專利名稱：：通過還原氨基化制備的羥烷基淀粉和蛋白質的偶聯(lián)物的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及羥烷基淀粉，優(yōu)選羥乙基淀粉，和蛋白質的偶聯(lián)物，其中這些偶聯(lián)物是羥烷基淀粉或羥烷基淀粉衍生物的至少一個醛基與蛋白質的至少一個氨基通過還原氨基化反應形成的，以使得該羥烷基淀粉或其衍生物通過偶氮甲堿鍵或氨基亞甲基鍵與蛋白質共價連接。本發(fā)明也涉及制備這些偶聯(lián)物的方法和該偶聯(lián)物的具體應用。
背景技術：
：根據(jù)廣泛接受的觀點，當?shù)鞍踪|偶聯(lián)到聚合物分子上時，可以改善蛋白質的穩(wěn)定性，并降低對這些蛋白質的免疫應答。WO94/28024披露了一種用聚乙二醇(PEG)修飾的生理活性蛋白，其顯示降低的免疫原性，而且在血流中的循環(huán)比非偶聯(lián)蛋白長得多，即，具有較長的血漿半衰期。WO03/074087涉及一種把蛋白質偶聯(lián)到來源于淀粉的修飾多糖的方法。蛋白質與多糖(羥烷基淀粉)之間的結合作用是共價鍵，該共價鍵是在羥烷基淀粉分子的末端醛基或該末端醛基經化學修飾后所得的官能團與蛋白質的官能團之間形成的。其公開了氨基、硫基和羧基作為蛋白質反應基團。此外，雖然其中列出了不同鍵的多種可能性，包括不同官能團、理論上適合的不同連接分子和不同的化學方法，但是其工作實施例只描述了兩種選擇第一，使用氧化的羥乙基淀粉，采用乙基二甲基氨基丙基碳二亞胺(EDC)活化作用直接與蛋白質偶聯(lián)，或者采用未氧化的羥乙基淀粉，直接(即不需要連接化合物)與蛋白質偶聯(lián)形成希夫堿，隨后還原成各自的胺。因此，WO03/074087的工作實施例并未公開包含羥乙基淀粉、蛋白質和一種或多種連接分子的單一偶聯(lián)物。此外，盡管其涉及了通過還原氨基化作用形成偶聯(lián)物，但是WO03/074087并不包含任何關于進行該還原氨基化作用的蛋白質的優(yōu)選氨基的信息。
發(fā)明內容因此，本發(fā)明的一個目的是提供羥烷基淀粉，優(yōu)選羥乙基淀粉，和蛋白質的新的偶聯(lián)物，其中當施用于需要的患者時，該偶聯(lián)物具有有益的治療效果。本發(fā)明進一步的目的是提供羥烷基淀粉，優(yōu)選羥乙基淀粉，和蛋白質的新的偶聯(lián)物，其中該偶聯(lián)物是寡肽或多肽的氨基與羥烷基淀粉，優(yōu)選羥乙基淀粉的醛基或酮基或半縮醛基或與其醛基官能化的衍生物通過還原氨基化反應形成的。本發(fā)明的另一個目的是提供一種制備所述新偶聯(lián)物的方法，其中所述方法是在特殊的和選擇的反應條件下進行的。因此，本發(fā)明涉及一種制備包含蛋白質和聚合物或聚合物衍生物的偶聯(lián)物的方法，其中該聚合物是羥烷基淀粉，所述方法包括將聚合物或聚合物衍生物的至少一個醛基或酮基或半縮醛基與蛋白質的至少一個氨基通過還原氨基化作用共價連接，所述方法進一步包含通過開環(huán)氧化反應在聚合物中引入至少兩個醛基，并且所述聚合物的至少一個醛基與蛋白質的氨基反應，或者該聚合物與至少雙官能化合物反應，所述雙官能化合物包括兩個官能團M和Q，一個官能團M與聚合物反應，一個官能團Q被化學修飾，產生醛基或酮基或半縮醛基官能化的聚合物衍生物，所述的官能化衍生物通過還原氨基化作用與蛋白質的氨基反應。因此，本發(fā)明也涉及一種包含蛋白質和聚合物或聚合物衍生物的偶聯(lián)物，其中該聚合物是羥烷基淀粉，可以通過制備偶聯(lián)物的方法獲得該偶聯(lián)物，所述方法包括將聚合物或聚合物衍生物的至少一個醛基或酮基或半縮醛基與蛋白質的至少一個氨基通過還原氨基化作用共價連接，所述方法進一步包含通過開環(huán)氧化反應在聚合物中引入至少兩個醛基并且所述聚合物的至少一個醛基與蛋白質的氨基反應，或者該聚合物與至少雙官能化合物反應，所述化合物包括兩個官能團M和Q，一個官能團M與聚合物反應，一個官能團Q被化學修飾，產生醛基或酮基或半縮醛基官能化的聚合物衍生物，所述的官能化衍生物通過還原氨基化作用與蛋白質的氨基反應。在本發(fā)明的上下文中，術語“蛋白質”涉及任意的氨基酸序列，其具有至少2個，優(yōu)選至少5個，更優(yōu)選至少10個，更優(yōu)選至少15個，更優(yōu)選至少20個，更優(yōu)選至少25個，更優(yōu)選至少30個，更優(yōu)選至少35個，更優(yōu)選至少40個，更優(yōu)選至少45個，更優(yōu)選至少50個，及更優(yōu)選至少100個氨基酸。該蛋白質可以通過化學合成方法來制備，或者可以來源于任意的人或其它哺乳動物，并可以通過從天然來源中純化而獲得。根據(jù)本發(fā)明，該蛋白質可以是生長因子、細胞因子、活化劑、抑制劑、酶、抗體、抗原、轉運蛋白、生物粘著蛋白、激素、受體、抑制因子、或其功能性衍生物或片段。在本發(fā)明的上下文中，術語“功能性衍生物或片段”涉及能夠全部或部分地維持原始分子的所需生物學性質或活性的衍生物或片段，例如，能夠維持原始分子至少10％，更優(yōu)選至少20％，更優(yōu)選至少30％，更優(yōu)選至少40％，更優(yōu)選至少50％，更優(yōu)選至少60％，更優(yōu)選至少70％，更優(yōu)選至少80％，特別優(yōu)選至少90％的所需的生物學性質或活性。所述片段特別優(yōu)選的例子是，例如抗體片段。蛋白質的例子是紅細胞生成素(EPO)例如重組人EPO(rhEPO)、集落刺激因子(CSF)例如G-CSF樣重組人G-CSF(rhG-CSF)、α-干擾素(IFNα)、β-干擾素(IFNβ)或γ-干擾素(IFNγ)例如IFNα和IFNβ樣重組人IFNα或IFNβ(rhIFNα或rhIFNβ)、白細胞介素例如IL-1到IL-18，例如IL-2或IL-3樣重組人IL-2或IL-3(rhIL-2或rhIL-3)、血清蛋白例如凝結因子II-XIII樣因子VII，VIII，IX、α1-抗胰蛋白酶(A1AT)、活化的蛋白C(APC)、纖溶酶原活化因子例如組織型纖溶酶原活化因子(tPA)，例如人組織纖溶酶原活化因子(hTPA)、ATIII例如重組人ATIII(rhATIII)、肌紅蛋白、白蛋白例如牛血清白蛋白(BSA)、生長因子例如表皮生長因子(EGF)，血小板生長因子(PDGF)，成纖維細胞生長因子(FGF)，腦源性生長因子(BDGF)，神經生長因子(NGF)，B-細胞生長因子(BCGF)，腦源性神經營養(yǎng)生長因子(BDNF)，睫狀神經營養(yǎng)因子(CNTF)、轉化生長因子例如TGFα或TGFβ、BMP(骨形成蛋白)、生長激素例如人生長激素、腫瘤壞死因子例如TNFα或TNFβ、生長抑素、生長激素、生長介素、血紅蛋白、激素或激素原例如胰島素、促性腺素、促黑激素(α-MSH)、曲普瑞林、下丘腦激素例如抗利尿激素(ADH)和催產素及釋放激素和釋放抑制激素、甲狀旁腺激素、甲狀腺激素例如甲狀腺素、促甲狀腺素、促甲狀腺激素釋放素、促乳素、降鈣素、胰高血糖素、胰高血糖素樣肽(GLP-1，GLP-2等)、毒蜥外泌肽(exendine)例如毒蜥外泌肽-4、來普汀、加壓素、胃泌素、胰泌素、整聯(lián)蛋白、糖蛋白激素(例如LH，F(xiàn)SH等)、melanoside-刺激激素、脂蛋白和載脂蛋白例如載脂蛋白-B、載脂蛋白-E、載脂蛋白-La、免疫球蛋白例如IgG、IgE、IgM、IgA、IgD及其片段、水蛭素、組織路徑抑制劑、植物蛋白例如凝集素或蓖麻毒素、蜂毒、蛇毒、免疫毒素、E抗原、α-蛋白酶抑制劑、豕草變應原、黑色素、寡聚賴氨酸蛋白、RGD蛋白或任選這些蛋白的其中一個的相應受體；或者任意這些蛋白或受體的功能性衍生物或片段。優(yōu)選的酶是例如糖類特異性酶、蛋白水解酶、氧化酶、氧化還原酶、轉移酶、水解酶、裂解酶、異構酶、激酶和連接酶。特別的非限制性的例子是門冬酰胺酶、精氨酸酶、精氨酸脫氨酶、腺苷脫氨酶、谷氨酰胺酶、谷氨酰胺酶-天冬酰胺酶、苯丙氨酸酶、色氨酸酶、酪氨酸酶、超氧化物歧化酶(SOD)、內毒素酶、過氧化氫酶、過氧化物酶、激肽釋放酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、彈性蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、脂肪酶、尿酸酶、腺苷二磷酸酶、嘌呤核苷磷酸化酶、膽紅素氧化酶、葡萄糖氧化酶、glucodase、葡糖酸氧化酶、半乳糖苷酶、葡糖腦苷脂酶、葡糖醛酸酶、透明質酸酶、凝血激酶、鏈激酶、尿激酶、MAP-激酶、DNA酶、RNA酶、乳鐵蛋白及其功能性衍生物或片段。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，該蛋白質選自EPO、G-CSF、IFNα、IFNβ、ATIII、IL-2、IL-3、肌紅蛋白、SOD、A1AT、和BSA。根據(jù)本發(fā)明特別優(yōu)選的實施方案，該蛋白質選自rhEPO、rhG-CSF、rhIFNα、rhIFNβ、rhATIII、rhIL-2、rhIL-3、肌紅蛋白、SOD、A1AT、和BSA。紅細胞生成素(EPO)是一種紅系祖細胞成熟為紅細胞所必需的糖蛋白激素。在成年人中，它在腎中生成。EPO是調節(jié)循環(huán)中的紅細胞水平所必需的。低水平組織氧的條件可以刺激EPO的生物合成增加，接著EPO會刺激紅細胞生成。如在慢性腎功能衰竭中所觀察到的那樣，腎功能的缺失，例如，一般導致EPO生物合成減少伴有紅細胞減少。紅細胞生成素是一種約34,000Da的酸性糖蛋白激素。人紅細胞生成素是一種作為單體自然存在的166個氨基酸的多肽(Lin等，1985，PNAS82，7580-7584，EP148605B2，EP411678B2)。在例如U.S.4,703,008中描述了編碼紅細胞生成素的基因的鑒別、克隆和表達。在例如U.S.4,667,016中描述了從細胞培養(yǎng)基中純化重組紅細胞生成素，該細胞培養(yǎng)基支持包含重組紅細胞生成素質粒的哺乳動物細胞的生長。在本
技術領域：
一般確信，EPO在體內的生物活性主要取決于EPO結合唾液酸的程度(參見，例如EP428267B1)。理論上，14個唾液酸分子可以結合到1分子EPO的糖側鏈的末端，該糖側鏈連接到N-和O-糖基化位點。要獲得高唾液酸化的EPO制品，必須經過高度復雜的純化步驟。紅細胞生成素的進一步詳細信息可參見Krantz，Erythropoietin(紅細胞生成素)，1991，Blood，77(3)419-34(綜述)和Cerami，Beyonderythropoiesisnovelapplicationsforrecombinanthumanerythropoietin(紅細胞生成重組人紅細胞生成素的新應用)，2001，SeminHematol.，(3Suppl7)33-9(綜述)。G-CSF是一種21kDa的糖蛋白，其通過兩個鏈內二硫鍵和包含一個O-連接糖部分來穩(wěn)定化。成熟的G-CSF有174個氨基酸。在動物體內，G-CSF是由骨髓基質細胞、巨噬細胞和成纖維細胞合成的。它的主要功能是作為中性粒細胞和其前體細胞的生長和分化因子。但是本領域也已知，G-CSF能夠活化成熟的中性粒細胞。此外，它還能刺激各種其他的造血祖細胞的生長/分化(與其它的造血生長因子產生協(xié)同作用)，并促進內皮細胞的增殖和遷移。在臨床上，G-CSF被用于治療中性粒細胞水平不足(例如由再生障礙性貧血、脊髓發(fā)育不良、AIDS、或化學療法所導致)。G-CSF可以用化學合成的方法制備，或者可以是任意地來源于人(參見例如，Burgess，A.W.等.1977，Stimulationbyhumanplacentalconditionedmediumofhemopoieticcolonyformationbyhumanmarrowcells(人胎盤條件培養(yǎng)基刺激人骨髓細胞造血集落形成)，Blood49(1977)，573-583；Shah，R.G.等1977，Characterizationofcolony-stimulatingactivityproducedbyhumanmonocytesandphytohemagglutinin-stimulatedlymphocytes(人單核細胞和植物凝集素刺激的淋巴細胞產生的集落刺激活性的表征)，Blood50(1977)，811)或其它哺乳動物，或者可以是從自然來源例如人胎盤、人血或人尿中純化。另外，許多的上皮癌、急性髓細胞樣白血病和各種腫瘤細胞系(膀胱癌、成神經管細胞瘤)都能表達該因子。此外，表達性G-CSF也包括G-CSF變體，其中一個或多個氨基酸(例如，1到25個，優(yōu)選1到10個，更優(yōu)選1到5個，最優(yōu)選1或2個)被其他的氨基酸置換，而且顯示G-CSF活性(參見，例如Riedhaar-Olson，J.F.等1996，Identificationofresiduescriticaltotheactivityofhumangranulocytecolony-stimulatingfactor(人粒細胞集落刺激因子活性關鍵殘基的鑒定)，Biochemistry359034-90411996；U.S.5,581,476；5,214,132；5,362,853；4,904,584)。在本領域也描述了G-CSF的活性測定(G-CSF的體外活性測定參見例如Shirafuji，N.等1989，Anewbioassayforhumangranulocytecolony-stimulatingfactor(hG-CSF)usingmurinemyeloblasticNFS-60cellsastargetsandestimationofitslevelsinserafromnormalhealthypersonsandpatientswithinfectiousandhematologicaldisorders(用鼠成髓NFS-60細胞作為靶標的一種新的人粒細胞集落刺激因子(hG-CSF)生物測定法，以及檢測其在正常健康者和傳染病和血液病患者血清中的水平)，Exp.Hematol.1989，17，116-119；G-CSF的體內活性測定參見例如Tanalca，H.等.1991，Pharmacokineticsofrecombinanthumangranulocytecolony-stimulatingfactorconjugatedtopolyethyleneglycolinrats(與聚乙二醇偶聯(lián)的重組人粒細胞集落刺激因子在大鼠中的藥代動力學)，CancerResearch，51，3710-3714，1991)。公開了G-CSF活性測定試驗的其他出版物包括，U.S.6,555,660；Nohynek，G.J.等.1997，Comparisonofthepotencyofglycosylatedandnonglycosylatedrecombinanthumangranulocytecolony-stimulatingfactorsinneutropenicandnonneutropenicCDrats(糖基化和非糖基化重組人粒細胞集落刺激因子在中性白細胞減少和非中性白細胞減少CD大鼠中的效果的比較)，CancerChemotherPharmacol(1997)39；259-266。優(yōu)選地，該G-CSF是重組產生的。這包括通過基因組或cDNA克隆或通過DNA合成獲得的外源性DNA序列的原核或真核宿主表達。適當?shù)脑怂拗靼ǜ鞣N細菌例如大腸桿菌。適當?shù)恼婧怂拗靼ń湍咐玑劸平湍?S.cerevisiae)和哺乳動物細胞，例如中國倉鼠卵巢細胞和猴細胞。蛋白質的重組產生方法是本領域已知的。一般地，包括用適當?shù)谋磉_載體轉染宿主細胞、在能產生蛋白質的條件下培養(yǎng)宿主細胞和從宿主細胞中純化蛋白質。詳細的信息參見例如Souza，L.M.等.1986，Recombinanthumangranulocytecolony-stimulatingfactoreffectsonnormalandleukemicmyeloidcells(重組人粒細胞集落刺激因子對正常和白血病骨髓細胞的影響)，Science198623261-65，1986；Nagata，S.等.1986，MolecularcloningandexpressionofcDNAforhumangranulocytecolony-stimulatingfactor(人粒細胞集落刺激因子cDNA的分子克隆和表達)，Nature319415-418，1986；Komatsu，Y.等.1987，Cloningofgranulocytecolony-stimulatingfactorcDNAfromhumanmacrophagesanditsexpressioninEscherichiacoli(來自人巨噬細胞的粒細胞集落刺激因子cDNA的克隆及其在大腸桿菌中的表達)，JpnJCancerRes.198778(11)1179-1181。在一個優(yōu)選的實施方案中，該G-CSF具有人成熟G-CSF的氨基酸序列(參見例如，Nagata，S.等.1986，MolecularcloningandexpressionofcDNAforhumangranulocytecolony-stimulatingfactor(人粒細胞集落刺激因子cDNA的分子克隆和表達)，Nature319415-418，1986)，可以在其氨基末端進一步包含甲硫氨酸，形成175個氨基酸的蛋白質。此外，G-CSF可以包含絲氨酸或蘇氨酸殘基來代替甲硫氨酸。用于本發(fā)明的方法和根據(jù)本發(fā)明的偶聯(lián)物中的G-CSF可以包括在Thr133位經O-連接糖基化連接到G-CSF上的一個糖側鏈，即該G-CSF被糖基化(V.Gervais等，Eur.J.Biochem.1997，247，386-395)。該糖側鏈的結構可以是NeuNAc(α2-3)Gal(β1-3)[NeuNAc(α2-6)]GalNAc和(α2-3)Gal(β1-3)GalNAc(NeuNAc＝N-乙酰神經氨酸，GalNAc＝N-乙酰半乳糖胺)。也有人建議，與天然多肽相比可以引入至少一個其他的糖鏈來修飾G-CSF和其他多肽(U.S.5,218,092)。根據(jù)所使用的宿主，該G-CSF表達產物可以是用哺乳動物或其他真核的糖類糖基化的。通常，當用真核細胞制備G-CSF時，該蛋白質在翻譯后糖基化。因此，糖側鏈可以在哺乳動物，特別是人、昆蟲或酵母細胞的生物合成期間連接到G-CSF上。重組人G-CSF(rhG-CSF)通常用于治療不同形式的白細胞減少。這樣，rhG-CSF的商業(yè)制劑也是可以利用的，其商品名為非格司亭(Gran和Neupogen)、來格司亭(Neutrogin和Granocyte)和那托司亭(Neu-up)。Gran和Neupogen是非糖基化的，在重組大腸桿菌細胞中產生。Neutrogin和Granocyte是糖基化的，在重組CHO細胞中產生，Neu-up是非糖基化的，在重組大腸桿菌細胞中產生的完整rhG-CSF的N末端含有5個取代的氨基酸。干擾素是介導對病毒感染和其他生物誘導物應答的抗病毒、抗增殖和免疫調節(jié)活性的細胞因子。與IFNα不同，IFNβ是高度物種特異性的。IFNβ有兩種亞型，IFNβ1a和IFNβ1b。當用工業(yè)化生產時，IFNβ1a和IFNβ1b的主要區(qū)別在于用來產生它們的各自的細胞系統(tǒng)不同。IFNβ1a是由哺乳動物細胞制備的，IFNβ1a被命名為1a是因為它的氨基酸序列與天然干擾素β的氨基酸序列相同。IFNβ1b是由細菌產生的。干擾素，像大多數(shù)其他的哺乳動物蛋白質一樣，在翻譯后通過糖基化作用而修飾。但是細菌缺乏使蛋白質糖基化的能力，因此IFNβ1b不包括在天然物質中發(fā)現(xiàn)的糖側鏈。IFNβ1a具有166個氨基酸，分子量為約22,500D，IFNβ1b具有165個氨基酸，分子量為約18,500Da，這是因為由于采用細菌制備方法，IFNβ1b的N-末端沒有甲硫氨酸和糖基化作用。在例如EP0218825A1中給出了人干擾素β的氨基酸序列。在下列文獻中報道了干擾素β的晶體結構Proc.Natl.Acad.Sci.USA94(1997)pp11813-11818，Biochemistry，KarpusasM，NolteM，BentonCB，MeierW，LipscombWN，GoelzS。干擾素β的商業(yè)制品是Betaseron(IFNbeta1b)、Avonex和Rebif(IFNβ1a)。IFNβ1b制備方法包括細菌性發(fā)酵大腸桿菌菌株，該大腸桿菌攜帶包含人干擾素βser17基因的基因工程質粒。從人成纖維細胞中可以獲得該天然基因，并且可以通過在17位用絲氨酸殘基取代半胱氨酸殘基的方法來改變該基因。通過重組DNA技術，使用引入了人干擾素β基因的遺傳工程中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，產生IFNβ1a。IFNβ1a的氨基酸序列與來源于天然成纖維細胞的人干擾素β的氨基酸序列相同。天然干擾素β和干擾素β1a分別通過各自包含單個N-連接復合糖部分在Asn80處糖基化。根據(jù)說明，干擾素β藥物可以用于治療復發(fā)-緩解型多發(fā)性硬化。但是施用該干擾素β藥物產品會帶來很多嚴重的副作用。此外它們通過注射(肌內或皮下)給藥，會導致另外的危險。為了減少副作用和易于(例如，低頻率)給藥，已經進行了大量的開發(fā)工作以改善IFNβ的性質。蛋白質的聚合物修飾是一項可以用于改善蛋白質性質的技術。主要使用的技術是用聚乙二醇修飾干擾素，稱為PEG化。單核細胞/巨噬細胞、類淋巴母細胞、成纖維細胞和許多不同細胞類型在由病毒、核酸、糖皮質激素和其他誘導物誘導后天然產生IFNα型。已知IFNα有至少23種不同的變體。各蛋白質的分子量在19-26kD之間，蛋白質包含的長度為156-166和172個氨基酸。所有的IFNα亞型在115-151氨基酸位都具有一個共同的保守序列區(qū)，而氨基末端則是可變的。許多IFNα亞型的序列僅有1或2個位置不同。在1/98位和29/138位的半胱氨酸之間形成了二硫鍵。29/138的二硫鍵對于生物活性是必需的，而1/98的鍵則可以還原而不影響生物活性。所有的IFNα型包含潛在的糖基化位點，但大多數(shù)亞型并未被糖基化。與IFNγ不同，IFNα蛋白在pH＝2時是穩(wěn)定的。用遺傳修飾的大腸桿菌進行IFNα的工業(yè)化生產。由于細菌缺少使蛋白質糖基化的能力，用于已批準的藥物產品的IFNα的兩種變體(IFNα2a和IFNα2b)都是未糖基化的。常規(guī)的IFNα主要缺點在于其副作用。干擾素α藥物可以用于治療丙型肝炎，為改善干擾素α藥物已經做了大量的工作。蛋白質的聚合物修飾是一項可以用于改善蛋白質性質的技術。主要使用的技術是用聚乙二醇修飾干擾素，稱為PEG化。兩種商業(yè)可用的IFNα的PEG化變體是PEGIntron(SP)和Pegasys(Roche)?？鼓窱II(ATIII)是一種抑制凝血酶和因子Xa的絲氨酸蛋白酶抑制劑(Travis，Annu.Rev.Biochem.52655，1983)。也可輕度抑制因子IXa、XIa、XIIa、tPA、尿激酶、胰蛋白酶、纖溶酶和激肽釋放酶(Menache，Semin.Hematol.281，1991；Menache，Transfusion32580，1992；Lahiri，Arch.Biochem.Biophys.175737，1976)。人ATIII是在肝中合成的，其為一種分子量(MW)約58,000D的具有432個氨基酸的單鏈糖蛋白。它的血漿濃度在14-20mg/dL之間(Rosenberg，Rev.Hematol.2351，1986；Murano，Thromb.Res.18259，1980)。該蛋白質含有3個二硫鍵(Cys8-128，Cys21-95，Cys247-430)和占總質量15％的4個N-連接糖鏈(Asn96，-135，-155，-192)(Franzen，J.Biol.Chem.2555090，1980；Peterson，ThePhysiologicalInhibitionsofBloodCoagulationandFibrinolysis(凝血和纖維蛋白溶解的生理抑制)，Elsevier/North-HollandBiomedicalPress1979，p43)?？鼓甘且环Nserpin型的絲氨酸蛋白酶抑制劑，在血液凝固的控制中是主要的重要因子。ATIII是在人血漿中循環(huán)的最豐富的內源抗凝因子。該絲氨酸蛋白酶抑制劑參與調節(jié)生理和病理狀態(tài)的凝固(Opal，Crit.CareMed.2002，30325)。它以兩種具有較低的凝血酶抑制容量的形式循環(huán)(Pike，J.Biol.Chem.27219562，1997；Ersdal-Badju，F(xiàn)ed.Proc.44404，1985)(85-95％是具有4個雙觸角、單和二唾液酸化寡糖鏈的α異構體，5-15％是高肝素親和力的β異構體，其在Asn135缺少糖基化，2-6末端唾液酸連接)。一小部分循環(huán)的ATIII通常與在血管內皮細胞表面上的蛋白聚糖結合。這些蛋白聚糖主要是硫酸乙酰肝素，其分子結構與肝素類似，能夠以與肝素相同的方式催化對凝血酶的抑制。與肝素的明確限定的戊糖單元結合的ATIII會導致蛋白質的構象變化(Choay，Ann.NYAcad.Sci.370644，1981；Choay，Biochem.Biophys.Res.Commun.116492，1983；Olson，J.Biol.Chem.2666353，1991；Bauer，Semin.Hematol.2810，1991；Carell，Thromb.Haemost.78516，1997)。該結合的催化作用使得ATIII對凝血酶和因子Xa的抑制活性增加了1000倍(Rosenberg，F(xiàn)ed.Proc.44404，1985；Bjork，Antithrombinandrelatedinhibitorsofcoagulationproteinases(抗凝血酶和相關的凝血蛋白酶抑制劑)inBarett，Salvesen(eds.)ProteinaseInhibitors，vol17，Amsterdam，TheNetherlandsElsevierSciencePublishers(BiomedicalDevision)1986p489；Olson，J.Biol.Chem.26712528，1992)。部分ATIII定位于通常產生內源性凝血級聯(lián)的內皮表面，使得ATIII能快速中和這些凝血酶，保護天然表面以免形成血栓。因此，ATIII預防血栓形成的關鍵性質是它能與催化劑肝素相結合，經歷改變其抑制性質的構象變化，并且不可逆地與凝血酶或因子Xa結合，并由此抑制它們的活性。ATIII也具有顯著的抗炎性質，其中一些抗炎性質是由它在凝血級聯(lián)中的作用而產生的(Roemisch，BloodCoagulFibrinolysis.2002，13657)?；罨哪鞍酌福缁罨囊蜃覺和凝血酶可以促成炎癥的發(fā)生；例如，通過釋放促炎介質。ATIII對這些蛋白酶的抑制作用可以防止它們與細胞的特異性相互作用和后續(xù)的反應(Roemisch，BloodCoagulFibrinolysis2002，13657)。非依賴于凝固的ATIII的抗炎性質包括與細胞的直接相互作用，導致例如前列環(huán)素的釋放。ATIII與近來鑒別出的一個細胞受體多配體聚糖-4(syndecan-4)的結合導致了對例如脂多糖類介質誘導的細胞內信號的干擾，這樣使得炎癥應答下調(Roemisch，BloodCoagulFibrinolysis2002，13657)。除了分析游離ATIII的結構，由于肝素ATIII絡合物對于ATIII生理功能的重要性，也進行了許多研究來評估肝素的低聚糖單元的絡合位(Choay，Ann.NYAcad.Sci.370644，1981；Choay，Biochem.Biophys.Res.Commun.116492，1983；Olson，J.Biol.Chem.2666353，1991；Bauer，Semin.Hematol.2810，1991；Carell，Thromb.Haemost.78516，1997)?？梢杂媒浀涞娜搜獫{分級分離技術來制備ATIII。使用高親和力的肝素作為ATIII配體進行親和色譜(肝素-sepharose)，然后用熱處理法使病毒滅活，可以用于從血漿中分離。除了從血漿中分級分離外，近來更多地選擇重組生產技術來產生ATIII，該技術為該重要的治療性蛋白的生產提供了一種更安全的途徑(Levi，SeminThrombHemost27405，2001)。ATrynTM是GTCBiotherapeutics在轉基因山羊中產生的一種重組人ATIII(rhATIII)。已經有詳細的研究對來源于血漿的ATIII(phATIII)和rhATIII的結構和功能性質進行了比較(Edmunds，Blood，914561，1998)。根據(jù)該實驗，除了糖基化外，rhATIII在結構上與phATIII相同。在轉基因產生的物質的Asn155位上發(fā)現(xiàn)了低聚甘露醇結構，而在來源于血漿的蛋白質中則探測到了絡合物結構。pdATIII的某些半乳糖單元在rhATIII中被GalNac單元所取代。在rhATIII中巖藻糖基化程度較高是另一個不同之處。最后，這兩種蛋白質的唾液酸化模式在兩方面不同rhATIII的唾液酸化較少并包含N-乙酰-和N-羥乙酰神經氨酸。這兩種分子的兩個糖部分之間的結構差異也導致了生物化學性質的不同。如下的ATIII藥物在歐洲的醫(yī)療市場中是可以得到的(來源IMS-ATCgroup2001)Kybernin(AventisBehring)、ATIII(Baxter，Grifols)、Atenativ(Pharmacia)、Aclotine(LFB)、Anbin(Grifols)。因子VIII參加內在的蛋白酶凝血級聯(lián)系統(tǒng)，并且可以在將因子X轉換成活化型Xa的因子IXa的反應中作為輔助因子，Xa最終導致纖維蛋白凝塊的形成。因子VIII的缺乏或不穩(wěn)定會導致血友病A，其為一種隱性x-連鎖的凝血障礙。在所有的種族中，血友病A的頻率為每10,000個男性出生兒中1-2個?；颊叩囊蜃覸III表達水平遠低于正常水平或者屬于所謂的crm(交叉反應物質)陽性患者組(約5％的患者)，其血漿中含有大量的因子VIII(正常水平的至少30％)，但是該蛋白質是非功能性的。所有患者中約50％具有嚴重的血友病A，其中因子VIII活性小于正常水平的1％；他們經常自發(fā)性出血流入關節(jié)、肌肉和內臟中。30-40％患者發(fā)生的輕度血友病A與活性為正常水平的5-30％有關。其僅僅在重大的創(chuàng)傷或外科手術后才會發(fā)生出血。在約10％的患者中會發(fā)生中度嚴重血友病A；在此，因子VIII的活性為正常水平的2-5％，較小的創(chuàng)傷后就會發(fā)生出血。因子VIII的人體內半衰期通常是10-15小時，但必須注意的是，另一種因子-vanWillebrand因子也會影響其釋放、穩(wěn)定性和分解動力學。因子VIII既可以通過常規(guī)提取從捐贈的人血漿中產生，也可以用近來的重組系統(tǒng)來產生。例如，幼倉鼠腎(BHK)細胞可以用于產生Kogenate(Bayer)，而中國倉鼠卵巢(CHO)細胞可以用于另一種產品Rekombinate(Baxter)。名義分子量為267kD的含有2351個氨基酸的完全單鏈蛋白質(Toole等，1984，Nature312342)或完全或部分去除了B-域的其他形式，能獲得更穩(wěn)定的產物而且在制備中可以獲得更高收率(Bhattacharyya等.2003，CRIPS4/32-8)。在高爾基體中前體產物被加工成200和80kD的兩條多肽鏈，在血中表達與金屬離子一起保持的這兩條鏈(Kaufman等，1988，J.Biol.Chem.，2636352)。前凝血劑活性需要凝血酶進一步分裂以得到54kD和44kD的重鏈片段和72kD的輕鏈片段(Aly等，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA4933)。在來源于人血漿的因子VIII濃縮物中，斷裂的某些具有完全活性的因子VIII形式已經在文獻中進行了描述(Anderson等，1986，Proc.Natl.Acad，Sci.832979)。施用血漿或重組因子VIII通常的副作用是會在大量患者中(高達30％)發(fā)生免疫反應，這使得該因子喪失了治療價值。過去，已經開始有各種嘗試通過耐受性的口腔誘導來使患者具有耐受性，但結果都不是太令人鼓舞。也有人提出誘導耐受性的新的遺傳學方法，但并未發(fā)現(xiàn)其廣泛的應用。本發(fā)明人考慮到，HES化的蛋白質具有輕度免疫原性，因此可以減少這種并發(fā)癥。因子VIII高度富含賴氨酸殘基(在全部2350個氨基酸中有超過220個)，可以用于還原氨基化的途徑。α-抗胰蛋白酶(A1AT，也稱作α1-蛋白酶抑制劑)是一種蛋白酶抑制劑，其顯示出可以抑制事實上所有哺乳動物的絲氨酸蛋白酶(TravisAnn.Rev.Biochem.52(1983)p.655)，包括中性白細胞彈性蛋白酶、凝血酶、因子Xa和XIa。A1AT是一種在肝中合成的具有394個氨基酸、分子量為53kD的單鏈糖蛋白。血漿濃度為1-1.3g/l。在整個蛋白中僅存在一個半胱氨酸，因此不會形成分子內二硫鍵。該分子含有占分子量12％的三個糖側鏈(Asn46，83，247)(MegaJBiol.Chem.255(1980)p.4057；MegaJ.Biol.Chem.255(1980)p.4053；CarellFEBSLetters135(1981)p.301；HodgesBiochemistry21(1982)p.2805)。已經發(fā)現(xiàn)分別具有2或3個觸角結構的兩種類型的糖鏈(HodgesJBiol.Chem.254(1979)p.8208)。在一般人群中，人A1AT至少具有20種不同的形式。這種微異質性是兩種類型的糖鏈含量不同的結果。其關鍵功能是對中性白細胞彈性蛋白酶的活性控制(TravisAnn.Rev.Biochem.52(1983)p.655)。不受控制的彈性蛋白酶活性會導致對上皮組織的攻擊，造成不可挽回的損害。在滅活過程中，A1AT作為底物用于將彈性蛋白酶結合到蛋白酶的活性中心，接著形成絡合物而使該蛋白酶滅活。缺乏A1AT會導致例如，與肺的上皮組織損害有關的肺氣腫。A1AT中兩種類型的糖側鏈對A1AT三個N-糖基化位點的分布在每個A1AT同種型中是不同的。A1AT的經典制備方法是使用不同的親和層析步驟從人血漿中提取的血漿分級分離技術。但是，較新的生產A1AT的方法是使用重組技術。PPLTherapeutics已經發(fā)展出了一種方法，允許從轉基因羊的奶中回收重組人A1AT(rHA1AT)(OlmanBiochem.Soc.Symp.63(1998)p.141；TebbuttCurr.Opin.Mol.Cher.2(2000)p.199；CarverCytotechnology9(1992)p.77；WrightBiotechnology(NY)9(1991)p.830)。至于該分子的蛋白質部分，rhA1AT顯示了與pdA1AT相同的結構。但是，對于其他重組產生的人蛋白質的情況，糖側鏈會有不同，特別是唾液酸殘基的量會不同。組織型纖溶酶原活化因子(tPA)是一種在血塊溶解中重要的胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶。當存在纖維蛋白凝塊時，tPA將纖溶酶原轉變成可以降解纖維蛋白的纖溶酶。當存在纖維蛋白時，tPA的活性增強，結果導致纖維蛋白特異性的纖溶酶原活化(M.W.Spellman，L.J.Basa，C.K.Leonard，J.A.Chakel，J.V.O′Connor，TheJournalofBiologicalChemistry264(1989)p.14100)。纖溶酶溶解纖維蛋白，可以獲得纖維蛋白降解產物。通過正反饋機制，纖溶蛋白通過刺激tPA介導的纖溶酶原活化可以促進其自身的降解(R.J.Stewart等.TheJournalofBiologicalChemistry275(2000)pp.10112-10120)。htPA是纖維蛋白溶解的生理活化劑，在不同類型的組織中都存在纖維蛋白溶解。它是一種分子量約68kD的糖蛋白。在天然形式中，tPA以單鏈形式(單鏈組織型纖溶酶原活化劑，sctPA)存在，其可以通過在肽鍵Arg275-Ile276處的纖溶酶分裂轉變成雙鏈結構(雙鏈組織型纖溶酶原活化劑，tctPA)。對于纖維蛋白溶解的處理，可以產生重組rtPA(重組組織型纖溶酶原活化劑)。不同類型的tPA顯示了在糖結構上的結構差異。I型tPA在氨基酸Asn117、Asn184和Asn448位具有N-連接寡糖。II型tPA在Asn117和Asn448處糖基化。兩種類型在Thr61位都包含O-連接的巖藻糖殘基(K.Mori等.TheJournalofBiologicalChemistry270(1995)pp.3261-3267)。研究了CHO-細胞中表達的tPA的糖結構，表明糖鏈的2、3和4觸角結構具有較多的種類(M.W.Spellman，L.J.Basa，C.K.Leonard，J.A.Chakel，J.V.O′Connor，TheJournalofBiologicalChemistry264(1989)p.14100)。tPA的一級結構包含數(shù)個據(jù)信將要交聯(lián)的半胱氨酸，另外在83位有一個游離的半胱氨酸殘基，其可以與另一個tPA相互作用形成二聚體。多個結果表明，tPA的體內清除率會受到糖結構，特別是在Asnl17位連接的高甘露醇寡糖的影響。提出的另一種清除機制包括肝細胞上的高親和力受體識別在Thr61位的O-連接的巖藻糖殘基。該殘基在Cys83附近。已經發(fā)展出一種生物工程tPA(TNK-tPA)來延長半衰期。在117位的糖基化位點轉移到103位。在117位的天冬酰胺被谷氨酰胺取代，在103位的蘇氨酸被天冬酰胺取代。由于在蛋白酶區(qū)域的四丙氨酸取代，TNK-tPA對于纖溶酶原活化物抑制劑1的滅活作用具有耐受性(R.J.Stewart等.TheJournalofbiologicalChemistry275(2000)pp.10112-10120)。TNK-tPA可以作為單一靜脈推注藥物施用，而tPA只能作為丸藥使用，然后輸注?；罨鞍證(APC)是一種與嚴重敗血癥有關的凝固和炎癥的調節(jié)因子?；罨鞍證是通過凝血酶與血栓調節(jié)蛋白偶合而由它的無活性前體(蛋白C)轉變而成的。該復合物N-末端的短活化肽從蛋白質C的重鏈上脫落，形成活化蛋白C。Drotrecoginα(活化的)是一種重組人活化蛋白C(rhAPC)。它的氨基酸序列與來源于血漿的活化蛋白C相同，并具有相似的性質。在市場銷售的活化蛋白C是EliLilly的Xigris。它是在人細胞系(HEK293)中產生的，在該細胞系中引入了蛋白C表達載體。使用該細胞系是由于其具有正確絡合物系列翻譯后修飾的序列能力，該翻譯后修飾是功能性活性所需要的。重組人活化蛋白C是一種包含4個N-糖基化位點和12個二硫鍵的雙鏈糖蛋白。該重鏈包含250個氨基酸。在該鏈中，7個殘基是半胱氨酸，3個是N-連接的糖基化位點(Asn-248，Asn-313和Asn-329)。這7個半胱氨酸殘基在形成3個重鏈內二硫鍵和1個鏈間二硫鍵。輕鏈包含1個N-連接糖基化位點(Asn-97)和17個半胱氨酸殘基，后者形成8個輕鏈內二硫鍵和1個鏈間二硫鍵。在輕鏈上的前9個谷氨酸是γ-羧酸化的(Gla)，而天冬氨酸71是β羥基化的。rhAPC與來源于人血漿的活化蛋白C具有相同的氨基酸序列，但是與后者的不同之處在于它的糖基化模式?；罨鞍證是一種屬于絲氨酸蛋白酶家族的蛋白酶。它在調節(jié)凝固中發(fā)揮主要作用?；罨鞍證抗血栓功能的基礎是它能夠抑制凝血酶的功能。此外，活化蛋白C是一種與嚴重敗血癥相關的炎癥的重要調節(jié)因子。內源性絲氨酸蛋白酶抑制劑是活化蛋白C的天然抑制劑，導致活化蛋白C體內循環(huán)活性半衰期非常短暫(短于30分鐘)。從循環(huán)中清除活化蛋白C是由至少三個過程的組合介導的，這三個過程包括內源性蛋白酶抑制劑對活化蛋白C酶活性的抑制，器官例如肝或腎清除活化蛋白C和/或活化蛋白C-絲氨酸蛋白酶抑制劑絡合物，及循環(huán)或組織蛋白酶分解活化蛋白C和/或活化蛋白C-絲氨酸蛋白酶抑制劑絡合物。用24μg/kg/h的劑量進行24小時輸注的I期臨床研究得到了穩(wěn)態(tài)的血漿濃度70ng/ml。在輸注結束時測得的rhAPC的半衰期為0.5-1.9小時。血漿rhAPC濃度在輸注結束后2小時內降低到10ng/ml的檢測限度以下。由于其較短的生理和藥代動力學半衰期，在臨床應用于治療敗血癥時，活化蛋白C按一定的速率連續(xù)地輸注，以維持所需的血漿濃度。進行了一些嘗試來改善活化蛋白C的藥代動力學分布。例如D.T.Berg等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA100(2003)pp.4423-4428描述了一種具有延長的血漿半衰期的活化蛋白C工程變體。因子VII參加蛋白酶的內源性凝血級聯(lián)系統(tǒng)并通過活化凝血級聯(lián)的外部途徑來加速止血。因子VII通過因子Xa、因子XIIa、因子IXa或凝血酶的輕度蛋白水解作用轉變?yōu)橐蜃覸IIa。在組織因子和鈣離子存在下，因子VIIa隨后通過限制性蛋白水解把因子X轉變成因子Xa。在組織因子和鈣存在下，因子VIIa也可以把因子IX轉變?yōu)橐蜃覫Xa。因子VII是一種由406個氨基酸殘基組成的維生素K-依賴型糖蛋白(分子量為50K道爾頓)。因子VII可以從捐贈人的血漿中常規(guī)提取，也可以用近來的重組系統(tǒng)來生產。NovoNordisk使用幼倉鼠腎(BHK)細胞來生產NovoSeven。其表達為一種具有406個氨基酸、名義分子量為55kDa的單鏈蛋白質(Thim，L.等，Biochemistry277785-7793(1988))。該分子包含4個糖側鏈。在Ser52，60位有2個O-連接的糖側鏈，在Asn145，322位有2個N-連接的糖側鏈(Thim，L.等，Biochemistry277785-7793(1988))。據(jù)稱，因子VII與因子VIII或因子IX的抑制劑一起可以用于治療血友病A或B患者發(fā)生的出血。因此，本發(fā)明也涉及HAS-因子VII偶聯(lián)物在制備與因子VIII或因子IX的抑制劑一起用于治療血友病A或B患者發(fā)作的藥物中的應用。因子IX是一種維生素K-依賴型血漿蛋白質，其通過在Ca(2+)離子、磷脂、和因子VIIIa存在下將因子X轉變成它的活化形式參與血液凝固的內源性途徑。因子IX是一種分子量約為55,000Da、在單鏈中包含415個氨基酸的糖蛋白(YoshitakeS.等，Biochemistry243736-3750(1985))。因子IX可以從捐贈人的血漿中常規(guī)提取，也可以用近來的重組系統(tǒng)來生產。Wyeth使用中國倉鼠卵巢(CHO)細胞生產了BeneFIX。它具有與來源于血漿的因子IX的Ala148等位型相同的一級氨基酸序列，并且與內源性因子IX具有相似的結構和功能性質。該蛋白質包含8個糖側鏈。在Ser53，61位和蘇氨酸159，169，172，179位有6個O-連接的糖側鏈，在Asn157，167位有2個N-連接的糖側鏈(YoshitakeS.等，Biochemistry243736-3750(1985)；BallandA.等，EurJBiochem.1988；172(3)565-72)。據(jù)稱，因子IX可以用于控制和預防血友病B(先天性因子IX缺乏或克里斯馬斯病)患者的出血性發(fā)作，包括控制和預防在外科環(huán)境中的出血。因此，本發(fā)明也提供一種HAS-因子IX偶聯(lián)物在制備用于控制和預防血友病B(例如，先天性因子IX缺乏或克里斯馬斯病)患者的出血性發(fā)作(包括控制和預防在外科環(huán)境中的出血)的藥物中的應用。在本發(fā)明的上下文中，術語“羥烷基淀粉”(HAS)涉及一種被至少一個羥烷基取代的淀粉衍生物。本發(fā)明一個優(yōu)選的羥烷基淀粉具有根據(jù)通式(I)的結構其中該淀粉分子的還原端呈非氧化型，末端糖單元呈半縮醛型，根據(jù)如溶劑的不同，該半縮醛型可以與醛型平衡。本發(fā)明使用的術語羥烷基淀粉并不限于如通式(I)中為簡便起見所示在末端糖部分包含羥烷基R1、R2和/或R3的化合物，也涉及其中在末端糖部分和/或淀粉分子HAS′中其余部分的任何位置的至少一個羥烷基被羥烷基R1、R2、或R3取代的化合物。羥烷基淀粉也可能包含兩個或多個不同羥烷基。包含在HAS中的至少一個羥烷基可包含兩個或多個羥基。根據(jù)一個優(yōu)選的實施方案，包含在HAS中的至少一個羥烷基包含一個羥基。術語“羥烷基淀粉”也包括其中烷基被單-或多取代的衍生物。在本文中，優(yōu)選烷基被鹵素，特別是氟取代，或被芳基取代。此外，羥烷基的羥基也可被酯化或醚化。此外，也可使用直鏈或支鏈的取代或未取代的烯基代替烷基。羥烷基淀粉是淀粉的醚衍生物。除了所述醚衍生物外，本發(fā)明中也可使用其他淀粉衍生物。例如，可用包含酯化羥基的衍生物。這些衍生物可以是，例如含2-12個碳原子的未取代一元或二元羧酸或其取代衍生物的衍生物。特別有用的是含2-6個碳原子的未取代一元羧酸的衍生物，特別是乙酸的衍生物。本文中，優(yōu)選乙?；矸?、丁酰基淀粉和丙?；矸?。此外，優(yōu)選含2-6個碳原子的未取代二元羧酸的衍生物。對于二元羧酸衍生物，該二元羧酸的第二個羧基也被酯化是有用的。此外，二元羧酸的單烷基酯衍生物也適用于本發(fā)明。對于取代的一元或二元羧酸，取代基優(yōu)選地可與上述用于取代烷基殘基的取代基相同。淀粉的酯化技術是本領域公知的(參見，例如，KlemmD.等，ComprehensiveCelluloseChemistryVol.2，1998，Whiley-VCH，Weinheim，NewYork，特別是4.4章，EsterificationofCellulose(ISBN3-527-29489-9)。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案，使用根據(jù)上述通式(I)的羥烷基淀粉。在通式(I)中，明確說明的糖環(huán)和以HAS′表示的殘基共同代表優(yōu)選的羥烷基淀粉分子。HAS′中包含的其他糖環(huán)結構可以與明確說明的糖環(huán)相同或不同。根據(jù)通式(I)的殘基R1、R2、和R3沒有特別的限制。根據(jù)一個優(yōu)選的實施方案，R1、R2、和R3分別獨立地是氫或在各烷基殘基中具有2到10個碳原子的羥烷基、羥芳基、羥芳烷基或羥烷芳基，或基團(CH2CH2O)n-H，其中n是一個整數(shù)，優(yōu)選1，2，3，4，5或6。優(yōu)選氫和具有2到10個碳原子的羥烷基。更優(yōu)選具有2到6個碳原子的羥烷基，更優(yōu)選具有2到4個碳原子的羥烷基，甚至更優(yōu)選具有2到3個碳原子的羥烷基。因此，“羥烷基淀粉”優(yōu)選包括羥乙基淀粉、羥丙基淀粉和羥丁基淀粉，其中特別優(yōu)選羥乙基淀粉和羥丙基淀粉，最優(yōu)選羥乙基淀粉。烷基、芳基、芳烷基和/或烷芳基可以是直鏈或支鏈的，并且可以被適當取代。因此，本發(fā)明也涉及一種如上所述的方法和偶聯(lián)物，其中R1、R2、和R3分別獨立地是氫或含2到6個碳原子的直鏈或支鏈羥烷基。因此，R1、R2、和R3優(yōu)選地可以是羥乙基，羥戊基，羥丁基，羥丙基例如2-羥丙基、3-羥丙基、2-羥異丙基，羥乙基例如2-羥乙基，特別優(yōu)選是氫和2-羥乙基。因此，本發(fā)明涉及一種如上所述的方法和偶聯(lián)物，其中R1、R2、和R3分別獨立地是氫或2-羥乙基，特別優(yōu)選R1、R2、和R3中至少一個殘基是2-羥乙基的實施方案。羥乙基淀粉(HES)對于本發(fā)明所有的實施方案都是最優(yōu)選的。因此，本發(fā)明涉及一種如上所述的方法和偶聯(lián)物，其中聚合物為羥乙基淀粉，并且聚合物衍生物為羥乙基淀粉衍生物。羥乙基淀粉(HES)是天然支鏈淀粉的衍生物，可被體內的α-淀粉酶降解。HES是糖聚合物支鏈淀粉的取代衍生物，其在玉米淀粉中的濃度高達95％重量。HES具有有利的生物性質，在臨床上用作血容量置換劑及用于血液稀釋療法(Sommermeyer等，1987，Krankenhauspharmazie，8(8)，271-278；和Weidler等，1991，Arzneim.-Forschung/DrugRes.，41，494-498)。支鏈淀粉由葡萄糖單位組成，其中主鏈中含有α-1，4-糖苷鍵，并且可以在分支位點處發(fā)現(xiàn)α-1，6-糖苷鍵。該分子的物理化學性質主要由糖苷鍵的類型決定。由于存在切口α-1，4-糖苷鍵，因此產生了每一圈約6個葡萄糖單體的螺旋結構。聚合物的物理化學性質和生化性質可通過取代來改變。可以利用堿性羥乙基化引入羥乙基。通過調節(jié)反應條件，可以使未取代的葡萄糖單體中各羥基對羥乙基化作用具有不同反應性。基于此事實，本領域技術人員可以在有限的范圍內改變取代模式。HES的主要特征在于分子量分布和取代程度。表述取代程度有兩種可能的方式1.取代程度可表示為取代的葡萄糖單體相對于所有葡萄糖部分的比例。2.取代程度可表示為摩爾取代程度，其表述的是每個葡萄糖部分的羥乙基數(shù)。在本發(fā)明的內容中，以DS表示的取代程度涉及如上所述的摩爾取代程度(也可參見Sommermeyer等，1987，Krankenhauspharmazie，8(8)，271-278，如上述引用，特別是p.273)。HES溶液以多分散組合物存在，其中各分子在聚合度、分支位點的數(shù)目和模式及取代模式上彼此不同。因此，HES是不同分子量的化合物的混合物。因此，特定的HES溶液由借助統(tǒng)計方式得到的平均分子量來確定。在本文中，Mn計算為取決于分子數(shù)的算術平均值?？蛇x擇地，平均重量Mw(或MW)代表取決于HES質量的單位。在本發(fā)明的上下文中，羥乙基淀粉可優(yōu)選具有1至300kD的平均分子量(平均重量)。羥乙基淀粉可進一步顯示0.1到3的優(yōu)選摩爾取代程度，優(yōu)選0.1到2，更優(yōu)選0.1到0.9，優(yōu)選0.1到8，羥乙基的C2∶C6取代的優(yōu)選比例范圍是2到20。本發(fā)明的上下文中使用的術語“平均分子量”涉及用如Sommermeyer等，1987，Krankenhauspharmazie，8(8)，271-278；和Weidler等，1991，Arzneim.-Forschung/DrugRes.，41，494-498所述的LALLS-(低角激光散射)-GPC方法確定的重量。另外對于10kD或更小的平均分子量，可以用先前LALLS-GPC確定的標準值來進行校準。根據(jù)本發(fā)明一個優(yōu)選的實施方案，所使用的羥乙基淀粉的平均分子量為1到300kD，更優(yōu)選2到200kD，更優(yōu)選4到130kD，更優(yōu)選4到70kD。平均分子量約130kD的HES的例子是取代程度為0.1到0.9，優(yōu)選0.2到0.8，例如0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、或0.8，優(yōu)選0.4到0.7，例如0.4、0.5、0.6、或0.7的HES。平均分子量約130kD的HES的例子是來自Fresenius的Voluven。Voluven是一種人造膠體，其用于例如在治療和預防低血容量癥的治療適應癥中進行容量置換。Voluven的特征是平均分子量為130,000+/-20,000D，摩爾取代程度為0.4，C2∶C6的比例約9∶1。因此，本發(fā)明涉及一種如上所述的方法和偶聯(lián)物，其中羥烷基淀粉是平均分子量為4到100kD，優(yōu)選4到70kD的羥乙基淀粉。平均分子量的優(yōu)選范圍是例如，4到70kD，或10到70kD，或12到70kD，或18到70kD，或50到70kD，或4到50kD，或10到50kD，或12到50kD，或18到50kD，或4到18kD，或10到18kD，或12到18kD，或4到12kD，或10到12kD或4到10kD。根據(jù)本發(fā)明特別優(yōu)選的實施方案，所使用羥乙基淀粉的平均分子量范圍在4kD以上和70kD以下，例如約10kD，或在9到10kD，或10到11kD或9到11kD的范圍內，或約12kD，或在11到12kD或12到13kD或11到13kD的范圍內，或約18kD，或在17到18kD或18到19kD或17到19kD的范圍內，或約50kD，或在49到50kD或50到51kD或49到51kD的范圍內。至于摩爾取代程度(DS)的上限，其值可以高達3.0，例如0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9或2.0，優(yōu)選小于2.0的值，更優(yōu)選小于1.5的值，更優(yōu)選小于1.0的值，例如0.7、0.8、或0.9。因此，摩爾取代程度的優(yōu)選范圍是0.1到2，或0.1到1.5，或0.1到1.0，或0.1到0.9，或0.1到0.8。摩爾取代程度的更優(yōu)選范圍是0.2到2，或0.2到1.5，或0.2到1.0，或0.2到0.9，或0.2到0.8。摩爾取代程度的更優(yōu)選范圍是0.3到2，或0.3到1.5，或0.3到1.0，或0.3到0.9，或0.3到0.8。摩爾取代程度甚至更優(yōu)選的范圍是0.4到2，或0.4到1.5，或0.4到1.0，或0.4到0.9，或0.4到0.8。至于所涉及的取代程度(DS)，DS優(yōu)選至少0.1，更優(yōu)選至少0.2，更優(yōu)選至少0.4和更優(yōu)選至少0.4。DS的優(yōu)選范圍是0.1到3，優(yōu)選0.1到2，更優(yōu)選0.1到0.9，更優(yōu)選0.1到0.8，更優(yōu)選0.2到0.8，更優(yōu)選0.3到0.8，甚至更優(yōu)選0.4到0.8，更優(yōu)選0.1到0.7，更優(yōu)選0.2到0.7，更優(yōu)選0.3到0.7，及更優(yōu)選0.4到0.7。特別優(yōu)選的DS的值是，例如0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，或0.9，更優(yōu)選0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7或0.8，甚至更優(yōu)選0.3，0.4，0.5，0.6，0.7或0.8，更優(yōu)選0.4，0.5，0.6，0.7或0.8，例如特別優(yōu)選0.4和0.7。在本發(fā)明的上下文中，摩爾取代程度的一個給定值，例如0.9，可以是該確定值，或者可以理解成0.85到0.94的范圍，或0.8，可以是該確定值，或者可以理解成0.75到0.84的范圍。因此，例如，給定值0.1可以是確定值0.1或者0.05到0.14的范圍，給定值0.4可以是確定值0.4或者0.35到0.44的范圍，給定值0.7可以是確定值0.7或者0.65到0.74的范圍。羥烷基淀粉，優(yōu)選羥乙基淀粉的分子量和其取代程度DS的特別優(yōu)選組合是例如，10kD和0.4，或10kD和0.7，或12kD和0.4，或12kD和0.7，或18kD和0.4，或18kD和0.7，或50kD和0.4，或50kD和0.7或100kD和0.7。關于C2∶C6的取代比例，所述取代優(yōu)選在2到20的范圍內，更優(yōu)選2到15，甚至更優(yōu)選3到12。根據(jù)本發(fā)明的另一個實施方案，也可使用平均分子量不同和/或取代程度不同和/或C2∶C6的取代比例不同的羥乙基淀粉的混合物。因此，所使用的羥乙基淀粉的混合物可具有不同平均分子量和不同取代程度和不同C2∶C6的取代比例，或者具有不同平均分子量和不同取代程度和相同或大約相同的C2∶C6的取代比例，或者具有不同平均分子量和相同或大約相同的取代程度和不同的C2∶C6的取代比例，或者具有相同或大約相同的平均分子量和不同取代程度和不同C2∶C6的取代比例，或者具有不同平均分子量和相同或大約相同的取代程度和相同或大約相同的C2∶C6的取代比例，或者具有相同或大約相同的平均分子量和不同取代程度和相同或大約相同的C2∶C6的取代比例，或者具有相同或大約相同的平均分子量和相同或大約相同的取代程度和不同的C2∶C6的取代比例，或者具有大約相同的平均分子量和大約相同的取代程度和大約相同的C2∶C6的取代比例。在根據(jù)本發(fā)明的不同偶聯(lián)物和/或不同方法中，可使用不同的羥烷基淀粉，優(yōu)選不同的羥乙基淀粉，和/或不同的羥烷基淀粉的混合物，優(yōu)選不同的羥乙基淀粉的混合物。根據(jù)本發(fā)明的還原氨基化反應，其中聚合物或聚合物衍生物通過還原氨基化作用經至少一個醛基共價連接到蛋白質的至少一個氨基上，其進行的溫度優(yōu)選是0到40℃，更優(yōu)選0到37℃，更優(yōu)選0到25℃，特別是4到21℃，特別優(yōu)選0到21℃。反應時間優(yōu)選0.5到72小時，更優(yōu)選2到48小時，特別優(yōu)選4到7小時。至于反應的溶劑，優(yōu)選是水性介質。因此，本發(fā)明也涉及一種如上所述的方法和偶聯(lián)物，其中該還原氨基化作用是在4到21℃，但特別優(yōu)選在0到21℃下進行的。因此，本發(fā)明也涉及一種如上所述的方法和偶聯(lián)物，其中該還原氨基化作用是在水性介質中進行的。因此，本發(fā)明也涉及一種如上所述的方法和偶聯(lián)物，其中該還原氨基化作用是在4到21℃，特別優(yōu)選0到21℃，在水性介質中進行的。在本發(fā)明中使用的術語“水性介質”涉及一種溶劑或溶劑的混合物，以所包含溶劑的重量為基準，其包含水的含量為至少10％重量，更優(yōu)選至少20％重量，更優(yōu)選至少30％重量，更優(yōu)選至少40％重量，更優(yōu)選至少50％重量，更優(yōu)選至少60％重量，更優(yōu)選至少70％重量，更優(yōu)選至少80％重量，甚至更優(yōu)選至少90％重量或高達100％重量。優(yōu)選的反應介質是水。該反應介質的pH值一般在4到9的范圍內，或者4到8或者4到7.5或者4到7.3。根據(jù)本發(fā)明一個優(yōu)選的實施方案，進行還原氨基化反應的pH在10以下，優(yōu)選在7.5以下，優(yōu)選7.3，更優(yōu)選小于或等于7，最優(yōu)選在7以下，即在酸性范圍內。因此優(yōu)選的范圍是3到7以下，更優(yōu)選3.5到6.5，更優(yōu)選4到6，更優(yōu)選4.5到5.5，特別優(yōu)選約5.0，即4.6或4.7或4.8或4.9或5.0或5.1或5.2或5.3或5.4。優(yōu)選的范圍還包括下列范圍3到6.9，或3到6.5，或3到6，或3到5.5，或3到5，或3到4.5，或3到4，或3到3.5，或3.5到6.9，或3.5到6.5，或3.5到6，或3.5到5.5，或3.5到5，或3.5到4.5，或3.5到4，或4到6.9，或4到6.5，或4到6，或4到5.5，或4到5，或4到4.5，或4.5到6.9，或4.5到6.5，或4.5到6，或4.5到5.5，或4.5到5，或5到6.9，或5到6.5，或5到6，或5到5.5，或5.5到6.9，或5.5到6.5，或5.5到6，或6到6.9，或6到6.5或6.5到6.9。因此，本發(fā)明也涉及一種如上所述的方法和偶聯(lián)物，其中該還原氨基化作用是在pH為7或更小，更優(yōu)選pH為6或更小的條件下進行的。本發(fā)明也涉及一種如上所述的方法和偶聯(lián)物，其中該還原氨基化作用是在0到21℃，優(yōu)選4到21℃，pH為7.5或更小，優(yōu)選7或更小，優(yōu)選6或更小的條件下進行。因此，本發(fā)明也涉及一種如上所述的方法和偶聯(lián)物，其中該還原氨基化作用是在pH為7或更小，優(yōu)選6或更小的水性介質中進行的。因此，本發(fā)明也涉及一種如上所述的方法和偶聯(lián)物，其中該還原氨基化作用是在4到21℃，pH為7或更小，優(yōu)選6或更小的水性介質中進行的。用于該反應的聚合物衍生物∶蛋白質的摩爾比優(yōu)選在200∶1到5∶1的范圍內，更優(yōu)選100∶1到10∶1，特別優(yōu)選75∶1到20∶1。令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，在上述給定的優(yōu)選pH范圍，特別是pH在7以下并大于或等于4時，聚合物衍生物主要與位于蛋白質N-末端的氨基反應。在本發(fā)明的上下文中，術語“主要”涉及這樣的實施方案，其中至少80％，優(yōu)選至少85％的可用的N末端氨基通過還原氨基化作用而反應。至少90％或至少95％或至少96％或至少97％或至少98％或至少99％的可用的N-末端氨基反應也是可以的。盡管與N末端氨基以外的其他氨基偶聯(lián)并不能完全排除，但我們相信，根據(jù)本發(fā)明在pH7以下，優(yōu)選6以下的經還原氨基化作用的偶聯(lián)基本上選擇性地發(fā)生在N末端氨基上。特別地，這些反應條件優(yōu)選用于在這些條件下穩(wěn)定的蛋白質。如果該蛋白質是例如酸不穩(wěn)定的，例如α1-抗胰蛋白酶，那么優(yōu)選需要選擇適當?shù)姆磻獥l件，特別是小于7.5到大于5的pH。因此，本發(fā)明也涉及一種如上所述的方法和偶聯(lián)物，其中該蛋白質包含N末端氨基和至少一個另外的氨基，所述偶聯(lián)物包含主要偶聯(lián)到N末端氨基上的聚合物。根據(jù)一個特別優(yōu)選的實施方案，本發(fā)明涉及一種把醛基或酮基或半縮醛基官能化的羥烷基淀粉或者醛基或酮基或半縮醛基官能化的羥烷基淀粉衍生物主要連接到蛋白質的N末端氨基上的方法，所述方法包括在pH為7或更小，優(yōu)選6或更小的條件下將所述羥烷基淀粉或其衍生物進行還原氨基化反應，所述還原氨基化反應優(yōu)選在水性介質中進行。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選醛基官能化的羥烷基淀粉或醛基官能化的羥烷基淀粉衍生物。根據(jù)本發(fā)明另一個優(yōu)選的實施方案，本發(fā)明涉及一種把醛基或酮基或半縮醛基官能化的羥乙基淀粉或者醛基或酮基或半縮醛基官能化的羥乙基淀粉衍生物選擇性地連接到蛋白質的N末端氨基上的方法，所述方法包括在pH為7或更小，優(yōu)選6或更小的條件下將所述羥乙基淀粉或其衍生物進行還原氨基化反應，所述還原氨基化反應優(yōu)選在水性介質中進行，所使用的羥乙基淀粉優(yōu)選是平均分子量是約10kD并且DS是約0.4的羥乙基淀粉，或者平均分子量是約10kD并且DS是約0.7的羥乙基淀粉，或者平均分子量是約12kD并且DS是約0.4的羥乙基淀粉，或者平均分子量是約12kD并且DS是約0.7的羥乙基淀粉，或者平均分子量是約18kD并且DS是約0.4的羥乙基淀粉，或者平均分子量是約18kD并且DS是約0.7的羥乙基淀粉，或者平均分子量是約50kD并且DS是約0.4的羥乙基淀粉，或者平均分子量是約50kD并且DS是約0.7的羥乙基淀粉，或者平均分子量是約100kD并且DS是約0.7的羥乙基淀粉。該聚合物衍生物和蛋白質在醛基或酮基或半縮醛基與氨基之間的反應是一種產生希夫堿的還原氨基化作用。隨后在該反應后，該堿可以用至少一種還原劑還原，以在該聚合物衍生物和蛋白質之間形成穩(wěn)定的鍵。該反應在至少一種還原劑存在下反應也是可能的。根據(jù)一個優(yōu)選的實施方案，該還原氨基化反應在至少一種還原劑存在下進行。優(yōu)選的還原劑是硼氫化鈉、氰基硼氫化鈉、有機硼烷絡合化合物例如4-(二甲胺)吡啶硼烷絡合物、N-乙基二異丙胺硼烷絡合物、N-乙基嗎啉硼烷絡合物、N-甲基嗎啉硼烷絡合物、N-苯基嗎啉硼烷絡合物、二甲基吡啶硼烷絡合物、三乙胺硼烷絡合物、或三甲胺硼烷絡合物。特別優(yōu)選氰基硼氫化鈉。因此，本發(fā)明也涉及一種如上所述的方法和偶聯(lián)物，其中該還原氨基化作用是在NaCNBH3存在下進行的。因此，本發(fā)明也涉及一種如上所述的方法和偶聯(lián)物，其中該還原氨基化作用是在pH為7或更小，優(yōu)選6或更小的水性介質中，在還原劑，優(yōu)選NaCNBH3存在下進行的。因此，本發(fā)明也涉及一種如上所述的方法和偶聯(lián)物，其中該還原氨基化作用是在4到21℃，pH為7或更小，優(yōu)選6或更小的水性介質中，在還原劑，優(yōu)選NaCNBH3存在下進行的。用于該反應的聚合物衍生物∶蛋白質的摩爾比優(yōu)選在200∶1到10∶1的范圍內，更優(yōu)選100∶1到10∶1，特別優(yōu)選75∶1到20∶1。因此，本發(fā)明也涉及一種制備偶聯(lián)物的方法，所述方法包括將包含醛基的聚合物或聚合物衍生物在水性介質中，在還原劑存在下與蛋白質的氨基反應，所述還原劑優(yōu)選是NaCNBH3。根據(jù)本發(fā)明的第一個優(yōu)選實施方案，根據(jù)該方案聚合物包含通過開環(huán)氧化反應引入聚合物中的至少兩個醛基，該聚合物優(yōu)選包含至少一個根據(jù)下列通式的結構根據(jù)本發(fā)明的該實施方案，每個氧化劑或氧化劑的組合都是可以使用的，其中該氧化劑能夠氧化聚合物的至少一個糖環(huán)，以得到具有至少一個，優(yōu)選至少兩個醛基的打開的糖環(huán)。下面通過反應流程來說明該反應，其中該反應流程顯示了聚合物的糖環(huán)，該糖環(huán)被氧化后得到具有兩個醛基的開環(huán)適當?shù)难趸瘎┦?，高碘酸鹽例如堿金屬的高碘酸鹽或其兩種或多種的混合物，優(yōu)選高碘酸鈉和高碘酸鉀。因此，本發(fā)明也涉及一種如上所述的方法和偶聯(lián)物，其中該聚合物用高碘酸鹽進行開環(huán)氧化反應，以得到具有至少一個，優(yōu)選至少兩個醛基的聚合物衍生物。對于該氧化反應，可以使用是具有氧化型或非氧化型，優(yōu)選非氧化型還原端的聚合物。因此，本發(fā)明也涉及一種如上所述的方法和偶聯(lián)物，其中使用的是具有非氧化型還原端的聚合物。反應溫度的優(yōu)選范圍是0到40℃，更優(yōu)選0到25℃，特別優(yōu)選0到5℃。反應時間的優(yōu)選范圍是1分鐘到5小時，特別優(yōu)選10分鐘到4小時。根據(jù)所需的氧化程度，即氧化反應得到的醛基數(shù)目，可以適當選擇高碘酸鹽∶聚合物的摩爾比。因此，本發(fā)明也涉及一種如上所述的方法和偶聯(lián)物，其中在0到5℃的溫度下進行開環(huán)氧化反應。該聚合物和高碘酸鹽的氧化反應優(yōu)選在水性介質，最優(yōu)選在水中進行。因此，本發(fā)明也涉及一種如上所述的方法和偶聯(lián)物，其中開環(huán)氧化反應是在水性介質中進行的?？梢约尤胫辽僖环N適當?shù)木彌_液將該反應混合物調節(jié)至適當?shù)膒H值。優(yōu)選的緩沖液包括醋酸鈉緩沖液、磷酸鹽或硼酸鹽緩沖液。用于所述開環(huán)氧化反應的羥乙基淀粉優(yōu)選是平均分子量是約10kD并且DS是約0.4的羥乙基淀粉，或者平均分子量是約10kD并且DS是約0.7的羥乙基淀粉，或者平均分子量是約12kD并且DS是約0.4的羥乙基淀粉，或者平均分子量是約12kD并且DS是約0.7的羥乙基淀粉，或者平均分子量是約18kD并且DS是約0.4的羥乙基淀粉，或者平均分子量是約18kD并且DS是約0.7的羥乙基淀粉，或者平均分子量是約50kD并且DS是約0.4的羥乙基淀粉，或者平均分子量是約50kD并且DS是約0.7的羥乙基淀粉，或者平均分子量是約100kD并且DS是約0.7的羥乙基淀粉。可以用至少一種適當?shù)姆椒◤姆磻旌衔镏屑兓玫降木酆衔镅苌?。如果需要，可以在用適當?shù)姆椒ǚ蛛x前沉淀該聚合物衍生物。如果首先沉淀該聚合物衍生物，可以例如將與該反應混合物所處的溶劑或溶劑混合物不同的至少一種溶劑或溶劑混合物和該反應混合物在適當?shù)臏囟冉佑|。根據(jù)本發(fā)明一個特別優(yōu)選的實施方案，其中所使用的溶劑是水性介質，優(yōu)選是水，該反應混合物與2-丙醇或丙酮和乙醇的混合物，優(yōu)選1∶1的混合物(v/v)接觸，這表示所述化合物為同樣的體積，溫度優(yōu)選是-20到+50℃，特別優(yōu)選是-20到25℃?？梢杂冒粋€或多個步驟的適當方法來進行聚合物衍生物的分離。根據(jù)本發(fā)明一個優(yōu)選的實施方案，用適當?shù)姆椒ɡ珉x心分離或過濾將該聚合物衍生物首先從該反應混合物或該反應混合物與例如水2-丙醇混合物的混合物中分離出來。第二步，可以對分離出來的聚合物衍生物進行進一步處理，例如后處理，如透析、離心過濾或加壓過濾、離子交換色譜、反相色譜法、HPLC、MPLC、凝膠過濾和/或冷凍干燥。根據(jù)一個甚至更優(yōu)選的實施方案，將分離出來的聚合物衍生物首先進行透析，優(yōu)選在水中透析，然后冷凍干燥直至反應產物中的溶劑含量根據(jù)所需的產物規(guī)格顯著地降低。進行冷凍干燥的溫度是20到35℃，優(yōu)選20到30℃。根據(jù)一個優(yōu)選的實施方案，用至少一種適當?shù)姆椒ǎ绯瑸V和/或透析來純化氧化反應得到的氧化聚合物，以例如除去不想要的低分子量鹽和聚合物組分，因此也提供一種控制氧化聚合物的分子量范圍的方法。該氧化聚合物可以直接與蛋白質反應或在第一步中適當復原，例如冷凍干燥并溶解于水中用于第二步中與蛋白質結合。關于該聚合物的至少一個醛基通過還原氨基化作用與蛋白質的至少一個氨基偶聯(lián)，可以參考上文中詳細公開的還原氨基化反應的特定反應參數(shù)，例如pH或溫度。根據(jù)本發(fā)明特別優(yōu)選的實施方案，根據(jù)所用的蛋白質為rhIL2、rhIL3、rhIFNα、rhIFNβ、rhEPO、rhATIII、rhG-CSF、BSA、肌紅蛋白和SOD，該還原氨基化作用優(yōu)選在0到5℃，例如約4℃，pH為約4.5到5.5，例如約5.0的條件下進行，反應時間為約20到30小時，例如約24小時。根據(jù)第二個優(yōu)選實施方案，該聚合物與至少雙官能化合物反應，該雙官能化合物包含至少一個能與該聚合物反應的官能團M和至少一個官能團Q，Q是醛基或酮基或半縮醛基并且其通過還原氨基化作用與蛋白質的氨基反應。優(yōu)選使用一種化合物，除了具有醛基或酮基或半縮醛基外，它還具有至少一個羧基或至少一個反應性羧基，優(yōu)選一個羧基或一個反應性羧基。醛基或酮基或半縮醛基和羧基或反應性羧基可以用任何適當?shù)拈g隔基分開。其中，該間隔基可以是任選取代的直鏈、支鏈和/或環(huán)狀的烴殘基。一般地，該烴殘基具有1到60，優(yōu)選1到40，更優(yōu)選1到20，更優(yōu)選2到10，更優(yōu)選2到6，特別優(yōu)選2到4個碳原子。如果存在雜原子，該間隔基通常包含1到20，優(yōu)選1到8，特別優(yōu)選1到4個雜原子。該烴殘基可以包含具有例如5到7個碳原子的任選分支的烷基鏈或芳基或環(huán)烷基，或是芳烷基、烷芳基，其中烷基部分可以是直鏈和/或環(huán)烷基。根據(jù)甚至更優(yōu)選的實施方案，該烴殘基是具有5到7，優(yōu)選6個碳原子的芳殘基。最優(yōu)選地，該烴殘基是苯殘基。根據(jù)該優(yōu)選實施方案，該羧基和醛基可以位于苯環(huán)的1，4-位、1，3-位或1，2位，優(yōu)選在1，4-位。反應性酯、異硫氰酸酯或異氰酸酯可以作為反應性羧基。優(yōu)選的反應性酯來源于N-羥基琥珀酰亞胺類例如N-羥基琥珀酰亞胺或硫代-N-羥基琥珀酰亞胺，適當取代的苯酚類例如對硝基苯酚、鄰，對-二硝基苯酚、鄰，鄰′-二硝基苯酚，三氯苯酚例如2，4，6-三氯苯酚或2，4，5-三氯苯酚，三氟苯酚例如2，4，6-三氟苯酚或2，4，5-三氟苯酚，五氯苯酚，五氟苯酚，或羥基唑類例如羥基苯并三唑。特別優(yōu)選的是N-羥基琥珀酰亞胺類，特別優(yōu)選N-羥基琥珀酰亞胺和硫代-N-羥基琥珀酰亞胺。所有的醇可以單獨使用或者可以兩種或幾種適當組合使用。作為反應性酯，特別優(yōu)選五氟苯酯和N-羥基琥珀酰亞胺酯。因此，根據(jù)一個優(yōu)選的實施方案，本發(fā)明也涉及一種如上所述的方法和偶聯(lián)物，其中該聚合物與甲酰苯甲酸反應。根據(jù)另一個優(yōu)選的實施方案，本發(fā)明也涉及一種如上所述的方法和偶聯(lián)物，其中該聚合物與甲酰苯甲酸五氟苯基酯反應。根據(jù)另一個優(yōu)選的實施方案，本發(fā)明也涉及一種如上所述的方法和偶聯(lián)物，其中該聚合物與甲酰苯甲酸N-羥基琥珀酰亞胺酯反應。根據(jù)另一個優(yōu)選的實施方案，本發(fā)明也涉及一種如上所述的方法和偶聯(lián)物，其中該聚合物與4-(4-甲酰-3，5-二甲氧基苯氧基)丁酸反應。根據(jù)另一個優(yōu)選的實施方案，本發(fā)明也涉及一種如上所述的方法和偶聯(lián)物，其中該聚合物與雙官能化合物反應，其中該雙官能化合物是選自α-酮基羧酸、唾液酸或其衍生物及磷酸吡哆醛的生物相容性化合物。對于α-酮基羧酸，優(yōu)選是由氨基酸衍生的α-酮基羧酸，大多數(shù)情況下也可以在人體內發(fā)現(xiàn)。優(yōu)選的由氨基酸衍生的α-酮基羧酸選自酮基-纈氨酸、酮基-亮氨酸、酮基-異亮氨酸和酮基-丙氨酸。α-酮基羧酸中的羧基與該聚合物的基團Q反應，其中基團Q為氨基。這樣就形成了酰胺基。然后α-酮基羧酸剩余的游離酮基可以與蛋白質的官能團，特別是氨基反應。這樣形成了可以氫化的亞氨基。因此，本發(fā)明涉及一種如上所述的方法和偶聯(lián)物，其中該聚合物與α-酮基羧酸反應。至于唾液酸或其衍生物，優(yōu)選其是生物相容性的，特別地，它們是在人體內發(fā)現(xiàn)的N-和/或O-乙酰化的糖類。在一個優(yōu)選的實施方案中，唾液酸是N-乙酰神經氨酸。由于吡喃糖結構，這些化合物顯示出了所需要的剛性，以實現(xiàn)作為間隔基的功能。另一方面，通過選擇性氧化向這些化合物中引入醛基也是可能的。在人體內可以發(fā)現(xiàn)唾液酸，例如在糖基化蛋白的聚糖鏈中作為末端單糖。在一個優(yōu)選的實施方案中，唾液酸可以被選擇性氧化為醛基。選擇性氧化唾液酸的方法在本領域是已知的，例如L.W.Jaques，B.F.Riesco，W.Weltner，CarbohydrateResearch，83(1980)，21-32和T.Masuda，S.Shibuya，M.Arai，S.Yoshida，T.Tomozawa，A.Ohno，M.Yamashita，T.Honda，Bioorganic&MedicinalChemistryLetters，13(2003)，669-673。優(yōu)選在與聚合物的氨基反應前進行唾液酸的氧化。然后該任選氧化的唾液酸經其羧基與聚合物的氨基反應。所得到的化合物包含醛基，該醛基可以進一步通過還原氨基化作用與蛋白質的氨基反應。因此，本發(fā)明涉及一種如上所述的方法和偶聯(lián)物，其中該聚合物與任選氧化的唾液酸反應。至于磷酸吡哆醛(PyP)，它是一種具有高度生物相容性的雙官能化合物，也稱作維生素B6。PyP是一種輔酶，其參與氨基酸側鏈的氨基轉移、脫羧、消旋化和很多的修飾。所有需要PyP的酶通過在氨基酸和輔酶之間形成希夫堿來發(fā)揮作用。PyP的磷酸基可以與聚合物，優(yōu)選羥烷基淀粉，特別是羥乙基淀粉的氨基反應形成磷酰胺。然后PyP的醛基可以與蛋白質的氨基反應，形成希夫堿，然后該希夫堿會被還原。在一個優(yōu)選的實施方案中，該偶聯(lián)物的結構是HES-NH-P(O)2-O-(吡哆醛)-CH-NH-蛋白質。在PyP的情況中，優(yōu)選通過使用如上所述的二氨基化合物向該聚合物中引入該聚合物的官能團。因此，本發(fā)明涉及一種如上所述的方法和偶聯(lián)物，其中該聚合物與磷酸吡哆醛反應。與包含M和Q的化合物(其中M優(yōu)選是羧基或反應性羧基，并且Q是醛基或酮基或半縮醛基)反應的羥乙基淀粉，最優(yōu)選是平均分子量是約10kD并且DS是約0.7的羥乙基淀粉。其他的可能是平均分子量是約10kD并且DS是約0.4的羥乙基淀粉，或者平均分子量是約12kD并且DS是約0.4的羥乙基淀粉，或者平均分子量是約12kD并且DS是約0.7的羥乙基淀粉，或者平均分子量是約18kD并且DS是約0.4的羥乙基淀粉，或者平均分子量是約18kD并且DS是約0.7的羥乙基淀粉，或者平均分子量是約50kD并且DS是約0.4的羥乙基淀粉，或者平均分子量是約50kD并且DS是約0.7的羥乙基淀粉，或者平均分子量是約100kD并且DS是約0.7的羥乙基淀粉。特別優(yōu)選地，所使用的羥烷基淀粉和甚至更優(yōu)選的羥乙基淀粉具有氧化型的還原端。接著，所得到的具有醛基或酮基或半縮醛基的聚合物衍生物通過還原氨基化作用與蛋白質的氨基反應。關于聚合物的至少一個醛基或酮基或半縮醛基通過還原氨基化作用與蛋白質的至少一個氨基偶聯(lián)，可以參考上文中詳細公開的還原性氨基化作用的特定反應參數(shù)，例如pH或溫度。根據(jù)本發(fā)明一個特別優(yōu)選的實施方案，根據(jù)使用哪種G-CSF作為蛋白質，與蛋白質的氨基反應的溫度是優(yōu)選0到40℃，更優(yōu)選0到25℃，特別優(yōu)選4到21℃。反應時間優(yōu)選從30分鐘到72小時，更優(yōu)選2到48小時，特別優(yōu)選4到17小時。優(yōu)選用水性介質作為反應溶劑。反應介質的pH值優(yōu)選在4到9的范圍內，更優(yōu)選4到8，特別優(yōu)選4.5到5.5。根據(jù)第三個優(yōu)選的實施方案，該聚合物在其任選氧化的還原端與至少雙官能的化合物反應，該雙官能化合物包含氨基M和官能團Q，其中所述氨基M與該聚合物任選氧化的還原端反應，并且其中官能團Q被化學修飾，得到可以與蛋白質的氨基通過還原氨基化作用反應的醛基官能化的聚合物衍生物。在本發(fā)明的上下文中使用的術語“該聚合物經還原端反應”或“該聚合物經氧化的還原端反應”涉及的方法，包括羥烷基淀粉主要經其(選擇性氧化的)還原端反應。該聚合物是羥烷基淀粉，特別是羥乙基淀粉。術語“主要經其(選擇性氧化的)還原端”涉及的方法，包括用于給定反應的統(tǒng)計學上大于50％，優(yōu)選至少55％，更優(yōu)選至少60％，更優(yōu)選至少65％，更優(yōu)選至少70％，更優(yōu)選至少75％，更優(yōu)選至少80％，更優(yōu)選至少85％，更優(yōu)選至少90％，更優(yōu)選至少95％，例如95％，96％，97％，98％，或99％的聚合物分子經每聚合物分子至少一個(選擇性氧化的)還原端反應，其中經至少一個還原端反應的給定聚合物分子可以經包含在所述聚合物中的并且不是還原端的至少另外一個適當?shù)墓倌軋F在相同的給定反應中反應。如果一個或多個聚合物分子經至少一個還原端，同時經包含在該聚合物中的并且不是還原端的至少另外一個適當?shù)墓倌軋F反應，那么在這些聚合物分子的所有反應的官能團中，統(tǒng)計學上優(yōu)選大于50％，優(yōu)選至少55％，更優(yōu)選至少60％，更優(yōu)選至少65％，更優(yōu)選至少70％，更優(yōu)選至少75％，更優(yōu)選至少80％，更優(yōu)選至少85％，更優(yōu)選至少90％，更優(yōu)選至少95％，例如95％，96％，97％，98％，或99％的是還原端，其中所述官能團包括還原端。在本發(fā)明的上下文中，術語“還原端”涉及可以作為醛基和/或相應的乙縮醛的形式存在的聚合物分子的末端醛基。當還原端被氧化時，醛基或乙縮醛基為羧基和/或相應的內酯的形式。對于官能團Q，包括如下的官能團-C-C-雙鍵或C-C-三鍵或芳香族C-C-鍵；-硫基或羥基；-烷基磺酸酰肼，芳基磺酸酰肼；-1，2-二醇；-1，2-氨基-硫醇；-疊氮化物；-1，2-氨基醇；-氨基-NH2或包含結構單元-NH-的氨基衍生物，例如氨基烷基、氨基芳基、氨基芳烷基或烷芳基氨基；-羥氨基-O-NH2，或包含結構單元-O-NH-的羥氨基衍生物，例如羥烷基氨基、羥芳基氨基、羥芳烷基氨基或羥烷芳基氨基；-烷氧基氨基、芳氧基氨基、芳烷氧基氨基或烷芳氧基氨基，其各包含結構單元-NH-O-；-具有羰基、-Q-C(＝G)-M的殘基，其中G是O或S，并且M是例如--OH或-SH；-烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、或烷芳氧基；-烷硫基、芳硫基、芳烷硫基、或烷芳硫基；-烷基羰基氧基、芳基羰基氧基、芳烷基羰基氧基、烷芳基羰基氧基；-活化的酯，如羥胺的酯，其具有如N-羥基琥珀酰亞胺的亞胺結構或具有結構單元O-N，其中N是雜芳基化合物的一部分，或其中G＝O和Q不存在，如具有取代芳基殘基如五氟苯基、對硝基苯基或三氯苯基的芳氧基化合物；其中Q不存在或者是NH或雜原子，如S或O；--NH-NH2，或-NH-NH-；--NO2；-腈基；-羰基，如醛基或酮基；-羧基；--N＝C＝O基或-N＝C＝S基；-乙烯基鹵化物基團，例如乙烯基碘化物或乙烯基溴化物基團或三氟甲磺酸(triflate)；--C≡C-H；--(C＝NH2Cl)-O烷基--(C＝O)-CH2-Hal，其中Hal是Cl、Br、或I；--CH＝CH-SO2-；-包含-S-S-結構的二硫基；-基團-基團根據(jù)本發(fā)明一個優(yōu)選的實施方案，術語“官能團Q”涉及的官能團Q包括化學結構-NH-，例如-NH2-，或包含結構單元-NH-的氨基的衍生物，例如氨烷基、氨芳基、氨芳烷基、或烷芳氨基。根據(jù)本發(fā)明一個優(yōu)選的實施方案，官能團M是具有結構R′-NH-的基團，其中R′是氫或烷基、環(huán)烷基、芳基、芳烷基、芳環(huán)烷基、烷芳基或環(huán)烷芳基殘基，其中該環(huán)烷基、芳基、芳烷基、芳環(huán)烷基、烷芳基或環(huán)烷芳基殘基可以直接連接到NH基上，或者根據(jù)另一個實施方案，可以通過氧橋連接到NH基上。該烷基、環(huán)烷基、芳基、芳烷基、芳環(huán)烷基、烷芳基或環(huán)烷芳基殘基可以被適當?shù)厝〈?。?yōu)選的取代基包括鹵素，例如F、Cl或Br。特別優(yōu)選的殘基R′是氫、烷基和烷氧基，甚至更優(yōu)選氫和未取代的烷基和烷氧基。在烷基和烷氧基中，優(yōu)選含1、2、3、4、5或6個碳原子的基團。更優(yōu)選的是甲基、乙基、丙基、異丙基、甲氧基、乙氧基、丙氧基和異丙氧基。特別優(yōu)選的是甲基、乙基、甲氧基、乙氧基，特別優(yōu)選甲基或甲氧基。根據(jù)本發(fā)明的另一個實施方案，官能團M具有R′-NH-R″-結構，其中R″優(yōu)選包含結構單元-NH-和/或結構單元-(C＝G)-，其中G是O或S，和/或結構單元-SO2-。官能團R″的具體實例是其中，如果G出現(xiàn)兩次，則分別獨立地是O或S。因此，本發(fā)明也涉及一種如上所述的方法和偶聯(lián)物，其中官能團M選自其中G是O或S，并且如果出現(xiàn)兩次，則分別獨立地是O或S，并且R′是甲基。根據(jù)本發(fā)明一個特別優(yōu)選的實施方案，官能團M是氨基-NH2。根據(jù)第一個選擇，為氨基NH2的官能團M與該聚合物的氧化的還原端反應，得到酰胺基，其連接該聚合物和包含M和Q的化合物。根據(jù)第二個選擇，為氨基NH2的官能團M與該聚合物的未氧化的還原端通過還原氨基化作用反應，得到亞氨基，優(yōu)選接著使該亞氨基氫化得到氨基，該亞氨基和氨基分別連接該聚合物和包含M和Q的化合物。在這種情況下，官能團Q可以是氨基。如果所得到的聚合物衍生物隨后與至少雙官能化合物反應，該反應通過羧基或反應性羧基，如下文所述，或者通過與氨基反應的該至少雙官能化合物的另一個基團進行，則優(yōu)選該包含M和Q的化合物是伯胺，其僅包含一個氨基作為官能團。在該特定情況下，盡管該化合物僅包含一個官能團，但仍將其視為包含M和Q的雙官能化合物，其中包含在該化合物中的M是氨基并與聚合物的還原端發(fā)生還原氨基化作用，其中Q是還原氨基化作用及隨后的氫化而得到的仲氨基。根據(jù)第三個選擇，該聚合物的未氧化的還原端通過還原氨基化作用與氨反應，得到聚合物的末端亞氨基，優(yōu)選隨后氫化該亞氨基得到聚合物的末端氨基，這樣就形成了末端的伯氨基。在該特定情況下，氨被視為包含M和Q的雙官能化合物，其中所使用的氨包含的M是NH2，其中Q是還原氨基化及隨后的氫化得到的伯氨基。術語“氨基Q”涉及的官能團Q，包括化學結構-NH-，例如-NH2-，或包含結構單元-NH-的氨基衍生物，例如氨烷基、氨芳基、氨芳烷基、或烷芳氨基。根據(jù)本發(fā)明一個優(yōu)選的實施方案，官能團Q是具有如下結構R′-NH-的基團，其中R′是氫或烷基、環(huán)烷基、芳基、芳烷基、芳環(huán)烷基、烷芳基或環(huán)烷芳基殘基，其中該環(huán)烷基、芳基、芳烷基、芳環(huán)烷基、烷芳基或環(huán)烷芳基殘基可以直接連接到NH基上，或者根據(jù)另一個實施方案，可以通過氧橋連接到NH基上。該烷基、環(huán)烷基、芳基、芳烷基、芳環(huán)烷基、烷芳基或環(huán)烷芳基殘基可以被適當?shù)厝〈?。?yōu)選的取代基包括鹵素，例如F、Cl或Br。特別優(yōu)選的殘基R′是氫、烷基和烷氧基，甚至更優(yōu)選氫和未取代的烷基和烷氧基。在烷基和烷氧基中，優(yōu)選含1、2、3、4、5或6個碳原子的基團。更優(yōu)選的是甲基、乙基、丙基、異丙基、甲氧基、乙氧基、丙氧基和異丙氧基。特別優(yōu)選的是甲基、乙基、甲氧基、乙氧基，特別優(yōu)選甲基或甲氧基。根據(jù)本發(fā)明的另一個實施方案，官能團Q具有R′-NH-R″-結構，其中R″優(yōu)選包含結構單元-NH-和/或結構單元-(C＝G)-，其中G是O或S，和/或結構單元-SO2-。根據(jù)更優(yōu)選的實施方案，官能團R″選自其中，如果G出現(xiàn)兩次，則分別獨立地是O或S。因此，本發(fā)明也涉及一種如上所述的方法和偶聯(lián)物，其中官能團Q選自其中G是O或S，并且如果出現(xiàn)兩次，則分別獨立地是O或S，并且R′是甲基。根據(jù)本發(fā)明一個特別優(yōu)選的實施方案，官能團M是氨基-NH2。根據(jù)本發(fā)明另一個特別優(yōu)選的實施方案，官能團M和Q都包含氨基-NH-。根據(jù)一個特別優(yōu)選的實施方案，官能團M和Q都是氨基-NH2。根據(jù)本發(fā)明一個優(yōu)選的實施方案，該包含M和Q的化合物是同型雙官能化合物，更優(yōu)選是包含M和Q、最優(yōu)選氨基-NH2作為官能團的同型雙官能化合物，或根據(jù)另一個實施方案，是羥氨基-O-NH2，或基團其中G優(yōu)選是O。這些包含M和Q的化合物的實例是與包含M，其中M優(yōu)選是氨基-NH-，更優(yōu)選是氨基-NH2，更優(yōu)選M和Q都包含氨基-NH-，特別優(yōu)選M和Q都包含氨基-NH2的化合物反應的羥乙基淀粉，優(yōu)選是平均分子量是約10kD并且DS是約0.4的羥乙基淀粉，或者平均分子量是約10kD并且DS是約0.7的羥乙基淀粉。也可能是平均分子量是約12kD并且DS是約0.4的羥乙基淀粉，或者平均分子量是約12kD并且DS是約0.7的羥乙基淀粉，或者平均分子量是約18kD并且DS是約0.4的羥乙基淀粉，或者平均分子量是約18kD并且DS是約0.7的羥乙基淀粉，或者平均分子量是約50kD并且DS是約0.4的羥乙基淀粉，或者平均分子量是約50kD并且DS是約0.7的羥乙基淀粉，或者平均分子量是約100kD并且DS是約0.7的羥乙基淀粉。在M和Q都是氨基-NH2的情況中，M和Q可以用任何適當?shù)拈g隔基分開。其中，該間隔基可以是任選取代的直鏈、支鏈和/或環(huán)狀的烴殘基。一般地，該烴殘基具有1到60，優(yōu)選1到40，更優(yōu)選1到20，更優(yōu)選2到10，更優(yōu)選2到6，特別優(yōu)選2到4個碳原子。如果存在雜原子，該間隔基通常包含1到20，優(yōu)選1到8，特別優(yōu)選1到4個雜原子。該烴殘基可以包含具有例如5到7個碳原子的任選分支的烷基鏈或芳基或環(huán)烷基，或是芳烷基、烷芳基，其中烷基部分可以是直鏈和/或環(huán)烷基。根據(jù)甚至更優(yōu)選的實施方案，該烴殘基是具有1到20，優(yōu)選2到10，更優(yōu)選2到6，特別優(yōu)選2到4個碳原子的烷基鏈。因此，本發(fā)明也涉及一種如上所述的方法和偶聯(lián)物，其中該聚合物與1，4-一氨基丁烷、1，3-二氨基丙烷或1，2-二氨基乙烷反應，得到聚合物衍生物。包含M和Q的至少雙官能化合物與該聚合物的反應優(yōu)選在0到100℃，更優(yōu)選4到80℃，特別優(yōu)選20到80℃的溫度下進行；反應時間優(yōu)選為4小時到7天，更優(yōu)選10小時到5天，特別優(yōu)選17小時到4天。至少雙官能化合物∶聚合物的摩爾比優(yōu)選是10到200，特別是50到100。作為至少雙官能化合物和聚合物的反應溶劑，優(yōu)選至少一種非質子溶劑，特別優(yōu)選含水含量不超過0.5％重量，優(yōu)選不超過0.1％重量的無水非質子溶劑。其中適當?shù)娜軇┌ǘ讈嗧?DMSO)、N-甲基吡咯烷酮、二甲基乙酰胺(DMA)、二甲基甲酰胺(DMF)和其中兩種或多種的混合物。作為至少雙官能化合物和聚合物的反應溶劑，也可以使用水性介質。根據(jù)一個優(yōu)選的實施方案，包含該聚合物和至少雙官能化合物的該聚合物衍生物在游離的官能團Q上被化學修飾，得到包含醛基或酮基或半縮醛基的聚合物衍生物。根據(jù)該實施方案，優(yōu)選該聚合物衍生物與至少一種至少雙官能的化合物反應，其中至少雙官能的化合物包含能與官能團Q反應的官能團和醛基或酮基或半縮醛基。作為至少雙官能化合物，具有醛基或酮基或半縮醛基和至少一個能與聚合物衍生物的官能團Q形成鍵的官能團的每個化合物都是適合的。該至少一個官能團選自與官能團Q相同的組，并且選擇可以與Q反應的官能團。在優(yōu)選的情況中，Q是氨基-NH2-或包含結構單元-NH-的氨基衍生物，例如氨基烷基、氨基芳基、氨基芳烷基或烷芳基氨基，優(yōu)選所使用一種化合物，其除了具有醛基或酮基或半縮醛基外，還具有至少一個羧基或至少一個反應性羧基，優(yōu)選一個羧基或一個反應性羧基。醛基或酮基或半縮醛基和羧基或反應性羧基可以用任何適當?shù)拈g隔基分開。其中，該間隔基可以是任選取代的直鏈、支鏈和/或環(huán)狀的烴殘基。一般地，該烴殘基具有1到60，優(yōu)選1到40，更優(yōu)選1到20，更優(yōu)選2到10，更優(yōu)選2到6，特別優(yōu)選2到4個碳原子。如果存在雜原子，該間隔基通常包含1到20，優(yōu)選1到8，特別優(yōu)選1到4個雜原子。該烴殘基可以包含具有例如5到7個碳原子的任選分支的烷基鏈或芳基或環(huán)烷基，或是芳烷基、烷芳基，其中烷基部分可以是直鏈和/或環(huán)烷基。根據(jù)一個優(yōu)選的實施方案，該烴殘基是具有2到6個，優(yōu)選2到4個碳原子的烷基。在醛基或酮基與羧基之間不存在碳原子也是可能的。可選擇地，該烴殘基可以是具有3到11個碳原子，優(yōu)選3到6或3到5個碳原子的取代或未取代的環(huán)烴基。當環(huán)烴基被取代時，取代基可以選自取代或未取代的氨基或烷氧基。如果存在，取代基的數(shù)目優(yōu)選是1到3。進一步地，該烷基和/或環(huán)烴基可以包含一個或多個雜原子，例如O或S，特別是O。在這種情況中，優(yōu)選存在1到3，特別是1到2個雜原子。在本文中優(yōu)選的化合物選自下列的化合物R＝H、烷基、芳基、?；iR’3R’＝烷基、芳基根據(jù)一個甚至更優(yōu)選的實施方案，該烴殘基是具有5到7，優(yōu)選6個碳原子的芳基殘基。更優(yōu)選地，該烴殘基是苯殘基。根據(jù)該優(yōu)選的實施方案，該羧基和醛基可以位于苯環(huán)的1，4-位、1，3-位或1，2-位，優(yōu)選1，4-位。至于反應性羧基，包括反應性酯、異硫氰酸酯或異氰酸酯。優(yōu)選的反應性酯來源于N-羥基琥珀酰亞胺類例如N-羥基琥珀酰亞胺或硫代-N-羥基琥珀酰亞胺，適當取代的苯酚類例如對硝基苯酚、鄰，對-二硝基苯酚、鄰，鄰′-二硝基苯酚，三氯苯酚例如2，4，6-三氯苯酚或2，4，5-三氯苯酚，三氟苯酚例如2，4，6-三氟苯酚或2，4，5-三氟苯酚，五氯苯酚，五氟苯酚，或羥基唑類例如羥基苯并三唑。特別優(yōu)選的是N-羥基琥珀酰亞胺類，特別優(yōu)選N-羥基琥珀酰亞胺和硫代-N-羥基琥珀酰亞胺。所有的醇可以單獨使用或者可以其中兩種或幾種適當組合使用。作為反應性酯，特別優(yōu)選五氟苯酯和N-羥基琥珀酰亞胺酯。根據(jù)一個特別的實施方案，能與官能團Q形成化學鍵的官能團是反應性羧基，其中Q優(yōu)選是NH2，或包含結構單元-NH-的氨基衍生物，例如氨基烷基、氨基芳基、氨基芳烷基或烷芳基氨基，特別是NH2。在這種情況中，能與官能團Q形成化學鍵并且是羧基的該官能團可以適當?shù)胤磻?，得到如上所述的反應性羧基。因此，?yōu)選包含羧基和醛基或酮基或半縮醛基的至少一個至少雙官能化合物發(fā)生反應，其中羧基轉變成反應性羧基，純化得到的至少雙官能化合物并與聚合物衍生物的官能團Q反應。包含能反應得到反應性羧基的羧基的至少雙官能化合物的實例是上文所列的化合物1到11。在本文中，術語“羧基”也涉及二羧酸化合物的內酯和內酐。因此根據(jù)一個優(yōu)選的實施方案，本發(fā)明涉及一種如上所述的方法和偶聯(lián)物，其中包含Q的聚合物衍生物進一步與甲酰苯甲酸反應，其中Q是氨基-NH2，或包含結構單元-NH-的氨基衍生物，例如氨基烷基、氨基芳基、氨基芳烷基或烷芳基氨基。根據(jù)另一個實施方案，本發(fā)明涉及一種如上所述的方法和偶聯(lián)物，其中包含Q的聚合物衍生物進一步與甲酰苯甲酸五氟苯基酯反應，其中Q是氨基。根據(jù)另一個優(yōu)選的實施方案，本發(fā)明也涉及一種如上所述的方法和偶聯(lián)物，其中該包含Q的聚合物衍生物進一步與甲酰苯甲酸N-羥基琥珀酰亞胺酯反應，其中Q是氨基。根據(jù)另一個優(yōu)選的實施方案，本發(fā)明也涉及一種如上所述的方法和偶聯(lián)物，其中該包含Q的聚合物衍生物進一步與4-(4-甲酰-3，5-二甲氧基苯氧基)丁酸反應，其中Q是氨基。根據(jù)另一個優(yōu)選的實施方案，本發(fā)明也涉及一種如上所述的方法和偶聯(lián)物，其中該聚合物與雙官能化合物反應，其中該雙官能化合物是選自α-酮基羧酸、唾液酸或其衍生物及磷酸吡哆醛的生物相容性化合物。對于α-酮基羧酸，優(yōu)選是由氨基酸衍生的α-酮基羧酸，在大多數(shù)情況下可以在人體內發(fā)現(xiàn)。優(yōu)選的由氨基酸衍生的α-酮基羧酸選自酮基-纈氨酸、酮基-亮氨酸、酮基-異亮氨酸和酮基-丙氨酸。α-酮基羧酸中的羧基與該聚合物的基團Q反應，其中Q為氨基。這樣就形成了酰胺基。然后α-酮基羧酸剩余的游離酮基可以與蛋白質的官能團，特別是氨基反應。這樣形成了可以氫化的亞氨基。因此，本發(fā)明涉及一種如上所述的方法和偶聯(lián)物，其中該聚合物與α-酮基羧酸反應。至于唾液酸或其衍生物，優(yōu)選其是生物相容性的。特別地，它們是在體內可以發(fā)現(xiàn)的N-和/或O-乙?；奶穷悺Ｔ谝粋€優(yōu)選的實施方案中，唾液酸是N-乙酰神經氨酸。由于吡喃糖結構，這些化合物顯示出了所需要的剛性，以實現(xiàn)作為間隔基的功能。另一方面，通過選擇性氧化向這些化合物中引入醛基也是可能的。在人體內可以發(fā)現(xiàn)唾液酸，例如在糖基化蛋白的聚糖鏈中作為末端單糖。在一個優(yōu)選的實施方案中，唾液酸可以被選擇性氧化為醛基。選擇性氧化唾液酸的方法在本領域是已知的，例如L.W.Jaques，B.F.Riesco，W.Weltner，CarbohydrateResearch，83(1980)，21-32和T.Masuda，S.Shibuya，M.Arai，S.Yoshida，T.Tomozawa，A.Ohno，M.Yamashita，T.Honda，Bioorganic&MedicinalChemistryLetters，13(2003)，669-673。優(yōu)選地可以在與聚合物的氨基反應前進行唾液酸的氧化。然后該任選氧化的唾液酸經其羧酸基與聚合物的氨基反應。所得到的化合物包含醛基，該醛基可以進一步通過還原氨基化作用與蛋白質的氨基反應。因此，本發(fā)明涉及一種如上所述的方法和偶聯(lián)物，其中該聚合物與任選氧化的唾液酸反應。至于磷酸吡哆醛(PyP)，它是一種具有高度生物相容性的雙官能化合物，也稱作維生素B6。PyP是一種輔酶，其參與氨基酸側鏈的氨基轉移、脫羧、消旋化和很多的修飾。所有需要PyP的酶通過在氨基酸和輔酶之間形成希夫堿來發(fā)揮作用。PyP的磷酸基可以與聚合物、優(yōu)選羥烷基淀粉、特別是羥乙基淀粉的氨基反應形成磷酰胺。然后PyP的醛基可以與蛋白質的氨基反應，形成希夫堿，然后該希夫堿可以被還原。在一個優(yōu)選的實施方案中，該偶聯(lián)物的結構是HES-NH-P(O)2-O-(吡哆醛)-CH-NH-蛋白質。在PyP的情況中，優(yōu)選通過使用如上所述的二氨基化合物向該聚合物中引入該聚合物的官能團。因此，本發(fā)明涉及一種如上所述的方法和偶聯(lián)物，其中該聚合物與磷酸吡哆醛反應。作為包含氨基和例如甲酰苯甲酸的聚合物衍生物的反應溶劑，優(yōu)選至少一種非質子溶劑或至少一種極性溶劑。其中適當?shù)娜軇┌ㄋ?、二甲亞?DMSO)、N-甲基吡咯烷酮、二甲基乙酰胺(DMA)、二甲基甲酰胺(DMF)和其中兩種或多種的混合物。作為包含氨基的聚合物衍生物和包含羧基的至少雙官能化合物的反應溶劑，也可以使用水性介質。在本發(fā)明的上下文中使用的術語“水性介質”涉及一種溶劑或溶劑的混合物，以所包含溶劑的重量為基準，其包含水的含量為至少10％重量或至少20％重量或至少30％重量或至少40％重量或至少50％重量或至少60％重量或至少70％重量或至少80％重量或至少90％重量或高達100％重量。該反應的溫度優(yōu)選是0到40℃，更優(yōu)選0到25℃，特別優(yōu)選15到25℃。反應時間優(yōu)選0.5到24小時，特別優(yōu)選1到17小時。根據(jù)一個優(yōu)選的實施方案，該反應在活化劑存在條件下進行。適當?shù)幕罨瘎┌?，碳二亞胺類例如二異丙基碳二亞?DIC)、二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)、1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺(EDC)，特別優(yōu)選二異丙基碳二亞胺(DIC)。用至少一種適當?shù)姆椒◤姆磻旌衔镏屑兓玫降木酆衔镅苌?。如果需要，可以在用至少一種適當?shù)姆椒ǚ蛛x前沉淀該聚合物衍生物。如果首先沉淀該聚合物衍生物，可以例如將與該反應混合物所處的溶劑或溶劑混合物不同的至少一種溶劑或溶劑混合物和該反應混合物在適當?shù)臏囟冉佑|。根據(jù)本發(fā)明一個特別優(yōu)選的實施方案，其中所使用的溶劑是水性介質，優(yōu)選是水，該反應混合物與2-丙醇或丙酮和乙醇的混合物，優(yōu)選1∶1的混合物(v/v)接觸，這表示所述化合物為同樣的體積，溫度優(yōu)選是-20到+50℃，特別優(yōu)選是-20到25℃?？梢杂冒粋€或多個步驟的適當方法來進行聚合物衍生物的分離。根據(jù)本發(fā)明一個優(yōu)選的實施方案，用適當?shù)姆椒ɡ珉x心分離或過濾將該聚合物衍生物首先從該反應混合物或該反應混合物與例如水2-丙醇混合物的混合物中分離出來。第二步，可以對分離出來的聚合物衍生物進行進一步處理，例如后處理，如透析、離心過濾或加壓過濾、離子交換色譜、反相色譜法、HPLC、MPLC、凝膠過濾和/或冷凍干燥。根據(jù)一個甚至更優(yōu)選的實施方案，將分離出來的聚合物衍生物首先進行透析，優(yōu)選在水中透析，然后冷凍干燥直至反應產物中的溶劑含量根據(jù)所需的產物規(guī)格顯著地降低。冷凍干燥可以在20到35℃，優(yōu)選20到30℃的溫度下進行。接著，所得到的具有醛基或酮基或半縮醛基的聚合物衍生物通過還原氨基化作用與蛋白質的氨基反應。關于至少一個醛基或酮基或半縮醛基通過還原氨基化作用與蛋白質的至少一個氨基偶聯(lián)，可以參考上文中詳細公開的還原氨基化作用的特定反應參數(shù)，例如pH或溫度。根據(jù)本發(fā)明一個特別優(yōu)選的實施方案，根據(jù)使用哪種G-CSF作為蛋白質，該還原氨基化作用進行的溫度是0到10℃，如1到8℃，或2到6℃，例如4℃，pH是約4.5到5.5，例如5。反應時間是約10到20小時例如12到19小時，或14到18小時例如約17小時，或20到30小時例如約24小時。根據(jù)本發(fā)明特別優(yōu)選的實施方案，根據(jù)所用的蛋白質為rhIL2、rhIL3、rhIFNα、rhIFNβ、rhEPO、rhATIII、BSA、肌紅蛋白和SOD，該還原氨基化作用的溫度優(yōu)選是0到5℃，例如約4℃，pH為約4.5到5.5，例如約5.0，反應時間為約20到30小時，例如約24小時。因此，根據(jù)上述優(yōu)選的實施方案，在聚合物通過其氧化的還原端反應的情況下，本發(fā)明也涉及根據(jù)下列通式的偶聯(lián)物根據(jù)一個特別優(yōu)選的實施方案，如上所述，該聚合物是羥乙基淀粉，即HAS′是HES′，并且n＝2，3或4，最優(yōu)選4。因此，在聚合物通過其氧化的還原端反應的情況下，本發(fā)明也涉及根據(jù)下列通式的偶聯(lián)物根據(jù)另一個優(yōu)選的實施方案，在聚合物通過其氧化的還原端反應的情況下，本發(fā)明也涉及根據(jù)下列通式的偶聯(lián)物其中n＝2，3，或4，R4獨立地是氫或甲氧基，并且如果R4是氫則m＝0，如果R4是甲氧基則m＝1，HAS優(yōu)選是HES′。在上述的每個通式中，與蛋白質連接的氮來源于蛋白質的氨基，聚合物衍生物通過醛基與該蛋白質連接。根據(jù)上述的實施方案，其中官能團M和Q包含氨基-NH2，也可以M是氨基-NH2，Q包含β羥氨基-CH(OH)-CH2-NH2并優(yōu)選是β羥氨基。因此，本發(fā)明也涉及一種如上所述的方法和偶聯(lián)物，其中包含兩個氨基M和Q的化合物中的氨基Q是β羥氨基-CH(OH)-CH2-NH2。在這種情況下，M和Q可以用任何適當?shù)拈g隔基分開。其中，該間隔基可以是任選取代的直鏈、支鏈和/或環(huán)狀的烴殘基。一般地，該烴殘基具有1到60，優(yōu)選1到40，更優(yōu)選1到20，更優(yōu)選2到10，更優(yōu)選1到6，特別優(yōu)選1到2個碳原子。如果存在雜原子，該間隔基通常包含1到20，優(yōu)選1到8，特別優(yōu)選1到4個雜原子。該烴殘基可以包含具有例如5到7個碳原子的任選分支的烷基鏈或芳基或環(huán)烷基，或是芳烷基、烷芳基，其中烷基部分可以是直鏈和/或環(huán)烷基。根據(jù)甚至更優(yōu)選的實施方案，該烴殘基是具有1到20，優(yōu)選1到10，更優(yōu)選1到6，更優(yōu)選1到4，特別優(yōu)選1到2個碳原子的烷基鏈。更優(yōu)選地，M和Q用亞甲基隔開。因此，本發(fā)明也涉及一種如上所述的方法和偶聯(lián)物，其中該聚合物與1，3-二氨基-2-羥丙烷反應。在聚合物通過其氧化的還原末端反應的情況下，根據(jù)通式的聚合物衍生物形成了特別優(yōu)選HAS′＝HES′。包含M和Q的至少雙官能化合物，特別優(yōu)選1，3-二氨基-2-羥丙烷，與聚合物反應的優(yōu)選溫度是40到120℃，更優(yōu)選40到90℃，特別優(yōu)選60到80℃。反應時間優(yōu)選17到168小時，更優(yōu)選17到96小時，特別優(yōu)選48到96小時。至少雙官能化合物∶聚合物的摩爾比優(yōu)選是200∶1到10∶1，特別是50∶1到100∶1。作為至少雙官能化合物和聚合物的反應溶劑，優(yōu)選是至少一種非質子溶劑，優(yōu)選含水不超過0.5％重量，優(yōu)選不超過0.1％重量的無水非質子溶劑。其中適當?shù)娜軇┌ǘ讈嗧?DMSO)、N-甲基吡咯烷酮、二甲基乙酰胺(DMA)、二甲基甲酰胺(DMF)和其中兩種或多種的混合物。聚合物衍生物的β羥氨基Q一般可與至少雙官能化合物反應，該至少雙官能化合物包含至少一個能與Q反應的官能團，并進一步包含至少一個是醛基或酮基或半縮醛基的官能團或者能修飾成醛基或酮基或半縮醛基的官能團。根據(jù)本發(fā)明另一個實施方案，直接通過化學氧化來化學修飾β羥氨基，得到醛基。該氧化反應可以使用所有能把β羥氨基轉變成醛基的適當?shù)难趸瘎?。?yōu)選的氧化劑是高碘酸鹽，例如堿金屬的高碘酸鹽。特別優(yōu)選高碘酸鈉，優(yōu)選使用其水溶液。該溶液具有的碘酸鹽濃度優(yōu)選是1到50mM，更優(yōu)選1到25mM，特別優(yōu)選1到10mM。氧化反應的溫度是0到40℃，優(yōu)選0到25℃，特別優(yōu)選4到20℃。用至少一種適當?shù)姆椒◤姆磻旌衔镏屑兓玫降木酆衔镅苌铩Ｈ绻枰?，可以在用至少一種適當?shù)姆椒ǚ蛛x前沉淀該聚合物衍生物。如果首先沉淀該聚合物衍生物，可以例如將與該反應混合物所處的溶劑或溶劑混合物不同的至少一種溶劑或溶劑混合物和該反應混合物在適當?shù)臏囟冉佑|。根據(jù)本發(fā)明一個特別優(yōu)選的實施方案，其中所使用的溶劑是水性介質，優(yōu)選是水，該反應混合物與2-丙醇或丙酮和乙醇的混合物，優(yōu)選1∶1的混合物(v/v)接觸，這表示所述化合物為同樣的體積，溫度優(yōu)選是-20到+50℃，特別優(yōu)選是-20到25℃。可以用包含一個或多個步驟的適當方法來進行聚合物衍生物的分離。根據(jù)本發(fā)明一個優(yōu)選的實施方案，用適當?shù)姆椒ɡ珉x心分離或過濾將該聚合物衍生物首先從該反應混合物或該反應混合物與例如水2-丙醇混合物的混合物中分離出來。第二步，可以對分離出來的聚合物衍生物進行進一步處理，例如后處理，如透析、離心過濾或加壓過濾、離子交換色譜、反相色譜法、HPLC、MPLC、凝膠過濾和/或冷凍干燥。根據(jù)一個甚至更優(yōu)選的實施方案，將分離出來的聚合物衍生物首先進行透析，優(yōu)選在水中透析，然后冷凍干燥直至反應產物中的溶劑含量根據(jù)所需的產物規(guī)格顯著地降低。冷凍干燥可以在20到35℃，優(yōu)選20到30℃的溫度下進行。因此，本發(fā)明也涉及一種如上所述的方法和偶聯(lián)物，其中β羥氨基Q的氧化作用是使用高碘酸鹽進行的。因此，本發(fā)明也涉及一種制備偶聯(lián)物的方法，其中當使用的聚合物具有氧化的還原端時，優(yōu)選用高碘酸鹽氧化具有β羥氨基的聚合物衍生物，特別優(yōu)選并且特別是HAS′＝HES′，得到具有醛基的聚合物衍生物，特別優(yōu)選并且特別是HAS′＝HES′。根據(jù)本發(fā)明，也可以用包含1-氨基-2羥基結構的上述化合物與包含羧基或反應性羧基和醛基、酮基或半縮醛基的上述至少雙官能化合物反應，得到可以與蛋白質的氨基進行還原氨基化作用的聚合物衍生物。所得到的具有醛基A的聚合物衍生物隨后與蛋白質反應。因此，本發(fā)明也涉及一種制備偶聯(lián)物的方法，所述方法包括具有β羥氨基的聚合物衍生物與蛋白質的氨基反應，當所使用的聚合物具有氧化的還原端時，特別優(yōu)選根據(jù)下式并且，特別是HAS′＝HES′。所得到的具有醛基的聚合物衍生物隨后通過還原氨基化作用與蛋白質的氨基反應。對于蛋白質的至少一個氨基與聚合物的至少一個醛基通過還原氨基化作用的偶聯(lián)，可以參考上述詳細公開的內容。因此，根據(jù)上述的優(yōu)選實施方案，本發(fā)明也涉及一種如下通式的偶聯(lián)物特別是HAS′＝HES′，當所使用的聚合物具有氧化的還原端時。在上述通式中，與蛋白質連接的氮來源于蛋白質的氨基，聚合物衍生物通過醛基與該蛋白質連接。根據(jù)本發(fā)明的另一個實施方案，聚合物先與合適的化合物反應，產生包含至少一個反應性羧基的第一聚合物衍生物。該第一聚合物衍生物再與另一種至少雙官能化合物反應，其中該另一種化合物的至少一個官能團與聚合物衍生物的至少一個反應性羧基反應，并且該另一種化合物的至少另一個官能團是醛基或酮基或半縮醛基，或者是化學修飾成醛基或酮基或半縮醛基的官能團，其中所得到的包含該醛基或酮基或半縮醛基的聚合物衍生物，如上所述，通過還原氨基化作用，與蛋白質的至少一個氨基反應。也可以改變各化合物的相互反應順序。根據(jù)該另一個實施方案的第一種替代方案，包含至少一個反應性羧基的聚合物的制備方法包括，在聚合物的還原端選擇性氧化該聚合物，然后使氧化的聚合物與合適的化合物反應，該氧化的聚合物為內酯和/或羧酸或羧酸的合適的鹽例如堿金屬鹽，優(yōu)選鈉鹽和/或鉀鹽，且HAS′優(yōu)選為HES′，得到包含至少一個反應性羧基的化合物。該聚合物、優(yōu)選羥乙基淀粉的氧化可以根據(jù)得到上述結構(IIa)和/或(IIb)的化合物的各方法或方法組合來進行。雖然氧化反應可根據(jù)所有得到羥烷基淀粉的氧化的還原端的所有適宜方法進行，但優(yōu)選如DE19628705A1所述采用堿性碘溶液進行，將該文獻的內容(實施例A，第9欄，第6至24行)在此引入作為參考。向在還原端已選擇性氧化的聚合物中引入反應性羧基可以采用所有可能的方法和所有合適的化合物進行。根據(jù)本發(fā)明一個特別的方法，在還原端已選擇性氧化的聚合物在其氧化的還原端與至少一種醇反應，優(yōu)選與至少一種酸性醇，如25℃下的pKA值為6到12或7到11的酸性醇反應。該酸性醇的分子量可以是80到500克/摩爾，如100到200克/摩爾。合適的酸性醇是所有具有酸性質子并能與氧化的聚合物反應形成各自反應性聚合物酯的醇H-O-RA，優(yōu)選如下式更優(yōu)選如下式優(yōu)選的醇是N-羥基琥珀酰亞胺類例如N-羥基琥珀酰亞胺或硫代-N-羥基琥珀酰亞胺，適當取代的苯酚類例如對硝基苯酚、鄰，對二硝基苯酚、鄰，鄰′-二硝基苯酚，三氯苯酚例如2，4，6-三氯苯酚或2，4，5-三氯苯酚，三氟苯酚例如2，4，6-三氟苯酚或2，4，5-三氟苯酚，五氯苯酚，五氟苯酚，或羥基唑類例如羥基苯并三唑。特別優(yōu)選的是N-羥基琥珀酰亞胺類，特別優(yōu)選N-羥基琥珀酰亞胺和硫代-N-羥基琥珀酰亞胺。所有的醇可以單獨使用或者可以兩種或幾種適當組合使用。在本發(fā)明的上下文中，也可以使用例如通過添加碳酸的二酯而釋放各自的醇的化合物。因此，本發(fā)明也涉及一種如上所述的方法，其中在還原端被選擇性氧化的聚合物通過該氧化的聚合物與酸性醇，優(yōu)選與N-羥基琥珀酰亞胺和/或硫代-N-羥基琥珀酰亞胺反應而活化。根據(jù)本發(fā)明一個優(yōu)選的實施方案，還原端被選擇性氧化的聚合物與至少一種碳酸二酯RB-O-(C＝O)-O-RC反應，其中RB與RC可相同或不同。優(yōu)選地，該方法產生如下式的反應性聚合物其中HAS′優(yōu)選為HES′。作為合適的碳酸二酯化合物，可使用的化合物其醇成分分別獨立地是N-羥基琥珀酰亞胺類例如N-羥基琥珀酰亞胺或硫代-N-羥基琥珀酰亞胺，適當取代的苯酚類例如對硝基苯酚、鄰，對二硝基苯酚、鄰，鄰′-二硝基苯酚，三氯苯酚例如2，4，6-三氯苯酚或2，4，5-三氯苯酚，三氟苯酚例如2，4，6-三氟苯酚或2，4，5-三氟苯酚，五氯苯酚，五氟苯酚，或羥基唑類例如羥基苯并三唑。特別優(yōu)選的是N，N’-二琥珀酰亞胺基碳酸酯和硫代-N，N’-二琥珀酰亞胺基碳酸酯，特別優(yōu)選N，N’-二琥珀酰亞胺基碳酸酯。因此，本發(fā)明也涉及一種如上所述的方法，其中在還原端被選擇性氧化的聚合物通過該氧化的聚合物與N，N′-二琥珀酰亞胺基碳酸酯反應而活化。酸性醇與氧化的聚合物或氧化的聚合物的鹽反應，酸性醇∶聚合物的摩爾比優(yōu)選是5∶1到50∶1，更優(yōu)選8∶1到20∶1，優(yōu)選的反應溫度是2到40℃，更優(yōu)選10到30℃，特別優(yōu)選15到25℃。反應時間優(yōu)選是1到10小時，更優(yōu)選2到5小時，更優(yōu)選2到4小時，特別是2到3小時。碳酸二酯化合物與氧化的聚合物或氧化的聚合物的鹽反應，二酯化合物∶聚合物的摩爾比一般為1∶1到3∶1，例如1∶1到1.5∶1。反應時間一般是0.1到12小時，例如0.2到6小時，或0.5到2小時，或0.75到1.25小時。根據(jù)本發(fā)明一個優(yōu)選的實施方案，氧化的聚合物與酸性醇和/或碳酸二酯的反應在至少一種非質子溶劑，如含水不超過0.5％重量，優(yōu)選不超過0.1％重量的無水非質子溶劑中進行。其中適當?shù)娜軇┌ǘ讈嗧?DMSO)、N-甲基吡咯烷酮、二甲基乙酰胺(DMA)、二甲基甲酰胺(DMF)和其中兩種或多種的混合物。優(yōu)選反應溫度是2到40℃，更優(yōu)選10到30℃。氧化的聚合物與至少一種酸性醇的反應中，可以使用至少另一種活化劑。適當?shù)幕罨瘎┌ǎ识溥?、碳二亞胺類例如二異丙基碳二亞?DIC)、二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)、1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺(EDC)，特別優(yōu)選二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)、1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺(EDC)。因此本發(fā)明也涉及一種如上所述的方法和偶聯(lián)物，其中還原端被氧化的聚合物與酸性醇在另一種活化劑存在下反應，得到反應性聚合物酯。根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，氧化的聚合物與碳酸二酯和/或酸性醇的反應在低堿活性下進行，其中該低堿活性可以通過按10∶1的水∶反應混合物的體積比例將混合物加入水中來確定。在添加前，基本上不包含緩沖液的水在25℃下pH值為7。添加反應混合物后測定pH值，反應混合物的堿活性值優(yōu)選不超過9.0，更優(yōu)選不超過8.0，特別優(yōu)選不超過7.5。根據(jù)本發(fā)明的另一個實施方案，該氧化的聚合物與N-羥基琥珀酰亞胺在干燥DMA中，在沒有水的條件下，與EDC反應，選擇性得到如下式的聚合物N-羥基琥珀酰亞胺酯更優(yōu)選HAS′是HES′。令人驚訝的是，該反應不會得到由EDC與HES的OH基團反應而產生的副產物，并且意外地抑制了EDC與氧化聚合物形成的O-?；愲宸謩e成為各自N-?；宓闹嘏欧磻８鶕?jù)本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案，該氧化的聚合物與N，N′-二琥珀酰亞胺基碳酸酯在干燥DMA中，在沒有水和活化劑的條件下反應，選擇性得到如下式的聚合物N-羥基琥珀酰亞胺酯更優(yōu)選HAS′是HES′。根據(jù)本發(fā)明另一個實施方案，還原端被選擇性氧化的聚合物在氧化的還原端處與唑化物例如羰二咪唑或羰基二苯并咪唑反應，得到具有反應性羧基的聚合物。如果使用羰二咪唑，得到如下式的反應性咪唑聚合物衍生物優(yōu)選HAS′是HES′。根據(jù)本發(fā)明所述另一個實施方案的第二種替代方案，要向聚合物中引入至少一個反應性羧基，通過聚合物的至少一個羥基與碳酸二酯反應向還原端未氧化的聚合物中引入該反應性羧基。因此，本發(fā)明也涉及一種方法和偶聯(lián)物，其中通過聚合物的至少一個羥基和至少一種碳酸二酯RB-O-(C＝O)-O-RC反應，其中RB與RC可相同或不同，以向還原端未氧化的聚合物中引入反應性羧基。根據(jù)本發(fā)明的另一個實施方案，還原端未氧化的聚合物在至少一個羥基上與唑化物例如羰二咪唑、羰基-二-(1，2，4-三唑)或羰基二苯并咪唑反應，得到具有反應性羧基的聚合物。作為合適的碳酸二酯化合物，可使用的化合物其醇成分分別獨立地是N-羥基琥珀酰亞胺類例如N-羥基琥珀酰亞胺或硫代-N-羥基琥珀酰亞胺，適當取代的苯酚類例如對硝基苯酚、鄰，對二硝基苯酚、鄰，鄰′-二硝基苯酚，三氯苯酚例如2，4，6-三氯苯酚或2，4，5-三氯苯酚，三氟苯酚例如2，4，6-三氟苯酚或2，4，5-三氟苯酚，五氯苯酚，五氟苯酚，或羥基唑類例如羥基苯并三唑。特別優(yōu)選對稱的碳酸二酯化合物，因此RB與RC相同。碳酸二酯的醇組分優(yōu)選選自N-羥基琥珀酰亞胺、磺化的N-羥基琥珀酰亞胺、N-羥基苯并三唑，和硝基-和鹵素-取代的苯酚。其中優(yōu)選硝基苯酚、二硝基苯酚、三氯苯酚、三氟苯酚、五氯苯酚和五氟苯酚。特別優(yōu)選的是N，N′-二琥珀酰亞胺基碳酸酯和硫代-N，N′-二琥珀酰亞胺基碳酸酯，特別優(yōu)選N，N′-二琥珀酰亞胺基碳酸酯。因此，本發(fā)明也涉及一種羥烷基淀粉衍生物，優(yōu)選羥乙基淀粉衍生物，其中所述淀粉的至少一個羥基，優(yōu)選至少兩個羥基經與碳酸二酯化合物反應而得到各自的反應性酯。根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，還原端未氧化的聚合物與至少一個碳酸二酯化合物的反應溫度是2到40℃，更優(yōu)選10到30℃，特別是15到25℃。優(yōu)選的反應時間是0.5到5小時，更優(yōu)選1到3小時，特別優(yōu)選2到3小時。碳酸二酯化合物∶聚合物的摩爾比取決于聚合物的取代程度，即與碳酸二酯化合物反應的羥基數(shù)與未反應的聚合物中羥基數(shù)的相對比例。根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，碳酸二酯化合物∶聚合物的脫水葡萄糖單元的摩爾比是1∶2到1∶1000，更優(yōu)選1∶3到1∶100，特別優(yōu)選1∶10到1∶50，所得到的取代程度是0.5到0.001，優(yōu)選0.33到0.01，特別優(yōu)選0.1到0.02。根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，還原端未氧化的聚合物與碳酸二酯的反應在至少一種非質子溶劑，特別優(yōu)選在含水不超過0.5％重量，優(yōu)選不超過0.1％重量的無水非質子溶劑中進行。其中適當?shù)娜軇┌ǘ讈嗧?DMSO)、N-甲基吡咯烷酮、二甲基乙酰胺(DMA)、二甲基甲酰胺(DMF)和其中兩種或多種的混合物。因此本發(fā)明也涉及一種如上所述的方法，其中還原端未氧化的聚合物的至少一個羥基與碳酸二酯反應得到反應性羧基是在無水非質子溶劑中進行的，該溶劑優(yōu)選是二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺或其混合物。包含至少一個反應性羧基的反應性聚合物衍生物，其優(yōu)選如上所述由聚合物與酸性醇、碳酸酯和/或唑化物反應得到，進一步與另一種至少雙官能化合物反應，其中該另一種化合物的至少一個官能團F1與聚合物衍生物的至少一個反應性羧基反應。該另一種化合物的至少一個官能團F1沒有明確的限制，只要可與聚合物的至少一個反應性羧基反應即可。優(yōu)選的官能團F1是例如，氨基或羥基或硫基或羧基。該另一種至少雙官能化合物包含至少另一個是醛基的官能團F2或能化學修飾成醛基的官能團F2。該化學修飾可以是，例如，官能團F2與另一種連接化合物的官能團F3反應，或氧化或還原合適的官能團F2。如果F2與另一種化合物的官能團F3反應，官能團F2特別可選自-C-C-雙鍵或C-C-三鍵或芳香族C-C-鍵；-硫基或羥基；-烷基磺酸酰肼，芳基磺酸酰肼；-1，2-二醇；-1，2-氨基醇；-1，2-氨基硫醇；-疊氮化物；-氨基-NH2或包含結構單元-NH-的氨基衍生物，例如氨基烷基、氨基芳基、氨基芳烷基或烷芳基氨基；-羥氨基-O-NH2，或包含結構單元-O-NH-的羥氨基衍生物，例如羥烷基氨基、羥芳基氨基、羥芳烷基氨基或羥烷芳基氨基；-烷氧基氨基、芳氧基氨基、芳烷氧基氨基或烷芳氧基氨基，其各包含結構單元-NH-O-；-具有羰基、-Q-C(＝G)-M的殘基，其中G是O或S，并且M是例如--OH或-SH；-烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、或烷芳氧基；-烷硫基、芳硫基、芳烷硫基、或烷芳硫基；-烷基羰基氧基、芳基羰基氧基、芳烷基羰基氧基、烷芳基羰基氧基；-活化的酯，如羥胺的酯，其具有如N-羥基琥珀酰亞胺的亞胺結構或具有結構單元O-N，其中N是雜芳基化合物的一部分，或其中G＝O和Q不存在，如具有取代芳基殘基如五氟苯基、對硝基苯基或三氯苯基的芳氧基化合物；其中Q不存在或者是NH或雜原子，如S或O；--NH-NH2，或-NH-NH-；--NO2；-腈基；-羰基，如醛基或酮基；-羧基；--N＝C＝O基或-N＝C＝S基；-乙烯基鹵化物基團，例如乙烯基碘化物或乙烯基溴化物基團或三氟甲磺酸(triflate)；--C≡C-H；--(C＝NH2Cl)-O烷基--(C＝O)-CH2-Hal基團，其中Hal是Cl、Br、或I；--CH＝CH-SO2-；-包含-S-S-結構的二硫基；-基團基團其中F3是能與上述基團之一形成化學鍵的基團，其優(yōu)選選自上述基團。此外，第二連接化合物優(yōu)選具有至少一個可與蛋白質的氨基通過還原氨基化反應的醛基或酮基或半羧醛基。與聚合物反應的該至少雙官能連接化合物的官能團F1和醛基或酮基或半縮醛基，和/或與聚合物反應的該至少雙官能連接化合物中的官能團F1和F2，和/或該另一種至少雙官能連接化合物中的官能團F3與醛基或酮基或半縮醛基，可分別利用任何合適的間隔基分隔。其中該間隔基可以是任選取代的直鏈、支鏈和/或環(huán)狀的烴殘基。一般地，該烴殘基具有至多60，優(yōu)選至多40，更優(yōu)選至多20，更優(yōu)選至多10個碳原子。如果存在雜原子，該間隔基通常包含1到20，優(yōu)選1到8，更優(yōu)選1到6，更優(yōu)選1到4，特別優(yōu)選1到2個雜原子。優(yōu)選該雜原子是O。該烴殘基可以包含具有例如5到7個碳原子的任選分支的烷基鏈或芳基或環(huán)烷基，或是芳烷基、烷芳基，其中烷基部分可以是直鏈和/或環(huán)烷基。具有官能團F1和F2的化合物的實例有例如具有2至20個碳原子的任選取代的二氨基烷，特別優(yōu)選1，2-二氨基乙烷、1，3-二氨基丙烷、和1，4-二氨基丁烷。具有官能團F3和醛基或酮基或半縮醛基的優(yōu)選化合物的實例是例如甲?；郊姿?、4-甲酰基苯甲酸五氟苯基酯、4-甲?；郊姿?N-羥基琥珀酸亞胺酯和4-(4-甲酰基-3，5-二甲氧基苯氧基)丁酸，或者選自α-酮基羧酸、神經氨酸或其衍生物及磷酸吡哆醛的生物相容性化合物。根據(jù)另一個優(yōu)選的實施方案，本發(fā)明也涉及一種如上所述的方法和偶聯(lián)物，其中該聚合物與雙官能化合物反應，其中該雙官能化合物是選自α-酮基羧酸、神經氨酸或唾液酸或其衍生物及磷酸吡哆醛的生物相容性化合物。對于α-酮基羧酸，優(yōu)選是由氨基酸衍生的α-酮基羧酸，在大多數(shù)情況下也可以在人體內發(fā)現(xiàn)。優(yōu)選的由氨基酸衍生的α-酮基羧酸選自酮基-纈氨酸、酮基-亮氨酸、酮基-異亮氨酸和酮基-丙氨酸。α-酮基羧酸中的羧基與該聚合物的基團Q反應，其中Q為氨基。于是形成了酰胺基。然后α-酮基羧酸剩余的游離酮基與蛋白質的官能團，特別是氨基反應。于是形成了可以氫化的亞氨基。因此，本發(fā)明涉及一種如上所述的方法和偶聯(lián)物，其中該聚合物與α-酮基羧酸反應。至于唾液酸或其衍生物，優(yōu)選其是生物相容性的。特別地，它們是在體內可以發(fā)現(xiàn)的N-和/或O-乙酰化的糖類。在一個優(yōu)選的實施方案中，唾液酸是N-乙酰神經氨酸。由于吡喃糖結構，這些化合物顯示出了所需要的剛性，以實現(xiàn)作為間隔基的功能。另一方面，通過選擇性氧化向這些化合物中引入醛基也是可能的。在人體內可以發(fā)現(xiàn)唾液酸，例如在糖基化蛋白的聚糖鏈中作為末端單糖。在一個優(yōu)選的實施方案中，唾液酸可以被選擇性氧化為醛基。選擇性氧化唾液酸的方法在本領域是已知的，例如L.W.Jaques，B.F.Riesco，W.Weltner，CarbohydrateResearch，83(1980)，21-32和T.Masuda，S.Shibuya，M.Arai，S.Yoshida，T.Tomozawa，A.Ohno，M.Yamashita，T.Honda，Bioorganic&MedicinalChemistryLetters，13(2003)，669-673。優(yōu)選在與聚合物的氨基反應前進行唾液酸的氧化。然后該任選氧化的唾液酸可以經其羧基與聚合物的氨基反應。所得到的化合物包含醛基，該醛基可以進一步通過還原氨基化作用與蛋白質的氨基反應。因此，本發(fā)明涉及一種如上所述的方法和偶聯(lián)物，其中該聚合物與任選氧化的唾液酸反應。至于磷酸吡哆醛(PyP)，它是一種具有高度生物相容性的雙官能化合物，也稱作維生素B6。PyP是一種輔酶，其參與氨基酸側鏈的氨基轉移、脫羧、消旋化和很多的修飾。所有需要PyP的酶通過在氨基酸和輔酶之間形成希夫堿來發(fā)揮作用。PyP的磷酸基可以與聚合物、優(yōu)選羥烷基淀粉、特別優(yōu)選羥乙基淀粉的氨基反應形成磷酰胺。然后PyP的醛基可以與蛋白質的氨基反應，形成希夫堿，然后該希夫堿可被還原。在一個優(yōu)選的實施方案中，該偶聯(lián)物的結構是HES-NH-P(O)2-O-(吡哆醛)-CH-NH-蛋白質。在PyP的情況中，優(yōu)選通過使用如上所述的二氨基化合物向該聚合物中引入該聚合物的官能團。因此，本發(fā)明涉及一種如上所述的方法和偶聯(lián)物，其中該聚合物與磷酸吡哆醛反應。因此，本發(fā)明也涉及一種制備偶聯(lián)物的方法，所述方法包括使聚合物，優(yōu)選羥乙基淀粉，在其任選被氧化的還原端與選自酸性醇、碳酸二酯和唑化物的化合物反應，得到具有至少一個反應性羧基的聚合物衍生物，所述聚合物衍生物與至少一種至少雙官能化合物反應，得到具有醛基或酮基或半縮醛基或者能經化學修飾得到醛基或酮基或半縮醛基的官能團的聚合物衍生物，任選化學修飾所述官能團得到包含醛基或酮基或半縮醛基的聚合物衍生物，再由該包含醛基或酮基或半縮醛基的聚合物衍生物與蛋白質的氨基通過還原氨基化作用反應。因此，本發(fā)明也涉及一種偶聯(lián)物，其包含聚合物，優(yōu)選羥乙基淀粉，和彼此共價連接的蛋白質，該偶聯(lián)物可通過制備偶聯(lián)物的方法獲得，該方法包括，聚合物在它任選被氧化的還原端與選自酸性醇、碳酸二酯和唑化物的化合物反應，得到具有至少一個反應性羧基的聚合物衍生物，所述聚合物衍生物與至少一種至少雙官能化合物反應，得到具有醛基或酮基或半縮醛基或者能經化學修飾得到醛基或酮基或半縮醛基的官能團的聚合物衍生物，任選化學修飾所述官能團得到包含醛基或酮基或半縮醛基的聚合物衍生物，再由該包含醛基或酮基或半縮醛基的聚合物衍生物與蛋白質的氨基通過還原氨基化作用反應。具有官能團F1和被氧化而得到醛基的官能團F2的化合物的具體的例子是，例如具有氨基作為F1以及β羥氨基作為F2的化合物。一個特別優(yōu)選的例子是1，3-二氨基-2-羥基丙烷。該氧化反應可以使用所有可將β羥氨基轉化成醛基的合適的氧化劑來進行。優(yōu)選的氧化劑是高碘酸鹽，例如堿金屬的高碘酸鹽。特別優(yōu)選高碘酸鈉，優(yōu)選使用其水溶液。該溶液具有的碘酸鹽濃度優(yōu)選是1到50mM，更優(yōu)選1到25mM，特別優(yōu)選1到10mM。氧化反應的溫度是0到40℃，優(yōu)選0到25℃，特別優(yōu)選4到20℃?？梢杂弥辽僖环N適當?shù)姆椒◤姆磻旌衔镏屑兓玫降木酆衔镅苌铩Ｈ绻枰?，可以在用至少一種適當?shù)姆椒ǚ蛛x前沉淀該聚合物衍生物。如果首先沉淀該聚合物衍生物，可以例如將與該反應混合物所處的溶劑或溶劑混合物不同的至少一種溶劑或溶劑混合物和該反應混合物在適當?shù)臏囟冉佑|。根據(jù)本發(fā)明一個特別優(yōu)選的實施方案，其中所使用的溶劑是水性介質，優(yōu)選是水，該反應混合物與2-丙醇或丙酮和乙醇的混合物，優(yōu)選1∶1的混合物(v/v)接觸，這表示所述化合物為同樣的體積，溫度優(yōu)選是-20到+50℃，特別優(yōu)選是-20到25℃?？梢杂冒粋€或多個步驟的適當方法來進行聚合物衍生物的分離。根據(jù)本發(fā)明一個優(yōu)選的實施方案，用適當?shù)姆椒ɡ珉x心分離或過濾將該聚合物衍生物首先從該反應混合物或該反應混合物與例如水2-丙醇混合物的混合物中分離出來。第二步，可以對分離出來的聚合物衍生物進行進一步處理，例如后處理，如透析、離心過濾或加壓過濾、離子交換色譜、反相色譜法、HPLC、MPLC、凝膠過濾和/或冷凍干燥。根據(jù)一個甚至更優(yōu)選的實施方案，將分離出來的聚合物衍生物首先進行透析，優(yōu)選在水中透析，然后冷凍干燥直至反應產物中的溶劑含量根據(jù)所需的產物規(guī)格顯著地降低。冷凍干燥可以在20到35℃，優(yōu)選20到30℃的溫度下進行。本發(fā)明也涉及一種包含羥烷基淀粉和蛋白質的偶聯(lián)物，其中羥烷基淀粉用它的氧化的還原端經酰胺鍵與第一交聯(lián)化合物偶聯(lián)，所述交聯(lián)化合物還經酰胺鍵與第二交聯(lián)化合物連接，所述第二交聯(lián)化合物經偶氮甲堿和/或氨基鍵與蛋白質連接，其中所使用的第一交聯(lián)化合物是二氨基官能化化合物并且所使用的第二交聯(lián)化合物優(yōu)選是羧基和醛基或酮基或半縮醛基，更優(yōu)選是羧基和醛基官能化化合物。本發(fā)明也涉及一種包含蛋白質和聚合物或其衍生物的偶聯(lián)物，其中該聚合物是羥烷基淀粉(HAS)，其具有如下式的結構其中R1、R2、和R3分別獨立地是氫或具有1到10個碳原子的羥烷基、羥芳基、羥芳烷基或羥烷芳基，優(yōu)選氫或羥烷基，更優(yōu)選氫或羥乙基，并且其中L是任選取代的、直鏈、支鏈和/或環(huán)狀的烴殘基，任選包含至少一個雜原子，具有1到60，優(yōu)選1到40，更優(yōu)選1到20，更優(yōu)選1到10，更優(yōu)選1到6，更優(yōu)選1到2個碳原子，特別優(yōu)選1個碳原子，L特別是CH2。本發(fā)明也涉及一種包含蛋白質和聚合物或其衍生物的偶聯(lián)物，其中該聚合物是羥烷基淀粉(HAS)，其具有如下式的結構其中R1、R2、和R3分別獨立地是氫或具有1到10個碳原子的羥烷基、羥芳基、羥芳烷基或羥烷芳基，優(yōu)選氫或羥烷基，更優(yōu)選氫或羥乙基，并且其中L1和L2獨立地是任選取代的、直鏈、支鏈和/或環(huán)狀的烴殘基，任選包含至少一個雜原子，包含烷基、芳基、芳烷基雜烷基、和/或雜芳烷基部分，所述殘基具有1到60，優(yōu)選1到40，更優(yōu)選1到20，更優(yōu)選1到10個碳原子，并且其中D是一個鍵，優(yōu)選是通過適當?shù)墓倌軋FF2與L1連接和適當?shù)墓倌軋FF3與L2連接而形成的共價鍵。本發(fā)明也涉及如上所述的偶聯(lián)物，其中L1是-(CH2)n-，其中n＝2，3，4，5，6，7，8，9，10，優(yōu)選是2，3，4，5，6，更優(yōu)選2，3，4，特別優(yōu)選4。本發(fā)明也涉及如上所述的偶聯(lián)物，其中L2包含任選適當取代的芳基部分，優(yōu)選芳基部分包含6個碳原子，特別優(yōu)選L2是C6H4。本發(fā)明也涉及如上所述的偶聯(lián)物，其中F2選自下列基團-C-C-雙鍵或C-C-三鍵或芳香族C-C-鍵；-硫基或羥基；-烷基磺酸酰肼，芳基磺酸酰肼；-1，2-二醇；-1，2-氨基硫醇；-疊氮化物；-1，2-氨基醇；-氨基-NH2或包含結構單元-NH-的氨基衍生物，例如氨基烷基、氨基芳基、氨基芳烷基或烷芳基氨基；-羥氨基-O-NH2，或包含結構單元-O-NH-的羥氨基衍生物，例如羥烷基氨基、羥芳基氨基、羥芳烷基氨基或羥烷芳基氨基；-烷氧基氨基、芳氧基氨基、芳烷氧基氨基或烷芳氧基氨基，其各包含結構單元-NH-O-；-具有羰基、-Q-C(＝G)-M的殘基，其中G是O或S，并且M是例如--OH或-SH；-烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、或烷芳氧基；-烷硫基、芳硫基、芳烷硫基、或烷芳硫基；-烷基羰基氧基、芳基羰基氧基、芳烷基羰基氧基、烷芳基羰基氧基；-活化的酯，如羥胺的酯，其具有如N-羥基琥珀酰亞胺的亞胺結構或具有結構單元O-N，其中N是雜芳基化合物的一部分，或其中G＝O和Q不存在，如具有取代芳基殘基如五氟苯基、對硝基苯基或三氯苯基的芳氧基化合物；其中Q不存在或者是NH或雜原子，如S或O；--NH-NH2，或-NH-NH-；--NO2；-腈基；-羰基，如醛基或酮基；-羧基；--N＝C＝O基或-N＝C＝S基；-乙烯基鹵化物基團，例如乙烯基碘化物或乙烯基溴化物基團或三氟甲磺酸(triflate)；--C≡C-H；--(C＝NH2Cl)-O烷基--(C＝O)-CH2-Hal基團，其中Hal是Cl、Br、或I；--CH＝CH-SO2-；-包含-S-S-結構的二硫基；-基團-基團其中F3是能與F2形成化學鍵的官能團，優(yōu)選選自上述的基團，F(xiàn)2優(yōu)選包含-NH-部分，更優(yōu)選包含氨基，F(xiàn)3優(yōu)選包含-(C＝G)-部分，更優(yōu)選-(C＝O)-部分，更優(yōu)選-(C＝G)-G-部分，更優(yōu)選-(C＝O)-G-部分，特別優(yōu)選-(C＝O)-O，D特別優(yōu)選是酰胺鍵。本發(fā)明也涉及如上所述的偶聯(lián)物，其具有如下式的結構n＝2，3，或4，R4獨立地是氫或甲氧基，并且如果R4是氫則m＝0，如果R4是甲氧基則m＝1。本發(fā)明也涉及一種包含蛋白質和聚合物或其衍生物的偶聯(lián)物，其中該聚合物是羥烷基淀粉(HAS)并且該蛋白質是粒細胞集落刺激因子(G-CSF)，具有如下式的結構其中-CH2-N2-部分的碳原子來源于醛基，該醛基是通過開環(huán)氧化反應引入到該聚合物中的，并且其中氮原子來源于蛋白質的氨基。本發(fā)明也涉及如上所述的偶聯(lián)物，其中羥烷基淀粉是羥乙基淀粉。本發(fā)明也涉及如上所述的任意的偶聯(lián)物，其中羥乙基淀粉的分子量為2到200kD，優(yōu)選4到130kD，更優(yōu)選4到70kD。本發(fā)明也涉及如上所述的偶聯(lián)物，其中該蛋白質選自EPO、G-CSF、IFNα、IFNβ、ATIII、IL-2、IL-3、肌紅蛋白、SOD和BSA，優(yōu)選選自rhEPO、rhG-CSF、rhIFNα、rhIFNβ、rhATIII、rhIL-2、rhIL-3、肌紅蛋白、SOD、和BSA，和/或A1AT、因子VII、因子VIII、因子IX、tPA和APC。在制備本發(fā)明的偶聯(lián)物的方法中，上述方法的轉化率是至少50％，更優(yōu)選至少70％，甚至更優(yōu)選至少80％，特別是95％或更多，例如至少98％或99％。根據(jù)本發(fā)明的偶聯(lián)物可以是至少50％純度，甚至更優(yōu)選至少70％純度，甚至更優(yōu)選至少90％，特別是至少95％或至少99％純度。在最優(yōu)選的實施方案中，該偶聯(lián)物是100％純度，即，不存在其他的副產物。因此，根據(jù)另一個方面，本發(fā)明也涉及一種包含本發(fā)明的偶聯(lián)物的組合物，其中該偶聯(lián)物的量可以是至少50wt-％，甚至更優(yōu)選至少70wt-％，甚至更優(yōu)選至少90wt-％，特別是至少95wt-％或至少99wt-％。在一個最優(yōu)選的實施方案，該組合物由偶聯(lián)物組成，即偶聯(lián)物的量是100wt.-％。根據(jù)另一個方面，本發(fā)明也涉及一種如上所述的偶聯(lián)物或用所述方法得到的偶聯(lián)物，在用于治療人或動物體的方法中應用。因此，本發(fā)明涉及一種藥物組合物，包含治療有效量的如上所述的偶聯(lián)物或用如上所述的方法得到的偶聯(lián)物。在本發(fā)明的上下文中，術語“治療有效量”是指對于給定條件和給藥方案提供治療效果的量。因此，在一個優(yōu)選的實施方案中，該藥物組合物進一步包含至少一種藥學可接受的稀釋劑、佐劑和/或載體。優(yōu)選地，該藥學可接受的稀釋劑、佐劑和/或載體特別用于IFNα、IFNβ、EPO、ATIII、G-CSF、APC、A1AT、tPA、因子VII、因子VIII或因子IX治療中。本發(fā)明的所有蛋白質-HAS偶聯(lián)物優(yōu)選通過靜脈內、皮下或肌肉內途徑給藥。所選擇的具體途徑取決于所要治療的情況。優(yōu)選地，該偶聯(lián)物可以與適當?shù)妮d體，例如本領域已知的載體(例如，在第一代/未修飾的無白蛋白或含白蛋白生物藥物中用作賦形劑)、適當?shù)南♂寗缬糜陟o脈內、皮下或肌肉內給藥的無菌溶液一起給藥。所需要的劑量取決于所要治療情況的嚴重性、患者的個體應答、所用的給藥方法等等。本領域技術人員可以根據(jù)他的常規(guī)知識確定正確的劑量。根據(jù)另一個方面，本發(fā)明也涉及如上所述的HAS-蛋白質偶聯(lián)物，優(yōu)選HES-蛋白質偶聯(lián)物，或用如上所述的方法得到的HAS-蛋白質偶聯(lián)物，優(yōu)選HES-蛋白質偶聯(lián)物，其中該蛋白質是EPO，在制備用于治療貧血性疾病或相關的造血機能障礙疾病或病癥的藥物中的應用。紅細胞生成素同種型的給藥優(yōu)選采用胃腸外途徑。所選擇的具體途徑取決于所要治療的情況。紅細胞生成素同種型的給藥優(yōu)選作為制劑的一部分來完成，該制劑包含適當?shù)妮d體例如人血清白蛋白、適當?shù)南♂寗├缇彌_鹽溶液、和/或適當?shù)淖魟Ｋ璧膭┝靠梢宰銐虻靥岣呋颊叩难毎热?，可以根?jù)所要治療情況的嚴重性、所用的給藥方法等等而不同。用本發(fā)明的藥物組合物治療的目的優(yōu)選使血中血紅蛋白值的增加超過6.8mmol/l。為此，可以利用使血紅蛋白值每周增加0.6mmol/l到1.6mmol/l的方法來進行該藥物組合物的給藥。如果血紅蛋白值超過8.7mmol/l，優(yōu)選應當中止該治療，直至血紅蛋白值低于8.1mmol/l。本發(fā)明的組合物優(yōu)選用于適合皮下或靜脈或胃腸外注射的制劑中。對此適宜的稀釋劑和載體是，例如磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氯酸納、聚山梨酯80、HAS和注射用水。該組合物可以一周三次給藥，優(yōu)選一周兩次，更優(yōu)選一周一次，最優(yōu)選兩周一次。優(yōu)選地，該藥物組合物的給藥量是0.01-10μg/kg患者體重，更優(yōu)選0.1到5μg/kg，0.1到1μg/kg，或0.2到0.9μg/kg，最優(yōu)選0.3-0.7μg/kg，最優(yōu)選0.4-0.6μg/kg體重。一般地，優(yōu)選每劑量給藥為10μg到200μg，優(yōu)選15μg到100μg。根據(jù)另一個方面，本發(fā)明也涉及如上所述的HAS-蛋白質偶聯(lián)物，優(yōu)選HES-蛋白質偶聯(lián)物，或用如上所述的方法得到的HAS-蛋白質偶聯(lián)物，優(yōu)選HES-蛋白質偶聯(lián)物，其中該蛋白質是G-CSF，在制備用于治療以造血或免疫功能降低為特征的疾病的藥物中的應用，其中所述疾病優(yōu)選是化學治療、放射治療、傳染性疾病、重度慢性粒細胞減少癥、或白血病的結果。根據(jù)另一個方面，本發(fā)明也涉及如上所述的HAS-蛋白質偶聯(lián)物，優(yōu)選HES-蛋白質偶聯(lián)物，或用如上所述的方法得到的HAS-蛋白質偶聯(lián)物，優(yōu)選HES-蛋白質偶聯(lián)物，其中該蛋白質是因子VIII，在制備用于治療血友病A的藥物中的應用。根據(jù)另一個方面，本發(fā)明也涉及如上所述的HAS-ATIII偶聯(lián)物，或用如上所述的方法得到的HAS-蛋白質偶聯(lián)物，在制備用于治療ATIII遺傳性缺乏、靜脈閉塞性疾病、燒傷和冠狀動脈旁路移植(CABG)術中的肝素耐受、由外傷或胃腸手術導致的腸穿孔、彌散性血管內凝血(DIC)和/或敗血癥，和預防與通氣治療有關的微血塊形成的藥物中的應用。因此包含本發(fā)明HAS-ATIII偶聯(lián)物的該藥物組合物可以用于上述目的。根據(jù)另一個方面，本發(fā)明也涉及如上所述的HAS-蛋白質偶聯(lián)物，優(yōu)選HES-蛋白質偶聯(lián)物，或用如上所述的方法得到的HAS-蛋白質偶聯(lián)物，優(yōu)選HES-蛋白質偶聯(lián)物，其中該蛋白質是A1AT，在制備用于治療肺氣腫、囊性纖維化、特應性皮炎、慢性阻塞性肺病(COPD)、和/或支氣管炎的藥物中的應用。因此包含本發(fā)明HAS-A1AT-偶聯(lián)物的該藥物組合物可以用于上述目的。根據(jù)另一個方面，本發(fā)明也涉及如上所述的HAS-蛋白質偶聯(lián)物，優(yōu)選HES-蛋白質偶聯(lián)物，或用如上所述的方法得到的HAS-蛋白質偶聯(lián)物，優(yōu)選HES-蛋白質偶聯(lián)物，其中該蛋白質是tPA，在制備用于治療心肌梗塞(心臟病發(fā)作)、血栓癥、血栓栓塞或閉塞性疾病，特別是閉塞性動脈疾病的藥物中的應用。根據(jù)另一個方面，本發(fā)明也涉及如上所述的HAS-蛋白質偶聯(lián)物，優(yōu)選HES-蛋白質偶聯(lián)物，或用如上所述的方法得到的HAS-蛋白質偶聯(lián)物，優(yōu)選HES-蛋白質偶聯(lián)物，其中該蛋白質是APC，在制備用于治療重度敗血癥、血栓癥、血栓栓塞或閉塞性疾病，特別是閉塞性動脈疾病的藥物中的應用。根據(jù)另一個方面，本發(fā)明也涉及如上所述的HAS-蛋白質偶聯(lián)物，優(yōu)選HES-蛋白質偶聯(lián)物，或用如上所述的方法得到的HAS-蛋白質偶聯(lián)物，優(yōu)選HES-蛋白質偶聯(lián)物，其中該蛋白質是IFNα，在制備用于治療白血病例如毛細胞性白血病、慢性髓細胞性白血病、多發(fā)性骨髓瘤、濾泡性淋巴瘤、癌癥例如類癌瘤、惡性黑色素瘤和肝炎例如慢性乙型肝炎和慢性丙型肝炎的藥物中的應用。根據(jù)另一個方面，本發(fā)明也涉及如上所述的HAS-蛋白質偶聯(lián)物，優(yōu)選HES-蛋白質偶聯(lián)物，或用如上所述的方法得到的HAS-蛋白質偶聯(lián)物，優(yōu)選HES-蛋白質偶聯(lián)物，其中該蛋白質是IFNβ，在制備用于治療多發(fā)性硬化癥，優(yōu)選復發(fā)型多發(fā)性硬化癥的藥物中的應用。本發(fā)明也涉及HAS-因子VII偶聯(lián)物在制備用于和因子VIII或因子IX的抑制劑一起治療血友病A或B患者發(fā)作的藥物中的應用。本發(fā)明也涉及HAS-因子IX偶聯(lián)物在制備用于控制和預防血友病B(例如先天性因子IX缺乏或克里斯馬斯病)患者的出血性發(fā)作，包括控制和預防在外科環(huán)境中的出血的藥物中的應用。本發(fā)明將通過下面的附圖、表格和實施例進行解釋說明，而不是以任何方式限制本發(fā)明的范圍。附圖1a圖1a顯示根據(jù)實施例2.1(a)制備的HES-G-CSF偶聯(lián)物Neupogen的SDSpage分析。使用XCellSureLockMiniCell(InvitrogenGmbH，Karlsruhe，D)和ConsortE143電源(CONSORTnv，Turnhout，B)進行凝膠電泳。根據(jù)制造商的說明，使用在還原條件下的12％Bis-Tris凝膠和MOPSSDS電泳緩沖液(均來自InvitrogenGmbH，Karlsruhe，D)。泳道A蛋白質標記物SeeBluePlus2(InvitrogenGmbH，Karlsruhe，D)。分子量標記物由上至下為188kD、98kD、62kD、49kD、38kD、28kD、17kD、14kD、6kD、3kD。泳道B如實施例2.1(a)所述的G-CSF(Neupogen)與HES偶聯(lián)后的粗產物。泳道CG-CSF起始物。附圖1b圖1b顯示根據(jù)實施例2.1(a)制備的HES-G-CSF偶聯(lián)物Granocyte的SDSpage分析。使用XCellSureLockMiniCell(InvitrogenGmbH，Karlsruhe，D)和ConsortE143電源(CONSORTnv，Turnhout，B)進行凝膠電泳。根據(jù)制造商的說明，使用在還原條件下的12％Bis-Tris凝膠和MOPSSDS電泳緩沖液(均來自InvitrogenGmbH，Karlsruhe，D)。泳道A蛋白質標記物SeeBluePlus2(InvitrogenGmbH，Karlsruhe，D)。分子量標記物由上至下為188kD、98kD、62kD、49kD、38kD、28kD、17kD、14kD、6kD、3kD。泳道B如實施例2.1(a)所述的G-CSF(Granocyte)與HES偶聯(lián)后的粗產物。泳道CG-CSF起始物。附圖2圖2顯示根據(jù)實施例2.1(b)制備的HES-G-CSF偶聯(lián)物的SDSpage分析，G-CSF是具有與商業(yè)品Neupogen基本相同的特性的純化hG-CSF。使用XCellSureLockMiniCell(InvitrogenGmbH，Karlsruhe，D)和ConsortE143電源(CONSORTnv，Turnhout，B)進行凝膠電泳。根據(jù)制造商的說明，使用在還原條件下的12％Bis-Tris凝膠和MOPSSDS電泳緩沖液(均來自InvitrogenGmbH，Karlsruhe，D)。泳道A蛋白質標記物SeeBluePlus2(InvitrogenGmbH，Karlsruhe，D)。分子量標記物由上至下為188kD、98kD、62kD、49kD、38kD、28kD、17kD、14kD、6kD、3kD。泳道BG-CSF與HES10/0.4在0.1MNaOAc緩沖液pH5.0中偶聯(lián)后的粗產物。泳道CG-CSF與HES10/0.7在0.1MNaOAc緩沖液pH5.0中偶聯(lián)后的粗產物。泳道DG-CSF與HES50/0.4在0.1MNaOAc緩沖液pH5.0中偶聯(lián)后的粗產物。泳道EG-CSF與HES50/0.7在0.1MNaOAc緩沖液pH5.0中偶聯(lián)后的粗產物。泳道FG-CSF起始物。附圖3圖3顯示根據(jù)實施例2.2制備的HES-G-CSF偶聯(lián)物的SDSpage分析，G-CSF是具有與商業(yè)品Neupogen基本相同的特性的純化hG-CSF。使用XCellSureLockMiniCell(InvitrogenGmbH，Karlsruhe，D)和ConsortE143電源(CONSORTnv，Turnhout，B)進行凝膠電泳。根據(jù)制造商的說明，使用在還原條件下的12％Bis-Tris凝膠和MOPSSDS電泳緩沖液(均來自InvitrogenGmbH，Karlsruhe，D)。泳道A蛋白質標記物SeeBluePlus2(InvitrogenGmbH，Karlsruhe，D)。分子量標記物由上至下為188kD、98kD、62kD、49kD、38kD、28kD、17kD、14kD、6kD、3kD。泳道BG-CSF與氧化的HES10/0.7在0.1MNaOAc緩沖液pH5.0中偶聯(lián)后的粗產物。泳道CG-CSF與氧化的HES50/0.4在0.1MNaOAc緩沖液pH5.0中偶聯(lián)后的粗產物。泳道DG-CSF與氧化的HES50/0.7在0.1MNaOAc緩沖液pH5.0中偶聯(lián)后的粗產物。泳道EG-CSF起始物。附圖4圖4顯示根據(jù)實施例2.3制備的HES-G-CSF偶聯(lián)物的SDSpage分析，G-CSF是Neupogen或Granocyte。使用XCellSureLockMiniCell(InvitrogenGmbH，Karlsruhe，D)和ConsortE143電源(CONSORTnv，Turnhout，B)進行凝膠電泳。根據(jù)制造商的說明，使用在還原條件下的12％Bis-Tris凝膠和MOPSSDS電泳緩沖液(均來自InvitrogenGmbH，Karlsruhe，D)。泳道A蛋白質標記物SeeBluePlus2(InvitrogenGmbH，Karlsruhe，D)。分子量標記物由上至下為188kD、98kD、62kD、49kD、38kD、28kD、17kD、14kD、6kD、3kD。泳道B根據(jù)實施例2.3的粗產物(i-N)。泳道C根據(jù)實施例2.3的粗產物(ii-N)。泳道D根據(jù)實施例2.3的粗產物(iii-N)。泳道E根據(jù)實施例2.3的粗產物(iv-N)。泳道F根據(jù)實施例2.3的粗產物(i-G)。泳道G根據(jù)實施例2.3的粗產物(ii-G)。泳道H根據(jù)實施例2.3的粗產物(iii-G)。泳道I根據(jù)實施例2.3的粗產物(iv-G)。泳道JNeupogen。附圖5圖5顯示根據(jù)實施例2.4制備的HES-G-CSF偶聯(lián)物的SDSpage分析，G-CSF是具有與商業(yè)品Neupogen基本相同的特性的純化hG-CSF。使用XCellSureLockMiniCell(InvitrogenGmbH，Karlsruhe，D)和ConsortE143電源(CONSORTnv，Turnhout，B)進行凝膠電泳。根據(jù)制造商的說明，使用在還原條件下的12％Bis-Tris凝膠和MOPSSDS電泳緩沖液(均來自InvitrogenGmbH，Karlsruhe，D)。泳道A蛋白質標記物SeeBluePlus2(InvitrogenGmbH，Karlsruhe，D)。分子量標記物由上至下為188kD、98kD、62kD、49kD、38kD、28kD、17kD、14kD、6kD、3kD。泳道B根據(jù)實施例2.4的粗產物(vi)。泳道C根據(jù)實施例2.4的粗產物(v)。泳道DG-CSF起始物。泳道E蛋白質標記物SeeBluePlus2(InvitrogenGmbH，Karlsruhe，D)。分子量標記物由上至下為188kD、98kD、62kD、49kD、38kD、28kD、17kD、14kD、6kD、3kD。泳道F根據(jù)實施例2.4的粗產物(ix)。泳道G根據(jù)實施例2.4的粗產物(viii)。泳道H根據(jù)實施例2.4的粗產物(vii)。泳道IG-CSF起始物。附圖6圖6顯示根據(jù)實施例2.5制備的HES-G-CSF偶聯(lián)物的SDSpage分析，G-CSF是具有與商業(yè)品Neupogen基本相同的特性的純化hG-CSF。使用XCellSureLockMiniCell(InvitrogenGmbH，Karlsruhe，D)和ConsortE143電源(CONSORTnv，Turnhout，B)進行凝膠電泳。根據(jù)制造商的說明，使用在還原條件下的10％Bis-Tris凝膠和MOPSSDS電泳緩沖液(均來自InvitrogenGmbH，Karlsruhe，D)。泳道A蛋白質標記物SeeBluePlus2(InvitrogenGmbH，Karlsruhe，D)。分子量標記物由上至下為188kD、98kD、62kD、49kD、38kD、28kD、17kD、14kD、6kD、3kD。泳道B根據(jù)實施例2.5的粗產物。泳道CG-CSF起始物。附圖7圖7顯示根據(jù)實施例2.6制備的HES-蛋白質偶聯(lián)物的SDSpage分析。使用XCellSureLockMiniCell(InvitrogenGmbH，Karlsruhe，D)和ConsortE143電源(CONSORTnv，Turnhout，B)進行凝膠電泳。根據(jù)制造商的說明，使用在還原條件下的12％Bis-Tris凝膠和MOPSSDS電泳緩沖液(均來自InvitrogenGmbH，Karlsruhe，D)。將體積大于15μl的樣品真空濃縮至15μl。泳道A蛋白質標記物SeeBluePlus2(InvitrogenGmbH，Karlsruhe，D)。分子量標記物由上至下為188kD、98kD、62kD、49kD、38kD、28kD、17kD、14kD、6kD、3kD。泳道BIL-2與根據(jù)實施例1.9合成的醛基-HES的偶聯(lián)。泳道CIL-2與根據(jù)實施例1.10合成的醛基-HES的偶聯(lián)。泳道D對照用硼氫化鈉處理過的IL-2，不含醛基-HES。泳道EIFNα與根據(jù)實施例1.9合成的醛基-HES的偶聯(lián)。泳道FIFNα與根據(jù)實施例1.10合成的醛基-HES的偶聯(lián)。泳道G對照用硼氫化鈉處理過的IFNα，不含醛基-HES。附圖8圖8顯示根據(jù)實施例2.6制備的HES-蛋白質偶聯(lián)物的SDSpage分析。使用XCellSureLockMiniCell(InvitrogenGmbH，Karlsruhe，D)和ConsortE143電源(CONSORTnv，Turnhout，B)進行凝膠電泳。根據(jù)制造商的說明，使用在還原條件下的12％Bis-Tris凝膠和MOPSSDS電泳緩沖液(均來自InvitrogenGmbH，Karlsruhe，D)。將體積大于15μl的樣品真空濃縮至15μl。泳道A蛋白質標記物SeeBluePlus2(InvitrogenGmbH，Karlsruhe，D)。分子量標記物由上至下為188kD、98kD、62kD、49kD、38kD、28kD、17kD、14kD、6kD、3kD。泳道BIL-3與根據(jù)實施例1.9合成的醛基-HES的偶聯(lián)。泳道CIL-3與根據(jù)實施例1.10合成的醛基-HES的偶聯(lián)。泳道D對照用硼氫化鈉處理過的IL-3，不含醛基-HES。泳道E肌紅蛋白與根據(jù)實施例1.9合成的醛基-HES的偶聯(lián)。泳道F肌紅蛋白與根據(jù)實施例1.10合成的醛基-HES的偶聯(lián)。泳道G對照用硼氫化鈉處理過的肌紅蛋白，不含醛基-HES。附圖9圖9顯示根據(jù)實施例2.6制備的HES-蛋白質偶聯(lián)物的SDSpage分析。使用XCellSureLockMiniCell(InvitrogenGmbH，Karlsruhe，D)和ConsortE143電源(CONSORTnv，Turnhout，B)進行凝膠電泳。根據(jù)制造商的說明，使用在還原條件下的3-8％Tris-醋酸凝膠和Tris-醋酸SDS電泳緩沖液(均來自InvitrogenGmbH，Karlsruhe，D)。泳道A蛋白質標記物SeeBluePlus2(InvitrogenGmbH，Karlsruhe，D)。分子量標記物由上至下為188kD、98kD、62kD、49kD、38kD、28kD、17kD、14kD、6kD、3kD。泳道BBSA與根據(jù)實施例1.9合成的醛基-HES的偶聯(lián)。泳道CBSA與根據(jù)實施例1.10合成的醛基-HES的偶聯(lián)。泳道D對照用硼氫化鈉處理過的BSA，不含醛基-HES。附圖10圖10顯示根據(jù)實施例2.6制備的HES-蛋白質偶聯(lián)物的SDSpage分析。使用XCellSureLockMiniCell(InvitrogenGmbH，Karlsruhe，D)和ConsortE143電源(CONSORTnv，Turnhout，B)進行凝膠電泳。根據(jù)制造商的說明，使用在還原條件下的12％Bis-Tris凝膠和MOPSSDS電泳緩沖液(均來自InvitrogenGmbH，Karlsruhe，D)。將體積大于15μl的樣品真空濃縮至15μl。泳道A蛋白質標記物SeeBluePlus2(InvitrogenGmbH，Karlsruhe，D)。分子量標記物由上至下為188kD、98kD、62kD、49kD、38kD、28kD、17kD、14kD、6kD、3kD。泳道BSOD與根據(jù)實施例1.9合成的醛基-HES的偶聯(lián)。泳道CSOD與根據(jù)實施例1.10合成的醛基-HES的偶聯(lián)。泳道D對照用硼氫化鈉處理過的SOD，不含醛基-HES。泳道E對照用硼氫化鈉處理過的EPO，不含醛基-HES。泳道FEPO與根據(jù)實施例1.9合成的醛基-HES的偶聯(lián)。泳道GEPO與根據(jù)實施例1.10合成的醛基-HES的偶聯(lián)。泳道HIFNβ與根據(jù)實施例1.9合成的醛基-HES的偶聯(lián)。泳道IIFNβ與根據(jù)實施例1.10合成的醛基-HES的偶聯(lián)。泳道J對照用硼氫化鈉處理過的IFNβ，不含醛基-HES。附圖11圖11顯示根據(jù)實施例2.6制備的HES-蛋白質偶聯(lián)物的SDSpage分析。使用XCellSureLockMiniCell(InvitrogenGmbH，Karlsruhe，D)和ConsortE143電源(CONSORTnv，Turnhout，B)進行凝膠電泳。根據(jù)制造商的說明，使用在還原條件下的3-8％Tris-醋酸凝膠和Tris-醋酸SDS電泳緩沖液(均來自InvitrogenGmbH，Karlsruhe，D)。泳道A蛋白質標記物SeeBluePlus2(InvitrogenGmbH，Karlsruhe，D)。分子量標記物由上至下為188kD、98kD、62kD、49kD、38kD、28kD、17kD、14kD、6kD、3kD。泳道BATIII與根據(jù)實施例1.9合成的醛基-HES的偶聯(lián)。泳道CATIII與根據(jù)實施例1.10合成的醛基-HES的偶聯(lián)。泳道D對照用硼氫化鈉處理過的ATIII，不含醛基-HES。附圖12圖12顯示實施例4的體外結果。在圖中，x軸表示濃度，單位是pg/ml，y軸表示細胞數(shù)/100,000。在圖中，下列縮寫是指G-CSF/A32根據(jù)實施例2.5制備的G-CSF偶聯(lián)物G-CSF/A33用于實施例2.5偶聯(lián)物的G-CSF起始物G-CSF/A57未修飾的NeulastaG-CSF/A58未修飾的Neupegen附圖13SDS-PAGE根據(jù)實施例2.5的HES-修飾的G-CSF在DEAE-SepharoseCL-6B上層析后(見實施例3)的流過液和洗脫液；1.5％的指定級分經超濾脫鹽，在SpeedVac中干燥，加到12.5％聚丙烯酰胺凝膠上。附圖14G-CSF的MALDI/TOF圖譜(見實施例3)附圖15HES-修飾的G-CSF的MALDI/TOF圖譜(見實施例3)附圖16附圖16顯示的是實施例5(用凝膠電泳分析如實施例5.5所述制備的粗制α1AT-HES偶聯(lián)物)的結果。使用XCellSureLockMiniCell(InvitrogenGmbH，Karlsruhe，D)和PowerPac200電源(Bio-Rad，Munchen，D)進行凝膠電泳。根據(jù)制造商的說明，使用在還原條件下的3-8％Tris-醋酸凝膠和Tris-醋酸SDS電泳緩沖液(均來自InvitrogenGmbH，Karlsruhe，D)。泳道A未染色的SDSPage蛋白質標記物6.5-200KDa(SERVAElektrophoresisGmbH，Heidelberg，D)。分子量標記物由上至下為200kD、116kD、67kD、45kD、29kD、21kD、14.3kD、6.5kD；泳道B如實施例5.5所述與醛基-HES的偶聯(lián)；泳道C如實施例5.6所述與HES的偶聯(lián)。附圖17附圖16顯示的是實施例5(分析在離子交換層析后(參見實施例5.7)后收集的B1-C6級分)的結果。凝膠電泳的條件參見附圖16。泳道A未染色的SDSPage蛋白質標記物6.5-200KDa(SERVAElektrophoresisGmbH，Heidelberg，D)。分子量標記物由上至下為200kD、116kD、67kD、45kD、29kD、21kD、14.3kD、6.5kD；泳道BB1級分泳道CC1級分泳道DC2級分泳道EC3級分泳道FC4級分泳道GC5級分泳道HC6級分泳道IA1AT(GTCBiotherapeuticsInc.，F(xiàn)ramingham，MA，lotNo.080604A)附圖18附圖18顯示的是ProlastinHS(BayerVitalGmbH，Leverkusen，Germany，LotNo.PR4HA43)、A1AT(GTCBiotherapeuticsInc.，F(xiàn)ramingham，MA，lotNo.080604A)和如實施例5.5所述合成的HES-A1AT偶偶聯(lián)物的殘留酶活性相對于濃度的曲線圖。附圖19附圖19顯示的是實施例6.2(b)的反應混合物的凝膠電泳。使用XCellSureLockMiniCell(InvitrogenGmbH，Karlsruhe，D)和ConsortE143電源(CONSORTnv，Turnhout，B)進行凝膠電泳。根據(jù)制造商的說明，使用在還原條件下的12％Bis-Tris凝膠和MOPSSDS電泳緩沖液(均來自InvitrogenGmbH，Karlsruhe，D)。該凝膠使用Roti-Blue(CarlRothGmbH+Co.KG，Karlsruhe，D)根據(jù)制造商的說明染色。泳道A蛋白質標記物Roti-MarkSTANDARD(CarlRothGmbH+Co.KG，Karlsruhe，D)。分子量標記物由上至下為200KD、119KD、66KD、43KD、29KD、20KD、14.3KD。泳道Bh-CSF和在實施例6.1(d)中制備的HES衍生物偶聯(lián)后的粗產物。泳道Ch-CSF和在實施例6.1(b)中制備的HES衍生物偶聯(lián)后的粗產物。泳道Dh-CSF和在實施例6.1(j)中制備的HES衍生物偶聯(lián)后的粗產物。泳道E對比反應HES50/0.7(Mw47,000，DS＝0.76)。附圖20附圖20顯示的是實施例6.2(d)的反應混合物的凝膠電泳。使用XCellSureLockMiniCell(InvitrogenGmbH，Karlsruhe，D)和ConsortE143電源(CONSORTnv，Turnhout，B)進行凝膠電泳。根據(jù)制造商的說明，使用在還原條件下的12％Bis-Tris凝膠和MOPSSDS電泳緩沖液(均來自InvitrogenGmbH，Karlsruhe，D)。該凝膠使用Roti-Blue(CarlRothGmbH+Co.KG，Karlsruhe，D)根據(jù)制造商的說明染色。泳道A蛋白質標記物Roti-MarkSTANDARD(CarlRothGmbH+Co.KG，Karlsruhe，D)。分子量標記物由上至下為200KD、119KD、66KD、43KD、29KD、20KD、14.3KD。泳道B如實施例6.2(c)所述的緩沖液更換后的hG-CSF。泳道Ch-CSF和在實施例6.1(f)中制備的HES衍生物偶聯(lián)后的粗產物。泳道Dh-CSF和在實施例6.1(h)中制備的HES衍生物偶聯(lián)后的粗產物。附圖21附圖21顯示的是實施例6.3的有絲分裂原性測定結果。Y軸代表NFS-60-細胞數(shù)/ml，X軸代表濃度，單位是pg/ml。附圖22附圖22顯示的是實施例6.4的體內測定結果。附圖23附圖23顯示的是通過凝膠電泳分析實施例7的粗制EPO-HES偶聯(lián)物。使用XCellSureLockMiniCell(InvitrogenGmbH，Karlsruhe，D)和ConsortE143電源(CONSORTnv，Turnhout，B)進行凝膠電泳。根據(jù)制造商的說明，使用在還原條件下的10％Bis-Tris凝膠和MOPSSDS電泳緩沖液(均來自InvitrogenGmbH，Karlsruhe，D)。泳道ARoti-MarkSTANDARD(CarlRothGmbH+Co.KG，Karlsruhe，D)。分子量標記物由上至下為200KD、119KD、66KD、43KD、29KD、20KD、14.3KD；泳道B如實施例7.3所述EPO和醛基-HES的偶聯(lián)；泳道C如實施例7.4所述EPO和醛基-HES在沒有氰基硼氫化鈉下的反應(對比反應A)；泳道D如實施例7.5所述EPO和氰基硼氫化鈉在沒有醛基-HES下的反應(對比反應B)。從附圖23可以明白地看出，在沒有醛基-HES或沒有氰基硼氫化鈉的對比反應A和B中沒有觀測到反應。附圖24附圖24顯示的是通過凝膠電泳分析實施例8.3.1的IFN-α-HES偶聯(lián)物。使用XCellSureLockMiniCell(InvitrogenGmbH，Karlsruhe，D)和ConsortE143電源(CONSORTnv，Turnhout，B)進行凝膠電泳。根據(jù)制造商的說明，使用在還原條件下的10％Bis-Tris凝膠和MOPSSDS電泳緩沖液(均來自InvitrogenGmbH，Karlsruhe，D)。泳道XRoti-MarkSTANDARD(CarlRothGmbH+Co.KG，Karlsruhe，D)。分子量標記物由上至下為200KD、119KD、66KD、43KD、29KD、20KD、14.3KD；泳道A如實施例8.3.1所述與醛基HES10/0.4偶聯(lián)，條目A；泳道B如實施例8.3.1所述與醛基HES10/0.7偶聯(lián)，條目B；泳道C如實施例8.3.1所述與醛基HES30/0.4偶聯(lián)，條目C；泳道D如實施例8.3.1所述與醛基HES30/0.7偶聯(lián)，條目D；泳道E如實施例8.3.1所述與醛基HES50/0.4偶聯(lián)，條目E；泳道F如實施例8.3.1所述與醛基HES50/0.7偶聯(lián)，條目F；泳道G對比反應，如實施例8.3.1所述沒有醛基HES，條目G；泳道I對比反應，如實施例8.3.1所述沒有醛基HES并且沒有NaCNBH3，條目I；泳道J對比反應，如實施例8.3.1所述含有醛基HES10/0.4，條目J；泳道K對比反應，如實施例8.3.1所述含有醛基HES10/0.4但沒有NaCNBH3，條目K。附圖25附圖25顯示的是通過凝膠電泳分析實施例8.3.2的IFN-α-HES偶聯(lián)物。使用XCellSureLockMiniCell(InvitrogenGmbH，Karlsruhe，D)和ConsortE143電源(CONSORTnv，Turnhout，B)進行凝膠電泳。根據(jù)制造商的說明，使用在還原條件下的10％Bis-Tris凝膠和MOPSSDS電泳緩沖液(均來自InvitrogenGmbH，Karlsruhe，D)。泳道XRoti-MarkSTANDARD(CarlRothGmbH+Co.KG，Karlsruhe，D)。分子量標記物由上至下為200KD、119KD、66KD、43KD、29KD、20KD、14.3KD；泳道A如實施例8.3.2所述與醛基HES偶聯(lián)，條目A；泳道B如實施例8.3.2所述與醛基HES偶聯(lián)，條目B；泳道C如實施例8.3.2所述與醛基HES偶聯(lián)，條目C；泳道D如實施例8.3.2所述與醛基HES偶聯(lián)，條目D；泳道E如實施例8.3.2所述與醛基HES偶聯(lián)，條目F；泳道G對比反應，如實施例8.3.2所述與HES偶聯(lián)，條目G。從附圖25可以明白地看出，在對比反應G中沒有觀測到反應。附圖26附圖26顯示的是通過凝膠電泳分析實施例8.3.3的IFN-α-HES偶聯(lián)物。使用XCellSureLockMiniCell(InvitrogenGmbH，Karlsruhe，D)和ConsortE143電源(CONSORTnv，Turnhout，B)進行凝膠電泳。根據(jù)制造商的說明，使用在還原條件下的10％Bis-Tris凝膠和MOPSSDS電泳緩沖液(均來自InvitrogenGmbH，Karlsruhe，D)。通過凝膠電泳分析粗制IFN-α-HES偶聯(lián)物。泳道ARoti-MarkSTANDARD(CarlRothGmbH+Co.KG，Karlsruhe，D)。分子量標記物由上至下為200KD、119KD、66KD、43KD、29KD、20KD、14.3KD；泳道B如實施例8.3.3.1所述IFNα與醛基HES的偶聯(lián)；泳道C如實施例8.3.3.2所述IFNα與醛基HES的偶聯(lián)；泳道D如實施例8.3.3.3所述IFNα與HES10/0.4鈉的偶聯(lián)(對比反應)。附圖27附圖27顯示的是通過凝膠電泳分析實施例8.3.4的IFN-α-HES偶聯(lián)物。使用XCellSureLockMiniCell(InvitrogenGmbH，Karlsruhe，D)和ConsortE143電源(CONSORTnv，Turnhout，B)進行凝膠電泳。根據(jù)制造商的說明，使用在還原條件下的10％Bis-Tris凝膠和MOPSSDS電泳緩沖液(均來自InvitrogenGmbH，Karlsruhe，D)。泳道XRoti-MarkSTANDARD(CarlRothGmbH+Co.KG，Karlsruhe，D)。分子量標記物由上至下為200KD、119KD、66KD、43KD、29KD、20KD、14.3KD；泳道A如實施例8.3.4所述與醛基HES的偶聯(lián)；泳道B對比反應；如實施例8.3.4所述與HES(MW＝7.6kD，DS＝0.41)的偶聯(lián)。從附圖27可以明白地看出，在對比反應B中沒有觀測到反應。附圖28附圖28顯示的是根據(jù)實施例9.1的IntronA與NIH標準rhIFN-α2a的增殖活性的比較。附圖29附圖29顯示的是根據(jù)實施例9.2的模擬溫育的IFN-α-HES與未修飾的IFN-α起始物相比的相對體外活性。附圖30附圖30顯示的根據(jù)實施例9.3的IFN-α-HES偶聯(lián)物分別與未修飾的IFN-α起始物、IntronA和Pegasys相比的相對體外活性。附圖31附圖31顯示的是根據(jù)實施例9.4的IFN-α-HES偶聯(lián)物與IntronA相比的相對體外活性。附圖32附圖32顯示的是在小鼠中靜脈注射30μg/kg后，達到50％保護MDBK細胞對抗病毒感染所需的血清樣品稀釋度相對于時間的圖。用未修飾的起始物處理的小鼠的血清只有非常低的抗病毒作用。用HES修飾IFN-α可以大大延長血清抗病毒作用。半衰期隨著用于修飾IFN-α的HES的分子量而增加(見實施例10)。附圖33附圖33顯示的是根據(jù)實施例11在兔的PK-研究中得到的數(shù)據(jù)。與IFN-α起始物相比，IFN-α-HES顯示了顯著延長的半衰期。在大于24小時時(約＜1000pCi/ml)，未修飾物的曲線變平，并且?guī)缀鯖]有觀測到活性進一步降低。附圖34附圖34顯示的是根據(jù)實施例11的兔的PK-研究。評價4到24小時之間的數(shù)據(jù)。與未修飾的IFN-α起始物相比，IFN-α-HES顯示了顯著延長的半衰期。附圖35附圖35顯示的是對根據(jù)實施例11的PK-研究(顯示的是高達12小時的期間)的統(tǒng)計學評價。在未修飾的起始物(見附圖35(a))的情況中，在開始的2小時中濃度降至幾乎為0，而IFN-α-HES顯示了顯著延長的半衰期(附圖25(b))。附圖36附圖36顯示的是實施例6.5(根據(jù)本發(fā)明的HES-G-CSF偶聯(lián)物、Neulasta和Neupogen半衰期測定的比較)的結果。附圖37附圖37顯示的是用圖表示的實施例10.3的結果(IFN-α-HES偶聯(lián)物的抗病毒活性)。附圖38附圖38顯示的是用圖表示的實施例9.5的結果(IFN-α-HES偶聯(lián)物的抗病毒活性)。實施例實施例1醛基官能化的羥乙基淀粉的合成實施例1.1(a)通過高碘酸鹽氧化其還原端已被選擇性氧化的羥乙基淀粉并在0℃下溫育而進行的合成取100mg氧代-HES10/0.4(MW＝10kD，DS＝0.4，由SupramolParenteralColloidsGmbH，Rosbach-Rodheim，D制備；根據(jù)DE19628705A1)溶解于5mL20mM磷酸鈉緩沖液pH7.2中，并冷卻至0℃。取21.4mg高碘酸鈉(Fluka，Sigma-AldrichChemieGmbH，Taufkirchen，D)溶解于5mL相同緩沖液中并冷卻至0℃。將這兩份溶液混合，并在0℃溫育10分鐘，然后添加0.73mL甘油，反應混合物在21℃溫育10分鐘。將該反應混合物在水中透析24小時(SnakeSkin透析管，阻斷值3.5kD，PerbioSciencesDeutschlandGmbH，Bonn，D)并凍干。當用LALLS-GPC測定時，HES10/0.4的分子量是10.5kD，DS是0.41。實施例1.1(b)通過高碘酸鹽氧化其還原端已被選擇性氧化的羥乙基淀粉并在21℃下溫育而進行的合成取100mg氧代-HES10/0.4(MW＝10kD，DS＝0.4，由SupramolParenteralColloidsGmbH，Rosbach-Rodheim，D制備；根據(jù)DE19628705A1)溶解于5mL20mM磷酸鈉緩沖液pH7.2中。取21.4mg高碘酸鈉(Fluka，Sigma-AldrichChemieGmbH，Taufkirchen，D)溶解于5mL相同緩沖液中。將這兩份溶液混合，并在21℃溫育10分鐘，然后添加0.73mL甘油，反應混合物在21℃溫育10分鐘。將該反應混合物在水中透析24小時(SnakeSkin透析管，阻斷值3.5kD，PerbioSciencesDeutschlandGmbH，Bonn，D)并凍干。當用LALLS-GPC測定時，HES10/0.4的分子量是10.5kD，DS是0.41。實施例1.2(a)通過高碘酸鹽氧化具有未氧化的還原端的羥乙基淀粉并在0℃下溫育，合成醛基官能化的羥乙基淀粉取100mgHES10/0.4(MW＝10kD，DS＝0.4，SupramolParenteralColloidsGmbH，Rosbach-Rodheim，D制備)溶解于5mL20mM磷酸鈉緩沖液pH7.2中，并冷卻至0℃。取21.4mg高碘酸鈉(Fluka，Sigma-AldrichChemieGmbH，Taufkirchen，D)溶解于5mL相同緩沖液中并冷卻至0℃。將這兩份溶液混合，并在0℃溫育10分鐘，然后添加0.73mL甘油，反應混合物在21℃溫育10分鐘。將該反應混合物在水中透析24小時(SnakeSkin透析管，阻斷值3.5kD，PerbioSciencesDeutschlandGmbH，Bonn，D)并凍干。當用LALLS-GPC測定時，HES10/0.4的分子量是8.5kD，DS是0.41。實施例1.2(b)通過高碘酸鹽氧化具有未氧化的還原端的羥乙基淀粉非氧化并在21℃下溫育，合成醛基官能化的羥乙基淀粉取100mgHES10/0.4(MW＝10kD，DS＝0.4，SupramolParenteralColloidsGmbH，Rosbach-Rodheim，D制備)溶解于5mL20mM磷酸鈉緩沖液pH7.2中。取21.4mg高碘酸鈉(Fluka，Sigma-AldrichChemieGmbH，Taufkirchen，D)溶解于5mL相同緩沖液中。將這兩份溶液混合，并在21℃溫育10分鐘，然后添加0.73mL甘油，反應混合物在21℃溫育10分鐘。將該反應混合物在水中透析24小時(SnakeSkin透析管，阻斷值3.5kD，PerbioSciencesDeutschlandGmbH，Bonn，D)并凍干。當用LALLS-GPC測定時，HES10/0.4的分子量是8.5kD，DS是0.41。實施例1.3由氨基官能化的羥乙基淀粉和甲酰基苯甲酸合成醛基官能化的羥乙基淀粉氧代-HES10/0.4(MW＝10kD，DS＝0.4)由SupramolParenteralColloidsGmbH，Rosbach-Rodheim，D制備；根據(jù)DE19628705A1。當用LALLS-GPC測定時，HES10/0.4的分子量是14.5kD，DS是0.41。取5.1g(0.51mmol)氧代-HES10/0.4溶于15mL無水二甲亞砜(DMSO，F(xiàn)luka，Sigma-AldrichChemieGmbH，Taufkirchen，D)，在氮氣中滴加到5.1mL(51mmol)1，4-二氨基丁烷的10mL無水二甲亞砜溶液中，并在40℃下攪拌19小時。添加反應混合物至80mL乙醇和80mL丙酮的混合物中。離心分離產生的沉淀，用20mL乙醇和20mL丙酮的混合物洗滌，再溶解于80mL水中。將該溶液在水中透析4天(SnakeSkin透析管，阻斷值3.5kD，PerbioSciencesDeutschlandGmbH，Bonn，D)，然后凍干。收率是67％(3.4g)氨基-HES10/0.4。取150mg4-甲?；郊姿岷?30mg1-羥基-1H-苯并三唑(均來自Aldrich，Sigma-AldrichChemieGmbH，Taufkirchen，D)溶于10mLN，N-二甲基甲酰胺(肽合成級，Biosolve，Valkenswaard，NL)，加入204μlN，N′-二異丙基碳二亞胺。在21℃溫育30分鐘后，加入1g氨基-HES10/0.4。在22℃振蕩19小時后，把反應混合物加入到84mL冰冷的丙酮和乙醇1∶1(v/v)混合物中。在4℃下離心收集沉淀產物，再溶解于50mL水中，在水中透析2天(SnakeSkin透析管，阻斷值3.5kD，PerbioSciencesDeutschlandGmbH，Bonn，D)并凍干。實施例1.4由羥乙基淀粉和甲?；郊姿岷铣扇┗倌芑牧u乙基淀粉氧代-HES10/0.7(MW＝10kD，DS＝0.7)由SupramolParenteralColloidsGmbH，Rosbach-Rodheim，D制備；根據(jù)DE19628705A1。當用LALLS-GPC測定時，HES10/0.7的分子量是14.5kD，DS是0.76。取83mg4-甲酰基苯甲酸和180mg1-羥基-1H-苯并三唑(均來自Aldrich，Sigma-AldrichChemieGmbH，Taufkirchen，D)溶于5mLN，N-二甲基甲酰胺(DMF，肽合成級，Biosolve，Valkenswaard，NL)，加入78μlN，N′-二異丙基碳二亞胺。在21℃溫育30分鐘后，加入0.5g氧代-HES10/0.7。在22℃振蕩19小時后，把反應混合物加入到37.5mL冰冷的丙酮和乙醇1∶1(v/v)混合物中。在4℃下離心收集沉淀產物，再溶解于2.5mL水和2.5mLDMF的混合物中，并如上所述再沉淀。如上所述離心分析收集反應產物，再溶解于10mL水中，在水中透析2天(SnakeSkin透析管，阻斷值3.5kD，PerbioSciencesDeutschlandGmbH，Bonn，D)并凍干。實施例1.5由羥乙基淀粉和甲?；郊姿岷铣扇┗倌芑牧u乙基淀粉氧代-HES10/0.7(MW＝10kD，DS＝0.7)由SupramolParenteralColloidsGmbH，Rosbach-Rodheim，D制備。當用LALLS-GPC測定時，HES10/0.7的分子量是10.5kD，DS是0.76。取50mg4-甲?；郊姿岷?08mg1-羥基-1H-苯并三唑(均來自Aldrich，Sigma-AldrichChemieGmbH，Taufkirchen，D)溶于3mLN，N-二甲基甲酰胺(肽合成級，Biosolve，Valkenswaard，NL)，加入47μlN，N′-二異丙基碳二亞胺。在21℃溫育30分鐘后，加入0.3g氧代-HES10/0.7。在22℃振蕩19小時后，把反應混合物加入到23mL冰冷的丙酮和乙醇1∶1(v/v)混合物中。在4℃下離心收集沉淀產物，再溶解于1.5mL水和1.5mLDMF的混合物中，并如上所述再沉淀。如上所述離心分析收集反應產物，再溶解于10mL水中，在水中透析2天(SnakeSkin透析管，阻斷值3.5kD，PerbioSciencesDeutschlandGmbH，Bonn，D)并凍干。實施例1.6由氨基官能化的羥乙基淀粉和甲?；郊姿嵛宸交ズ铣扇┗倌芑牧u乙基淀粉氧代-HES10/0.7(MW＝10kD，DS＝0.7)由SupramolParenteralColloidsGmbH，Rosbach-Rodheim，D制備；根據(jù)DE19628705A1。當用LALLS-GPC測定時，HES10/0.7的分子量是14.5kD，DS是0.76。取6.0g(0.6mmol)氧代-HES10/0.7溶于20mL無水二甲亞砜(DMSO，F(xiàn)luka，Sigma-AldrichChemieGmbH，Taufkirchen，D)，在氮氣中滴加到6mL(60mmol)1，4-二氨基丁烷的11mL無水二甲亞砜溶液中，并在40℃下攪拌19小時。添加反應混合物至80mL乙醇和80mL丙酮的混合物中。離心分離產生的沉淀，用20mL乙醇和20mL丙酮的混合物洗滌，再溶解于80mL水中。將該溶液在水中透析4天(SnakeSkin透析管，阻斷值3.5kD，PerbioSciencesDeutschlandGmbH，Bonn，D)，然后凍干。收率是52％(3.15g)氨基-HES10/0.7。4-甲?；郊姿嵛宸交ジ鶕?jù)J.S.Lindsey等，Tetrahedron50(1994)pp.8941-68，特別是p.8956所述合成。取50mg氨基-HES10/0.7溶于0.5mLN，N-二甲基甲酰胺(肽合成級，Biosolve，Valkenswaard，NL)，加入15.3mg4-甲?；郊姿嵛宸交ァＴ?2℃振蕩22小時后，把反應混合物加入到3.5mL冰冷的2-丙醇中。在4℃下離心收集沉淀產物，用4mL冰冷的2-丙醇洗滌，再溶解于50mL水中，在水中透析2天(SnakeSkin透析管，阻斷值3.5kD，PerbioSciencesDeutschlandGmbH，Bonn，D)并凍干。實施例1.7由羥乙基淀粉和甲酰基苯甲酸五氟苯基酯合成醛基官能化的羥乙基淀粉氧代-HES10/0.7(MW＝10kD，DS＝0.7)由SupramolParenteralColloidsGmbH，Rosbach-Rodheim，D制備；根據(jù)DE19628705A1。當用LALLS-GPC測定時，HES10/0.7的分子量是14.5kD，DS是0.76。4-甲?；郊姿嵛宸交ジ鶕?jù)J.S.Lindsey等，Tetrahedron50(1994)pp.8941-68，特別是p.8956所述合成。取200mg氧代-HES10/0.7溶于2mLN，N-二甲基甲酰胺(肽合成級，Biosolve，Valkenswaard，NL)，加入61.2mg4-甲酰基苯甲酸五氟苯基酯。在22℃振蕩22小時后，把反應混合物加入到15mL冰冷的丙酮和乙醇1∶1(v/v)混合物中。在4℃下離心收集沉淀產物，再溶解于1.4mL水和0.7mLDMF的混合物中，并如上所述再沉淀。如上所述離心收集反應產物，再溶解于10mL水中，并在水中透析2天(SnakeSkin透析管，阻斷值3.5kD，PerbioSciencesDeutschlandGmbH，Bonn，D)并凍干。實施例1.8由氨基官能化的羥乙基淀粉和4-(4-甲?；?3，5-二甲氧基苯氧基)丁酸合成醛基官能化的羥乙基淀粉氧代-HES10/0.4(MW＝10kD，DS＝0.4)由SupramolParenteralColloidsGmbH，Rosbach-Rodheim，D制備；根據(jù)DE19628705A1。當用LALLS-GPC測定時，HES10/0.4的分子量是14.5kD，DS是0.41。取5.1g(0.51mmol)氧代-HES10/0.4溶于15mL無水二甲亞砜(DMSO，F(xiàn)luka，Sigma-AldrichChemieGmbH，Taufkirchen，D)，在氮氣中滴加到5.1mL(51mmol)1，4-二氨基丁烷的10mL無水二甲亞砜溶液中，并在40℃下攪拌19小時。添加反應混合物至80mL乙醇和80mL丙酮的混合物中。離心分離產生的沉淀，用20mL乙醇和20mL丙酮的混合物洗滌，再溶解于80mL水中。將該溶液在水中透析4天(SnakeSkin透析管，阻斷值3.5kD，PerbioSciencesDeutschlandGmbH，Bonn，D)，然后凍干。收率是67％(3.4g)氨基-HES10/0.4。取80.5mg4-(4-甲酰基-3，5-二甲氧基苯氧基)丁酸(Calbiochem-Novabiochem，Lufelfingen，CH)和61mg1-羥基-1H-苯并三唑(Aldrich，Sigma-AldrichChemieGmbH，Taufkirchen，D)溶于3mLN，N-二甲基甲酰胺(肽合成級，Biosolve，Valkenswaard，NL)，加入45.4μlN，N′-二異丙基碳二亞胺。在21℃溫育30分鐘后，加入0.3g氧代-HES10/0.4。在22℃振蕩22小時后，把反應混合物加入到23mL冰冷的丙酮和乙醇1∶1(v/v)混合物中。在4℃下離心收集沉淀產物，再溶解于2mL水和1mLDMF的混合物中，并如上所述再沉淀。如上所述離心收集反應產物，再溶解于10mL水中，在水中透析1天(SnakeSkin透析管，阻斷值3.5kD，PerbioSciencesDeutschlandGmbH，Bonn，D)并凍干。實施例1.9由氨基官能化的羥乙基淀粉和4-甲酰苯甲酸合成醛基官能化的羥乙基淀粉氧代-HES10/0.4(MW＝10kD，DS＝0.4)由SupramolParenteralColloidsGmbH，Rosbach-Rodheim，D制備；根據(jù)DE19628705A1。當用LALLS-GPC測定時，HES10/0.4的分子量是14.5kD，DS是0.41。取5.1g(0.51mmol)氧代-HES10/0.4溶于15mL無水二甲亞砜(DMSO，F(xiàn)luka，Sigma-AldrichChemieGmbH，Taufkirchen，D)，在氮氣中滴加到5.1mL(51mmol)1，4-二氨基丁烷的10mL無水二甲亞砜溶液中，并在40℃下攪拌19小時。添加反應混合物至80mL乙醇和80mL丙酮的混合物中。離心分離產生的沉淀，用20mL乙醇和20mL丙酮的混合物洗滌，再溶解于80mL水中。將該溶液在水中透析4天(SnakeSkin透析管，阻斷值3.5kD，PerbioSciencesDeutschlandGmbH，Bonn，D)，然后凍干。收率是67％(3.4g)氨基-HES10/0.4。取150mg4-甲酰苯甲酸和230mg1-羥基-1H-苯并三唑(均來自Aldrich，Sigma-AldrichChemieGmbH，Taufkirchen，D)溶于10mLN，N-二甲基甲酰胺(肽合成級，Biosolve，Valkenswaard，NL)，加入204μlN，N′-二異丙基碳二亞胺。在21℃溫育30分鐘后，加入1g氨基-HES10/0.4。在22℃振蕩19小時后，把反應混合物加入到84mL冰冷的丙酮和乙醇1∶1(v/v)混合物中。在4℃下離心收集沉淀產物，再溶解于50mL水中，在水中透析2天(SnakeSkin透析管，阻斷值3.5kD，PerbioSciencesDeutschlandGmbH，Bonn，D)并凍干。實施例1.10通過高碘酸鹽氧化其還原端已被氧化的羥乙基淀粉，合成醛基官能化的羥乙基淀粉氧代-HES10/0.4(MW＝10kD，DS＝0.4)由SupramolParenteralColloidsGmbH，Rosbach-Rodheim，D制備；根據(jù)DE19628705A1。當用LALLS-GPC測定時，HES10/0.4的分子量是10.5kD，DS是0.41。取300mg氧代-HES10/0.4溶解于15mL20mM磷酸鈉緩沖液pH7.2中。取64.2mg高碘酸鈉(Fluka，Sigma-AldrichChemieGmbH，Taufkirchen，D)溶解于15mL相同緩沖液中。將這兩份溶液混合，并在21℃溫育30分鐘后，添加2mL甘油，反應混合物在21℃溫育10分鐘。將該反應混合物在水中透析24小時(SnakeSkin透析管，阻斷值3.5kD，PerbioSciencesDeutschlandGmbH，Bonn，D)并凍干。實施例2通過還原氨基化作用合成G-CSF偶聯(lián)物G-CSF是與商業(yè)品Neupogen(Amgen，München，D)具有基本相同性質的純化的G-CSF。實施例2.1(a)通過還原氨基化作用，使用含未氧化的還原端的羥乙基淀粉在pH＝7.4合成G-CSF-偶聯(lián)物(對比實施例)在實施例2.1中，試圖采用WO03/074087(實施例12，第22-23頁)的合成方法來制備HES-G-CSF偶聯(lián)物。向3.33μlG-CSF(Neupogen，來自Amgen，München，D或Granocyte，來自AventisPharmaAG，Zurich，CH，各3mg/mL)的0.1M磷酸緩沖液pH7.4水溶液中添加3.33μlHES10/0.4(MW＝10ka，DS＝0.4，SupramolParenteralColloidsGmbH，Rosbach-Rodheim，D，79mg/mL)在相同緩沖液中的溶液。向該混合物中加入3.33μl60mM氰基硼氫化鈉在相同緩沖液中的溶液，所得混合物在22℃溫育4小時。然后，再添加3.33μl新制備的60mM氰基硼氫化鈉溶液。在30小時的溫育時間內，共加入5份3.33μl新制備的60mM氰基硼氫化鈉溶液。用凝膠電泳法分析該反應混合物。未觀察到反應。實施例2.1(b)通過還原氨基化作用，使用含未氧化的還原端的羥乙基淀粉在pH＝5.0到9.2合成G-CSF-偶聯(lián)物(對比實施例)向3.33μlG-CSF(3mg/mL)在給定緩沖液中的溶液中添加3.33μlHES(30mg/mL)在相同緩沖液中的溶液。將該混合物冷卻到4℃，在4℃向該混合物中加入3.33μl60mM氰基硼氫化鈉在相同緩沖液中的溶液，所得混合物在4℃溫育20小時。使用如下的HES制劑和緩沖液a)緩沖液0.1M乙酸鈉緩沖液pH5.0-HES10/0.4(MW＝10kD，DS＝0.4，SupramolParenteralColloidsGmbH，Rosbach-Rodheim，D)。當用LALLS-GPC測定時，HES10/0.4的分子量是8.5kD，DS是0.41。-HES10/0.7(MW＝10kD，DS＝0.7，SupramolParenteralColloidsGmbH，Rosbach-Rodheim，D)。當用LALLS-GPC測定時，HES10/0.7的分子量是10.5kD，DS是0.76。-HES50/0.4(MW＝50kD，DS＝0.4，SupramolParenteralColloidsGmbH，Rosbach-Rodheim，D)。當用LALLS-GPC測定時，HES50/0.4的分子量是57kD，DS是0.41。-HES50/0.7(MW＝50kD，DS＝0.7，SupramolParenteralColloidsGmbH，Rosbach-Rodheim，D)。當用LALLS-GPC測定時，HES50/0.7的分子量是47kD，DS是0.76。b)緩沖液0.1M磷酸鈉緩沖液pH7.2-HES10/0.7(MW＝10kD，DS＝0.7，SupramolParenteralColloidsGmbH，Rosbach-Rodheim，D)。當用LALLS-GPC測定時，HES10/0.7的分子量是10.5kD，DS是0.76。c)緩沖液0.1M硼酸鈉緩沖液pH8.3-HES10/0.7(MW＝10kD，DS＝0.7，SupramolParenteralColloidsGmbH，Rosbach-Rodheim，D)。當用LALLS-GPC測定時，HES10/0.7的分子量是10.5kD，DS是0.76。d)緩沖液0.2M硼酸鉀緩沖液pH9.2-HES10/0.7(MW＝10kD，DS＝0.7，SupramolParenteralColloidsGmbH，Rosbach-Rodheim，D)。當用LALLS-GPC測定時，HES10/0.7的分子量是10.5kD，DS是0.76。通過凝膠電泳分析各反應混合物。偶聯(lián)反應未觀察到或可以忽略(未顯示對反應b)到d)的凝膠掃描)。實施例2.2通過還原氨基化作用，使用含氧化的還原端的羥乙基淀粉在pH＝5.0到9.2合成G-CSF-偶聯(lián)物(對比實施例)向3.33μlG-CSF(3mg/mL)在給定緩沖液中的溶液中添加3.33μl氧代-HES(30mg/mL)在相同緩沖液中的溶液。將該混合物冷卻到4℃，在4℃向該混合物中加入3.33μl60mM氰基硼氫化鈉在相同緩沖液中的溶液，所得混合物在4℃溫育17小時。使用如下的HES制劑和緩沖液a)緩沖液0.1M乙酸鈉緩沖液pH5.0-氧代-HES10/0.7(MW＝10kD，DS＝0.7，SupramolParenteralColloidsGmbH，Rosbach-Rodheim，D)。當用LALLS-GPC測定時，HES10/0.7的分子量是14.5kD，DS是0.76。-氧代-HES50/0.4(MW＝50kD，DS＝0.4，SupramolParenteralColloidsGmbH，Rosbach-Rodheim，D)。當用LALLS-GPC測定時，HES50/0.4的分子量是42kD，DS是0.41。-氧代-HES50/0.7(MW＝50kD，DS＝0.7，SupramolParenteralColloidsGmbH，Rosbach-Rodheim，D)。當用LALLS-GPC測定時，HES50/0.7的分子量是57kD，DS是0.76。b)緩沖液0.1M磷酸鈉緩沖液pH7.2-HES10/0.7(MW＝10kD，DS＝0.7，SupramolParenteralColloidsGmbH，Rosbach-Rodheim，D)。當用LALLS-GPC測定時，HES10/0.7的分子量是10.5kD，DS是0.76。c)緩沖液0.1M硼酸鈉緩沖液pH8.3-HES10/0.7(MW＝10kD，DS＝0.7，SupramolParenteralColloidsGmbH，Rosbach-Rodheim，D)。當用LALLS-GPC測定時，HES10/0.7的分子量是10.5kD，DS是0.76。d)緩沖液0.2M硼酸鉀緩沖液pH9.2-HES10/0.7(MW＝10kD，DS＝0.7，SupramolParenteralColloidsGmbH，Rosbach-Rodheim，D)。當用LALLS-GPC測定時，HES10/0.7的分子量是10.5kD，DS是0.76。通過凝膠電泳分析各反應混合物。偶聯(lián)反應未觀察到或可以忽略(未顯示對反應b)到d)的凝膠掃描)。HES10/0.4(MW＝8.4kD，DS＝0.41)的氧化作用由SupramolParenteralColloidsGmbH，Rosbach-Rodheim，D根據(jù)DE19628705A1來進行。實施例2.3通過還原氨基化作用，使用由高碘酸氧化合成的醛基官能化的羥乙基淀粉合成G-CSF-偶聯(lián)物向3.33μlG-CSF(Granocyte，來自AventisPharmaAG，Zurich，CH，和Neupogen，來自Amgen，München，D，各3mg/mL)在0.1M乙酸鈉緩沖液pH5.0中的水溶液中添加3.33μl醛基-HES(79mg/mL)在相同緩沖液中的溶液。向該混合物中加入3.33μl60mM氰基硼氫化鈉在相同緩沖液中的溶液，所得混合物在21℃溫育25小時。通過凝膠電泳分析各反應混合物。使用下列醛基官能化的HES偶聯(lián)物(i-N)根據(jù)上述實施例1.1(a)，用Neupogen制備；(ii-N)根據(jù)上述實施例1.1(b)，用Neupogen制備；(iii-N)根據(jù)上述實施例1.2(a)，用Neupogen制備；(iv-N)根據(jù)上述實施例1.2(b)，用Neupogen制備；(i-G)根據(jù)上述實施例1.1(a)，用Granocyte制備；(ii-G)根據(jù)上述實施例1.1(b)，用Granocyte制備；(iii-G)根據(jù)上述實施例1.2(a)，用Granocyte制備；(iv-G)根據(jù)上述實施例1.2(b)，用Granocyte制備；實施例2.4通過還原氨基化作用，使用由羥乙基淀粉和甲酰-羧酸偶聯(lián)合成的醛基官能化的羥乙基淀粉合成G-CSF-偶聯(lián)物向3.33μlG-CSF(3mg/mL)在0.1M乙酸鈉緩沖液pH5.0中的水溶液中添加3.33μl醛基-HES(118.5mg/mL)在相同緩沖液中的溶液，將溶液冷卻到4℃。在4℃向該混合物中加入3.33μl60mM氰基硼氫化鈉在相同緩沖液中的溶液，所得混合物在4℃溫育17小時。通過凝膠電泳分析反應混合物。使用下列醛基官能化的HES偶聯(lián)物(v)根據(jù)上述實施例1.4制備；(vi)根據(jù)上述實施例1.5制備；(vii)根據(jù)上述實施例1.6制備；(viii)根據(jù)上述實施例1.7制備；(ix)根據(jù)上述實施例1.8制備。實施例2.5通過還原氨基化作用，使用由羥乙基淀粉和甲酰-羧酸偶聯(lián)合成的醛基官能化的羥乙基淀粉合成G-CSF-偶聯(lián)物向2.5mLG-CSF(2.27mg/mL)在0.1M乙酸鈉緩沖液pH5.0中的水溶液中添加136mg如實施例1.3所制備的醛基-HES10/0.4，將溶液冷卻到0℃。向該混合物中加入2.5mL冰冷的40mM氰基硼氫化鈉在相同緩沖液中的溶液，所得混合物在4℃溫育17小時。通過凝膠電泳分析反應混合物。實施例2.6通過還原氨基化作用，分別使用根據(jù)實施例1.9和1.10合成的醛基官能化的羥乙基淀粉合成各種蛋白質偶聯(lián)物向wμl(見下表I)蛋白質P(見下表I)在0.1M乙酸鈉緩沖液pH5.0(xmg/mL；見下表I)中的水溶液中添加yμl(見下表I)HES-衍生物(如實施例1.9或1.10合成)在相同緩沖液中的溶液(200mg/mL)。將混合物冷卻到4℃并在4℃加入zμl120mM氰基硼氫化鈉在相同緩沖液中的溶液，所得混合物在4℃溫育24小時。通過凝膠電泳分析粗反應混合物。觀測到所有蛋白質都成功地偶聯(lián)，如蛋白質帶向較高分子量遷移所示(見附圖7到11)。增加的帶寬是由于所使用的HES衍生物的分子量分布和與蛋白質連接的HES衍生物的數(shù)量。表I根據(jù)實施例2.6進行的試驗所使用的IFN-β是由包含二-和三-觸角的糖側鏈和N-乙酰氨基乳糖重復單元的CHO細胞產生的rhIFN-β1a。所使用的EPO是重組產生的EPO，其具有人EPO的氨基酸序列，并與商業(yè)銷售的Erypo(ORTHOBIOTECH，Jansen-Cilag)或NeoRecormon(Roche)具有基本相同的特性，可參照EP0148605、EP0205564、EP0411678。實施例3實施例2.5獲得的G-CSF-偶聯(lián)物的分析A.純化獲得的G-CSF是與商業(yè)品Neupogen具有基本相同的特性的純化hG-CSF并且其中一份保持未修飾，作為對照。1.在用陰離子交換層析純化前G-CSF和G-CSF-偶聯(lián)物樣品的緩沖液更換對于HES-修飾的G-CSF樣品或未修飾G-CSF(作為對照)(0.5-5mg蛋白質)，用Vivaspin6Concentrator裝置(10.000MWCOPES，Vivascience，Cat.Nr.VS0602)進行緩沖液更換。將樣品濃縮到0.5-0.7mL并用10mM磷酸鈉緩沖液pH7.2稀釋到5mL。每個樣品都進行3次上述濃縮/緩沖液更換循環(huán)。2.G-CSF和其HES-修飾型在DEAE-Sepharose柱上的陰離子交換層析純化HES-修飾后的G-CSF和作為對比的未修飾G-CSF，并用所述的AKTAexplorer10系統(tǒng)在室溫下通過陰離子交換層析分析。將HES化之前或之后的G-CSF等份用超濾法在所述緩沖液A(10mM磷酸鈉，pH7.2)中透析，或用約13倍體積的緩沖液A稀釋。使用5.0倍柱容積(CV)的6.5M胍/HCl、5.0CV緩沖液A、5.0CV緩沖液C(1.5MNaCl在10mM磷酸鈉中，pH7.2)，然后使用10CV緩沖液A使含2mLDEAE-Sepharose(DEAE-SepharoseCL-6B，PharmaciaKat.Nr.17-0710-01)的柱再生。然后按0.6ml/min的流速注入樣品(0.8-4.5mL在10mM磷酸鈉緩沖液pH7.2中)。根據(jù)所加的樣品，用10mL(2mL樣品環(huán)管)或20mL(5mL樣品環(huán)管)的緩沖液A洗滌該樣品環(huán)管，然后進一步用0-22CV的緩沖液A(流速＝0.8ml/min)進一步洗滌該柱。用超過5CV的從0％到100％緩沖液B的線性梯度洗脫，用2.5CV的100％緩沖液B按流速0.6ml/min進行等度過柱。用5CV的緩沖液A使該柱再平衡，并如上所述按流速1ml/min使該柱再生。如果需要，用Vivaspin濃縮器濃縮樣品，并如上所述進行緩沖液更換，在用0.2μm過濾單元(Corning，Cat.No.431215)過濾除菌之前或之后將樣品在0-8℃貯存在10mM乙酸鈉緩沖液pH4.0中。制備下列樣品用于體外生物測定和用于進一步的分析。按照下列B1部分所述確定蛋白質濃度I.0401-15/A33，0.44mg/mL，體積＝500μlG-CSF(大腸桿菌)II.0401-13/A32，0.28mg/mL，體積＝900μlHES-修飾的G-CSF(大腸桿菌)III.0401-28/A58，0.60mg/mL，體積＝350μlNeupogenIV.0401-28/A57，0.50mg/mL，體積＝400μlNeulastaB.分析分析等分樣品的蛋白質含量和修飾。1.用RP-HPLC進行G-CSF蛋白質定量用未修飾的蛋白質(濃度0.453mg/mL)作為標準品對樣品的G-CSF蛋白質含量進行定量。使用的是DionexHPLC系統(tǒng)，包括泵P680AHPG，脫氣單元DegasysDG1210，自動采樣器和注射器ASI-100，樣品環(huán)管250μl，與裝有軟件Chromeleon層析管理系統(tǒng)的UV/Vis-DetektorUVD170U連接的恒溫柱部分TCC100。使用前置柱CC8/4Nucleosil120-5C4，Macherey-Nagel，Cat.No.721889，和分離柱40C-4NucleosilMPN，5μm，125×4mmRP-柱(Macherey-Nagel，編號No.720045.40)。溶劑A是H2O加0.06％(v/v)三氟乙酸，溶劑B是90％乙腈水溶液，其包含0.06％(v/v)三氟乙酸；流速1ml/min。在214，221，260和280nm波長下進行UV檢測。將約10-20μg樣品注入到RP-HPLC柱中。采用下列梯度0-5分鐘0-10％B-17分鐘10-45％B-35分鐘45-80％B-36分鐘80-100％B-38分鐘100％B-39分鐘10％B-45分鐘10％B采用在標準G-CSF制劑的洗脫位置處得到的波峰面積，并通過比較在約29分鐘在280nm波長下所得波峰與參考標準品進行比較。2.G-CSF蛋白質的還原+羧酰氨甲基化取G-CSF蛋白質樣品等份，如文獻(GuillerminaForno，MarielaBollatiFogolin，MarcosOggero，RicardoKratje，MarinaEtcheverrigaray，HaraldS.Conradt，ManfredNimtz(2004)N-andO-linkedcarbohydratesandglycosylationsiteoccupancyinrecombinanthumangranulocyte-macrophagecolony-stimulatingfactorsecretedbyaChinesehamsterovarycellline(中國倉鼠卵巢細胞系分泌的重組人粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子中N-及O-連接的糖和糖基化位點占據(jù))；EuropeanJ.Biochem，273(5)，907-919)所述進行還原和羧酰氨甲基化。羧酰氨甲基化反應產生修飾的半胱氨酸殘基。羧酰氨甲基化的蛋白質在含1M尿素、pH7.8的25mMNH4HCO3中以0.2∶10的酶/底物比進行內切蛋白酶Glu-C消化，共18-24小時。3.通過RP-HPLC分離內切-Glu-C肽內切-Glu-C消化產生的肽在DionexHPLC系統(tǒng)中分離，該系統(tǒng)包括泵P680AHPG，脫氣單元DegasysDG1210，自動采樣器和注射器ASI-100，樣品環(huán)管250μl，與裝有軟件Chromeleon層析管理系統(tǒng)的UV/Vis-DetektorUVD170U連接的恒溫柱部分TCC100。使用前置柱CC8/4Nucleosil120-5C4，Macherey-Nagel，Cat.No.721889，和分離柱40C-4NucleosilMPN，5μm，125×4mmRP-柱(Macherey-Nagel，編號No.720045.40)。溶劑A是H2O加0.06％(v/v)三氟乙酸，溶劑B是90％乙腈水溶液，其包含0.06％(v/v)三氟乙酸；流速1ml/min。采用下列的梯度0-5分鐘10％B-17分鐘45％B-65分鐘100％B-67分鐘100％B-69分鐘10％B-75分鐘10％B在214，221，260和280nm波長下進行UV檢測。內切-Glu-C消化產生的肽是可分離的(未顯示數(shù)據(jù))。4.通過基質輔助激光解吸/電離飛行時間質譜法(MALDI/TOF/TOF-MS)分析蛋白質水解的肽采用質譜法檢測所制備的不同樣品中G-CSF的完整N-末端。還原且羧酰氨甲基化的蛋白質樣品經內切蛋白酶Glu-C消化產生的樣品(3-5μg)直接用于MS-分析(不包括步驟3的RP-HPLC)，采用含C18反相物質的ZipTip吸管尖端，根據(jù)制造商的說明進行純化。用0.1％(v/v)苯甲酸洗滌后，以10μl0.1％(v/v)甲酸在60％(v/v)乙腈中的溶液進行肽的洗脫。蛋白質水解(內切Glu-C)的肽片段用BrukerULTRAFLEX飛行時間(TOF/TOF)儀器以線性正離子模式進行分析，采用22.4mg3，5-二甲氧基-4-羥基-肉桂酸在400μl乙腈和600μl0.1％(v/v)三氟乙酸水溶液中的溶液作為基質；并采用含19mgα-氰基-4-羥基肉桂酸在相同溶劑混合物中的溶液作為基質，使用反射器(reflectron)加強解析度，測定(糖基)-肽。取1μl濃度約1-10pmol-μl-1的樣品溶液與等量各基質混合。將混合物點樣在不銹鋼靶上，在室溫下干燥后進行分析。在質量范圍900-5000道爾頓下紀錄質譜。下表將預期質量與各自G-CSF肽進行了關聯(lián)。表由G-CSF產生的內切-Glu-C肽的理論(單同位素)質量半胱氨酸殘基被羧酰氨甲基化；在未修飾的G-CSF的MALDI/TOF圖譜上探測標記為脂肪的肽。在用如上所述的內切-Glu-C蛋白水解處理G-CSF后，包括蛋白質位點1-20的N-末端內切-Glu-C肽(MTPLGPASSLPQSFLLKCLE；m/z2189.1)在樣品的MALDI/TOF-MS圖譜上檢測。結果I.G-CSF和HES修飾的變體的純化用如A4所述的DEAE-SepharoseCL-6B柱來純化HES-修飾的G-CSF和未修飾的G-CSF。對于未修飾的樣品0401-15/A33，流過液在280nm沒有檢測到顯著的吸收，用體積6mL的40-50％緩沖液B(0.16-0.20MNaCl)洗脫的蛋白質在280nm處的特定波峰面積為660mAU×mL×mg-1。樣品(HES-修飾的G-CSF)用體積為12mL的緩沖液B，按20-80％(0.08-0.32MNaCl)的較大梯度范圍洗脫。在280nm處，在流過液中檢測到約90％的總波峰面積，其中包含約50％的總蛋白質，通過如圖13所示的SDS-PAGE分析進行檢測，其分子量顯然略高于洗脫的蛋白質。蛋白質的回收率是根據(jù)洗脫級分的波峰面積(A280nm)與未修飾的G-CSF蛋白質相比來計算的。表1.280nm下檢測的波峰面積的比較**蛋白質的RP-HPLC定量證實了該結果。II.用內切蛋白酶Glu-C處理后的肽圖譜和MALDI/TOFMS進行蛋白質分析通過對羧酰氨甲基化未修飾的G-CSF(附圖14)和市售品Neupogen(未顯示數(shù)據(jù))進行內切蛋白酶Glu-C消化得到的N-末端肽可以用MALDI/TOF-MS清楚地檢測出來(MTPLGPASSLPQSFLLKC*LE，m/z2189.1；半胱氨酸被羧酰氨甲基化)。該信號在HES-修飾的樣品(附圖15)和Neulasta(未顯示數(shù)據(jù))中是不存在的，表明該肽被修飾。HES修飾的G-CSF的N-末端序列測定顯示其N-末端已封閉，提示該蛋白質衍生物的N-末端甲硫氨基殘基被HAS衍生物修飾。參考文獻GuillerminaFomo，MarielaBollatiFogolin，MarcosOggero，RicardoKratje，MarinaEtcheverrigaray，HaraldS.Conradt，ManfredNimtz(2004)N-andO-linkedcarbohydratesandglycosylationsiteoccupancyinrecombinanthumangranulocyte-macrophagecolony-stimulatingfactorsecretedbyaChinesehamsterovarycellline(中國倉鼠卵巢細胞系分泌的重組人粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子中N-及O-連接的糖和糖基化位點占據(jù))Eur.J.Biochem，271(5)，907-919Nimtz，M.，Grabenhorst，E.，Conradt，H.S.，Sanz，L.和Calvete，J.J.(1999)StructuralcharacterizationoftheoligosaccharidechainsofnativeandcrystallizedboarseminalplasmaspermadhesinPSP-IandPSP-IIglycoforms(天然和結晶豬精漿精粘附蛋白PSP-I和PSP-II糖形的寡糖鏈的結構表征).Eur.J.Biochem.265，703-718。Nimtz，M.，Martin，W.，Wray，V.，Koppel，K.-D.，Agustin，J.和Conradt，H.S.(1993)StructuresofsialylatedoligosaccharidesofhumanerythropoietinexpressedinrecombinantBHK-21cells(重組BHK-21細胞中表達的人紅細胞生成素的唾液酸化寡糖的結構).EurJ.Biochem.213，39-56Nimtz，M.，NollG.，Paques，E.和Conradt，H.S.(1990)CarbohydratestructuresofhumantissueplasminogenactivatorvariantexpressedinrecombinantChinesehamsterovarycells(在重組中國倉鼠卵巢細胞中表達的人組織纖溶酶原激活物變體的糖結構).FEBSLett.271，14-18。Schroter，S.，Derr，P.，Conradt，H.S.，Nimtz，M.，Hale，G.和Kirchhoff，C.(1999)Male-specificmodificationofhumanCD52(人CD52的雄性特異性修飾).J.Biol.Chem.274，29862-29873E.Grabenhorst和H.S.Conradt(1999)TheCytoplasmic，TransmembraneandtheStemRegionsofGlycosyltransferasesspecifytheirinvivofunctionalsublocalizationandstabilityintheGolgi(糖基轉移酶的胞質、跨膜和干區(qū)決定了其體內功能亞定位和在高爾基體內的穩(wěn)定性)J.Biol.Chem.，274，36107-36116E.Grabenhorst，A.Hoffmann，M.Nimtz，G.ZettlmeiBI和H.S.Conradt(1995)ConstructionofstableBHK-21cellscoexpressinghumansecretoryglycoproteinsandhumanGalβ1-4GlcNAc-R2，6-sialyltransferase2，6-linkedNeuAcispreferablyattachedtotheGal1-4GlcNAcβ1-2Manβ1-3-branchofbiantennaryoligosaccharidesfromsecretedrecombinant-traceprotein(共表達人分泌型糖蛋白和人Galβ1-4GlcNAc-R2，6-唾液酸轉移酶的穩(wěn)定BHK-21細胞的構建2，6-連接的NeuAc優(yōu)選連接到來自分泌重組痕量蛋白的二觸角寡糖的Gal1-4GlcNAcβ1-2Manβ1-3-分支上).Eur.J.Biochem.，232，718-725實施例4在實施例2.5中得到的并根據(jù)實施例3純化的G-CSF-偶聯(lián)物的體外結果G-CSF變體對小鼠NFS-60細胞的有絲分裂原性已知G-CSF對嗜中性粒細胞系的造血細胞的增殖、分化和活化具有特定影響。采用小鼠NFS-60細胞(N.Shirafuji等，Exp.Hematol.1989，17，116-119)測試G-CSF變體的促有絲分裂能力。該細胞在含有5-10％WEHI-3B(DSMZ，Braunschweig，D；如DSMZ所述進行培養(yǎng))條件培養(yǎng)基作為外源性IL-3來源的含10％胎牛血清的RPMI培養(yǎng)基(GibcoINVITROGENGmbH，Karlsruhe，D)中生長，離心收集，洗滌，在24-孔板中按每孔100,000個細胞等分。將細胞在不含WEHI-3B條件培養(yǎng)基的RPMI培養(yǎng)基中37℃適應1小時，然后添加用相同的培養(yǎng)基稀釋的G-CSF生長因子樣品。在37℃下，將NFS-60細胞暴露于純化的G-CSF變體3天，然后電子計數(shù)(CasyTT細胞計數(shù)器，SchrfeSystem，Reutlingen，D)細胞數(shù)。結果如附圖12所示。如附圖12所示，與未添加生長因子的培養(yǎng)基相比，不同G-CSF變體(0.5-50pg/mL)可在3天后刺激細胞數(shù)增加。未修飾的對照蛋白質G-CSF/A33和G-CSF/A58對細胞的刺激程度非常類似(ED50＝5-10pg/mL)，而G-CSF偶聯(lián)物G-CSF/A32和G-CSF/A57比未修飾型只顯示活性稍微降低(ED50＝10-25pg/mL)。實施例5通過還原氨基化作用合成的A1AT(α1AT，α1aT)偶聯(lián)物實施例5.1由氧化的HES合成氨基-HES(A)取6.09g氧代-HES(MW＝57,000kD，DS＝0.76，SupramolParenteralColloidsGmbH，Rosbach-Rodheim，D，根據(jù)DE19628705A1制備)在80℃真空加熱過夜，在氮氣下溶解于32mL干燥二甲亞砜(Fluka，Sigma-AldrichChemieGmbH，Taufkirchen，D)中，加入1.22mL1，4-二氨基丁烷(Fluka，Sigma-AldrichChemieGmbH，Taufkirchen，D)。在40℃攪拌17小時后，將反應混合物加入到150mL冰冷的丙酮和乙醇1∶1(v/v)的混合物中。在4℃離心收集沉淀產物，用40mL冰冷的丙酮和乙醇1∶1(v/v)的混合物洗滌，并離心收集。將粗產品溶解于80mL水中，在水中透析4天(SnakeSkin透析管，阻斷值3.5kD，PerbioSciencesDeutschlandGmbH，Bonn，D)并凍干。分離產物的收率為82％。實施例5.2由實施例5.1的氨基-HES(A)合成醛基-HES(A)取125mg4-甲?；郊姿岷?74mg1-羥基-1H-苯并三唑(均來自Aldrich，Sigma-AldrichChemieGmbH，Taufkirchen，D)溶于38mLN，N-二甲基甲酰胺(肽合成級，Biosolve，Valkenswaard，NL)，加入155μlN，N′-二異丙基碳二亞胺(Fluka，Sigma-AldrichChemieGmbH，Taufkirchen，D)。在21℃培養(yǎng)30分鐘后，加入3.8g氨基-HES(A)(如實施例5.1所述制備)。在22℃振蕩19小時后，把反應混合物加入到160mL冰冷的丙酮和乙醇1∶1(v/v)混合物中。在4℃下離心收集沉淀產物，再溶解于20mLN，N-二甲基甲酰胺中，如實施例5.1所述用80mL冰冷的丙酮和乙醇1∶1(v/v)混合物沉淀。在離心后，將沉淀物溶解于50mL水中，在水中透析2天(SnakeSkin透析管，阻斷值3.5kD，PerbioSciencesDeutschlandGmbH，Bonn，D)并凍干。分離產物的收率為77％。實施例5.3由氧化的HES合成氨基-HES(B)取10g氧代-HES(MW＝57,000kD，DS＝0.76，SupramolParenteralColloidsGmbH，Rosbach-Rodheim，D，根據(jù)DE19628705A1制備)在80℃真空加熱過夜，在氮氣下溶解于52mL干燥二甲亞砜(Fluka，Sigma-AldrichChemieGmbH，Taufkirchen，D)中，加入2mL1，4-二氨基丁烷(Fluka，Sigma-AldrichChemieGmbH，Taufkirchen，D)。在40℃攪拌17小時后，將反應混合物加入到350mL冰冷的2-丙醇(CarlRothGmbH+Co.KG，Karlsruhe，D)中。在4℃離心收集沉淀產物，用80mL冰冷的2-丙醇洗滌，并離心收集。將粗產品溶解于80mL水中，在水中透析2天(SnakeSkin透析管，阻斷值3.5kD，PerbioSciencesDeutschlandGmbH，Bonn，D)并凍干。分離產物的收率為85％。實施例5.4由實施例5.3的氨基-HES(B)合成醛基-HES(B)取153mg4-甲酰基苯甲酸和241mg1-羥基-1H-苯并三唑(均來自Aldrich，Sigma-AldrichChemieGmbH，Taufkirchen，D)溶于51mLN，N-二甲基甲酰胺(肽合成級，Biosolve，Valkenswaard，NL)，加入170μlN，N′-二異丙基碳二亞胺(Fluka，Sigma-AldrichChemieGmbH，Taufkirchen，D)。在21℃培養(yǎng)30分鐘后，加入5.1g氨基-HES(B)(如實施例5.3所述制備)。在22℃振蕩16小時后，把反應混合物加入到360mL冰冷的丙酮和乙醇1∶1(v/v)混合物中。在4℃下離心收集沉淀產物，再溶解于50mL水中，如實施例5.1所述用360mL冰冷的丙酮和乙醇1∶1(v/v)混合物沉淀。在離心后，將沉淀物溶解于50mL水中，在水中透析2天(SnakeSkin透析管，阻斷值3.5kD，PerbioSciencesDeutschlandGmbH，Bonn，D)并凍干。分離產物的收率為87％。實施例5.5醛基-HES(A)和(B)與A1AT通過還原氨基化作用偶聯(lián)取189mg醛基-HES(B)(如實施例5.4所述制備)和172mg醛基-HES(A)(如實施例5.2所述制備)的混合物溶解于2.88mL反應緩沖液(0.1M磷酸鈉緩沖液，150mM氯化鈉，pH7.2)中。在20℃，加入1.67mL60mM氰基硼氫化鈉溶液在相同緩沖液中的溶液，然后加入0.455mLA1AT溶液(c(A1AT)＝11.0mg/mL，在20mM磷酸鈉緩沖液，150mM氯化鈉，pH7.2中，A1AT＝rhA1AT，由GTCBiotherapeuticsInc.，F(xiàn)ramingham，MA提供，lotNo.080604A)。在20℃溫育該混合物。17小時后，加入溶解于200μl反應緩沖液中的另外的6.7mg氰基硼氫化鈉，在相同溫度下將該混合物再溫育24小時。在總共溫育25小時后，用凝膠電泳分析10μl該溶液(見附圖16)。實施例5.6HES與A1AT通過還原氨基化作用偶聯(lián)(對比反應)取362mgHES(MW＝56,000kD，DS＝0.41，SupramolParenteralColloidsGmbH，Rosbach-Rodheim，D)溶解于2.88mL反應緩沖液(0.1M磷酸鈉緩沖液，150mM氯化鈉，pH7.2)中。在20℃，加入1.67mL60mM氰基硼氫化鈉溶液在相同緩沖液中的溶液，然后加入0.455mLA1AT溶液(c(A1AT)＝11.0mg/mL，在20mM磷酸鈉緩沖液，150mM氯化鈉，pH7.2中，α1AT＝rhα1AT，由GTCBiotherapeuticsInc.，F(xiàn)ramingham，MA提供，lotNo.080604A)。在20℃溫育該混合物。17小時后，加入溶解于200μl反應緩沖液中的另外的6.7mg氰基硼氫化鈉，在相同溫度下將該混合物再溫育24小時。在總共溫育25小時后，用凝膠電泳分析10μl該溶液(見附圖17)。實施例5.7用離子交換層析法(IEC)純化HES-A1AT偶聯(lián)物可以用AKTA-Explorer層析系統(tǒng)在HiTrapQHP柱上(均來自AmershamBiosciences)通過離子交換層析來純化A1AT的偶聯(lián)物。該純化可以根據(jù)在″Chen，Hammond，Lang和Lebing，Purificationofα1ProteinaseInhibitorfromHumanPlasmaFractionIV-1byIonExchangeChromatography(通過離子交換層析從人血漿組分IV-1中純化α1蛋白酶抑制劑)，VoxSanguinis1998，74，232-241″中所述的從人血漿中分離A1AT的方法來進行。樣品制劑在與AKTA-Explorer層析系統(tǒng)組合的HiPrep26/10脫鹽柱(AmershamBiosciences)上更換緩沖液，使用20mM磷酸鈉，20mM氯化鈉，pH8作為洗脫液。用脫鹽的水稀釋粗制反應混合物(如實施例5.5制備，約5mL)后進行緩沖液更換，使最終體積為10mL，使用如下參數(shù)柱HiPrep26/10脫鹽柱流速10ml/min洗脫液20mM磷酸鈉，20mM氯化鈉，pH8樣品體積10mL洗脫液分級分離2.5mL平衡5倍柱體積洗脫長度2倍柱體積將最先的14mL洗脫液混合，然后加入結合緩沖液，最終體積達到20mL。用IEC純化該包含約5mg蛋白質的該溶液，使用如下參數(shù)柱HiTrapQHP1mL流速1ml/min結合緩沖液(BB)20mM磷酸鈉，20mM氯化鈉，pH8洗脫緩沖液(EB)20mM磷酸鈉，1M氯化鈉，pH8樣品體積20mL流過液分級分離2mL洗脫液分級分離1mL起始濃度EB0％平衡5倍柱體積洗脫非結合樣品15mL靶濃度EB15％洗脫長度20mL用SDS-Page來分析層析后收集的級分。混合包含HES-A1AT偶聯(lián)物的級分(相應于B1-B6級分，洗脫體積為40到47mL，見附圖17)。在一些混合級分中，檢測到了少量的未反應的A1AT。層析后混合級分的起始濃度可以用A1AT(由GTCBiotherapeuticsInc.，F(xiàn)ramingham，MA提供，lotNo.080604A)作為參照標準品通過BCA(PierceCat.No.23225)來測定，為170μg/mL。在稀釋和緩沖液更換為20mM磷酸鈉，150mM氯化鈉，pH7.2中以后，所得到的蛋白質濃度為54.5μg/mL(BCA(Pierce，A1AT來自GTCBiothearpeuticsInc.，F(xiàn)ramingham，MA，lotNo.080604A(作為參照標準品))。最終的溶液用于確定該偶聯(lián)物的抑制效能。實施例5.8確定HES-A1AT偶聯(lián)物對于人粒細胞彈性酶的體外抑制效能偶聯(lián)物的彈性酶抑制活性測定是根據(jù)Castillo等，Anal.Biochem.1979，99，53-64，用Sunrise型TecanUV-VIS-讀板器進行的。該測定是基于由彈性酶催化的對-硝基苯胺從N-Met-O-琥珀酰基-Ala-Ala-Pro-Val-p-NO2-苯胺中的釋放。該分解會導致在405nm處吸光度增加。開始的水解速率與該酶的活性密切相關。在沒有和存在不同濃度的該受試抑制劑的情況下進行測定。根據(jù)受試物質的抑制活性，酶活性的降低用A405相對于時間的曲線的斜率降低來表示。用抑制曲線的斜率除以未抑制曲線的斜率得出在一定抑制劑濃度下殘留的彈性酶活性。殘留的酶活性和抑制劑濃度具有線性相關。通過線性回歸，可以得到線性的平滑直線，這樣就可以計算出在給定抑制劑濃度時的殘留酶活性。用這種方法，可以比較不同抑制劑在相同濃度時的抑制活性(＝1-殘留的酶活性)(見附圖18)。使用下列的參數(shù)底物濃度1.5mM彈性酶活性7.5mU波長405nm溫度20℃時間間隔15s動態(tài)循環(huán)25測量形式中心測定溶液由300μl緩沖液(0.1MHepes，0.5MNaCl，0.05％(m/v)TritonX-100，pH7.5)組成，該緩沖液包含10％DMSO，1.5mMN-Met-O-琥珀?；?Ala-A1a-Pro-Val-p-NO2-苯胺，7.5mU彈性酶和不同量的抑制劑。彈性酶購自ServaElectrophoresisGmbH，Heidelberg。所有其它的物質購自SigmaAldrich，Taufkirchen。用A1AT(GTCBiotherapeuticsInc.，F(xiàn)ramingham，MA，lotNo.080604A)作為偶聯(lián)的起始物，與作為參照物的ProlastineHS(BayerVitalGmbH，Leverkusen，Germany，LotNo.PR4HA43)通過比較來測定如實施例5.5所述合成的偶聯(lián)物的抑制活性。附圖18給出了殘留的酶活性相對于時間的曲線。所有曲線的線性為R2＞0.98。在下文中，給出的是c(抑制劑)＝1μg/mL時的IC50-值和彈性酶抑制作用，及起始物和偶聯(lián)物相對于參照物的抑制活性。在下表中列出的數(shù)據(jù)清楚地表明，在與HES偶聯(lián)后A1AT保留了大部分的活性。實施例5.8的表實施例5.9與rhα1AT和來自血漿的hα1AT相比較，確定HES-rhα1AT偶聯(lián)物的體內半衰期利用8-10周大的雌性小鼠(BALB/cOlaHsd，HarlanGmbH，Borchen，Germany)作為受試生物(42只小鼠，每個樣品14只)。僅在施用不同的樣品溶液前，測定每只動物的“原體重”。將100μL50μg/mL下述樣品在緩沖液pH＝7.2(20mmol磷酸鈉，150mmol氯化鈉)中的溶液靜脈注射到小鼠的尾靜脈中。樣品1rhα1AT(GTCBiotherapeuticsInc.，F(xiàn)ramingham，MA，lotNo.080604A)樣品2如實施例5.5制備的rhα1AT-HES偶聯(lián)物樣品3來自血漿的hαAT(SERVAElectrophoresisGmbH，Heidelberg，Germany)在注射后1，2，4，10，24，31.5，48小時，殺死每組中的兩只小鼠，從該動物的心臟中取出全血樣品(～500μl)。用Microvette500Z-Gel(Sarstedt，Numbrecht，Germany)制備血清。把血清樣品貯存在-80℃，直至開始測定α1AT的濃度。用商業(yè)可用的α1AT-ELISA(Immundiagnostik，Bensheim，Germany)根據(jù)制造商的說明書測定α1AT濃度。所得到的結果表明，與未修飾的rhα1AT起始物相比，rhα1AT-HES偶聯(lián)物的血漿半衰期顯著地增加。根據(jù)下表，所測定的偶聯(lián)物半衰期與來自血漿的hα1AT的范圍相同。實施例5.9的表樣品1-3的血漿半衰期實施例6G-CSF-偶聯(lián)物的合成實施例6.1醛基-HES衍生物的合成實施例6.1(a)氨基HES10/0.4的合成取5.12g氧代-HES10/0.4(MW＝14,500D，DS＝0.41，SupramolParenteralColloidsGmbH，Rosbach-Rodheim，D；根據(jù)DE19628705A1制備)在80℃真空加熱過夜，在氮氣下溶解于25mL干燥二甲亞砜(Fluka，Sigma-AldrichChemieGmbH，Taufkirchen，D)中，加入5.13mL1，4-二氨基丁烷。在40℃攪拌17小時后，將反應混合物加入到150mL冰冷的丙酮和乙醇1∶1(v/v)的混合物中。在4℃離心收集沉淀產物，用40mL冰冷的丙酮和乙醇1∶1(v/v)的混合物洗滌，并離心收集。將粗產品溶解于80mL水中，在水中透析4天(SnakeSkin透析管，阻斷值3.5kD，PerbioSciencesDeutschlandGmbH，Bonn，D)并凍干。分離產物的收率為67％。實施例6.1(b)醛基HES10/0.4的合成取105mg4-甲?；郊姿岷?35mg1-羥基-1H-苯并三唑(均來自Aldrich，Sigma-AldrichChemieGmbH，Taufkirchen，D)溶于7mLN，N-二甲基甲酰胺(肽合成級，Biosolve，Valkenswaard，NL)，加入135μlN，N′-二異丙基碳二亞胺(Fluka，Sigma-AldrichChemieGmbH，Taufkirchen，D)。在21℃溫育30分鐘后，加入0.7g氨基HES10/0.4(如實施例6.1(a)所述合成)。在22℃振蕩18小時后，把反應混合物加入到42mL冰冷的丙酮和乙醇1∶1(v/v)混合物中。在4℃下離心收集沉淀產物，再溶解于5mLDMF中，并如上所述在42mL乙醇/丙酮中沉淀。離心分離后，把收集的沉淀物溶解于水中，在水中透析1天(SnakeSkin透析管，阻斷值3.5kD，PerbioSciencesDeutschlandGmbH，Bonn，D)并凍干。分離產物的收率為95％。實施例6.1(c)氨基HES10/0.7的合成取6.02g氧代-HES10/0.7(MW＝15,000D，DS＝0.76，SupramolParenteralColloidsGmbH，Rosbach-Rodheim，D；根據(jù)DE19628705A1制備)在氮氣下溶解于32mL干燥二甲亞砜(Fluka，Sigma-AldrichChemieGmbH，Taufkirchen，D)中，加入6.03mL1，4-二氨基丁烷。在40℃攪拌17小時后，將反應混合物加入到150mL冰冷的丙酮和乙醇1∶1(v/v)的混合物中。在4℃離心收集沉淀產物，用40mL冰冷的丙酮和乙醇1∶1(v/v)的混合物洗滌，并離心收集。將粗產品溶解于80mL水中，在水中透析4天(SnakeSkin透析管，阻斷值3.5kD，PerbioSciencesDeutschlandGmbH，Bonn，D)并凍干。分離產物的收率為52％。實施例6.1(d)醛基HES10/0.7的合成取150mg4-甲?；郊姿岷?30mg1-羥基-1H-苯并三唑(均來自Aldrich，Sigma-AldrichChemieGmbH，Taufkirchen，D)溶于10mLN，N-二甲基甲酰胺(肽合成級，Biosolve，Valkenswaard，NL)，加入204μlN，N′-二異丙基碳二亞胺(Fluka，Sigma-AldrichChemieGmbH，Taufkirchen，D)。在21℃溫育30分鐘后，加入1g氨基HES10/0.7(如實施例6.1(c)所述合成)。在22℃振蕩19小時后，把反應混合物加入到84mL冰冷的2-丙醇中。在4℃下離心收集沉淀產物，再溶解于50mL水中，在水中透析2天(SnakeSkin透析管，阻斷值3.5kD，PerbioSciencesDeutschlandGmbH，Bonn，D)并凍干。分離產物的收率為83％。實施例6.1(e)氨基HES30/0.4的合成取5g氧代-HES30/0.4(MW＝28,000D，DS＝0.41，SupramolParenteralColloidsGmbH，Rosbach-Rodheim，D；使用根據(jù)DE19628705A1的摩爾比的組分)在80℃真空加熱過夜，在氮氣下溶解于28mL干燥二甲亞砜(Fluka，Sigma-AldrichChemieGmbH，Taufkirchen，D)中，加入1.67mL1，4-二氨基丁烷。在40℃攪拌17小時后，將反應混合物加入到175mL冰冷的丙酮和乙醇1∶1(v/v)的混合物中。在4℃離心收集沉淀產物。將粗產品溶解于40mL水中，在水中透析2天(SnakeSkin透析管，阻斷值3.5kD，PerbioSciencesDeutschlandGmbH，Bonn，D)并凍干。分離產物的收率沒有測定。實施例6.1(f)醛基HES30/0.4的合成取130mg4-甲?；郊姿岷?53mg1-羥基-1H-苯并三唑(均來自Aldrich，Sigma-AldrichChemieGmbH，Taufkirchen，D)溶于36mLN，N-二甲基甲酰胺(肽合成級，Biosolve，Valkenswaard，NL)，加入110μlN，N′-二異丙基碳二亞胺(Fluka，Sigma-AldrichChemieGmbH，Taufkirchen，D)。在21℃溫育30分鐘后，加入2.61g氨基HES30/0.4(如實施例6.1(e)所述合成)。在22℃振蕩22.5小時后，把反應混合物加入到160mL冰冷的丙酮和乙醇1∶1(v/v)混合物中。在4℃下離心收集沉淀產物，并用冰冷的丙酮和乙醇1∶1(v/v)混合物洗滌。離心分離后，把沉淀物溶解于30mL水中，在水中透析1天(SnakeSkin透析管，阻斷值3.5kD，PerbioSciencesDeutschlandGmbH，Bonn，D)并凍干。分離產物的收率為81％。實施例6.1(g)氨基HES30/0.7的合成取5g氧代-HES30/0.7(MW＝31,000D，DS＝0.76，SupramolParenteralColloidsGmbH，Rosbach-Rodheim，D；使用根據(jù)DE19628705A1的組分摩爾比)在80℃真空加熱過夜，在氮氣下溶解于28mL干燥二甲亞砜(Fluka，Sigma-AldrichChemieGmbH，Taufirchen，D)中，加入1.67mL1，4-二氨基丁烷。在40℃攪拌17小時后，將反應混合物加入到175mL冰冷的丙酮和乙醇1∶1(v/v)的混合物中。在4℃離心收集沉淀產物。將粗產品溶解于40mL水中，在水中透析2天(SnakeSkin透析管，阻斷值3.5kD，PerbioSciencesDeutschlandGmbH，Bonn，D)并凍干。分離產物的收率沒有測定。實施例6.1(h)醛基HES30/0.7的合成取122mg4-甲酰基苯甲酸和144mg1-羥基-1H-苯并三唑(均來自Aldrich，Sigma-AldrichChemieGmbH，Taufkirchen，D)溶于34mLN，N-二甲基甲酰胺(肽合成級，Biosolve，Valkenswaard，NL)，加入103μlN，N′-二異丙基碳二亞胺(Fluka，Sigma-AldrichChemieGmbH，Taufkirchen，D)。在21℃溫育30分鐘后，加入2.46g氨基HES30/0.7(如實施例6.1(g)所述合成)。在22℃振蕩22.5小時后，把反應混合物加入到160mL冰冷的丙酮和乙醇1∶1(v/v)混合物中。在4℃下離心收集沉淀產物，并用冰冷的丙酮和乙醇1∶1(v/v)混合物洗滌。離心分離后，把沉淀物溶解于30mL水中，在水中透析1天(SnakeSkin透析管，阻斷值3.5kD，PerbioSciencesDeutschlandGmbH，Bonn，D)并凍干。分離產物的收率為87％。實施例6.1(i)氨基HES50/0.7的合成取6.09g氧代-HES50/0.7(MW＝57,000D，DS＝0.76，SupramolParenteralColloidsGmbH，Rosbach-Rodheim，D；使用根據(jù)DE19628705A1的組分摩爾比)在80℃真空加熱過夜，在氮氣下溶解于32mL干燥二甲亞砜(Fluka，Sigma-AldrichChemieGmbH，Taufkirchen，D)中，加入1.22mL1，4-二氨基丁烷。在40℃攪拌17小時后，將反應混合物加入到150mL冰冷的丙酮和乙醇1∶1(v/v)的混合物中。在4℃離心收集沉淀產物并用40mL冰冷的丙酮和乙醇1∶1(v/v)的混合物洗滌，離心收集。將粗產品溶解于80mL水中，在水中透析4天(SnakeSkin透析管，阻斷值3.5kD，PerbioSciencesDeutschlandGmbH，Bonn，D)并凍干。分離產物的收率為82％。實施例6.1(j)醛基HES50/0.7的合成取125mg4-甲?；郊姿岷?74mg1-羥基-1H-苯并三唑(均來自Aldrich，Sigma-AldrichChemieGmbH，Taufkirchen，D)溶于38mLN，N-二甲基甲酰胺(肽合成級，Biosolve，Valkenswaard，NL)，加入155μlN，N′-二異丙基碳二亞胺(Fluka，Sigma-AldrichChemieGmbH，Taufkirchen，D)。在21℃溫育30分鐘后，加入3.8g氨基HES50/0.7(如實施例6.1(i)所述合成)。在22℃振蕩19小時后，把反應混合物加入到160mL冰冷的丙酮和乙醇1∶1(v/v)混合物中。在4℃下離心收集沉淀產物，并再溶解于20mLN，N-二甲基甲酰胺中，如上所述用80mL冰冷的丙酮和乙醇1∶1(v/v)混合物沉淀。離心分離后，把沉淀物溶解于50mL水中，在水中透析2天(SnakeSkin透析管，阻斷值3.5kD，PerbioSciencesDeutschlandGmbH，Bonn，D)并凍干。分離產物的收率為77％。實施例6.2通過還原氨基化作用合成HES-G-CSF偶聯(lián)物實施例6.2(a)緩沖液更換A用Vivaspin15R濃縮器(VS15RH11，5KDMWCO，VivascienceAG，Hannoyer，D)將33mL在pH4.0的10mM乙酸鈉，50mg/mL山梨醇和0.004％吐溫80中的0.454mg/mL的hG-CSF(純化hG-CSF，具有與商業(yè)品Neupogen基本相同的特性)溶液在0℃滲濾至4mL，并用pH5.0的0.1M乙酸鈉緩沖液再稀釋為15mL。重復滲濾2次。在最后的滲濾步驟中最終濃度為3mg/mL。實施例6.2(b)hG-CSF與實施例6.1(b)、6.1(d)和6.1(j)的醛基HES衍生物反應在緩沖液更換為0.1M乙酸鈉緩沖液，pH5.0(如上文實施例6.2(a)所述)以后，向1.67mL的hG-CSF溶液中加入在相同緩沖液中的1.67mLHES-衍生物的溶液和1.67mL60mM氰基硼氫化鈉溶液，將該溶液在4℃溫育15.5小時。在混合前將所有溶液冷卻到0℃。使用如下的HES最終濃度根據(jù)實施例6.1(b)和6.1(d)制備的HES衍生物為39.4mg/mL。根據(jù)實施例6.1(j)制備的HES衍生物為197mg/mL。作為反應對照的為197mg/mLHES50/0.7(MW＝47,000D，DS＝0.76，SupramolParenteralColloidsGmbH，Rosbach-Rodheim，D)。通過凝膠電泳法分析反應混合物(見附圖19)。實施例6.2(c)緩沖液更換B用Vivaspin15R濃縮器(VS15RH11，5KDMWCO，VivascienceAG，Hannover，D)將20mL在pH4.0的10mM乙酸鈉，50mg/mL山梨醇和0.004％吐溫80中的0.454mg/mL的hG-CSF(純化hG-CSF，具有與商業(yè)品Neupogen基本相同的特性)溶液在15℃滲濾至4mL并用pH5.0的0.1M乙酸鈉緩沖液再稀釋為15mL。重復滲濾2次。在最后的滲濾步驟中最終濃度為1.5mg/mL。實施例6.2(d)hG-CSF與實施例6.1(f))和6.1(h)的醛基HES衍生物反應在緩沖液更換為0.1M乙酸鈉緩沖液，pH5.0(如上文實施例6.2(c)所述)以后，向3.3mL的hG-CSF溶液中加入在相同緩沖液中的3.3mL789mgHES-衍生物的溶液和3.3mL的60mM氰基硼氫化鈉溶液，將該溶液在4℃溫育30小時。在混合前將所有溶液冷卻到0℃。17小時后，從反應對照中移出樣品。通過凝膠電泳法分析反應混合物(見附圖20)。實施例6.3體外測定G-CSF變體對小鼠NFS-60細胞的有絲分裂原性已知G-CSF對嗜中性粒細胞系的造血細胞的增殖、分化和活化作用具有特定影響。用小鼠NFS-60細胞(N.Shirafuji等，Exp.Hematol.1989，17，116-119)測試G-CSF變體的促有絲分裂能力。細胞在含5-10％WEHI-3B(DSMZ，Braunschweig，D；如DSMZ所述培養(yǎng))條件培養(yǎng)基作為外源性IL-3來源的含10％胎牛血清的RPMI培養(yǎng)基(GibcoINVITROGENGmbH，Karlsruhe，D)中生長，離心收集，洗滌，在24-孔板中按每孔100,000個細胞等分。將細胞在不含WEHI-3B條件培養(yǎng)基的RPMI培養(yǎng)基中37℃適應1小時，然后添加用相同的培養(yǎng)基稀釋的G-CSF生長因子樣品。將NFS-60細胞暴露于純化的G-CSF變體(根據(jù)實施例3A1和2純化，根據(jù)實施例3B1進行蛋白質定量)。Neupogen、Neulasta均來自Amgen，如實施例6.2(b)制備的″HES-GCFS10/0.4偶聯(lián)物″，如實施例6.2(b)制備的″HES-GCFS10/0.7偶聯(lián)物″，如實施例6.2(d)制備的″HES-GCFS30/0.4偶聯(lián)物″，如實施例6.2(d)制備的″HES-GCFS30/0.7偶聯(lián)物″如實施例6.2(b)制備的″HES-GCFS50/0.7偶聯(lián)物″，″模擬溫育″(＝反應對照，197mg/mlHES50/0.7，MW47,000D，DS0.76，SupramolParenteralColloidsGmbH，RosbachRodheim，Germany)在37℃下3天，然后電子計數(shù)細胞數(shù)(CasyTT細胞計數(shù)器，ScharfeSystem，Reutlingen，D)。結果如下表和附圖21所示。在所有情況下，下表和附圖21給出的蛋白質的量僅表示偶聯(lián)物中G-CSF的含量。從附圖21中可以看出，與未添加生長因子的培養(yǎng)基相比，所有的不同G-CSF變體(2.5-250pg/ml)都能在3天后刺激細胞數(shù)目增加。所有變體在濃度為250pg/ml時達到相同的最高刺激水平。實施例6.3的表由G-CSF變體誘導的小鼠NFS-60細胞的增殖實施例6.4hG-CSF偶聯(lián)物在大鼠中的體內生物效應大鼠[雄性CRLCD大鼠(7周大)，CharlesriverDeutschlandGmbH，SanghoferWeg7，D-97633Sulzfeld]抵達時，隨即分成每組5只。適應環(huán)境7天后，淘汰狀態(tài)較差的大鼠，換成備用動物。大鼠抵達時的體重為181-203g。每組隨機選出的5只大鼠經靜脈內施用下列未偶聯(lián)或偶聯(lián)的G-CSF樣品(根據(jù)實施例3A1和2純化，根據(jù)實施例3B1進行蛋白質定量)，每公斤體重施用100μg蛋白質(注射速度為15秒/劑量，載體5mlPBS/kg體重)Neupogen、Neulasta均來自Amgen，如實施例6.2(b)制備的″HES-GCFS10/0.4偶聯(lián)物″(10/0.4)，如實施例6.2(b)制備的″HES-GCFS10/0.7偶聯(lián)物″(10/0.7)，如實施例6.2(d)制備的″HES-GCFS30/0.4偶聯(lián)物″(30/0.4)，如實施例6.2(d)制備的″HES-GCFS30/0.7偶聯(lián)物″(30/0.7)，如實施例6.2(b)制備的″HES-GCFS50/0.7偶聯(lián)物″(50/0.7)，″模擬溫育″(＝反應對照，197mg/mlHES50/0.7，MW47,000D，DS0.76，SupramolParenteralColloidsGmbH，RosbachRodheim，Germany)和載體對照(PBS，使用體積5ml/kg體重)。在輕乙醚麻醉下，所有動物從眼球后靜脈叢中抽取約200μlEDTA全血的血樣。在試驗前5天，在早晨對已禁食一夜的所有動物采血一次。在試驗第1至8天，每天采血2次，間隔為12小時。第1天的第一份血樣在施用G-CSF/G-CSF-HES-偶聯(lián)物之前采集。白細胞(WBC)計數(shù)用BayerADVIATM120(Fernwald，Germany)來進行。結果如附圖22所示。實施例6.5測定通過還原氨基化作用(實施例6.2(b))由HES50/0.7和G-CSF制備的偶聯(lián)物的體內半衰期，并與Neupogen和Neulasta(Amgen)作比較使用雌性小鼠BALB/cOlaHsd(HarlanGmbH/Borchen)。在施用的當天，測定動物的重量(19-22g)。在9只小鼠的尾靜脈中按每kg體重100μg的劑量分別靜脈注射如實施例6.2(b)制備的化學修飾的rh-G-CSF樣品，及Neupogen和Neulasta(Amgen)樣品。在注射1，3，6，11，22，30，49，72小時后(見下表)，用含肝素鈉(Hirschmann，Eberstadt)的毛細管從每組3只小鼠的尾部靜脈或眼球后靜脈叢抽取約150μl全血的樣品，并貯存在冰上，直至制備血漿。實施例6.5的表采樣過程的操作將全血在2000g離心10分鐘。把血漿轉移到另外的管中，并在3500g再離心5分鐘。等分后在-80℃下貯存直至分析的當天。按照制造商的說明，使用ELISA(R&DGmbH，Wiesbaden)法來確定血漿樣品中G-CSF的量。結果如附圖36所示，該附圖清楚地表明，與Neupogen相比，根據(jù)本發(fā)明的HES-G-CSF偶聯(lián)物的半衰期有了較大的增加(5.1小時相對于1.2小時)，與Neulasta相比，其具有基本相等的半衰期(5.1小時相對于5.2小時)。實施例7HES和重組hEPO通過還原氨基化作用偶聯(lián)使用重組人EPO，其具有人EPO的氨基酸序列，并與商業(yè)可用的Erypo(OrhtoBiotech，Jansen-Cilag)或NeoRecormon(Roche)具有基本相同的特性，參照EP0148605、EP0205564、EP0411678。實施例7.1氨基-HES的合成取10g氧代-HES(MW＝57,000D，DS＝0.76，SupramolParenteralColloidsGmbH，Rosbach-Rodheim，D；使用根據(jù)DE19628705A1制備)在80℃真空加熱過夜，在氮氣下溶解于53mL干燥二甲亞砜(Fluka，Sigma-AldrichChemieGmbH，Taufkirchen，D)中，加入2mL1，4-二氨基丁烷(Fluka，Sigma-AldrichChemieGmbH，Taufkirchen，D)。在40℃攪拌17小時后，將反應混合物加入到350mL冰冷的2-丙醇(CarlRothGmbH+Co.KG，Karlsruhe，D)中。在4℃離心收集沉淀產物并用80mL冰冷的2-丙醇洗滌，離心收集。將粗產品溶解于80mL水中，在水中透析2天(SnakeSkin透析管，阻斷值3.5kD，PerbioSciencesDeutschlandGmbH，Bonn，D)并凍干。分離產物的收率為85％。實施例7.2醛基-HES的合成取153mg4-甲?；郊姿岷?41mg1-羥基-1H-苯并三唑(均來自Aldrich，Sigma-AldrichChemieGmbH，Taufkirchen，D)溶于51mLN，N-二甲基甲酰胺(肽合成級，Biosolve，Valkenswaard，NL)，加入170μlN，N′-二異丙基碳二亞胺(Fluka，Sigma-AldrichChemieGmbH，Taufkirchen，D)。在21℃溫育30分鐘后，加入5.1g根據(jù)實施例7.1制備的氨基-HES。在22℃振蕩16小時后，把反應混合物加入到360mL冰冷的丙酮和乙醇1∶1(v/v)混合物中。在4℃下離心收集沉淀產物，再溶解于50mL水中，并如上所述在360mL冰冷的丙酮和乙醇1∶1(v/v)混合物中沉淀。離心分離后，把沉淀物溶解于50ml水中，在水中透析2天(SnakeSkin透析管，阻斷值3.5kD，PerbioSciencesDeutschlandGmbH，Bonn，D)并凍干。分離產物的收率為87％。實施例7.3醛基-HES和EPO通過還原氨基化作用偶聯(lián)取625mg根據(jù)實施例7.2制備的醛基-HES溶解于1.67ml反應緩沖液(0.1M乙酸鈉緩沖液，pH5.0)，并冷卻到0℃。加入冷卻到0℃的在相同緩沖液中的1.67mLEPO溶液(3mg/ml)和1.67mL60mM氰基硼氫化鈉溶液，該混合液在0℃下溫育。17小時后在用凝膠電泳分析后，純化該反應混合物(見附圖23，泳道B)。實施例7.4反應對照A在沒有氰基硼氫化鈉時醛基-HES和EPO的反應取313mg根據(jù)實施例7.2制備的醛基-HES溶解于0.83ml反應緩沖液(0.1M乙酸鈉緩沖液，pH5.0)，并冷卻到0℃。加入冷卻到0℃的在相同緩沖液中的0.83mLEPO溶液(3mg/ml)和0.83ml反應緩沖液，在0℃溫育該混合液。17小時后在用凝膠電泳分析后，純化該反應混合物(見附圖23，泳道C)。實施例7.5反應對照BEPO和氰基硼氫化鈉的反應將在反應緩沖液(0.1M乙酸鈉緩沖液，pH5.0)中的0.83mLEPO溶液(3mg/ml)冷卻到0℃，加入冷卻到0℃的在相同緩沖液中的0.83mL60mM氰基硼氫化鈉溶液和0.83ml反應緩沖液，在0℃溫育該混合液。17小時后在用凝膠電泳分析后，純化該反應混合物(見附圖23，泳道D)。實施例7.6用于純化EPO和EPO衍生物的離子交換層析EPO樣品的純化可以在室溫下使用AKTAexplorer10系統(tǒng)(AmershamPharmaciaBiotech)來進行，該系統(tǒng)包括泵P-903，具有0.6ml腔室的混和器M-925，具有10mm流動池的監(jiān)視器UV-900，監(jiān)視器pH/C-900，分段收集器Frac-900，樣品環(huán)管2ml，以及Unicorn軟件版本3.2.1.。用10CV的緩沖液A(20mMN-嗎啉代-丙烷磺酸/NaOH緩沖液，pH8.0)平衡包含5mlQ-SepharoseFastFlow的柱。將EPO樣品按照1∶10的比例用緩沖液A稀釋(并最終把pH調節(jié)為pH7.8-8.2)，并按1ml/min的流速使用樣品泵加樣。用10ml緩沖液A洗滌樣品泵后，進一步按1.0ml/min的流速用6CV的緩沖液A洗滌該柱。隨后按0.8ml/min的流速使用4體積的20mM磷酸鈉，pH6.5緩沖液B，用0-40％緩沖液C(0.5MNaCl在20mM磷酸鈉，pH6，5中)的較陡梯度在37分鐘內洗脫EPO。記錄206，260和280nm處的吸光度來繪制洗脫曲線。在洗脫完成后，用25ml緩沖液C按照1ml/min的流速使柱再生。最后用1MNaOH在該柱上運行60分鐘，并用緩沖液C重恢復，保存至下一次使用。實施例7.7EPO蛋白質測定EOP蛋白質的定量測定是根據(jù)歐洲藥典(EuropeanPharmacopeia4，Monography01/20021316erythropoietinconcentratedsolution(紅細胞生成素濃縮溶液))在1em徑長的杯中測定280nm處的UV吸光度而完成的。此外，可以使用RP-C4柱(VydacProteinC4，Cat.#214TP5410，GraceVydac，Ca，US)通過RP-HPLC法來定量EPO；該HPLC法用紅細胞生成素BRP1參照標準來校準(EuropeanPharmacopeia，Conseildel′EuropeB.P.907-F67029，StrasbourgCedex1)。實施例7.8HES-修飾的EPO生物活性的體內測定根據(jù)歐洲藥典EuropeanPharmacopeia4，Monography01/20021316Erythropoietinconcentratedsolution(紅細胞生成素濃縮溶液)和Ph.Eur.Chapter5.3″StatisticalAnalysisofResultsofBiologicalAssaysandTests(生物測定結果的統(tǒng)計學分析)″所述的方法在紅細胞正常的小鼠系統(tǒng)中進行EPO-生物測定；對于實施例7.3的HES-修飾的EPO，測定到在每mgEPO蛋白質中有418500單位的比活性值，這表明與EPO起始物相比，比活性提高了約4-5倍。該研究的結果如下表所示。實施例7.8的表實施例8通過還原氨基化作用合成HES-IFN-α偶聯(lián)物使用的IFN-α是利用大腸桿菌(E.coli)通過重組DNA技術制得的重組人干擾素α-2b。它包含165個氨基酸并且氨基酸序列與天然的人干擾素α2b(hIFN-α2b)相同。實施例8.1氧代-HES的合成如下所述的在其還原端被氧化的HES(氧代-HES)是如DE19628705A1所述用堿性碘溶液由HES制備而成的，在此將DE19628705A1(實施例A，第9欄，第6到24行)的內容引入本文作為參考。實施例8.2HES衍生物的合成在兩步法中，用胺在實施例8.1的氧代-HES的還原端修飾該化合物，在第二反應中引入醛基。所得到的醛基-HES用于通過實施例8.3所述的還原氨基化作用制備IFN-α-HES偶聯(lián)物。實施例8.2.1從實施例8.1的氧代-HES合成氨基-HES取5.12g實施例8.1的氧代-HES(MW＝14.5kD，DS＝0.41，SupramolParenteralColloidsGmbH，Rosbach-Rodheim，D)在80℃真空加熱過夜，在氮氣下溶解于25mL干燥二甲亞砜(Fluka，Sigma-AldrichChemieGmbH，Taufkirchen，D)中，加入5.13mL1，4-二氨基丁烷。在40℃攪拌17小時后，將反應混合物加入到150mL冰冷的丙酮和乙醇1∶1(v/v)的混合物中。在4℃離心收集沉淀產物，用40mL冰冷的丙酮和乙醇1∶1(v/v)的混合物洗滌，并離心收集。將粗產品溶解于80mL水中，在水中透析4天(SnakeSkin透析管，阻斷值3.5kD，PerbioSciencesDeutschlandGmbH，Bonn，D)并凍干。分離產物的收率為67％。實施例8.2.2從實施例8.2.1的氨基-HES合成醛基-HES取105mg4-甲?；郊姿岷?35mg1-羥基-1H-苯并三唑(均來自Aldrich，Sigma-AldrichChemieGmbH，Taufkirchen，D)溶于7mLN，N-二甲基甲酰胺(肽合成級，Biosolve，Valkenswaard，NL)，加入135μlN，N′-二異丙基碳二亞胺(Fluka，Sigma-AldrichChemieGmbH，Taufkirchen，D)。在21℃溫育30分鐘后，加入0.7g氨基-HES(如實施例8.2.1所述合成)。在22℃振蕩18小時后，把反應混合物加入到42mL冰冷的丙酮和乙醇1∶1(v/v)混合物中。在4℃下離心收集沉淀產物，再溶解于5mLDMF中，并如上所述在42mL乙醇/丙酮中沉淀。離心分離后，把收集的沉淀物溶解于水中，在水中透析4天(SnakeSkin透析管，阻斷值3.5kD，PerbioSciencesDeutschlandGmbH，Bonn，D)并凍干。分離產物的收率為95％。實施例8.2.3從實施例8.1的氧代-HES合成氨基-HES取6.02g實施例8.1的氧代-HES(MW＝14.7kD，DS＝0.76，SupramolParenteralColloidsGmbH，Rosbach-Rodheim，D)在80℃真空加熱過夜，在氮氣下溶解于32mL干燥二甲亞砜(Fluka，Sigma-AldrichChemieGmbH，Taufkirchen，D)中，加入6.03mL1，4-二氨基丁烷。在40℃攪拌17小時后，將反應混合物加入到150mL冰冷的丙酮和乙醇1∶1(v/v)的混合物中。在4℃離心收集沉淀產物，用40mL冰冷的丙酮和乙醇1∶1(v/v)的混合物洗滌，并離心收集。將粗產品溶解于80mL水中，在水中透析4天(SnakeSkin透析管，阻斷值3.5kD，PerbioSciencesDeutschlandGmbH，Bonn，D)并凍干。分離產物的收率為52％。實施例8.2.4從實施例8.2.3的氨基-HES合成醛基-HES取150mg4-甲酰基苯甲酸和230mg1-羥基-1H-苯并三唑(均來自Aldrich，Sigma-AldrichChemieGmbH，Taufkirchen，D)溶于10mLN，N-二甲基甲酰胺(肽合成級，Biosolve，Valkenswaard，NL)，加入204μlN，N′-二異丙基碳二亞胺(Fluka，Sigma-AldrichChemieGmbH，Taufkirchen，D)。在21℃溫育30分鐘后，加入1g氨基HES(如實施例8.2.3所述合成)。在22℃振蕩19小時后，把反應混合物加入到84mL冰冷的2-丙醇中。在4℃下離心收集沉淀產物，再溶解于50mL水中，在水中透析2天(SnakeSkin透析管，阻斷值3.5kD，PerbioSciencesDeutschlandGmbH，Bonn，D)并凍干。分離產物的收率為83％。實施例8.2.5從實施例8.1的氧代-HES合成氨基-HES取5g實施例8.1的氧代-HES(MW＝28kD，DS＝0.41，SupramolParenteralColloidsGmbH，Rosbach-Rodheim，D)在80℃真空加熱過夜，在氮氣下溶解于28mL干燥二甲亞砜(Fluka，Sigma-AldrichChemieGmbH，Taufkirchen，D)中，加入1.67mL1，4-二氨基丁烷。在40℃攪拌17小時后，將反應混合物加入到175mL冰冷的丙酮和乙醇1∶1(v/v)的混合物中。在4℃離心收集沉淀產物。將粗產品溶解于40mL水中，在水中透析2天(SnakeSkin透析管，阻斷值3.5kD，PerbioSciencesDeutschlandGmbH，Bonn，D)并凍干。分離產物的收率沒有測定。實施例8.2.6從實施例8.2.5的氨基-HES合成醛基-HES取130mg4-甲酰基苯甲酸和153mg1-羥基-1H-苯并三唑(均來自Aldrich，Sigma-AldrichChemieGmbH，Taufkirchen，D)溶于36mLN，N-二甲基甲酰胺(肽合成級，Biosolve，Valkenswaard，NL)，加入110μlN，N′-二異丙基碳二亞胺(Fluka，Sigma-AldrichChemieGmbH，Taufkirchen，D)。在21℃溫育30分鐘后，加入2.61g氨基-HES(如實施例8.2.5所述合成)。在22℃振蕩22.5小時后，把反應混合物加入到160mL冰冷的丙酮和乙醇1∶1(v/v)混合物中。在4℃下離心收集沉淀產物，并用冰冷的丙酮和乙醇1∶1(v/v)混合物洗滌。離心分離后，把沉淀物溶解于30mL水中，在水中透析1天(SnakeSkin透析管，阻斷值3.5kD，PerbioSciencesDeutschlandGmbH，Bonn，D)并凍干。分離產物的收率為81％。實施例8.2.7從實施例8.1的氧代-HES合成氨基-HES取5g實施例8.1的氧代-HES(MW＝30.8kD，DS＝0.76，SupramolParenteralColloidsGmbH，Rosbach-Rodheim，D)在80℃真空加熱過夜，在氮氣下溶解于28mL干燥二甲亞砜(Fluka，Sigma-AldrichChemieGmbH，Taufkirchen，D)中，加入1.67mL1，4-二氨基丁烷。在40℃攪拌17小時后，將反應混合物加入到175mL冰冷的丙酮和乙醇1∶1(v/v)的混合物中。在4℃離心收集沉淀產物。將粗產品溶解于40mL水中，在水中透析2天(SnakeSkin透析管，阻斷值3.5kD，PerbioSciencesDeutschlandGmbH，Bonn，D)并凍干。分離產物的收率沒有測定。實施例8.2.8從實施例8.2.7的氨基-HES合成醛基-HES取122mg4-甲?；郊姿岷?44mg1-羥基-1H-苯并三唑(均來自Aldrich，Sigma-AldrichChemieGmbH，Taufirchen，D)溶于34mLN，N-二甲基甲酰胺(肽合成級，Biosolve，Valkenswaard，NL)，加入103μlN，N′-二異丙基碳二亞胺(Fluka，Sigma-AldrichChemieGmbH，Taufkirchen，D)。在21℃溫育30分鐘后，加入2.46g氨基-HES(如實施例8.2.7所述合成)。在22℃振蕩22.5小時后，把反應混合物加入到160mL冰冷的丙酮和乙醇1∶1(v/v)混合物中。在4℃下離心收集沉淀產物，并用冰冷的丙酮和乙醇1∶1(v/v)混合物洗滌。離心分離后，把沉淀物溶解于30mL水中，在水中透析4天(SnakeSkin透析管，阻斷值3.5kD，PerbioSciencesDeutschlandGmbH，Bonn，D)并凍干。分離產物的收率為87％。實施例8.2.9從實施例8.1的氧代-HES合成氨基-HES取10g氧代-HES(MW＝42.1kD，DS＝0.41，SupramolParenteralColloidsGmbH，Rosbach-Rodheim，D)在80℃真空加熱2天，然后在氮氣下溶解于53mL干燥二甲亞砜(Fluka，Sigma-AldrichChemieGmbH，Taufkirchen，D)中，加入2.01mL1，4-二氨基丁烷。在40℃攪拌17小時后，將反應混合物加入到350mL冰冷的2-丙醇(CarlRothGmbH+Co.KG，Karlsruhe，D)中。在4℃離心收集沉淀產物并用80mL冰冷的2-丙醇洗滌，離心收集。將粗產品溶解于80mL水中，在水中透析2天(SnakeSkin透析管，阻斷值3.5kD，PerbioSciencesDeutschlandGmbH，Bonn，D)并凍干。分離產物的收率為76％。實施例8.2.10從實施例8.2.9的氨基-HES合成醛基-HES取900mg4-甲?；郊姿岷?053mg1-羥基-1H-苯并三唑(均來自Aldrich，Sigma-AldrichChemieGmbH，Taufirchen，D)溶于30mLN，N-二甲基甲酰胺(肽合成級，Biosolve，Valkenswaard，NL)，加入930μlN，N′-二異丙基碳二亞胺(Fluka，Sigma-AldrichChemieGmbH，Taufkirchen，D)。在21℃溫育30分鐘后，加入3g氨基-HES(如實施例8.2.9所述合成并溶解于20mLN，N-二甲基甲酰胺中)。在22℃振蕩22.5小時后，把反應混合物加入到210mL冰冷的丙酮和乙醇1∶1(v/v)混合物中。在4℃下離心收集沉淀產物，并用冰冷的丙酮和乙醇1∶1(v/v)混合物洗滌。離心分離后，把沉淀物溶解于30mL水中，在水中透析2天(SnakeSkin透析管，阻斷值3.5kD，PerbioSciencesDeutschlandGmbH，Bonn，D)并凍干。分離產物的收率為97％。實施例8.2.11從實施例8.1(A)的氧代-HES合成氨基-HES取6.09g氧代-HES(MW＝56.8kD，DS＝0.76，SupramolParenteralColloidsGmbH，Rosbach-Rodheim，D)在80℃真空加熱過夜，然后在氮氣下溶解于32mL干燥二甲亞砜(Fluka，Sigma-AldrichChemieGmbH，Taufkirchen，D)中，加入1.22mL1，4-二氨基丁烷。在40℃攪拌17小時后，將反應混合物加入到150mL冰冷的丙酮和乙醇1∶1(v/v)的混合物中。在4℃離心收集沉淀產物并用40mL冰冷的丙酮和乙醇1∶1(v/v)的混合物洗滌，離心收集。將粗產品溶解于80mL水中，在水中透析4天(SnakeSkin透析管，阻斷值3.5kD，PerbioSciencesDeutschlandGmbH，Bonn，D)并凍干。分離產物的收率為82％。實施例8.2.12從實施例8.2.11的氨基-HES合成醛基-HES取125mg4-甲酰基苯甲酸和174mg1-羥基-1H-苯并三唑(均來自Aldrich，Sigma-AldrichChemieGmbH，Taufkirchen，D)溶于38mLN，N-二甲基甲酰胺(肽合成級，Biosolve，Valkenswaard，NL)，加入155μlN，N′-二異丙基碳二亞胺(Fluka，Sigma-AldrichChemieGmbH，Taufkirchen，D)。在21℃溫育30分鐘后，加入3.8g氨基-HES(如實施例8.2.11所述合成)。在22℃振蕩19小時后，把反應混合物加入到160mL冰冷的丙酮和乙醇1∶1(v/v)混合物中。在4℃下離心收集沉淀產物，并再溶解于20mLN，N-二甲基甲酰胺中，用80mL冰冷的丙酮和乙醇1∶1(v/v)混合物沉淀。離心分離后，把沉淀物溶解于50mL水中，在水中透析2天(SnakeSkin透析管，阻斷值3.5kD，PerbioSciencesDeutschlandGmbH，Bonn，D)并凍干。分離產物的收率為77％。實施例8.2.13從實施例8.1(B)的氧代-HES合成氨基-HES取10g氧代-HES(MW＝56.8kD，DS＝0.76，SupramolParenteralColloidsGmbH，Rosbach-Rodheim，D)在80℃真空加熱過夜，然后在氮氣下溶解于53mL干燥二甲亞砜(Fluka，Sigma-AldrichChemieGmbH，Taufkirchen，D)中，加入2mL1，4-二氨基丁烷。在40℃攪拌17小時后，將反應混合物加入到350mL冰冷的2-丙醇(CarlRothGmbH+Co.KG，Karlsruhe，D)中。在4℃離心收集沉淀產物并用80mL冰冷的2-丙醇洗滌，離心收集。將粗產品溶解于80mL水中，在水中透析2天(SnakeSkin透析管，阻斷值3.5kD，PerbioSciencesDeutschlandGmbH，Bonn，D)并凍干。分離產物的收率為85％。實施例8.2.14從實施例8.2.13的氨基-HES合成醛基-HES取153mg4-甲?；郊姿岷?41mg1-羥基-1H-苯并三唑(均來自Aldrich，Sigma-AldrichChemieGmbH，Taufkirchen，D)溶于51mLN，N-二甲基甲酰胺(肽合成級，Biosolve，Valkenswaard，NL)，加入170μlN，N′-二異丙基碳二亞胺(Fluka，Sigma-AldrichChemieGmbH，Taufkirchen，D)。在21℃溫育30分鐘后，加入5.1g氨基-HES(如實施例8.2.13所述合成)。在22℃振蕩16小時后，把反應混合物加入到360mL冰冷的丙酮和乙醇1∶1(v/v)混合物中。在4℃下離心收集沉淀產物，再溶解于50mL水中，如上所述用360mL冰冷的丙酮和乙醇1∶1(v/v)混合物沉淀。離心分離后，把沉淀物溶解于50mL水中，在水中透析2天(SnakeSkin透析管，阻斷值3.5kD，PerbioSciencesDeutschlandGmbH，Bonn，D)并凍干。分離產物的收率為87％。實施例8.2.15從實施例8.1的氧代-HES合成氨基-HES取5.0g氧代-HES(MW＝29.3kD，DS＝0.86，SupramolParenteralColloidsGmbH，Rosbach-Rodheim，D)在80℃真空加熱過夜，然后在氮氣下溶解于20mL干燥二甲亞砜(Fluka，Sigma-AldrichChemieGmbH，Taufkirchen，D)中，加入1.67mL1，4-二氨基丁烷(Fluka，Sigma-AldrichChemieGmbH，Taufkirchen，D)。在40℃攪拌30.5小時后，將反應混合物加入到175mL冰冷的丙酮(CarlRothGmbH+Co.KG，Karlsruhe，D)和乙醇(Sonnenberg，DAB，Braunschweig，D)的1∶1(v/v)混合物中。在4℃離心120分鐘收集沉淀產物，并溶解于40mL水中，在水中透析2天(SnakeSkin透析管，阻斷值10kD，PerbioSciencesDeutschlandGmbH，Bonn，D)并凍干。分離產物的收率為87％。實施例8.2.16從實施例8.2.15的氨基-HES合成醛基-HES取150mg4-甲酰基苯甲酸和230mg1-羥基-1H-苯并三唑(均來自Aldrich，Sigma-AldrichChemieGmbH，Taufkirchen，D)溶于10mLN，N-二甲基甲酰胺(肽合成級，Biosolve，Valkenswaard，NL)，加入166μlN，N′-二異丙基碳二亞胺(Fluka，Sigma-AldrichChemieGmbH，Taufkirchen，D)。在21℃溫育30分鐘后，加入在20mlDMF中的3.02g氨基HES(如實施例8.2.15所述合成)溶液。在22℃振蕩16小時后，把反應混合物加入到215mL冰冷的丙酮(CarlRothGmbH+Co.KG，Karlsruhe，D)和乙醇(Sonnenberg，DAB，Braunschweig，D)的1∶1(v/v)混合物中。在4℃下離心收集沉淀產物，再溶解于20mL水中，并用如上所述的丙酮/乙醇沉淀。離心分離后，把沉淀物溶解于30mL水中，在水中透析2.5天(SnakeSkin透析管，阻斷值10kD，PerbioSciencesDeutschlandGmbH，Bonn，D)并凍干。分離產物的收率為87％。實施例8.2.17從實施例8.1的氧代-HES合成氨基-HES取5.0g氧代-HES(MW＝97.9kD，DS＝0.76，SupramolParenteralColloidsGmbH，Rosbach-Rodheim，D)在80℃真空加熱過夜，然后在氮氣下溶解于20mL干燥二甲亞砜(Fluka，Sigma-AldrichChemieGmbH，Taufkirchen，D)中，加入0.50mL1，4-二氨基丁烷(Fluka，Sigma-AldrichChemieGmbH，Taufkirchen，D)。在40℃攪拌30.5小時后，將反應混合物加入到175mL冰冷的丙酮(CarlRothGmbH+Co.KG，Karlsruhe，D)和乙醇(Sonnenberg，DAB，Braunschweig，D)的1∶1(v/v)混合物中。在4℃離心120分鐘收集沉淀產物，并溶解于40mL水中，在水中透析2天(SnakeSkin透析管，阻斷值10kD，PerbioSciencesDeutschlandGmbH，Bonn，D)并凍干。分離產物的收率為90％。實施例8.2.18從實施例8.2.17的氨基-HES合成醛基-HES取73mg4-甲?；郊姿岷?12mg1-羥基-1H-苯并三唑(均來自Aldrich，Sigma-AldrichChemieGmbH，Taufkirchen，D)溶于10mLN，N-二甲基甲酰胺(肽合成級，Biosolve，Valkenswaard，NL)，加入81.3μlN，N′-二異丙基碳二亞胺(Fluka，Sigma-AldrichChemieGmbH，Taufkirchen，D)。在21℃溫育30分鐘后，加入在20mlDMF中的3.09g氨基HES(如實施例8.2.17所述制備)溶液。在22℃振蕩16小時后，把反應混合物加入到215mL冰冷的丙酮(CarlRothGmbH+Co.KG，Karlsruhe，D)和乙醇(Sonnenberg，DAB，Braunschweig，D)的1∶1(v/v)混合物中。在4℃下離心收集沉淀產物，再溶解于20mL水中，如上所述用丙酮/乙醇沉淀。離心分離后，把沉淀物溶解于30mL水中，在水中透析2.5天(SnakeSkin透析管，阻斷值10kD，PerbioSciencesDeutschlandGmbH，Bonn，D)并凍干。分離產物的收率為96％。實施例8.3通過還原氨基化作用合成IFN-α偶聯(lián)物實施例8.3.1以20μg的規(guī)模與IFN-α偶聯(lián)向溶解于包含150mMNaCl和0.3mMEDTA的0.375ml25mM磷酸鈉緩沖液pH7.5中的0.675mgIFN-α中加入4ml反應緩沖液(0.1M乙酸鈉緩沖液pH5.0)，將該溶液在Vivaspin6濃縮器(VivaScience，5kDMWCO，Hannover，Germany)中按3939xg離心30分鐘。用反應緩沖液把殘留溶液稀釋成6ml并如上所述離心，將該洗滌過程重復兩次。IFN-α溶液的最終體積是0.236ml，相應地經計算IFN-α的最終濃度是2.86mg/ml。該蛋白質濃度沒有通過實驗進行證實。向如上所述制備并冷卻到0℃的7μlIFN-α溶液中，分別加入在相同緩沖液(乙酸鈉，pH5.0)中并冷卻到0℃的10μl(50當量)相應醛基-HES(見下表)溶液和11.3μl60mM氰基硼氫化鈉溶液。將該混合物在0℃溫育17小時。用凝膠電泳分析該反應混合物。下面是所使用的醛基-HES溶液的濃度實施例8.3.1的表偶聯(lián)物的SDS-Page分析如附圖24所示。實施例8.3.2以3mg的規(guī)模與IFN-α偶聯(lián)向溶解于包含150mMNaCl和0.3mMEDTA的25mM磷酸鈉緩沖液pH7.5中的20mgIFN-α中加入8ml反應緩沖液(0.1M乙酸鈉緩沖液pH5.0)，將該溶液在Vivaspin15R濃縮器(VivaScience，5kDMWCO，Hannover，Germany)中按3939xg離心99分鐘。用反應緩沖液把殘留溶液稀釋成18ml并如上所述離心，將該洗滌過程重復兩次。用反應緩沖液把IFN-α溶液稀釋成6.66ml，計算IFN-α的最終濃度是3mg/ml。該蛋白質濃度沒有經實驗進行證實。向如上所述制備并冷卻到0℃的1mlIFN-α溶液中加入在相同緩沖液(乙酸鈉，pH5.0)中并冷卻到0℃的1ml醛基-HES(75當量)溶液和1ml60mM氰基硼氫化鈉溶液。將該混合物在0℃溫育22小時。用凝膠電泳分析該反應混合物后純化該反應混合物。對于在條目G中所述的反應，只使用0.666μl的相應溶液。下面是所使用的醛基-HES溶液的濃度實施例8.3.2的表偶聯(lián)物的SDS-Page分析如附圖25所示。實施例8.3.3以3mg的規(guī)模與IFN-α偶聯(lián)實施例8.3.3.1通過還原氨基化作用將如實施例8.2.16制備的醛基-HES和IFN-α偶聯(lián)向溶解于包含150mMNaCl和0.3mMEDTA的25mM磷酸鈉緩沖液pH7.5中的10mgIFN-α中加入8ml反應緩沖液(0.1M乙酸鈉緩沖液pH5.0)，將該溶液在Vivaspin15R濃縮器(VivaScience，5kDMWCO，Hannover，Germany)中按3939xg離心30分鐘。用反應緩沖液把殘留溶液稀釋成18ml并如上所述離心，將該洗滌過程重復兩次。用反應緩沖液把終IFN-α溶液稀釋成3.33ml，計算IFN-α的最終濃度是3mg/ml。該蛋白質濃度沒有經實驗進行證實。向如上所述制備并冷卻到0℃的1mlIFN-α溶液中加入在相同緩沖液中并冷卻到0℃的1ml如實施例8.2.16制備的醛基-HES(75當量，352mg/ml)溶液和1ml60mM氰基硼氫化鈉溶液。將該混合物在0℃溫育22小時。用凝膠電泳分析該反應混合物后純化該反應混合物。使用XCellSureLockMiniCell(InvitrogenGmbH，Karlsruhe，D)和ConsortE143電源(CONSORTnv，Turnhout，B)進行凝膠電泳。根據(jù)制造商的說明，使用在還原條件下的12％Bis-Tris凝膠和MOPSSDS電泳緩沖液(均來自InvitrogenGmbH，Karlsruhe，D)。實施例8.3.3.2通過還原氨基化作用將如實施例8.2.18制備的醛基-HES和IFN-α偶聯(lián)向如實施例8.3.3.1所述制備并冷卻到0℃的1mlIFN-α溶液中加入在相同緩沖液中并冷卻到0℃的2ml如實施例8.2.18制備的醛基-HES(75當量，369mg/ml)溶液和1.5ml60mM氰基硼氫化鈉溶液。將該混合物在0℃溫育22小時。用凝膠電泳分析該反應混合物后純化該反應混合物。使用XCellSureLockMiniCell(InvitrogenGmbH，Karlsruhe，D)和ConsortE143電源(CONSORTnv，Turnhout，B)進行凝膠電泳。根據(jù)制造商的說明，使用在還原條件下的12％Bis-Tris凝膠和MOPSSDS電泳緩沖液(均來自InvitrogenGmbH，Karlsruhe，D)。實施例8.3.3.3反應對照HES10/0.4(Mw7.6kD；DS＝0.41)和IFN-α通過還原氨基化作用的偶聯(lián)向如實施例8.3.3.1所述制備并冷卻到0℃的1mlIFN-α溶液中加入在相同緩沖液中并冷卻到0℃的1mlHES10/0.4(75當量，117mg/ml)溶液和1ml60mM氰基硼氫化鈉溶液。將該混合物在0℃溫育22小時。用凝膠電泳分析該反應混合物后純化該反應混合物。使用XCellSureLockMiniCell(InvitrogenGmbH，Karlsruhe，D)和ConsortE143電源(CONSORTnv，Turnhout，B)進行凝膠電泳。根據(jù)制造商的說明，使用在還原條件下的12％Bis-Tris凝膠和MOPSSDS電泳緩沖液(均來自InvitrogenGmbH，Karlsruhe，D)。偶聯(lián)物的SDS-Page分析如附圖26所示。實施例8.3.4以16mg的規(guī)模與IFN-α偶聯(lián)如實施例8.3.2所述更換20mgIFN-α溶液的緩沖液。用反應緩沖液把IFN-α終溶液稀釋成6.37ml，經計算IFN-α的最終濃度是3.14mg/ml。用900μl反應緩沖液稀釋100μl上述溶液，以摩爾消光系數(shù)18000為基準，用分光光度計在279nm處測量的蛋白質的濃度為3.01mg/ml。在與確定蛋白質濃度的物質組合后，最終體積為7.0ml，蛋白質濃度為2.74mg/ml。向如上所述制備并冷卻到0℃的5.91ml該IFN-α溶液(16.2mg)中加入在相同緩沖液(乙酸鈉，pH5.0)中并冷卻到0℃的在5ml反應緩沖液中的3.152g如實施例8.2.14的醛基-HES(75當量)和6ml60mM氰基硼氫化鈉溶液，并將該混合物在0℃溫育22小時(見附圖27，泳道A)。作為反應對照，將1.09ml預冷的IFN-α溶液(3mg)，與在相同緩沖液中并冷卻到0℃的1ml在反應緩沖液中的122mg非氧化HES10/0.4(Mw7.6kDDS＝0.41)和1ml60mM氰基硼氫化鈉溶液混合(見附圖27，泳道B)。偶聯(lián)物的SDS-Page分析如附圖27所示。實施例8.4IFN-α-HES偶聯(lián)物的純化8.4.1通過還原氨基化的蛋白質與活化的HES衍生物溫育純化HES-IFN-α(從HES-衍生物中分離修飾和未修飾的蛋白質)用AKTAexplorer10設備在室溫下進行所有樣品的純化。用10CV的緩沖液A(20mMTris/HCl，pH8.0)使包含3mlQ-SapharoseFastFlow的柱平衡。該樣品按1∶10的比例用緩沖液A稀釋，并按1ml/min的流速使用樣品泵加樣。用10ml緩沖液A洗滌樣品泵后，進一步按1.0ml/min的流速用6CV的緩沖液A洗滌該柱。隨后使用超過2CV的0-100％緩沖液B(0.3NaCl在20mMTris/HCl，pH8.0)線性梯度在37分鐘內洗脫，并按0.8ml/min的流速用0.5CV的緩沖液B等度過柱。按照0.8ml/min的流速使用2CV緩沖液C(1.5MNaCl在20mMTris/HCl中，pH8.0)，然后使用0.5CV緩沖液B使柱再生。使用流速1.0ml/min和6CV的緩沖液A進行重平衡，以便下一次運行。8.4.2材料和方法設備AKTAexplorer10(AmershamPharmaciaBiotech)，具有泵P-903混合器M-925，具有0.6ml腔室監(jiān)視器UV-900，具有10mm流動池監(jiān)視器pH/C-900泵P-950(樣品泵)軟件Unicorn版本3.21柱AmershamBiosciencesC10/10柱材料Q-SepharoseFastFlow，編號17-0510-01，批號OD06453柱體積3ml緩沖液A20mMTris/HCl，pH8.0，Lot-Nr.PL0746緩沖液B0.3MNaCl在20mMTris/HCl中，pH8.0，Lot-Nr.PL0747緩沖液C1.5MNaCl在20mMTris/HCl中，pH8.0，Lot-Nr.PL0748方法體積步驟緩沖液流速1CV平衡100％緩沖液A1.0ml/min5-28ml加樣在緩沖液A中1∶10樣品1.0ml/min10ml洗滌樣品泵100％緩沖液A1.0ml/min5CV洗出未結合樣品100％緩沖液A1.0ml/min開始分級分離100％緩沖液A1.0ml/min6CV洗脫，線性梯度0-100％緩沖液B0.8ml/min2CV等度洗脫100％緩沖液B0.8ml/min2CV再生100％緩沖液C0.8ml/min0.5CV再生100％緩沖液B0.8ml/min停止分級分離100％緩沖液B0.8ml/min5CV再平衡100％緩沖液A1.0ml/min檢測280nm，260nm，220nmpH傳導性分級分離1ml級分8.4.3結果8.4.3.1根據(jù)實施例8的樣品樣品組成1mgEP2001(rhIFN-a2b)在25mM磷酸鈉，0.13MNaCl和0.3mMEDTA，pH7.5±0.2中起始體積0.5ml，按1∶10用緩沖液A＝5ml稀釋流過/洗滌9.3ml運行日期2004-09-29運行編號QS24D39(見實施例8.4.4.1的表)8.4.3.2根據(jù)實施例8.3.2(條目A)的樣品樣品組成2.5mgEP2001+97.5mg醛基HES10/0.4(NZA256)在0.1mM乙酸鈉，20mM氰基硼氫化鈉，pH5.0中起始體積2.5ml，按1∶10用緩沖液A＝25ml稀釋流過/洗滌44ml運行日期2004-09-29運行編號QS25D56(見實施例8.4.4.1的表)8.4.3.3根據(jù)實施例8.3.2(條目B)的樣品樣品組成2.5mgEP2001+97.5mg醛基HES10/0.7(NZA235A)在0.1mM乙酸鈉，20mM氰基硼氫化鈉，pH5.0中起始體積2.5ml，按1∶10用緩沖液A＝25ml稀釋流過/洗滌41ml運行日期2004-09-30運行編號QS26D57(見實施例8.4.4.1的表)8.4.3.4根據(jù)實施例8.3.2(條目C)的樣品樣品組成2.5mgEP2001+292mg醛基HES30/0.4(NZA328)在0.1mM乙酸鈉，20mM氰基硼氫化鈉，pH5.0中起始體積2.5ml，按1∶10用緩沖液A＝25ml稀釋流過/洗滌42ml運行日期2004-09-30運行編號QS27D58(見實施例8.4.4.1的表)8.4.3.5根據(jù)實施例8.3.2(條目D)的樣品樣品組成2.5mgEP2001+292mg醛基HES30/0.7(NZA329)在0.1mM乙酸鈉，20mM氰基硼氫化鈉，pH5.0中起始體積2.5ml，按1∶10用緩沖液A＝25ml稀釋流過/洗滌40ml運行日期2004-09-30運行編號QS28D59(見實施例8.4.4.1的表)8.4.3.6根據(jù)實施例8.3.2(條目E)的樣品樣品組成2.5mgEP2001+487mg醛基HES50/0.4(NZA303)在0.1mM乙酸鈉，20mM氰基硼氫化鈉，pH5.0中起始體積2.7ml，按1∶10用緩沖液A＝27ml稀釋流過/洗滌50ml運行日期2004-09-30運行編號QS29D60(見實施例8.4.4.1的表)8.4.3.7根據(jù)實施例8.3.2(條目F)的樣品樣品組成2.5mgEP2001+487mg醛基HES50/0.7(NZA309)在0.1mM乙酸鈉，20mM氰基硼氫化鈉，pH5.0中起始體積2.6ml，按1∶10用緩沖液A＝26ml稀釋流過/洗滌50ml運行日期2004-09-30運行編號QS30D61(見實施例8.4.4.1的表)8.4.3.8根據(jù)實施例8.3.2(條目G)的樣品樣品組成1.7mgEP2001+98mg醛基HES10/0.4(SupramolLot.407B)在0.1mM乙酸鈉，20mM氰基硼氫化鈉，pH5.0中起始體積2.5ml，按1∶10用緩沖液A＝25ml稀釋流過/洗滌42ml運行日期2004-10-1運行編號QS31D62(見實施例8.4.4.1的表)8.4.4結果比較8.4.4.1IFN-α洗脫峰的SDS-PAGE′分析表1在HES化的IFN-α的Q-Sepharose層析中在280nm處檢測到的峰面積的比較(實施例8.4.4.1的表)*來自RP-HPLC-3的定量分析的數(shù)據(jù)實施例9IFN-α抗病毒活性生物測定概述實驗程序概述干擾素-α的抗病毒活性在細胞培養(yǎng)基中預稀釋測試物后，制備連續(xù)二倍稀釋液。在96孔微量滴定板中，每個稀釋度重復4份，將稀釋的干擾素加入到新受胰蛋白酶消化的MDBK細胞(每孔40000個細胞)中。該測定在37℃溫育24小時(每孔總體積150μL(實施例9.1)或175μL(實施例9.2、9.3、9.4、10))。然后，每孔(除陽性對照孔外)加入50μL稀釋的VSV母液，得到0.1的感染復數(shù)。在每個測定中包括下列的對照物12個孔，其接受病毒和細胞培養(yǎng)基來代替干擾素(陰性對照)，和12個孔，其接受細胞培養(yǎng)基來代替干擾素和病毒(陽性對照)。該測定在37℃溫育42小時。在培養(yǎng)期結束時，用50μL的MTT溶液(在細胞培養(yǎng)基中至少2mg/mL)置換每孔中的細胞培養(yǎng)上清液。將細胞培養(yǎng)3小時。向每孔中加入100μL異丙醇/HCl溶液(含40mMHCl的異丙醇)來溶解由增殖細胞形成的紫色甲染料。隨后，在微量滴定板讀數(shù)器上測定在570/630nm處溶液的吸光度值。對于每個干擾素稀釋度，用下式計算在干擾素和VSV存在下生長的MDBK細胞的增殖活性對于每個測試物，在4個分別的測定中確定干擾素-α的抗病毒活性。實施例9.1IntronA相對于NIH標準品的抗病毒活性在所有實驗中，使用IntronA(IFN-α2b，Schering-Plough)作為實驗室內部參照物，其用NIH-標準品rhIFN-α2a(NIAID，NIH，Bethesda，USA，Gxa01-901-535)校準。NIH-標準品的比活性為9,000IU/ml。在實施例9所述的測試中實驗室內部參照物IntronA具有8,487,000IU/ml的比活性。IntronA相對于NIH-標準品rhIFN-α2a的增殖活性如附圖28所示。實施例9.2模擬溫育的IFN-α-HES相對于未修飾的起始物的抗病毒活性如實施例8.3.4所述，使用模擬溫育的IFN-α-HES(如實施例8.3.2所述，條目G)作為反應對照。將該物質的抗病毒活性與未修飾的起始物的抗病毒活性相比較，來研究偶聯(lián)和純化過程對于生物活性的影響。模擬溫育對于IFN-α的體外生物活性沒有影響。模擬溫育的IFN-α-HES與未修飾的IFN-α起始物相比的相對體外活性如附圖29所示。實施例9.3IFN-α-HES偶聯(lián)物相對于IntronA的抗病毒活性在實施例9所述的測定系統(tǒng)中，測定該偶聯(lián)物(根據(jù)實施例8.4純化的實施例8.3.2的條目A、B、C、D、E)并與未修飾的IFN-α起始物、IntronA和Pegasys(Roche)比較。計算該物質的CPE50的濃度。所有IFN-α-HES偶聯(lián)物保持了基本上高于Pegasys的抗病毒活性。IFN-α-HES偶聯(lián)物與未修飾的IFN-α起始物、IntronA和Pegasys相比的相對體外活性如附圖30所示。實施例9.4IFN-α-HES偶聯(lián)物與IntronA相比的抗病毒活性在實施例9所述的測定系統(tǒng)中，測定根據(jù)實施例8.4純化的實施例8.3.4的IFN-α-HES偶聯(lián)物并與IntronA比較。計算該物質的CPE50濃度。IFN-α-HES偶聯(lián)物保持了比IntronA高25％的抗病毒活性。IFN-α-HES偶聯(lián)物與IntronA相比的相對體外活性如附圖31所示。實施例9.5IFN-α-HES偶聯(lián)物與IntronA相比的抗病毒活性在實施例9所述的測定系統(tǒng)中，測定根據(jù)實施例8.4純化的實施例8.3.3的IFN-α-HES偶聯(lián)物并與IntronA和PegIntron比較。計算該物質的CPE50濃度。IFN-α-HES偶聯(lián)物保持了與IntronA相比約25％的抗病毒活性，與PegIntron的體外活性處于同樣的水平。IFN-α-HES偶聯(lián)物與IntronA相比的相對體外活性如附圖38所示。實施例10IFN-α-HES偶聯(lián)物的體內生物活性(在小鼠中的PK研究)實施例10.1小鼠血清對如實施例9所述的測定系統(tǒng)的影響在細胞培養(yǎng)基(對照)和小鼠血清(1∶40稀釋液和1∶80稀釋液)中制備干擾素-α的稀釋液。如實施例9所述進行測定。對于對照、1∶40稀釋的小鼠血清和1∶80稀釋的小鼠血清，在兩個分別的測定中確定干擾素-α的抗病毒活性。結果表明，1∶40稀釋和1∶80稀釋的小鼠血清不會影響對干擾素-α抗病毒活性的生物測定。實施例10.2在小鼠中的體內研究(I)在抗病毒測定中測定混合血清的抗病毒活性。在每個時間點從兩只小鼠(雌性BALB/c小鼠，8周大)收集血清，小鼠在靜脈注射30μg/kg(以蛋白質含量為基準)干擾素-α或干擾素-α-HES偶聯(lián)物2小時、4小時、12小時和24小時后被處死。融化并通過渦旋(和稀釋)充分均質化該血清樣品。在細胞培養(yǎng)基中制備連續(xù)二倍稀釋液。融化并通過渦旋充分均質化一瓶IntronA(已稀釋的)。在細胞培養(yǎng)基中制備連續(xù)二倍稀釋液。根據(jù)如實施例9所述的1∶2稀釋系列的劑量響應曲線來確定在CPE-測定中的EC50-稀釋度。確定該物質的半衰期并與未修飾的起始物和Pegasys比較。由EC50-稀釋度相對于注射后時間的半對數(shù)圖來計算半衰期。測定(i)IFN-α-HES(實施例8.3.2，表的條目B)，(ii)IFN-α-HES(實施例8.3.2，表的條目D)，(iii)IFN-α-HES(實施例8.3.4)在高達24小時的抗病毒活性。從附圖32中可以看出，半衰期從(i)(約3小時)超過(ii)(約5小時)到(iii)(約7小時)逐漸增加。對于未修飾的IFN-α，血清的抗病毒活性太低而無法計算血清半衰期。在K.R.Reddy等，AdvacedDrugDeliveryReviews54(2002)571-586中，測定了IFN-α在大鼠中的血清半衰期(靜脈內)為2小時。實施例10.3在小鼠中的體內研究(II)在抗病毒測定中測定混合血清的抗病毒活性。在每個時間點從兩只小鼠(雌性BALB/c小鼠，8周大)收集血清，小鼠在靜脈注射30μg/kg(以蛋白質含量為基準)干擾素-α或干擾素-α-HES偶聯(lián)物2小時、4小時、12小時和24小時后被處死。融化并通過渦旋(和稀釋)充分均質化該血清樣品。在細胞培養(yǎng)基中制備連續(xù)二倍稀釋液。融化并通過渦旋充分均質化一瓶IntronA(已稀釋的)。在細胞培養(yǎng)基中制備連續(xù)二倍稀釋液。根據(jù)如實施例9所述的1∶2稀釋系列的劑量響應曲線來確定在CPE-測定中的EC50-稀釋度。確定該物質的半衰期并與未修飾的起始物和Pegasys比較。由EC50-稀釋度相對于注射后時間的半對數(shù)圖來計算半衰期。測定(i)PegIntron，(ii)IFN-α-HES30/0.8(實施例8.3.3.1)和(iii)IFN-α-HES100/0.7(實施例8.3.3.2)在高達24小時的抗病毒活性。從附圖37中可以看出，半衰期從(i)(約3.6小時)到(ii)和(iii)(約6.5和6.8小時)增加。實施例11IFN-α-HES偶聯(lián)物的體內生物活性(在家兔中的PK研究)實施例11.1IFN-α和IFN-α-HES偶聯(lián)物的放射性標記采用氯胺T法用125I標記用于PK研究的樣品。氯胺T與碘化物反反應，生成鹵間化合物類型(I-Cl)。該鹵間化合物在酪氨酸的芳環(huán)上反應并在鄰位取代。實施例11.2參照實驗用125I標記氧代-HES50/0.4在第一實驗系列中，在給定的反應條件下，研究用例如HES和碘、多聚碘或多聚碘化物形成的絡合物是否可以探測到痕量的碘。在比較中，在相同條件下標記氧代-HES(MW42.1kDDS＝0.41)和IFN-α-HES(實施例8.3.2，表的條目E)，在純化過程后測定樣品中的放射性。根據(jù)文獻報道，當螺旋結構有至少11個脫水葡萄糖單元時，支鏈淀粉可以和碘、多聚碘或多聚碘化物形成絡合物。僅僅在IFN-α-HES樣品中，探測到了放射性。該結果證明，是IFN-α的酪氨酸殘基的共價修飾，而不是在純化過程中不能避免的潛在物理結合的碘，唯一地導致了放射性?？梢钥紤]把氧代-HES50/0.4(MW＝42.1kD，DS＝0.41)作為陰性對照?？紤]到該氧代-HES類型的高分子量和低取代程度，如果存在的話，可以期望會存在最長的螺旋結構，因此在這種情況下，存在最高的碘絡合物的危險。實施例11.3用非放射性碘標記干擾素-α(“冷碘化作用”)采用與IFN-α-HES偶聯(lián)物50/0.4相同的標記和純化方法用非放射性碘標記干擾素-α。在抗病毒測定中，其保持了抗病毒活性。但是，沒有進行定量，因為在標記和純化過程中，濃度發(fā)生了改變，由于可用物質的量太少而無法進行測定。實施例11.4IFN-α-HES偶聯(lián)物的放射性標記根據(jù)實施例11.1用放射性125I標記樣品。該樣品是IFN-α起始物，IFN-α-HES(實施例8.3.2，表的條目D)。該樣品的比活性為38μCi/μg(IFN-α起始物)，41μCi/μg(IFN-α-HES30/0.7)。實施例11.5在家兔中的體內PK研究實施例11.5.1實驗程序該實驗項目使用稀釋液。制備4μCi/ml的溶液。稀釋緩沖液是PBS。4只新西蘭白兔HsdIfNZW.SourceHarlanWinkelmannGmbH，D-33178Borchen.，性別雌性；在實驗開始時的體重＞2.5kg。所有動物均靜脈注射放射標記的受試物質，接受體積為1ml/kg體重，相當于4μCi/kg體重的劑量。在確定的時間點采集血樣。在每個采樣點，從動物的耳靜脈采集約600μl血液用于進一步研究。為了采血樣，在全身性麻醉(氯胺酮/甲苯噻嗪)下將靜脈留置導管放入耳靜脈內。在應用前的采血點、應用本身和應用后最初的3個采血點(0.5小時、1小時和2小時)時維持麻醉。把導管留在動物內用于進一步的采樣點，直至被動物本身切斷。用插入耳靜脈不同區(qū)域的插管來確定進一步的采血。在采集血樣后進行進一步的血樣處理。為了測定血液內的放射性標記測試物，可以根據(jù)特定的溶解方案來處理收集的血樣。為此，將250μl的血樣轉移到新的瓶中，并加入等量的SolvableTM。在搖動的水浴中將樣品在50℃溫育1小時。在溫育時間后，把樣品冷卻到室溫，加入100μlEDTA-溶液[100mM]。隨后加入300μlH2O2[30％]，在再次搖動后，在搖動的水浴中將樣品在50℃溫育1小時。在進一步處理前，收集樣品。在收集血液和溶解結束后，把樣品轉移到20ml閃爍瓶中，加入10ml閃爍混合物UltimaGoldTM。把樣品在2-8℃的黑暗中保存，直至在閃爍計數(shù)器中進行同位素125I的測定(在加入混合物約72小時后)。在數(shù)據(jù)的處理和統(tǒng)計分析之前，確定在特定實驗條件下活性猝滅?；貧w系數(shù)(r2＝0.9970)是與線性擬合的參數(shù)。發(fā)現(xiàn)猝滅因數(shù)[pCi/cpm]是3.315938。結果(見附圖33)與起始物相比，IFN-α-HES顯示出了顯著延長的半衰期。在超過24小時的時間里(約＜1000pCi/ml)，未修飾物質的曲線變平，幾乎沒有觀測到活性降低。測定的所有樣品的放射性具有較小的標準差，證明了實驗的質量。由血樣中IFN-α的濃度計算半衰期。該評估顯示在附圖34中，只考慮在4到24小時之間采集的血樣的數(shù)據(jù)。對于未修飾物質，計算的半衰期為7小時。含有IFN-α-HES時，觀測到半衰期有實質的增加(約33小時)。根據(jù)附圖35a和b的圖所示的不同區(qū)室模型(截取0-12小時)對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。在一室模型中，明顯地，在注射后的最初2小時期間，IFN-α的濃度迅速地降低。對于IFN-α-HES，半衰期明顯地延長。IFN-α的統(tǒng)計學計算的半衰期是0.26小時，IFN-α-HES是7.7小時。根據(jù)非區(qū)室模型，統(tǒng)計學分析的結果為，未修飾的IFN-α的半衰期是147小時(基于24-120小時的數(shù)據(jù))，IFN-α-HES的半衰期是42.7小時(基于36-120小時的數(shù)據(jù))。如上所述，由于曲線在24小時后變平，未修飾的IFN-α的半衰期實質性地延長。下表中概述了這兩個樣品的半衰期，其基于所述的計算模型。實施例11.5.1的表根據(jù)不同模型計算的IFN-α和IFN-α-HES的半衰期*計算24-120小時的數(shù)據(jù)，**計算36-120小時的數(shù)據(jù)權利要求1.一種制備包含蛋白質和聚合物的偶聯(lián)物的方法，其中該聚合物是羥烷基淀粉，所述方法包括(a)(1)通過開環(huán)氧化反應在聚合物中引入至少一個醛基，或者(a)(2)聚合物與至少雙官能化合物反應，所述化合物包含兩個官能團M和Q，一個官能團M與聚合物反應，一個官能團Q是(i)一個醛基或酮基或半縮醛基；或(ii)一個可以化學修飾成醛基或酮基或半縮醛基官能化的聚合物衍生物的官能團；和(b)通過還原氨基化作用把聚合物或其衍生物的至少一個醛基或酮基或半縮醛基與蛋白質的至少一個氨基共價連接。2.如權利要求1的方法，其中羥烷基淀粉是羥乙基淀粉。3.如權利要求2的方法，其中羥乙基淀粉的分子量是2到200kD，優(yōu)選4到130kD，更優(yōu)選4到70kD。4.如權利要求1到3任一的方法，其中還原氨基化作用在水性介質中進行。5.如權利要求1到4任一的方法，其中還原氨基化作用在NaCNBH3存在下進行。6.如權利要求1到5任一的方法，其中還原氨基化作用在pH7.5，優(yōu)選7或更低的pH下進行。7.如權利要求6的方法，其中pH是6或更低。8.如權利要求1到7任一的方法，其中還原氨基化作用在0到25℃的溫度下進行。9.如權利要求1到8任一的方法，其中在(a)(1)中該聚合物用高碘酸鹽進行開環(huán)氧化反應，得到具有至少一個醛基的聚合物衍生物。10.如權利要求9的方法，其中開環(huán)氧化反應在水性介質中進行。11.如權利要求9或10的方法，其中開環(huán)氧化反應在0到5℃的溫度下進行。12.如權利要求9到11任一的方法，其中使用的該聚合物具有非氧化形式的還原端。13.如權利要求1到8任一的方法，其中在(a)(2)中官能團M是羧基或反應性羧基，官能團Q是醛基或酮基或半縮醛基。14.如權利要求13的方法，其中包含M和Q的雙官能化合物選自甲酰苯甲酸、4-甲酰苯甲酸五氟苯基酯、4-甲酰苯甲酸N-羥基琥珀酰亞胺酯、和4-(4-甲酰-3，5-二甲氧基苯氧基)丁酸。15.如權利要求1到8任一的方法，其中在(a)(2)(ii)中官能團M是氨基，官能團Q是氨基。16.如權利要求15的方法，其中包含兩個氨基M和Q的化合物是具有2到20個碳原子的任選取代的二氨基烷。17.如權利要求16的方法，其中該二氨基烷選自1，2-二氨基乙烷、1，3-二氨基丙烷、和1，4-二氨基丁烷。18.如權利要求15到17任一的方法，另外還包括聚合物衍生物-其得自聚合物與包含兩個氨基M和Q的至少雙官能化合物的反應-在氨基Q上與另一種包含羧基或反應性羧基和醛基或酮基或半縮醛基的雙官能化合物反應，得到具有醛基或酮基或半縮醛基的聚合物衍生物。19.如權利要求18的方法，其中所述另一種雙官能化合物選自甲酰苯甲酸、4-甲酰苯甲酸五氟苯基酯、4-甲酰苯甲酸N-羥基琥珀酰亞胺酯、和4-(4-甲酰-3，5-二甲氧基苯氧基)丁酸。20.如權利要求15的方法，其中包含兩個氨基M和Q的化合物中的氨基Q是β-羥氨基。21.如權利要求20的方法，其中氧化該β-羥氨基得到醛基。22.如權利要求20或21的方法，其中包含兩個氨基M和Q且Q是β-羥氨基的化合物是1，3-二氨基-2-羥丙烷。23.如權利要求21或22的方法，其中使用高碘酸鹽進行該氧化反應。24.如權利要求1到23任一的方法，其中蛋白質選自EPO、G-CSF、IFNα、IFNβ、ATIII、IL-2、IL-3、肌紅蛋白、SOD、和BSA，優(yōu)選選自rhEPO、rhG-CSF、rhIFNα、rhIFNβ、rhATIII、rhIL-2、rhIL-3、肌紅蛋白、SOD、和BSA，或選自A1AT、因子VII、因子VIII、因子IX、tPA、和APC。25.一種包含蛋白質和聚合物的偶聯(lián)物，用如權利要求1到24任一所限定的方法得到。26.如權利要求25的偶聯(lián)物，其中該聚合物或其衍生物主要通過偶氮甲堿和/或氨基鍵偶聯(lián)在蛋白質N-末端的氨基上，用于該反應的蛋白質包含N-末端氨基和至少另外一個氨基，優(yōu)選另外一個賴氨酸基團。27.如權利要求25或26任一的偶聯(lián)物，其中所使用的聚合物包含通過開環(huán)氧化反應引入聚合物的至少一個醛基，該聚合物包含至少一個根據(jù)下列通式的結構其中，R1是氫或具有2到10個碳原子的羥烷基、羥芳基、羥芳烷基或羥烷芳基。28.如權利要求25或26的偶聯(lián)物，其中該蛋白質通過偶氮甲堿和/或氨基鍵與聚合物衍生物共價連接，所述聚合物衍生物得自聚合物與包含兩個氨基M和Q的雙官能化合物通過官能團M反應，所得到的化合物通過Q與另一種包含羧基或反應性羧基和醛基或酮基或半縮醛基的雙官能化合物反應，所述羧基或反應性羧基與氨基Q形成酰胺鍵，所述醛基或酮基或半縮醛基通過還原氨基化作用與蛋白質的氨基反應。29.如權利要求28的偶聯(lián)物，其中所述另一種包含羧基或反應性羧基和醛基或酮基或半縮醛基的雙官能化合物選自甲酰苯甲酸、4-甲酰苯甲酸五氟苯基酯、4-甲酰苯甲酸N-羥基琥珀酰亞胺酯、和4-(4-甲酰-3，5-二甲氧基苯氧基)丁酸。30.如權利要求29的偶聯(lián)物，具有結構如果聚合物通過其氧化的還原端反應，R1、R2、和R3各自獨立地是氫或羥烷基，n＝2，3，或4，R4獨立地是氫或甲氧基，如果R4是氫則m＝0，如果R4是甲氧基則m＝1。31.如權利要求25或26的偶聯(lián)物，其中該蛋白質通過偶氮甲堿或氨基鍵與聚合物衍生物共價連接，所述聚合物衍生物得自聚合物與包含兩個氨基M和Q的化合物反應，Q是β-羥氨基，以及該β-羥氨基Q氧化成醛基。32.如權利要求31的偶聯(lián)物，其中包含兩個氨基M和Q且Q是β-羥氨基的化合物是1，3-二氨基-2-羥丙烷。33.如權利要求32的偶聯(lián)物，具有結構如果聚合物通過其氧化的還原端反應，R1、R2、和R3各自獨立地是氫或羥烷基。34.如權利要求25到33任一的偶聯(lián)物，其中蛋白質選自EPO、G-CSF、IFNα、IFNβ、ATIII、IL-2、IL-3、肌紅蛋白、SOD、和BSA。35.如權利要求25到33任一的偶聯(lián)物，其中蛋白質選自rhEPO、rhG-CSF、rhIFNα、rhIFNβ、rhATIII、rhIL-2、rhIL-3、肌紅蛋白、SOD、和BSA。36.如權利要求25到33任一的偶聯(lián)物，其中蛋白質選自A1AT、因子VII、因子VIII、因子IX、tPA、和APC。37.如權利要求25到36或49到58任一的偶聯(lián)物，或通過權利要求1到24任一的方法制備的偶聯(lián)物，用于治療人體或動物體的方法。38.一種藥物組合物，包含治療有效量的如權利要求25到36或49到58任一的偶聯(lián)物，或通過如權利要求1到24任一的方法制備的偶聯(lián)物。39.如權利要求38的藥物組合物，還包含至少一種藥學可接受的稀釋劑、佐劑、或載體。40.如權利要求25到36或49到58任一的偶聯(lián)物，或通過權利要求1到24任一的方法制備的偶聯(lián)物，其中蛋白質是EPO并且聚合物是HAS，優(yōu)選HES，在制備用于治療貧血性疾病或相關的造血機能障礙疾病或病癥的藥物中的應用。41.如權利要求25到36或49到58任一的偶聯(lián)物，或通過權利要求1到24任一的方法制備的偶聯(lián)物，其中蛋白質是G-CSF并且聚合物是HAS，優(yōu)選HES，在制備用于治療以造血或免疫功能降低為特征的疾病的藥物中的應用，其中所述疾病優(yōu)選是化學治療、放射治療、傳染性疾病、重度慢性中性粒細胞減少癥、或白血病的結果。42.如權利要求25到36或49到58任一的偶聯(lián)物，或通過權利要求1到24任一的方法制備的偶聯(lián)物，其中蛋白質是ATIII并且聚合物是HAS，優(yōu)選HES，在制備用于治療遺傳性缺乏、靜脈閉塞性疾病、燒傷和冠狀動脈旁路移植(CABG)術中的肝素耐受、預防與通氣治療有關的微血塊形成、治療由外傷或胃腸手術導致的腸穿孔、彌散性血管內凝血(DIC)和/或敗血癥的藥物中的應用。43.如權利要求25到36或49到58任一的偶聯(lián)物，或通過權利要求1到24任一的方法制備的偶聯(lián)物，其中蛋白質是因子VIII并且聚合物是HAS，優(yōu)選HES，在制備用于治療血友病A的藥物中的應用。44.如權利要求25到36或49到58任一的偶聯(lián)物，或通過權利要求1到24任一的方法制備的偶聯(lián)物，其中蛋白質是A1AT并且聚合物是HAS，優(yōu)選HES，在制備用于治療肺氣腫、囊性纖維化、特應性皮炎、慢性阻塞性肺病(COPD)、和/或支氣管炎的藥物中的應用。45.如權利要求25到36或49到58任一的偶聯(lián)物，或通過權利要求1到24任一的方法制備的偶聯(lián)物，其中蛋白質是tPA并且聚合物是HAS，優(yōu)選HES，在制備用于治療心肌梗塞(心臟病發(fā)作)、血栓癥、血栓栓塞或閉塞性疾病，特別是閉塞性動脈疾病的藥物中的應用。46.如權利要求25到36或49到58任一的偶聯(lián)物，或通過權利要求1到24任一的方法制備的偶聯(lián)物，其中蛋白質是APC并且聚合物是HAS，優(yōu)選HES，在制備用于治療重度敗血癥、血栓癥、血栓栓塞或閉塞性疾病，特別是閉塞性動脈疾病的藥物中的應用。47.如權利要求25到36或49到58任一的偶聯(lián)物，或通過權利要求1到24任一的方法制備的偶聯(lián)物，其中蛋白質是IFNα并且聚合物是HAS，優(yōu)選HES，在制備用于治療白血病例如毛細胞性白血病、慢性髓細胞性白血病、多發(fā)性骨髓瘤、濾泡性淋巴瘤、癌癥例如類癌瘤、惡性黑色素瘤和肝炎例如慢性乙型肝炎和慢性丙型肝炎的藥物中的應用。48.如權利要求25到36或49到54任一的偶聯(lián)物，或通過權利要求1到24任一的方法制備的偶聯(lián)物，其中蛋白質是IFNβ并且聚合物是HAS，優(yōu)選HES，在制備用于治療多發(fā)性硬化癥，優(yōu)選復發(fā)型多發(fā)性硬化癥的藥物中的應用。49.一種包含羥烷基淀粉和蛋白質的偶聯(lián)物，其中羥烷基淀粉用它的氧化的還原端經酰胺鍵與第一交聯(lián)化合物偶聯(lián)，所述交聯(lián)化合物還經酰胺鍵與第二交聯(lián)化合物連接，所述第二交聯(lián)化合物經偶氮甲堿和/或氨基鍵與蛋白質連接，其中優(yōu)選使用的第一交聯(lián)化合物為二氨基官能化合物，并且優(yōu)選使用的第二交聯(lián)化合物為羧基和醛基或酮基或半縮醛基官能化的化合物，更優(yōu)選為羧基和醛基官能化的化合物。50.一種包含蛋白質和聚合物或其衍生物的偶聯(lián)物，其中該聚合物是羥烷基淀粉(HAS)，該偶聯(lián)物具有如下式的結構其中R1、R2、和R3分別獨立地是氫或具有1個，優(yōu)選2到10個碳原子的羥烷基、羥芳基、羥芳烷基或羥烷芳基，優(yōu)選氫或羥烷基，更優(yōu)選氫或羥乙基，并且其中L是任選取代的、直鏈、支鏈和/或環(huán)狀的烴殘基，任選包含至少一個雜原子，具有1到60，優(yōu)選1到40，更優(yōu)選1到20，更優(yōu)選1到10，更優(yōu)選1到6，更優(yōu)選1到2個碳原子，特別優(yōu)選1個碳原子，L特別是CH2。51.一種包含蛋白質和聚合物或其衍生物的偶聯(lián)物，其中該聚合物是羥烷基淀粉(HAS)，該偶聯(lián)物具有如下式的結構其中R1、R2、和R3分別獨立地是氫或具有1個，優(yōu)選2到10個碳原子的羥烷基、羥芳基、羥芳烷基或羥烷芳基，優(yōu)選氫或羥烷基，更優(yōu)選氫或羥乙基，并且其中L1和L2獨立地是任選取代的、直鏈、支鏈和/或環(huán)狀的烴殘基，任選包含至少一個雜原子，包含烷基、芳基、芳烷基雜烷基、和/或雜芳烷基部分，所述殘基具有1到60，優(yōu)選1到40，更優(yōu)選1到20，更優(yōu)選1到10個碳原子，并且其中D是一個鍵，優(yōu)選是通過適當?shù)墓倌軋FF2與L1連接和適當?shù)墓倌軋FF3與L2連接而形成的共價鍵。52.如權利要求51的偶聯(lián)物，其中L1是-(CH2)n-，其中n＝2，3，4，5，6，7，8，9，10，優(yōu)選是2，3，4，5，6，更優(yōu)選2，3，4，特別優(yōu)選4。53.如權利要求51或52的偶聯(lián)物，其中L2包含任選適當取代的芳基部分，優(yōu)選包含6個碳原子的芳基部分，特別優(yōu)選L2是C6H4。54.如權利要求51到53任一的偶聯(lián)物，其中F2選自下列基團-C-C-雙鍵或C-C-三鍵或芳香族C-C-鍵；-硫基或羥基；-烷基磺酸酰肼，芳基磺酸酰肼；-1，2-二醇；-1，2-氨基-硫醇-疊氮化物；-1，2-氨基醇；-氨基-NH2或包含結構單元-NH-的氨基衍生物，例如氨基烷基、氨基芳基、氨基芳烷基或烷芳基氨基；-羥氨基-O-NH2，或包含結構單元-O-NH-的羥氨基衍生物，例如羥烷基氨基、羥芳基氨基、羥芳烷基氨基或羥烷芳基氨基；-烷氧基氨基、芳氧基氨基、芳烷氧基氨基或烷芳氧基氨基，其各包含結構單元-NH-O-；-具有羰基、-Q-C(＝G)-M的殘基，其中G是O或S，并且M是例如--OH或-SH；-烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、或烷芳氧基；-烷硫基、芳硫基、芳烷硫基、或烷芳硫基；-烷基羰基氧基、芳基羰基氧基、芳烷基羰基氧基、烷芳基羰基氧基；-活化的酯，如羥胺的酯，其具有如N-羥基琥珀酰亞胺的亞胺結構或具有結構單元O-N，其中N是雜芳基化合物的一部分，或其中G＝O和Q不存在，如具有取代芳基殘基如五氟苯基、對硝基苯基或三氯苯基的芳氧基化合物；其中Q不存在或者是NH或雜原子，如S或O；--NH-NH2，或-NH-NH-；--NO2；-腈基；-羰基，如醛基或酮基；-羧基；--N＝C＝O基或-N＝C＝S基；-乙烯基鹵化物基團，例如乙烯基碘化物或乙烯基溴化物基團或三氟甲磺酸；--C≡C-H；--(C＝NH2Cl)-O烷基；--(C＝O)-CH2-Hal基，其中Hal是Cl、Br、或I；--CH＝CH-SO2-；-包含-S-S-結構的二硫基；-基團-基團并且其中F3是能與F2形成化學鍵的官能團，優(yōu)選選自上述的基團，F(xiàn)2優(yōu)選包含-NH-部分，更優(yōu)選包含氨基，F(xiàn)3優(yōu)選包含-(C＝G)-部分，更優(yōu)選-(C＝O)-部分，更優(yōu)選-(C＝G)-G-部分，更優(yōu)選-(C＝O)-G-部分，特別優(yōu)選-(C＝O)-O，D特別優(yōu)選是酰胺鍵。55.如權利要求54的偶聯(lián)物，其具有如下式的結構n＝2，3，或4，R4獨立地是氫或甲氧基，并且如果R4是氫則m＝0，如果R4是甲氧基則m＝1。56.一種包含蛋白質和聚合物或其衍生物的偶聯(lián)物，其中該聚合物是羥烷基淀粉(HAS)，該偶聯(lián)物有如下式的結構其中-CH2-N2-部分的碳原子來源于通過開環(huán)氧化反應引入到該聚合物中的醛基，并且其中氮原子來源于蛋白質的氨基。57.如權利要求54到71任一的偶聯(lián)物，其中羥烷基淀粉是羥乙基淀粉。58.如權利要求57的偶聯(lián)物，其中羥乙基淀粉的分子量是2到200kD，優(yōu)選4到130kD，更優(yōu)選4到70kD。59.如權利要求49到58任一的偶聯(lián)物，其中蛋白質選自EPO、G-CSF、IFNα、IFNβ、ATIII、IL-2、IL-3、肌紅蛋白、SOD、和BSA，優(yōu)選選自rhEPO、rhG-CSF、rhIFNα、rhIFNβ、rhATIII、rhIL-2、rhIL-3、肌紅蛋白、SOD、和BSA，和/或選自A1AT、因子VII、因子VIII、因子IX、tPA、和APC。60.如權利要求25到36或49到58任一的偶聯(lián)物，或通過權利要求1到24任一的方法制備的偶聯(lián)物，其中蛋白質是因子VII并且聚合物是HAS，優(yōu)選HES，在制備用于和因子VIII或因子IX的抑制劑一起治療血友病A或B患者發(fā)作的藥物中的應用。61.如權利要求25到36或49到58任一的偶聯(lián)物，或通過權利要求1到24任一的方法制備的偶聯(lián)物，其中蛋白質是因子IX并且聚合物是HAS，優(yōu)選HES，在制備用于控制和預防血友病B、優(yōu)選先天性因子IX缺乏或克里斯馬斯病患者的出血性發(fā)作，包括控制和預防在外科環(huán)境中的出血的藥物中的應用。全文摘要本發(fā)明涉及羥烷基淀粉，優(yōu)選羥乙基淀粉和蛋白質的偶聯(lián)物，這些偶聯(lián)物是羥烷基淀粉或羥烷基淀粉的衍生物的至少一個醛基或酮基或半縮醛基與蛋白質的至少一個氨基通過還原氨基化反應形成的，這樣羥烷基淀粉或其衍生物與蛋白質通過偶氮甲堿鍵或氨基鍵共價連接。本發(fā)明也涉及制備這些偶聯(lián)物的方法和這些偶聯(lián)物的特殊應用。文檔編號A61K51/08GK1946742SQ200580012503公開日2007年4月11日申請日期2005年3月11日優(yōu)先權日2004年3月11日發(fā)明者諾貝特·燦德爾,沃爾弗拉姆·艾希納,哈拉爾德·康拉特,弗蘭克·哈克特,克勞斯·朗格爾,米歇萊·奧爾蘭多,羅納德·弗蘭克申請人:弗雷澤紐斯卡比德國有限公司