小的殘余結腸直腸癌癥的患者中，當在原發(fā)腫瘤的手術后四個月內(nèi)五次劑量全身施用時，與未治療的患者相比，特異于EpCAM分子的鼠單克隆免疫球蛋白降低了5年死亡率30％(Riethmüller，Lancet 343(1994)，1177-83)。更近一些，已經(jīng)報道了在約40％的乳腺癌患者中的強烈的EpCAM過量表達，并與不良的總體和無疾病存活有關(Spizzo et al.，Int.J.Cancer 98(2002)，883-8)。最近，在3,722名患者中分析了EpCAM表達。發(fā)現(xiàn)，EpCAM表達在上皮細胞腫瘤中是非常普遍的，已經(jīng)在超過88％的腫瘤樣品中觀察到這種表達。具體地，在94.1％的卵巢癌中、94％的結腸癌、92.3％的胃癌、90.1％的前列腺癌和70.9％的肺癌中觀察到EpCAM表達。
識別EpCAM的(鼠)單克隆抗體的一個實例是Edrecolomab(Panorex)(Koprowski，Somatic Cell Genet.1979，5，957-971 andHerlyn，Cancer Res.，1980，40，717-721；該全文引入本文作參考)。然而，在結腸癌的輔助免疫治療期間，第一次施用Panorex引起魏格納氏肉芽腫病(Wegener′s granulomatosis)的發(fā)生和惡化，表明Panorex應當在患有自身免疫性疾病的患者中謹慎應用(Franz，Onkologie 2000，23，472-474；該全文引入本文作參考)。Panorex的局限在于快速形成人類抗小鼠抗體(HAMA)、通過它的鼠IgG2a Fcγ受體與人類免疫效應機制相互作用的能力受到受限和在循環(huán)中的短半衰期(Frodin，Cancer Res.，1990，50，4866-4871；該全文引入本文作參考)。此外，在患者中重復注射時，鼠抗體引起速發(fā)型變態(tài)反應和過敏反應(Riethmüller，Lancet 1994，343，1177-1183，Riethmüller，J Clin Oncol.，1998，16，1788-1794 and Mellstedt，Annals New York Academy of Sciences 2000，910，254-261；它們的全文引入本文作參考)。
ING-1是另一種已知的抗EpCAM免疫球蛋白(Lewis，Curr.Op.Mol.Ther.5，433-6，2003；通過完全引用來合并)。ING-1是小鼠-人類嵌合IgG1免疫球蛋白，當前處于患有進展的上皮細胞瘤的患者的I/II期臨床的研究中。雖然在已經(jīng)預先注射人類腫瘤細胞的小鼠中發(fā)現(xiàn)1mg/kg的免疫球蛋白劑量提供了最大的效果，但這個劑量在2名患有腺癌的人類患者中都引起了胰腺炎(腹痛伴有淀粉酶和脂肪酶升高)，使進一步的劑量提高變得不可能。每3周靜脈內(nèi)施用時，發(fā)現(xiàn)ING-1的MTD僅為0.3mg/kg體重?？紤]到ING-1的半衰期在這個劑量是約31小時，假定平均的成年人體重75kg，有約4.25升血液，21天后(即，16.25個半衰期后)的ING-1血清水平將降低到7×10-5μg/mL血液，比最大細胞溶解效果所需的1μg/mL血清水平還低四個數(shù)量級以上。因此ING-1的MTD妨礙了抗EpCAM免疫球蛋白的必需血漿波谷水平的維持。
因此，目前存在著涉及抗EpCAM抗體的癌癥治療方案的需求。相應地，本發(fā)明的目的是提供克服了以上所列諸多問題的涉及抗EpCAM免疫球蛋白的治療方案。
發(fā)明概述一種通過向患者施用特異性結合人類EpCAM抗原的人免疫球蛋白在人類患者中治療腫瘤疾病的方法符合了上述需求，所述免疫球蛋白展現(xiàn)出至少15天的血清半衰期，所述方法包括以不超過每周一次的頻率施用所述免疫球蛋白的步驟。
通過使用具有至少15天的血清半衰期的抗EpCAM免疫球蛋白可實現(xiàn)幾個有益的效果。最重要的，這種相對長的血清半衰期意味著，作為發(fā)明方法的一部分施用的抗EpCAM免疫球蛋白將不會象具有較短半衰期的其它免疫球蛋白，比如以上討論的IMG-1那樣快速地從血液中清除。然后假定，滿足用于本發(fā)明的方法的免疫球蛋白條件的抗EpCAM免疫球蛋白和不滿足這些條件的抗EpCAM免疫球蛋白同時并且以相同的絕對數(shù)量施用給人，在給定時間之后，與后一種免疫球蛋白相比，將有更多的前一種免疫球蛋白維持在血清中。在相反的意義上，與較短半衰期的其它抗EpCAM相比，血清中提高的存留容許一次施用較少的在本發(fā)明方法中使用的抗EpCAM免疫球蛋白，而仍然維持一定的預定血清波谷水平，即，確保了治療試劑的總血清濃度從不低于被確定為在兩次連續(xù)施用之間保持效力所必需的最低水平。這具有有益的效果，在任何給定劑量中需要應用較少的本發(fā)明的方法的抗EpCAM免疫球蛋白，從而消除了任何有害和/或有毒的副作用的可能性或至少緩解了任何有害和/或有毒的副作用。
在本發(fā)明的方法中使用的抗EpCAM免疫球蛋白的相對長的半衰期還意味著，施用不必過于頻繁地進行，從而提高了患者的生活質(zhì)量并降低了治療的總成本。
用于本發(fā)明的方法的抗EpCAM免疫球蛋白是人免疫球蛋白，這降低了或甚至消除了由患者的免疫系統(tǒng)針對施用的免疫球蛋白產(chǎn)生的非期望免疫反應的可能性。因為當在治療中使用許多鼠的或甚至鼠-人嵌合免疫球蛋白分子時觀察到的與人抗小鼠抗體(“HAMAs”)有關的這種問題，根據(jù)本發(fā)明的方法不構成問題。
不受理論的限制，發(fā)明人相信，在本發(fā)明的這個方面中使用的抗EpCAM免疫球蛋白在體內(nèi)根據(jù)兩種不同機制中的至少一種引發(fā)了治療效果。一種機制被稱為抗體依賴性細胞毒性(“ACDD”)。在ADCC中，包被了免疫球蛋白的細胞(“目標細胞”)被具有Fc受體的細胞(“效應細胞”)殺傷，所述Fc受體識別包被所述目標細胞的免疫球蛋白的Fc部分。在大多數(shù)情況下，參與ADCC的效應細胞是天然殺傷(“NK”)細胞，這些細胞在它們的表面帶有Fc受體FcγRIII和/或分子CD16。這樣，僅包被有免疫球蛋白的細胞被殺傷，因此細胞殺傷的特異性直接與包被這種細胞的免疫球蛋白的結合特異性(在此為EpCAM)有關。
在本發(fā)明的這個方面中使用的免疫球蛋白引發(fā)治療效果的另一種機制稱為補體依賴性細胞毒性(“CDC”)。在CDC中，在目標細胞的表面上兩個相同的免疫球蛋白結合到兩個相同的抗原(例如，在此的EpCAM)，從而它們各自的Fc部分變得相互接近。這種情況吸引了補體蛋白，例如它們之中的補體蛋白c1q和c3和c9，后一種在目標細胞上產(chǎn)生孔洞。目標細胞被這種穿孔殺死。同時，目標細胞在稱為調(diào)理作用(opsonization)的過程中在它/它們表面上的其它位置被裝飾。這種裝飾吸引了效應細胞，然后效應細胞以類似于在ADCC機制的上下文中所描述的方式殺死目標細胞。
憑借根據(jù)本發(fā)明的這個方面的方法中使用的免疫球蛋白的長半衰期，與使用具有較短半衰期的抗EpCAM免疫球蛋白相比，可以更長時間和更高水平地利用上述機制的一種或兩種的益處。
根據(jù)本發(fā)明的這個方面，以不超過每周一次的頻率向患者施用抗EpCAM免疫球蛋白，優(yōu)選的不超過每兩周一次的頻率。在這點上，利用了抗EpCAM免疫球蛋白的長血清半衰期的優(yōu)點。在每周進行一次施用的情況下，在任何一次施用僅需要少量的免疫球蛋白，因為超過一半的早先施用的免疫球蛋白將仍然存留在患者的血液中。這是因為一周時間小于早先施用的免疫球蛋白的約15天的半衰期。
在每兩周進行約一次施用的情況下，根據(jù)發(fā)明方法的給藥頻率大約相應于免疫球蛋白的半衰期。因而，在兩次連續(xù)施用之間的間期中該免疫球蛋白的血清水平從不會減少到超過緊隨相應前次施用后數(shù)量的約二分之一。這意味著，任何給定施用的劑量不必高于一定的數(shù)量，所述數(shù)量是在施用之后立即產(chǎn)生下一次施用之時達到的預定血清波谷水平的約兩倍所需的量。
一般地，人們可以定義兩個施用階段首先的“加載階段”，在其中施用一次或多次加載劑量以達到某個穩(wěn)定的免疫球蛋白血漿水平，和隨后的“維持階段”，在其中施用多次維持劑量以維持期望的免疫球蛋白血漿水平。與后來的維持劑量相比，加載劑量一般以更高的量和/或更頻繁地連續(xù)施用，因而使得加載階段的持續(xù)時間達到最小。
與本發(fā)明方法不同，按照當前的給藥方式，執(zhí)業(yè)醫(yī)生面臨兩個選擇要么以足夠高的初始量施用抗EpCAM免疫球蛋白，以在它從身體快速清除之后確保在下一次施用之前維持血清波谷水平(在這種情況下，高的初始劑量可能引起有害和/或有毒的副作用，例如胰腺炎)；要么以足夠低的量施用抗EpCAM免疫球蛋白，以避免有害和/或有毒的副作用(在這種情況下，抗EpCAM免疫球蛋白的血清水平在下一次施用之前降至低于血清波谷水平，引起治療效果的損失)。折中方案是提高低劑量施用的頻率，引起患者生活質(zhì)量的重要的損失。
相反，根據(jù)本發(fā)明的這個方面的方法在其中取得了平衡，一方面，可以以不引起有害和/或有毒的副作用的量施用各個劑量(individual doses)，另一方面，在血清中的治療性免疫球蛋白的量不降低到低于在連續(xù)的施用之間維持治療效果所需的血清波谷水平。在兩次連續(xù)施用之間的至少約一周、優(yōu)選的在兩次連續(xù)施用之間的至少約兩周的節(jié)奏，容許這種平衡，而不過度地損害患者的生活質(zhì)量。
根據(jù)本發(fā)明的一個實施方式，在進行下一次施用之前在患者的血液中檢查到來自前次施用仍然存在的抗EpCAM抗體血清水平。這樣，例如，如果在患者的血液中仍存有來自前次施用的充足的抗EpCAM免疫球蛋白的情況，執(zhí)業(yè)醫(yī)生可以避免過早地再次施用抗EpCAM免疫球蛋白。對于確切半衰期仍然未知的抗EpCAM抗體，這樣可以避免可能引起有害和/或有毒的副作用的偶然的給藥過量。同時，根據(jù)這種間期測量，執(zhí)業(yè)醫(yī)生獲得了關于所使用的抗EpCAM免疫球蛋白的清除率的寶貴認識，所述間期測量在任何情況下在相應的前次施用之后的至少兩周進行。在精密調(diào)整進一步的施用計劃時這種認識是寶貴的。在連續(xù)的施用之間，這種精密調(diào)整可以有利地使等待時間明顯長于一周，或優(yōu)選地長于約兩周，從而進一步提高了患者的生活質(zhì)量。
有利地，患者血液中抗EpCAM免疫球蛋白的血清水平的這種間期檢查，可以按以下方式進行。首先，執(zhí)業(yè)醫(yī)生可以確定，在相應的最后一次施用所述免疫球蛋白后的至少一周但先于相應的下一次施用所述免疫球蛋白的一段時間之后，仍存在于所述患者的血液中的所述免疫球蛋白的血清水平，從而獲得所述血清蛋白的中間血清水平值。然后將所述免疫球蛋白的這個中間血清水平值與所述免疫球蛋白的預定血清波谷水平(predetermined serum trough level)相比較。如果發(fā)現(xiàn)所述免疫球蛋白的中間血清水平值大大高于所述免疫球蛋白的預定血清波谷水平，則執(zhí)業(yè)醫(yī)生可以有利地選擇更久地等待抗EpCAM免疫球蛋白的血清水平進一步降低。在這時，可以重復上述步驟以獲得所述免疫球蛋白的新的中間血清水平，然后其將降低到一個接近預定血清波谷水平的值。在任何情況下，人們不應等待太久，以至測定的免疫球蛋白的中間血清水平降至低于該免疫球蛋白的預定血清波谷水平。可能通過等待、測定中間血清水平、并將該中間血清水平與特定抗EpCAM免疫球蛋白的預定血清波谷水平比較的重復循環(huán)，當執(zhí)業(yè)醫(yī)生確定了這個免疫球蛋白的中間血清水平已經(jīng)降低到所述血清波谷水平的一定百分比之內(nèi)時，可以進行相應下一次的抗EpCAM免疫球蛋白施用，來使抗EpCAM免疫球蛋白的血清水平回升到合適的水平，用以下一輪的清除。有利地，對于所使用的特定抗EpCAM免疫球蛋白，這種一定百分比可以相當于超過預定血清波谷水平的15％、優(yōu)選的10％、最優(yōu)選5％之內(nèi)的血清水平。
有利地，可以通過本領域普通技術人員已知的任何方法，例如通過免疫測定來測量中間免疫球蛋白血清水平。例如，為此目的可以使用免疫熒光分析、放射性免疫分析或酶聯(lián)免疫吸附分析—ELISA分析，后者是優(yōu)選的。
在本發(fā)明的這個方面的優(yōu)選的實施方式中，以不超過每兩周一次的頻率施用人類抗EpCAM免疫球蛋白。在特別的優(yōu)選的實施方式中，施用以兩周的間隔進行，其中每個后續(xù)劑量在數(shù)量上與施用的第一個劑量相等，即，所有劑量都制成相同的量。這樣的施用足以維持免疫球蛋白的血清水平，其從不降低到低于該免疫球蛋白的有益治療效果所需的預定血清波谷水平，而同時避免了、或基本上避免了有害和/或有毒的副作用。
然而，在另一個實施方式中，還預想了超過、或遠遠超過兩周的施用頻率是可能的。在以大于兩周的時間間隔施用免疫球蛋白的情況下，在初始劑量之后的任何時候施用的抗體的量應當大于初始劑量，所述初始劑量是指望兩周內(nèi)的隨后的施用而設計的。超過兩周后施用的后續(xù)劑量的數(shù)量可以大于兩周后施用的劑量，這可根據(jù)病例的不同而不同，例如，通過藥物動力學模擬(例如，用WinNonlin 4.0.1(Pharsight Corporation，USA；2001)，例如在附隨上述說明的實施例中所描述的那些方法來確定。本領域的普通技術人員知道如何構建和/或應用這種模擬。有利地構建這種模擬，從而在相應的施用之后，患者的血清中抗EpCAM免疫球蛋白的水平不被容許降低到低于被確定為治療效力所必需的血清波谷水平。
人類抗EpCAM免疫球蛋白的長血清半衰期確保了，在施用之間的這個更長的時期，比方說三周甚至四周或2到5周內(nèi)的任何中間時期，維持了治療效力所需的預定血清波谷水平。換句話說，人類抗EpCAM免疫球蛋白的長的血清半衰期(即，約15天)確保了自相應的前次施用以來顯著數(shù)量的這種免疫球蛋白仍存在于血清中。結果，與沒有這種長血清半衰期的抗體所必需的相比，只需應用較少的具有約15天半衰期的人類抗EpCAM免疫球蛋白。這降低了有害和/或有毒的副作用的風險。
應當注意到，對具有短半衰期的抗EpCAM免疫球蛋白(例如，對于抗EpCAM免疫球蛋白ING-1，已經(jīng)測量了它在人類中的血清半衰期為17到31小時)，在仍然維持治療效果時，這種延長的施用方案和與此相關的多種益處(參見上文)是不可能的。為了確保這種抗EpCAM免疫球蛋白的至少預定血清波谷水平的數(shù)量留存在血清中直到之后的施用，施用了太多的抗EpCAM免疫球蛋白以至很可能遭遇有害和/或有毒的副作用。另一方面，通過施用較少的這種短壽命的抗EpCAM免疫球蛋白來避免這種有害和/或有毒的副作用，當在血液中留存的免疫球蛋白的數(shù)量降至低于血清波谷水平時，將在兩次施用之間的某個時點引起治療效果的喪失。
當然，如果確定了臨床的必需性或益處，具有約15天半衰期的人類抗EpCAM免疫球蛋白可以在進一步的實施方式中以低于兩周的時間間隔施用，比方說1周的間隔或從1周到2周的任何中間的時間。雖然這種情況沒有完全地利用約15天的長血清半衰期，仍然存在著期望這樣的施用的臨床狀況。為了避免在患者中隨著時間的人類抗EpCAM免疫球蛋白的不需要的積累，在此優(yōu)選的是，相對于以雙周節(jié)奏施用所需的數(shù)量，降低在這種較短間隔中施用的人類抗EpCAM的數(shù)量。不足兩周后施用的后續(xù)劑量的量必須少于兩周后施用的劑量，這可以根據(jù)不同的病例而確定，例如，通過藥物動力學模擬，例如在附隨上述說明的實施例中所描述的那些方法來確定。本領域的普通技術人員知道如何構建和/或應用這種模擬。有利地構建這種模擬，從而在相應的施用之后，患者的血清中抗EpCAM免疫球蛋白的水平不被容許降低到低于確定為治療效力所必需的血清波谷水平。
根據(jù)一個實施方式，施用可以是靜脈內(nèi)的、腹膜內(nèi)的、皮下的、肌肉內(nèi)的、表面的(topical)或皮內(nèi)的。做為選擇，可以合適的使用這些施用方法的組合。進一步設想的是與其它化合物的聯(lián)合應用方案，其它化合物例如，通過T細胞起作用的雙特異性抗體構建體、靶向的毒素或其它化合物，或通過其它機制起作用的其它化合物，例如抗腫瘤試劑。聯(lián)合施用抗EpCAM免疫球蛋白的臨床方式可以包括同時的、在其它成分之前或之后的聯(lián)合施用。
有利地，所述腫瘤疾病選自乳腺癌、上皮癌、肝細胞癌、膽管細胞癌癥、胃癌(stomach cancer)、結腸癌、前列腺癌、頭和頸部癌癥、皮膚癌(黑素瘤)、泌尿生殖道的癌癥、例如，卵巢癌癌、子宮內(nèi)膜癌、宮頸癌和腎癌；肺癌、胃癌(gastric cancer)、小腸的癌癥、肝癌、胰腺癌、膽囊癌、膽管癌癥、食道癌、催涎腺的癌癥或甲狀腺的癌癥。
在另一個實施方式中，所述疾病也可以是最小的殘余疾病，優(yōu)選早期實體腫瘤、進展的實體腫瘤或轉(zhuǎn)移性的實體腫瘤，其特征在于由單個細胞的存活引起的腫瘤的局部或非局部的復發(fā)。
在本發(fā)明的這個方面的特別優(yōu)選的實施方式中，所述腫瘤疾病是前列腺癌或乳腺癌。在此，特別優(yōu)選的是，施用的人類抗EpCAM免疫球蛋白是包含具有SEQ ID NO1所列氨基酸序列的免疫球蛋白重鏈和具有SEQ IDNO2所列氨基酸序列的免疫球蛋白輕鏈的抗EpCAM免疫球蛋白。當施用這種人類抗EpCAM免疫球蛋白時，優(yōu)選的是它以1-7mg/kg體重的相應劑量數(shù)量、更優(yōu)選2-6mg/kg體重每兩周約一次地施用。
本發(fā)明的進一步的方面提供了與人類EpCAM抗原特異性結合的人免疫球蛋白的用途，所述免疫球蛋白展現(xiàn)出至少15天的血清半衰期，該免疫球蛋白用于制備治療腫瘤疾病的藥物。做為選擇，包含這種免疫球蛋白的組合物也可以用于制備上述的藥物。然后可以根據(jù)上文闡述的給藥計劃有利地施用所述藥物用于腫瘤疾病的治療方法。
根據(jù)本發(fā)明的這個方面的一個實施方式，制備的藥物適合于通過靜脈內(nèi)的、腹膜內(nèi)的、皮下的、肌肉內(nèi)的、表面的或皮內(nèi)的途徑施用。做為選擇，可以通過視情況組合超過一種的這些途徑來進行施用。進一步設想的是與其它化合物的聯(lián)合施用方案，其它化合物例如，通過T細胞起作用的雙特異性抗體構建體、靶向的毒素或其它化合物，或通過其它機制起作用的其它化合物，例如抗腫瘤試劑。聯(lián)合施用抗EpCAM免疫球蛋白的臨床方式可以包括同時的、在其它成分之前或之后的聯(lián)合施用。
有利地，所述腫瘤疾病是乳腺癌、上皮癌、肝細胞癌、膽管細胞癌癥、胃癌、結腸癌、前列腺癌、頭和頸部癌癥、皮膚癌(黑素瘤)、泌尿生殖道的癌癥，例如，卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、宮頸癌、和腎癌；肺癌、胃癌、小腸癌、肝癌、胰腺癌、膽囊癌、膽管癌癥、食道癌、催涎腺的癌癥、或甲狀腺癌癥。
在另一個實施方式中，所述疾病也可以是最小的殘余疾病，優(yōu)選早期實體腫瘤，進展的實體腫瘤或轉(zhuǎn)移性的實體腫瘤，其特征在于由單個細胞的存活引起的腫瘤的局部或非局部的復發(fā)。
在進一步的方面，本發(fā)明涉及與人類EpCAM抗原特異性結合的人免疫球蛋白，特征是在向人類患者施用之后所述免疫球蛋白展現(xiàn)出至少15天的血清半衰期。在治療腫瘤疾病的方法中這種抗體的用途的描述中，在上文已經(jīng)詳細說明了與這種長的血清半衰期有關的益處。優(yōu)選的是所述免疫球蛋白展現(xiàn)出20天、19天、18天、17天、16天或15天的血清半衰期。特別優(yōu)選的是約15天的血清半衰期。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的實施方式，所述人免疫球蛋白的半衰期是15天，并且所述人免疫球蛋白包含具有SEQ ID NO1中所列氨基酸序列的免疫球蛋白重鏈和具有SEQ ID NO2中所列氨基酸序列的免疫球蛋白輕鏈。
本發(fā)明的進一步的方面提供了包含如上所述的人類抗EpCAM免疫球蛋白的組合物?？梢杂欣貙⑦@種組合物施用給人類患者作為治療疾病的治療方案的一部分。考慮到在腫瘤疾病中EpCAM分子的表達的普遍性(prevalence)，特別優(yōu)選的是可以施用這種組合物作為目的在于治療這樣的腫瘤疾病的治療方案的一部分?？梢酝ㄟ^施用根據(jù)本發(fā)明的這個方面的這種組合物來有利地治療的腫瘤疾病包括乳腺癌、上皮癌、肝細胞癌、膽管細胞癌癥、胃癌、結腸癌、前列腺癌、頭和頸部癌癥、皮膚癌(黑素瘤)、泌尿生殖道的癌癥，例如，卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、宮頸癌、和腎癌；肺癌、胃癌、小腸癌、肝癌、胰腺癌、膽囊癌、膽管癌癥、食道癌、催涎腺的癌癥、或甲狀腺的癌癥。
在另一個實施方式中，所述疾病也可以是最小的殘余疾病(minimalresidual disease)，優(yōu)選早期實體腫瘤，進展的實體腫瘤或轉(zhuǎn)移性的實體腫瘤，其特征在于由單個細胞的存活引起的腫瘤的局部或非局部的復發(fā)。
包括在本發(fā)明這個方面之內(nèi)的是，本發(fā)明的治療方案可以治療單一的腫瘤疾病或腫瘤疾病的組合，例如可以治療由于原發(fā)腫瘤疾病的轉(zhuǎn)移性傳播引起的一種或多種繼發(fā)的腫瘤疾病。
如在此使用的，術語“抗體”、“抗體分子”、“免疫球蛋白”和“免疫球蛋白分子”理解為是等同的。在合適的地方，任何復數(shù)的使用都隱含了單數(shù)，任何單數(shù)的使用都暗含了復數(shù)的含義。
附圖的簡要說明以下附圖形成了本說明書的一部分，被包括在內(nèi)以進一步說明本發(fā)明的某些方面。通過參考一個或多個這些附圖并結合在此提供的特定實施方式的詳細說明，可以更好地理解本發(fā)明。
附

圖1I期各群組(或稱為組，cohort)的給藥計劃附圖2每個群組中與時間相對應的抗EpCAM免疫球蛋白的血漿濃度附圖3在抗EpCAM免疫球蛋白的單次給藥之后患者群組的藥物動力學參數(shù)附圖4在抗EpCAM免疫球蛋白的多次給藥之后患者群組的藥物動力學參數(shù)附圖5三分區(qū)模型(three-compartment model)的示意圖附圖6具有30μg/mL的目標波谷水平的抗EpCAM免疫球蛋白的波峰和波谷血漿水平附圖7具有10μg/mL的目標波谷水平的抗EpCAM免疫球蛋白的波峰和波谷血漿水平附圖8A-F表達EpCAM的組織的免疫組織學染色附圖9在患有各種肝臟疾病的患者中EpCAM半定量組織學分值的中值發(fā)明的詳細說明以下實施例被包括在本發(fā)明內(nèi)以說明本發(fā)明的優(yōu)選實施方式。本領域技術人員應當理解，實施例在以下描述了本發(fā)明人公開的技術，在實施例中公開的技術能夠很好地實施本發(fā)明，因此可以認為實施例構成了用于實踐本發(fā)明的優(yōu)選方式。然而，本領域的技術人員根據(jù)當前公開的內(nèi)容應當理解，可以在公開的特定的方案中進行許多變化，在不離開本發(fā)明的精神和范圍的情況下仍獲得同樣的或相似的結果。
實施例1在I期研究中測量的藥物動力學的結果群組。在具有激素難治的前列腺癌的患者中，在14天的時間間隔兩次單一靜脈內(nèi)輸注之后，研究了特征為SEQ ID NO1和2的抗EpCAM免疫球蛋白(下文稱“抗-EpCAM”)的藥物動力學。施用的劑量是10、20、40、64、102、164和262mg/m2體表面積。在第1天和第15天在每個劑量水平處理兩名或三名患者。在從第1天到第70天(第二次施用后56天)的29-31個采樣時點采取血液樣品。通過特異性ELISA方法測量抗EpCAM的血清濃度。ELISA被構建為典型的三明治樣夾心ELISA，在其中大鼠抗-抗EpCAM抗體用作俘獲抗體，雞抗-抗EpCAM抗體用作檢測抗體(如Sambrook，Molecular Cloning，Cold Spring Harbor Laboratory Press中所描述的)。用于I期患者群組的給藥方案在附圖1中示出。在附圖1的第3欄中符號“～”表示計算的劑量值，單位是mg/kg，是平均劑量(采用各個群組中的患者數(shù)目)除以平均體重(也采用各個群組中的患者數(shù)目)的結果。因而，各個劑量值代表兩個平均值的商。
血清濃度。在抗EpCAM的兩次單獨的靜脈內(nèi)的輸注之后在單個患者中測量抗EpCAM的血清水平(來自2-3次測定的平均值±SD)。單個群組中的個體分布型的對比在附圖2中示出。在以14天的時間間隔兩次單獨的靜脈內(nèi)輸注之后從患有激素難治的前列腺癌的患者的所有劑量組獲得的平均濃度/時間分布型(算術平均值)在附圖2中示出。
簡化的劑量方案?；颊呓邮軅€人化的劑量，其按照mg抗EpCAM/m2體表面積計算。由于一個劑量組中不同患者觀察到的血清分布型的一致性，分析了劑量方案的簡化是否是可行的。為了這個目的，將群組5、6和7的分布型標準化為相等的500mg總劑量，根據(jù)血清水平的變異性比較結果。
對于9名患者，劑量正?；?00mg總劑量引起血清水平改變了26.6％的平均系數(shù)(％CV)。變異系數(shù)從14.8到67.3％，在較低的血清水平觀察到了最高的變異。根據(jù)這些結果，將劑量方案簡單化到總劑量認為是可行的。
藥物動力學非分區(qū)評估(Non-Compartmental Evalation)。在第一次靜脈內(nèi)輸(單次劑量)注抗EpCAM之后，為患有激素難治的前列腺癌的所有七個群組的患者計算的主要藥物動力學參數(shù)(算術平均數(shù))的總結在附圖3中示出。在第14天第二次靜脈內(nèi)施用(多次劑量)之后抗EpCAM的主要藥物動力學參數(shù)(算術平均數(shù))在附圖4中示出。
附圖3和4中使用的術語的定義如下。Cmax是指最大(測量的)濃度。AUCτ是指從第14到28天(多次劑量)用梯形規(guī)則(trapezoidal rule)計算的一個劑量間隔中(τ＝14天)觀察到的濃度/時間曲線下的面積(AUC)。AUCINF是指使用梯形規(guī)則根據(jù)公式AUC∞＝AUCz+Cz/ke計算的從0小時到無窮大的AUC。t是指平均表觀末端半衰期(mean apparent terminalhalf-life)(ln2/λz)，其中術語“平均”是指多個測定的血清半衰期值的平均數(shù)；術語“表觀”是指將曲線擬合外推至選定的藥物動力學值到無窮大的時點，從而在患者血清中的免疫球蛋白的數(shù)量在無窮大的時間衰減到接近零；術語“末端”是指這個無窮大的時點。參數(shù)τ是用作恒定的倍增系數(shù)(constantmultiplication factor)的標準藥物動力學參數(shù)，參數(shù)z表示任何時點z。Clss是指總體的身體清除，根據(jù)公式劑量/AUC來計算。Vss是指分配的表觀容積(apparent volume of distribution)。Vz是指分配的平均容積。CL是指清除的平均容積。
在單次劑量之后平均表觀末端半衰期(t)測定為6.72±0.88天(從7-14天計算)，在多次劑量施用后為14.74±4.23天(從最后三個采樣點計算，即，28-42天或35-70天)。不同的半衰期值是由于第二劑量之后的明顯更長的觀察期，由于曲線擬合良好度的提高，測量的值越久，測出的半衰期值變得越精確。因而，14.74±4.23天的t值代表了更精確的t值，因為它是在很長的時間段上測量的。
在第一次施用之后，測出了10.4L的Vz和1.1L/天的清除平均容積。這些數(shù)據(jù)正與對第二劑量計算的結果相符合，為11.5L的平均Vz和1.0L/天的清除平均容積(CL)。此外，在所有劑量組中這些數(shù)據(jù)是很好地可比較的(變異系數(shù)從8.2％到14.8％)。結果，對于參數(shù)Vz和參數(shù)CL都沒有觀察到劑量依賴性。
劑量線性。確定了關于參數(shù)Cmax、AUClast(0-14)/AUCτ(14-28)和AUCinf的相互關系。對于所有參數(shù)(Cmax、AUClast(0-14)/AUCτ(14-28)和AUCinf)，人們可以推定在研究的劑量范圍內(nèi)的劑量線性增加。
藥物動力學分區(qū)評估。
分區(qū)分析基于需要藥物恒定輸注的兩種不同的模型。對于最佳分區(qū)的模型的評定，選擇了從群組6獲得的關于平均濃度對比時間的數(shù)據(jù)。對于兩種評估，因為施用之后更長的觀察期，采用了第二劑量之后的分布型。
為了研究最佳擬合，采用了以下的分區(qū)模型●2-分區(qū)評估●3-分區(qū)評估對于兩種模型，評估是可能的，然而，用3-分區(qū)分析獲得了明顯更好的擬合。在3-分區(qū)分析之后，在觀察的Y和預測的Y之間的相合性(congruence)顯著更好。為此，所有進一步的評估都根據(jù)這種3-分區(qū)模型來進行。
在患者中靜脈內(nèi)短期輸注10、20、40、102、164和262mg/m2體表面積之后，研究了抗EpCAM的藥物動力學。每個群組處理兩名或三名患者。在42或70天的時間段采取血液樣品。通過ELISA方法測量抗EpCAM的血清濃度?？梢詫λ谢颊攉@得和評估直至第42或70天的完整血清分布型。
清除容積和分配容積沒有顯示劑量依賴性，在第一和第二劑量之后沒有顯示主要的差異。根據(jù)來自7個群組的數(shù)據(jù)，在研究的劑量范圍中可以假定參數(shù)Cmax、AUCτ1和AUClast的劑量線性。
分區(qū)分析顯示了0.565天(ta)、3.78(tβ)和13.3天(tλz)半衰期的抗EpCAM血清濃度的三級下降。
如根據(jù)末端半衰期(約兩周)所預料的，各自劑量方式的模擬產(chǎn)生了雙周設計的最佳結果。每周劑量的模擬引起了積累，而每4周的施用引起了抗EpCAM血清水平的降低?？紤]到盡可能快地達到目標波谷水平，建議了與維持劑量相比雙倍劑量的加載劑量。
實施例2根據(jù)在I期研究中獲得的測量數(shù)據(jù)來模式化抗EpCAM給藥策略為這項研究選擇的給藥方案和治療持續(xù)時間基于在患有前列腺癌的患者中抗EpCAM的I/II期臨床研究的結果的藥物動力學的模式化。模擬的目標是發(fā)現(xiàn)抗EpCAM的給藥方案以分別達到10和30μg/mL的血清波谷水平。
根據(jù)臨床前的實驗，10μg/mL的血清波谷水平預計是對抗EpCAM的抗腫瘤活性有效的。然而，不能排除更高的劑量可能更有效。因此，將在臨床試驗中評估計算達到30μg/mL的血清波谷水平的第二劑量。這個血清波谷濃度預計沒有另外的毒性，因為Cmax和AUC值沒有超過I期臨床研究中觀察到的值。
由于更好的擬合，所有模擬都基于來自群組5到7的3-分區(qū)評估數(shù)據(jù)。
模擬的目標是考慮頻率(每周、雙周、每4周)、不同的波谷水平(10μg/mL、30μg/mL抗EpCAM)來評定最佳的施用方案和所需的劑量，并評估抗EpCAM的加載劑量的益處。
如對大約兩周的末端半衰期值所預計的，雙周的給藥方案產(chǎn)生了最好的結果。采用7天和28天的施用頻率，模擬分別產(chǎn)生了血清水平的積累或輕微的降低。加載劑量(LD)的應用引起了即時達到所需的波谷水平。對靜脈內(nèi)施用抗EpCAM，模擬了以下的劑量和相應的最小和最大血清水平。
每14天施用。如對抗EpCAM的末端半衰期所預計的，雙周施用產(chǎn)生了具有恒定的Cmin和Cmax值的模擬的分布型，因而可認為是推薦的給藥方案。因此，選擇雙周模型來計算產(chǎn)生10和30μg/mL目標波谷水平的抗EpCAM所需的劑量。
通過分區(qū)評估獲得用于計算的初始參數(shù)。
●研究數(shù)據(jù)在前列腺癌I/II期研究中獲得的藥物動力學測量值●軟件WinNonlin 4.0.1(Pharsight Corporation，USA；2001)●模型PK模型19(3區(qū)室IV輸注，宏觀常量(macro-constant)，無延遲時間，第一順序消除(1st order elimination)，均勻加權)。
附圖5是三分區(qū)模型的示意圖，其中“1”代表中央分區(qū)，“2”和“3”代表兩個不同的外圍分區(qū)。中央分區(qū)處于與血漿的即時平衡中。在施用藥物之后，外圍分區(qū)需要一定時間來達到與中央分區(qū)的平衡。K13、K31、K12、K21、K10是各自的速度常數(shù)，其中數(shù)字13、31等等的排序表示抗EpCAM的通過方向。
雖然原始的研究數(shù)據(jù)限于70天的時間，將模擬延至120天的時間。模擬基于加載階段(即，在第1、8和15天施用藥物)和維持階段(即，在第29天和此后每14天施用藥物)●組A(低劑量)2mg抗EpCAM/kg體重每周的加載階段(第1、8、15天)，之后是每到第二周2mg抗EpCAM/kg體重的23次維持劑量●組B(大劑量)6mg抗EpCAM/kg體重每周的加載階段(第1、8、15天)，之后是每到第二周6mg抗EpCAM/kg體重的23次維持劑量。
這些研究中預定的劑量產(chǎn)生了藥物動力學參數(shù)(即，Cmax和AUC)，它們沒有超過I期研究中施用給患者最高劑量所測量到的那些。已經(jīng)使用藥物動力學模型計算了加載階段和維持階段，以在短期內(nèi)達到目標血清波谷濃度并避免超過I期研究中所評定的值的最大血漿濃度。
附圖6顯示了包括加載階段、目標血清波谷水平30μg/mL的、對于抗EpCAM的如上所述雙周施用的模擬。附圖7顯示了包括加載階段、目標血清波谷水平10μg/mL的、對于抗EpCAM的如上所述雙周施用的模擬。
附圖6和7顯示了在120天的時間標度上各自的藥物施用?？梢钥吹讲ǚ搴筒ü妊鍧舛?，波峰水平由曲線的上部所呈現(xiàn)，波谷水平由曲線的下部所呈現(xiàn)。圖表描述了分別達到10和30μg/ml的上述不同波谷水平的模擬。從附圖中可看出，在兩個模擬中，波峰和波谷血清濃度是不同的。
實施例3抗EpCAM毒性數(shù)據(jù)，與ING-1比較，外推法以下內(nèi)容描述了各個患者群組觀察到的有害事件(adverse event)(AE)。為了以下的目的，將AE定義為發(fā)生在施用藥物的人體上、與這種治療不一定具有因果關系的，在患者或臨床研究中的任何不期望的醫(yī)學現(xiàn)象。因此它可以是與使用研究的產(chǎn)品暫時相關的任何不利的和非期望的體征(包括異常的實驗所見)、癥狀或疾病，不管是否認為與研究的產(chǎn)品有關。
有害的藥物反應(adverse drug reaction)(即，研究者認為至少有可能與研究藥物有關的AE)由研究者根據(jù)NCI通用毒性標準((NCT Common ToxicityCriteria)CTC，版本2.0)來分級。對于沒有在NCI CTC表格中列出的有害藥物反應，將遵循用于有害事件的嚴重度分級的一般性定義。因此，“輕微的”AE描述為患者很少可注意到的癥狀。它不影響患者的通常的活動或行為，和/或它沒有臨床的后果。“中度的”AE影響受試者的正?；顒樱阋允故茉囌卟皇娣?。它具有某些臨床后果；可能需要對癥狀進行治療?！爸囟鹊摹盇E是引起重度的不適和可能是應當中止研究性治療的這種嚴重度的事件。受試者通常不能工作或進行正?；顒樱?或AE具有明確的臨床后果?？赡苄枰獙ΠY狀的治療?！皣乐赜泻κ录?SAE)定義為在任何劑量的任何不期望的醫(yī)學現(xiàn)象導致死亡、危急生命、需要住院病人進行住院治療或延長現(xiàn)有的住院治療，引起持久性或重大的無力(disability)/無能力(incapacity)，或是先天異常/出生缺陷。
在治療和在最后輸注后28天的安全跟蹤期期間，19名患者(95％)報告了與研究藥物無關的總共120件有害事件(AE)。與較低劑量群組(群組1∶7；群組2∶9；群組3∶12；群組4∶7；群組5∶12)相比，群組6(38個事件))和群組7(35個事件)中報告了更多的有害事件。所述群組在附圖1中列出，在以上的實施例1中已說明。
不考慮研究者對與研究藥物關系的評定，最常見的治療緊急性臨床AE是體溫增高(在所有患者的30％中報告)、惡心(30％)、發(fā)熱(20％)、腹瀉(15％)、疲勞(15％)、發(fā)冷(15％)和嘔吐(15％)。不考慮研究者對與研究藥物關系的評定，最常見的報告為有害事件的治療緊急性實驗室改變是升高的堿性磷酸酶(在所有患者的30％中報告)、淋巴細胞減少(30％)、升高的LDH(25％)、PTT降低(20％)、血紅蛋白降低(20％)、WBC失調(diào)(15％)、糖尿(15％)和升高的轉(zhuǎn)氨酶(15％)。
大多數(shù)有害事件是輕微的(70％)或中度的(25％)。在四名患者中報告了六起重度有害事件(級別3)如下在治療前由中度(級別2)值的患者中升高的堿性磷酸酶；在患有已知糖尿病的患者中的糖尿；一名患者伴有降低的血紅蛋白和RBC和體重降低；一名患者伴有椎間盤疝形成。調(diào)查員評定這些事件都不與研究藥物相關。沒有報告級別4事件。
在研究期間在4名患者中報告了四起嚴重有害事件(SAE)。有一起調(diào)查員認為可能與研究的藥物有關在來自群組3(40mg/m2體表面積)的患者中由于第二次抗EpCAM輸注之后級別1的發(fā)燒而延長住院治療。
小鼠-人類嵌合的、高親合性(KD2×10-9)抗EpCAM抗體ING-1的臨床研究在1mg/kg的劑量引起胰腺炎。在清楚的MTD下這些有害事件是劑量依賴性的。可能的是，免疫球蛋白ING-1針對EpCAM抗原的親合性與抗EpCAM相比高兩個數(shù)量級，與ING-1觀察到的毒性分布型有關。由于ING-1的MTD(1mg/kg)和在抗EpCAM方案中預定的最高劑量(6mg/kg)相似，可預料的是，以上研究的免疫球蛋白抗EpCAM具有顯著更高的安全范圍，可能是由于其低得多的親合性。
實施例4疾病中的EpCAM表達為了評定在此描述的治療方法的適用性范圍，在許多不同疾病中研究了人類EpCAM抗原的表達。預料的是，本發(fā)明的方法可以有效地應用于任何疾病，在所述疾病中相對于給定組織的健康狀態(tài)，在疾病狀態(tài)下EpCAM表達升高。特別是，對于肝臟組織中的EpCAM抗原合成加以了特別的關注。
患者和組織。總共254個不同的肝臟組織樣本通過EpCAM的免疫組織學和以下所列的相關形態(tài)學的參數(shù)進行表征。分析了不同的腫瘤樣品，包括63例HCC、5例肝臟的膽管細胞癌和30例發(fā)育不良的節(jié)結(前惡性肝細胞的前兆損害)，以及5例正常的肝臟樣本。33例活組織檢查采自患有丙型慢性肝炎的患者，27例來自患有慢性乙型肝炎的患者，28例來自患有慢性酒精肝疾病(ALD)的患者；9名患者患有自體免疫性肝炎(AIH)。通過使用Menghini針進行活檢來獲得肝臟組織，對于HCC通過切除術或肝臟移出來獲得。立即將組織固定在4％中性緩沖的甲醛中，根據(jù)標準方案進行處理。
形態(tài)學評估。根據(jù)用H&E染色的切片進行形態(tài)學評估(癌和慢性肝炎的分級)。HCC的分級如Nzeako et al.，Cancer 76，1995，579-88中所列的進行。如下對非腫瘤性肝臟疾病進行形態(tài)學評估通過使用如Ishak，Mod.Pathol.7，1994，690-713中描述的經(jīng)修改的肝臟活動指數(shù)(hepatic activity index)來分析慢性乙型肝炎和慢性丙型肝炎的壞死性炎癥的活動。
免疫組織學評估。使用所謂的ABC法和二氨基聯(lián)苯胺作為發(fā)色團，如早先描述的(Prange et al.，J.Pathol.201，2003，250-9)進行免疫組織學。小鼠單克隆抗人類EpCAM抗體(克隆VU-1D9；Novocastra，Newcastle，UK)稀釋1/50，并在30min的胰蛋白酶預處理(0.1％，pH 7.8)后應用。相應地進行cyclinD1(DCS-6；1∶100；DAKO，Hamburg，Germany)、p53(FL-393；1∶50；Santa Cruz，Santa Cruz，USA)和遍在蛋白(70458；1∶200；DAKO)的免疫組織學。進行陰性對照，包括省略原始抗體。
對于在HCC中EpCAM染色的評估，僅半定量地對強度進行了分級(0＝陰性，+(1)＝弱陽性，++(2)＝中度陽性，+++(3)＝強陽性(至少與膽管染色的強度相等))。如下對非腫瘤活檢標本中EpCAM的肝細胞表達進行分級0＝無肝細胞染色；(+)(0.5)＝少數(shù)散布的陽性肝細胞，+(1)＝沿幾個或大多數(shù)間隔或門靜脈管道(septa or portal tract)的小群干細胞，++(2)＝環(huán)繞幾個或大多數(shù)門靜脈管道或間隔并發(fā)展到midacinar區(qū)域的大群陽性肝細胞，+++(3)＝廣泛的肝細胞陽性，一般覆蓋至少50％的肝小葉(acinus)。通過使用描述性統(tǒng)計學(平均值、中值、最大值、頻率)和Spearman的相關系數(shù)來進行統(tǒng)計學評價。P＜0.05的水平被認為是顯著的。
在HCC中EpCAM的新近表達(neo-expression)。正常的肝臟組織顯示了所有膽管上皮細胞的強烈染色，而肝細胞是完全陰性的(數(shù)據(jù)未顯示)。在63例分析的HCC中的9例(14.3％；附圖8A-F)和在所有分析的肝臟的膽管細胞癌(n＝5)中，EpCAM的免疫組織學顯示了特異性的膜染色(membranousstaining)。在HCC中，表達從弱到強烈，似乎在中度和不良分化的HCC中更常見，而僅一個良好分化的HCC是陽性的。在30例代表前惡性損害(pre-malignant lesion)的發(fā)育不良的節(jié)結中，僅3例顯示了輕微的EpCAM表達。對相同組織分析了許多其它的腫瘤相關抗原，綜合表達數(shù)據(jù)進行相關性分析。在HCC中EpCAM表達與p53和遍在蛋白的核積累之間存在著中度但是顯著的正相關(p＜0.05)，但與被懷疑的上游調(diào)節(jié)物cyclin D1之間沒有。
在慢性壞死炎癥性肝臟疾病中EpCAM的肝細胞新近表達。在高百分比的被分析的非腫瘤肝臟組織中檢測到肝細胞的特異性膜陽性(附圖8C-E)。在患有慢性肝炎的情況中發(fā)現(xiàn)了顯著的陽性(marked positivity)，在患有ALD的那些情況中發(fā)現(xiàn)的程度較低。此外，注意到所有小導管增殖的陽性，以及分散在門靜脈周圍的實質(zhì)的單個小細胞的陽性(潛在的前體細胞)。肝細胞的陽性顯示了強烈的門靜脈周圍的/間隔周圍的(periseptal)優(yōu)勢度，在某些情況下達到了膽管染色的強度。在任何情況下在非實質(zhì)肝細胞中存在EpCAM的非特異性反應性。
當分析半定量免疫組織分值的平均值和中值時(參見方法)，在有HBV感染(平均分值0.93；中值分值0.5；最大分值3；陽性EpCAM染色的頻率(+/++/+++)55.6％；)、ALD(平均分值0.88；中值分值0.75；最大分值2.5；陽性EpCAM染色頻率(+/++/+++)78.6％；)，和HCV-感染(平均分值0.86；中值分值0.5；最大分值3；陽性EpCAM染色的頻率(+/++/+++)63.6％)的組織中EpCAM表達是最高的?；加蠥IH的患者具有中間的EpCAM染色(平均分值0.72；中值分值0.5；最大分值3；陽性EpCAM染色頻率(+/++/+++)55.6％；)。在患有慢性的膽疾病PBC(平均分值0.13；中值分值0；最大分值0.5；陽性EpCAM染色的頻率(+/++/+++)25.0％；)和PSC(平均分值0.04；中值分值0；最大分值0.5；陽性EpCAM染色的頻率(+/++/+++)7.7％；)的患者中幾乎沒有肝細胞的EpCAM表達(附圖9；在圖右側的標繪中顯示了統(tǒng)計變量的說明)。
結論。針對肝纖維化的階段以及壞死性炎癥活動的組織學生化參數(shù)與EpCAM表達的相關性，對來自患有慢性肝病像慢性肝炎C病毒(HCV)和肝炎B病毒(HBV)感染、慢性自體免疫肝炎(AIH)、慢性酒精肝疾病(ALD)和肝細胞癌(HCC)的患者的組織樣品進行半定量分析。在正常的成年人肝臟中是EpCAM陰性的肝細胞，在來自患有慢性肝病的患者的肝臟組織中顯示了重新(de novo)EpCAM表達。在患有壞死性炎癥性疾病(HCV和HBV肝炎、AIH、ALD)的患者中肝細胞的EpCAM表達是最高的。肝細胞的EpCAM表達與炎癥性活動的組織學和生化參數(shù)和纖維化的程度顯著地相關，在有HBV感染的患者中這是特別驚人的。此外，14.3％的HCC顯示了腫瘤細胞上的EpCAM表達。
該結果表明，EpCAM的重新表達僅在一小部分肝細胞癌(HCC)中發(fā)生，但在慢性的壞死性炎癥性肝臟疾病中的肝細胞上經(jīng)常地發(fā)生。這種表達與疾病活性和纖維化正相關。具體地，已經(jīng)證明了在慢性壞死炎癥性肝臟疾病中的肝細胞EpCAM新近表達(neo-expression)與纖維化和壞死性炎癥性活動的相關性。這些發(fā)現(xiàn)暗示了即將出現(xiàn)的治療選擇，例如靶向惡性腫瘤中的目標EpCAM的單克隆抗體，并且也可以適用于某些HCC。作為特定的結果，一部分HCC代表針對EpCAM的抗體治療的有效目標。
實施例5使用“抗EpCAM”的II期研究中獲得的患者數(shù)據(jù)證實藥物動力學預測期望的是，使用從隨后II期研究中獲得的真實患者數(shù)據(jù)來證實根據(jù)藥物動力學模型的預測的精確性(它們本身基于抗EpCAM的I期研究獲得的藥物動力學數(shù)據(jù)，參見上文的實施例1和2)，在所述II期研究中根據(jù)本發(fā)明施用抗EpCAM。這項II期研究是國際的、開放標記的(open-label)、多中心(multicenter)、隨機化、具有兩個平行處理組的II期研究。將參與抗EpCAMII期研究的患者隨機分成兩個組，第一組接受如以下說明施用的低劑量的抗EpCAM(2mg/kg體重)，第二組接受如以下說明的高劑量的抗EpCAM(6mg/kg體重)。在抗EpCAM II期研究的過程中，每名患者最初在加載階段間隔一周接受抗EpCAM的三次加載劑量(各為2mg/kg體重或6mg/kg體重，取決于患者組)，繼之以直至23次隨后的抗EpCAM維持劑量(再次地，2mg/kg體重或6mg/kg體重，取決于患者組)，其中每兩周施用單個維持劑量。
根據(jù)基于抗EpCAM I期研究數(shù)據(jù)的藥物動力學預測，接受低劑量抗EpCAM的第一患者組的血清波谷水平預計將接近10μg/ml(與附圖7所示的波谷水平相關)，而接受高劑量抗EpCAM的第二患者組的血清波谷水平預計將接近30μg/ml(與附圖6所示的波谷水平相關)。
分析如下進行。用HD4A4(針對抗EpCAM的抗獨特型抗體；5μg/ml體積100ml)包被96孔板，繼之以阻斷和洗滌步驟。添加刻度標準、質(zhì)量控制樣品和抗EpCAM的樣品(100ml，以合適的稀釋度)，繼之以洗滌步驟。用生物素化的抗人IgG檢測HD4A4結合的抗EpCAM，再次繼之以洗滌步驟。添加鏈霉抗生物素蛋白(0.5mg/ml，體積100μl)，再次洗滌96孔板，在最后的步驟添加180μl的pNPP。用50μl 3M NaOH停止分析，在405和490nm在ELISA讀取器上測量。以1∶100的關系進行低劑量樣品的稀釋。以1∶300的關系進行高劑量樣品的稀釋。結果在附圖10中示出。
附圖10用點描述了對來自低劑量組的一名患者測量的個體波谷水平(患者編號401001；數(shù)據(jù)點用正方形標明)和對來自高劑量組的另一名患者測量的個體波谷水平(患者編號101002；數(shù)據(jù)點用菱形標明)。連接各個患者的數(shù)據(jù)點的水平線的平均垂直水平代表了該患者觀察到的血清波谷水平。因此，可以看出，高劑量患者101002的水平線(鉆石形點)表明了抗EpCAM的波谷水平濃度與這個劑量的30μg/ml的預計值的良好一致性(比較附圖6中的圖表的連接預測的波谷的水平線)。同樣地，低劑量患者401001的水平線(方形點)表明了抗EpCAM的波谷水平濃度與這個劑量的10μg/ml的預計值的良好一致性(比較附圖7中的圖表的連接預測的波谷的水平線)。
這些數(shù)據(jù)用抗EpCAM II期研究期間獲得的真實患者數(shù)據(jù)證實了根據(jù)抗EpCAM I期研究期間獲得的數(shù)據(jù)通過藥物動力學模型預測波谷水平的精確性。因而，可以斷定，藥物動力學模型的假定和結果是正確的，根據(jù)本發(fā)明的治療方式具有上文中詳細說明的效果和益處。
**************在此公開和在此要求權利的所有組合物和方法可以根據(jù)當前的公開來制造和執(zhí)行而不需過度的實驗。雖然已經(jīng)就優(yōu)選的實施方式描述了本發(fā)明的組合物和方法，對本領域的技術人員顯而易見的是，可以將各種變化應用于組合物和方法以及在此描述的步驟和步驟的順序中，而不背離本發(fā)明的概念、精神和范圍。更具體地，顯而易見的是，可以用化學上和生理學上都相關的某些試劑替換在此描述的試劑，而達到相同的或相似的結果。對于本領域的技術人員顯而易見的所有這種相似的替換和修改都認為處在由附隨的權利要求所定義的本發(fā)明的精神、范圍和概念之內(nèi)。
序列表<110>米克羅麥特股份公司(Micromet AG)<120>抗EpCAM免疫球蛋白<130>MIC-022 PCT<140>未知<141>2005-02-09<150>US 10/778,915<151>2004-02-13<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>457<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>抗EpCAM重鏈<400>1Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Lys Asp Met Gly Trp Gly Ser Gly Trp Arg Pro Tyr Tyr Tyr Tyr100 105 110Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala115 120 125Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser130 135 140Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe145 150 155 160Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly165 170 175
Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu180 185 190Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr195 200 205Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys210 215 220Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro225 230 235 240Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys245 250 255Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val260 265 270Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr275 280 285Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu290 295 300Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His305 310 315 320Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys325 330 335Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln340 345 350Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu355 360 365Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro370 375 380Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn385 390 395 400Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu405 410 415Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val420 425 430Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln435 440 445Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys450 455<210>2<211>214<212>PRT<213>人工序列
<220>
<223>抗EpCAM輕鏈<400>2Glu Leu Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr20 25 30Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Asp Ile Pro Tyr85 90 95Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala100 105 110Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly115 120 125Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala130 135 140Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln145 150 155 160Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser165 170 175Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr180 185 190Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser195 200 205Phe Asn Arg Gly Glu Cys210
權利要求
1.一種通過向患者施用與人類EpCAM抗原特異性結合的人免疫球蛋白在人類患者中治療腫瘤疾病的方法，所述免疫球蛋白展現(xiàn)出至少15天的血清半衰期，所述方法包括以不超過每周一次的頻率施用所述免疫球蛋白的步驟。
2.權利要求1的方法，進一步包括(a)在相應的最后一次施用所述免疫球蛋白、但先于相應的下一次施用所述免疫球蛋白的至少一周的時間之后，測定仍存在于所述患者的血液中的所述免疫球蛋白的血清水平，從而獲得所述血清蛋白的中間血清水平值；(b)將所述免疫球蛋白的所述中間血清水平值與預定的所述免疫球蛋白的血清波谷水平相比較；(c)任選地重復步驟(a)和(b)；(d)如果所述免疫球蛋白的中間血清水平值不高于超過所述血清波谷水平值以上15％、優(yōu)選10％、最優(yōu)選5％，進行相應的下一次施用。
3.權利要求1或2的方法，其中設置所施用的所述人免疫球蛋白的劑量的大小，從而，在兩次相應施用之間的間隔時間結束時，維持在血清中的所述人免疫球蛋白的量從不降至低于預定的血清波谷水平。
4.權利要求1到3的任一項的方法，其中所述施用每兩周進行一次，或其中所述施用頻率低于每兩周進行一次。
5.權利要求4的方法，其中所述施用每兩周進行一次，并且所述人免疫球蛋白的施用劑量從一次施用到下一次保持不變。
6.權利要求4的方法，其中所述施用頻率低于每兩周進行一次，并且所述人免疫球蛋白的施用劑量和施用頻率從一次施用到下一次保持不變。
7.權利要求5或6的方法，其中所述起始的和所有隨后的劑量的大小通過藥物動力學模擬來確定。
8.以上的權利要求的任一項的方法，其中所述施用是靜脈內(nèi)的、腹膜內(nèi)的、皮下的、肌肉內(nèi)的、表面的或皮內(nèi)的。
9.以上的權利要求的任一項的方法，其中所述腫瘤疾病是乳腺癌、上皮癌、肝細胞癌、膽管細胞癌癥、胃癌、結腸癌、前列腺癌、頭和頸部癌癥、皮膚癌(黑素瘤)、泌尿生殖道的癌癥，例如，卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、宮頸癌、和腎癌；肺癌、胃癌、小腸癌、肝癌、胰腺癌、膽囊癌、膽管癌癥、食道癌、催涎腺的癌癥、或甲狀腺的癌癥。
10.權利要求9的方法，其中所述腫瘤疾病是前列腺癌或乳腺癌，所述人免疫球蛋白以1到7mg每kg體重的劑量每兩周一次地施用。
11.權利要求10的方法，其中所述人免疫球蛋白以2到6mg每kg體重的劑量每兩周一次地施用。
12.以上的權利要求的任一項的方法，其中所述人免疫球蛋白包含具有SEQ ID NO1中所列氨基酸序列的免疫球蛋白重鏈和具有SEQ ID NO2中所列氨基酸序列的免疫球蛋白輕鏈。
13.與人類EpCAM抗原特異性結合的人免疫球蛋白，特征是在向人類患者施用之后所述人免疫球蛋白展現(xiàn)出至少15天的血清半衰期。
14.權利要求13的人免疫球蛋白，其中所述血清半衰期是20、19天、18天、17天、16天或15天。
15.權利要求13或14的人免疫球蛋白，其中所述半衰期是15天，并且所述人免疫球蛋白包括具有SEQ ID NO1中所列氨基酸序列的免疫球蛋白重鏈和具有SEQ ID NO2中所列氨基酸序列的免疫球蛋白輕鏈。
16.包含權利要求13-15任一項的人免疫球蛋白的藥物組合物。
17.與人類EpCAM抗原特異性結合的人免疫球蛋白用于制備治療腫瘤疾病的藥物的用途，所述人免疫球蛋白展現(xiàn)出至少15天的血清半衰期，所述藥物被配制為用于以不超過每周一次的頻率施用。
18.權利要求17的用途，其中所述藥物被配制為以不超過每兩周一次的頻率施用。
19.權利要求17或18的用途，其中所述藥物被配制為每兩周施用，并且所述人免疫球蛋白的施用劑量從一次施用到下一次保持不變。
20.權利要求17-19任一項的用途，其中所述藥物被配置為以不超過每兩周一次的頻率施用，設置所施用的所述人免疫球蛋白施用劑量，從而，在兩次相應施用之間的間隔時間結束時，維持在血清中的所述人免疫球蛋白的量從不降至低于被確定為治療效力所必需的血清波谷水平。
21.權利要求17-20任一項的用途，其中所述藥物被配制為用于靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi)、表面或皮內(nèi)施用的藥物。
22.權利要求17-21任一項的用途，其中所述腫瘤疾病是乳腺癌、上皮癌、肝細胞癌、膽管細胞癌癥、胃癌、結腸癌、前列腺癌、頭和頸部癌癥、皮膚癌(黑素瘤)、泌尿生殖道的癌癥，例如，卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、宮頸癌、和腎癌；肺癌、胃癌、小腸癌、肝癌、胰腺癌、膽囊癌、膽管癌癥、食道癌、催涎腺的癌癥、或甲狀腺的癌癥。
全文摘要
本發(fā)明特別涉及通過向患者施用特異性結合人類EpCAM抗原的人免疫球蛋白來治療人類患者中腫瘤疾病的方法，所述免疫球蛋白呈現(xiàn)至少15天的血清半衰期，所述方法包括以不超過每周一次、優(yōu)選以不超過每兩周一次的頻率施用所述免疫球蛋白的步驟。
文檔編號A61P35/00GK1976951SQ200580009976
公開日2007年6月6日 申請日期2005年2月9日 優(yōu)先權日2004年2月13日
發(fā)明者馬爾特·彼得斯, 馬賽厄斯·洛徹, 納德賈·普朗, 科尼利亞·奎特 申請人:米克羅麥特股份公司